LipidUNet-Machine Learning-gebaseerde methode voor karakterisering en kwantificering van lipideafzettingen met behulp van iPSC-afgeleid retinaal pigmentepitheel

Summary

Degeneratieve oogziekten die de retinale pigmentepitheellaag van het oog aantasten, hebben een monogene en polygene oorsprong. Verschillende ziektemodellen en een softwaretoepassing, LipidUNet, zijn ontwikkeld om ziektemechanismen te bestuderen, evenals mogelijke therapeutische interventies.

Abstract

Het retinale pigmentepitheel (RPE) is een monolaag van zeshoekige cellen aan de achterkant van het oog. Het biedt voeding en ondersteuning aan fotoreceptoren en choroïdale haarvaten, voert fagocytose uit van fotoreceptor buitenste segmenten (POS) en scheidt cytokines op een gepolariseerde manier af voor het handhaven van de homeostase van het buitenste netvlies. Disfunctionele RPE, veroorzaakt door mutaties, veroudering en omgevingsfactoren, resulteert in de degeneratie van andere retinale lagen en veroorzaakt verlies van het gezichtsvermogen. Een kenmerkend fenotypisch kenmerk van degenererende RPE is intra- en subcellulaire lipidenrijke afzettingen. Deze afzettingen zijn een veel voorkomend fenotype bij verschillende retinale degeneratieve ziekten. Om het lipideafzettingsfenotype van monogene retinale degeneraties in vitro te reproduceren, werd geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide RPE (iRPE) gegenereerd uit fibroblasten van patiënten. Cellijnen gegenereerd door patiënten met Stargardt en late-onset retinale degeneratie (L-ORD) ziekte werden gevoed met POS gedurende 7 dagen om de fysiologische functie van RPE te repliceren, wat POS fagocytose-geïnduceerde pathologie bij deze ziekten veroorzaakte. Om een model te genereren voor leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), een polygene ziekte geassocieerd met alternatieve complementactivering, werd iRPE uitgedaagd met alternatieve complementanafylatoxinen. De intra- en subcellulaire lipideafzettingen werden gekarakteriseerd met behulp van Nijlrood, boordipyrrometheen (BODIPY) en apolipoproteïne E (APOE). Om de dichtheid van lipideafzettingen te kwantificeren, werd een op machine learning gebaseerde software, LipidUNet, ontwikkeld. De software werd getraind op projectiebeelden met maximale intensiteit van iRPE op kweekoppervlakken. In de toekomst zal het worden getraind om driedimensionale (3D) beelden te analyseren en het volume van lipidedruppels te kwantificeren. De LipidUNet-software zal een waardevolle bron zijn voor het ontdekken van geneesmiddelen die de accumulatie van lipiden in ziektemodellen verminderen.

Introduction

Het retinale pigmentepitheel (RPE) is een monolaag van cellen aan de achterkant van het oog naast retinale fotoreceptoren. RPE speelt een vitale rol bij het behoud van een goed gezichtsvermogen door metabole en structurele ondersteuning te bieden aan de fotoreceptoren. Gezonde RPE-cellen worden gekenmerkt door een duidelijke zeshoekige morfologie. Ze zijn verbonden door tight junctions, waardoor de RPE kan fungeren als een barrière tussen de choriocapillaris aan de basale kant en fotoreceptoren die zich apisch bevinden. Om het retinale ecosysteem te behouden, verplaatst RPE belangrijke metabolieten, bijvoorbeeld glucose, naar fotoreceptoren op een manier die het glucoseverbruik in de RPE¹ minimaliseert. Vanwege deze beperking is RPE afhankelijk van andere metabolieten om hun metabole behoeften te behouden, waaronder vetzuren, die RPE omzet in ketonen door middel van β-oxidatie². Gezien de neiging van RPE om vetzuren te gebruiken, die waarschijnlijk worden gerecycled uit de vertering van fotoreceptor buitenste segment (POS), als energiebron, leiden schadelijke veranderingen in de lipideverwerkingsroutes in RPE vaak tot, of zijn betrokken bij, zowel monogene als polygene degeneratieve retinale ziekten³.

Leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), een polygene degeneratieve oogziekte die RPE-degeneratie veroorzaakt, is ook in verband gebracht met afwijkende autofagie en lipidenmetabolisme in de RPE-monolaag. Het falen van een disfunctionele RPE-monolaag om POS te verwerken en andere kritieke functies uit te voeren, leidt tot extracellulaire (sub-RPE) afzettingen die basale lineaire afzettingen (BLinD) worden genoemd en zich tussen de RPE en het membraan van Bruch bevinden - een kenmerk van AMD-pathologieën. Belangrijke componenten van BLinD zijn lipoproteïnen, waarvan apolipoproteïne E (APOE)⁴ de meest voorkomende is. Accumulatie van dunne lagen BLinD kan leiden tot zachte drusen, die wordt herkend als een klinisch symptoom van AMD ^5,6.

Verschillende groepen hebben aangetoond dat stamcel-afgeleide in vitro ziektemodellen die RPE-disfunctie veroorzaken, sub-RPE-lipidenaccumulatie ^7,8,9 hebben. Hallam et al. (2017) genereerden geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide RPE (iRPE) van patiënten met een hoog risico op AMD als gevolg van een polymorfisme van het CFH-gen. De iRPE toonde drusenaccumulatie, zoals gemarkeerd door APOE, en de hoogrisico-RPE accumuleerde grotere afzettingen dan iRPE gegenereerd door patiënten met een laag risico¹⁰.

Om een in vitro model te maken dat cellulaire kenmerken van AMD samenvat, zoals lipidedruppels en drusenafzetting, werden iRPE-lijnen gegenereerd uit bloedmonsters van patiënten vastgesteld met behulp van een eerder gepubliceerd ontwikkelingsgestuurd protocol¹¹. De iRPE werden onderworpen aan complement-competent humaan serum (CC-HS), een oplossing die anafylatoxinen bevat die één mogelijke oorzaak van AMD nabootsen: verhoogde alternatieve complementsignalering⁸. De resulterende cellulaire en subcellulaire afzetting van lipideafzettingen werd gemeten met behulp van veelgebruikte lipide- en lipoproteïnemarkers, APOE, Nile Red en BODIPY. Door middel van deze markers werd aangetoond dat geactiveerde complementsignalering via CC-HS de lipideaccumulatie in iRPE-cellen^{verergerde 8}.

Om een ziektemodel voor een monogene retinale degeneratieve ziekte te ontwikkelen, werden iRPE-lijnen ontwikkeld van patiënten met de ziekte van Stargardt, een ziekte veroorzaakt door mutaties in het ABCA4-gen in RPE. Het is eerder aangetoond dat wanneer ABCA4 wordt uitgeschakeld, A2E lipofuscine, een intracellulaire afzetting waarvan bekend is dat het hoge niveaus van fosfolipiden en lichtafhankelijke lipideperoxidatieproducten bevat, zich ophoopt in de RPE¹². ABCA4 knock-outlijnen werden ontwikkeld naast de patiëntenlijnen en beide werden onderworpen aan POS-voeding. De Stargardt iRPE toonde POS-fagocytose-geïnduceerde pathologie aan, met verhoogde lipideaccumulatie gekwantificeerd door BODIPY-kleuring. RPE afgeleid van ABCA4 KO iPSC's werden onderworpen aan CC-HS-behandeling; kwantificering van het BODIPY-signaal toonde een defect in lipidenbehandeling in het Stargardt-ziektemodel^{en 9}.

Gezien de prevalentie van deze ziekten en de behoefte aan effectieve therapieën, samen met de hierboven beschreven relevante ziektemodellen, is het noodzakelijk om robuuste methoden vast te stellen voor het kwantificeren van de werkzaamheid van potentiële behandelingen. Om lipideafzettingen te kwantificeren op een manier die objectief, geautomatiseerd en gestandaardiseerd is, is een op machine learning gebaseerde software, LipidUNet, gemaakt zodat, in combinatie met maskeranalysetools, lipideafzetting snel en effectief kan worden geïdentificeerd met behulp van de gemeenschappelijke markers Nile Red, BODIPY en APOE. De samenvattende statistieken die met behulp van deze analysepijplijn worden verkregen, kunnen vervolgens worden geanalyseerd en grafisch worden weergegeven, waardoor de behandelingsomstandigheden eenvoudig kunnen worden vergeleken. Het schema van het protocol is weergegeven in figuur 1.

Figuur 1: Schema van het protocol: RPE-cellen worden gekweekt op een 96-well plaat en uitgedaagd met actief menselijk serum of gezuiverde runderbuitensegmenten om verschillende soorten retinale degeneraties in vitro te modelleren. RPE-cellen worden gefixeerd en gekleurd voor lipoproteïneafzettingen met Nile Red, BODIPY en APOE. Een confocale microscoop wordt gebruikt om Z-stacks van fluorescerend gelabelde lipidedeeltjes te verkrijgen, die vervolgens worden verwerkt tot 2D-projecties met maximale intensiteit. Een machine-learning algoritme werd getraind om lipoproteïnedeeltjes te herkennen en correct te segmenteren. Overzichtstabellen met het aantal deeltjes en verschillende vormstatistieken worden gegenereerd en kunnen worden gebruikt voor latere plotting en statistische analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

Alle protocolstappen voldoen aan de richtlijnen die zijn uiteengezet door de ethische commissie voor menselijk onderzoek van de NIH. Stamcelwerk en het verzamelen van patiëntmonsters werden goedgekeurd door de Combined NeuroScience Institutional Review Board (CNS IRB) onder het Office of Human Research Protection (OHRP), NIH, volgens 45 CFR 46-richtlijnen van de Amerikaanse overheid. Patiëntmonsters werden verzameld met behulp van het CNS IRB-goedgekeurde toestemmingsformulier in overeenstemming met de criteria die zijn vastgesteld in de Verklaring van Helsinki onder het protocolnummer NCT01432847 (https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01432847?cond=NCT01432847&draw=2&rank=1).

1. iRPE generatie

1. Genereer iRPE uit van bloed afgeleide iPSC van patiënten volgens het gepubliceerde protocol van Sharma et al., 2022¹¹ (figuur 2 en figuur 3).

Figuur 2: Schema van iRPE differentiatie en rijping. Om iRPE te genereren, werd een vastgesteld differentiatieprotocol gevolgd en mochten de cellen 5 weken rijpen. De resulterende celcultuur fungeert als een in vitro model dat kan worden gemanipuleerd met verschillende behandelingen om RPE-disfunctie na te bootsen bij ziekten zoals AMD en de ziekte van Stargardt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Representatieve beelden van succesvolle en mislukte RPE-differentiatie en rijping. Twee brightfield-beelden met een vergroting van 10x van TJP1 RPE worden getoond op dag 42 van het iRPE-protocol. (A) Succesvolle differentiatie en rijping zullen confluente RPE met pigmentatie en polygonale morfologie laten zien. (B) Mislukte differentiatie en rijping zullen clusters van stervende cellen laten zien, zoals hier getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. RPE onderhoudsmedia (RPE-MM) voorbereiding

1. Ontdooi het N2-supplement een nacht bij 4 °C. Ontdooi alle andere reagentia bij kamertemperatuur (RT).
2. Voeg onder steriele omstandigheden de in tabel 1 vermelde reagentia toe aan de vermelde verdunningsfactoren, volgens het protocol dat is vastgesteld door Sharma et al., 2022¹¹.
3. Meng de media goed en filter deze met een filtratie-eenheid van 0,22 μm.
   OPMERKING: Media zijn geschikt voor gebruik binnen 2 weken indien bewaard bij 4 °C.

3. 96-well plaat zaaien

1. Ontdooi een aliquot vitronectine bij RT gedurende 3-5 minuten of totdat het ijs volledig is gesmolten.
2. Verdun de vitronectine met 1x Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing (DPBS) om de gewenste werkoplossing te verkrijgen met behulp van een verdunning van 1:200 (vitronectine: DPBS). Voor een plaat met 96 putten bedekt u elke put met 200 μL van de werkoplossing.
3. Combineer ontdooide ROCK-remmer (Y-27632-dihydrochloride) met de RPE-MM in een verdunning van 1:1000 om een eindconcentratie van 10 μM te bereiken. Dit is het platingmedium voor RPE-cellen.
4. Ontdooi de iRPE-injectieflacon met behulp van een geautomatiseerd celontdooisysteem en breng de iRPE-celsuspensie over naar een buis van 50 ml.
5. Verdun de celsuspensie met de platingmedia met een verdunning van 1:10. Centrifugeer de buis op 400 x g gedurende 5 minuten.
6. Zuig het supernatant voorzichtig op en resuspensie de cellen in 10 ml van de platingmedia.
7. Meng 400 μL van de platingmedia met 100 μL van de geresuspendeerde celoplossing voor celtelling. Gebruik dit aliquot om de levensvatbare celconcentratie van de celsuspensie te bepalen met behulp van een cel levensvatbaarheidsteller.
8. Verdun de celsuspensie met de platingmedia tot een uiteindelijke concentratie van 60.000 cellen/ml.
9. Zuig de vitronectine-coatingoplossing volledig op uit de 96-putplaat en doseer 200 μL van de celsuspensie in elk putje. Er zullen ongeveer 12.000 cellen / put zijn of ~ 200 cellen / mm².
10. Incubeer de gezaaide celplaten gedurende 48 uur bij 37 °C en 5% CO₂. Wijzig na 48 uur de media in RPE-MM zonder ROCK-remmersupplement. Verander de media elke 2-3 dagen tijdens de rijpingsperiode van 5 weken.

4. In vitro ziektemodellen

1. Complement competent humaan serum (CC-HS) behandeling
   1. Ontdooi het humane complement competent serum bij 4°C gedurende een nacht.
   2. Bereid CC-HS voor en vul incompetente humane serum (CI-HS) media aan.
      1. Om 5% CC-HS-media te bereiden, mengt u het ontdooide complement competente humane serum met RPE-MM in een verdunning van 1:20. Filtreer de oplossing voor gebruik door een mediafilter van 0,22 μm.
      2. Om 5% complement incompetent human serum (CI-HS) media te bereiden, verwarm eerst de CC-HS in een waterbad van 57 °C gedurende 30 minuten en meng vervolgens met de kweekmedia in een verdunning van 1:20. Filtreer de oplossing voor gebruik door een mediafilter van 0,22 μm.
   3. Serum behandelt de cellen met 200 μL van 5% CC-HS of 5% CI-HS media voor een totale incubatietijd van 48 uur, waarbij de media na 24 uur worden ververst.
   4. Was de cellen met 1x DPBS en fixeer ze met 4% paraformaldehyde gedurende 20 min bij RT. Was nogmaals met 1x DPBS en bewaar de monsters bij 4 °C, ondergedompeld in 200 μL DPBS.
   5. OPTIONEEL: Indien gewenst, lyseer de cellen van de plaat om alleen sub-RPE lipideafzetting weer te geven.
      1. Om de cellen te lyseren en alleen lipideafzettingen achter te laten, verwijdert u de media en voegt u 200 μL gedeïoniseerd water toe aan elke put.
      2. Incubeer gedurende 10-15 minuten, pipetteer op en neer totdat de cellen zijn verwijderd. Was nogmaals met 200 μL gedeïoniseerd water en fixeer de cellen onmiddellijk met 4% paraformaldehyde.
      3. Bevestig de werkzaamheid van celverwijdering met nucleaire kleuring met Hoechst. Voeg Hoechst met een verdunning van 1:2000 toe aan een 1x DPBS-oplossing die 1% runderserumalbumine (BSA), 0,5% Tween 20 en 0,5% Triton-X 100 bevat. Incubeer bij RT gedurende 1 uur in het donker. Daarna wassen met 1x DPBS.
2. Fotoreceptor buitenste segment (POS) behandeling op iRPE
   1. POS-voorbereiding
      1. Haal de POS-pelletbuis uit -80 °C opslag en ontdooi een nacht bij 4 °C in een afgedekte ijsemmer.
      2. Bereid de POS-wasbuffer voor door 10 g sucrose te mengen in 40 ml dubbel gedeïoniseerd H 2 O(ddH₂O).
      3. Verwarm het mengsel op 40-50 °C onder voorzichtig roeren gedurende 15 minuten. Voeg 840 mg natriumbicarbonaat toe aan het mengsel en roer tijdens het verwarmen gedurende 10 minuten.
      4. Stel het totale volume van de POS-wasbuffer in op 100 ml met ddH₂O en stel de pH van de oplossing indien nodig in op 8,3 met 1 N HCl of 1 N NaOH. Filter de wasoplossing met een filter van 0,22 μm.
         OPMERKING: Het protocol kan hier worden gepauzeerd; de POS-wasbuffer kan 's nachts bij 4 °C worden bewaard.
      5. Eenmaal ontdooid, suspensie de pellet in 15 ml POS-wasbuffer. Wees voorzichtig tijdens pelletsuspensies om de POS-integriteit te waarborgen. Centrifugeer de POS-suspensie gedurende 20 minuten bij 600 x g bij 4 °C en zuig vervolgens het supernatant op.
      6. Resuspendeerde de POS-pellet in 10 ml van de POS-wasbuffer.
      7. Verwijder een aliquot van 100 μL van de POS + POS-wasbuffer (POS-oplossing) en verdun in 400 μL 1x DPBS. Verdeel 50 μL van de verdunde POS-oplossing op een bloedagarplaat en een agaroseplaat om te controleren op bacteriële en schimmelverontreinigingen. Bereid positieve controles voor elk voor en incuber alle platen gedurende 48 uur bij 37 °C.
      8. Voer een qPCR-test uit door 1 μL POS-oplossing toe te voegen aan de detectieput om te testen op mycoplasma. Om DNA-fragmenten te versterken, voert u 40 cycli van denaturatie (95 ° C, 15 s) en gloeien en rek (60 ° C, 1 min) uit. De voorwaartse en omgekeerde primers voor het detecteren van mycoplasma in het POS-monster zijn als volgt:
         Voorwaartse primer: GGA TTA GAT ACC CTG GTA GTC CAC G
         Omgekeerde primer: CGT CAA TTC CTT TAA GTT TCA CTC TTG GC
      9. Meet de POS-concentratie met behulp van een celanalysator en aliquot volgens behoefte. Voor één put van 96 putplaten met RPE-cellen is 3 x 10⁶ POS voldoende. De gewenste verhouding is 10 POS / RPE-cel. Bewaar de aliquots bij 80 °C voor toekomstig gebruik.
   2. Toevoeging van POS aan cellen
      1. Ontdooi flesjes POS in een ijsbad.
      2. Meng de berekende hoeveelheid voorbereide POS met RPE-MM en behandel de cellen eenmaal daags met POS gedurende 7 dagen.
         OPMERKING: Bereid de POS-oplossing dagelijks vers voor.
      3. Was de cellen met 1x DPBS en fixeer ze vervolgens met 4% paraformaldehyde gedurende 20 minuten bij RT. Was nogmaals met DPBS en bewaar monsters bij 4 °C, ondergedompeld in 200 μL DPBS.

5. Kleuring voor sub-RPE-afzettingen

1. Nijl rood kleuringsprotocol
   1. Na PFA-fixatie was u de monsters 3 keer met 1x DPBS.
      OPMERKING: Als het protocol niet onmiddellijk wordt gebruikt, kan het hier worden gepauzeerd, maar monsters moeten worden bewaard in een 1x DPBS + 0,02% natriumazideoplossing bij 4 °C.
   2. Om de Nile Red-stamoplossing te bereiden, lost u Nile Red-poeder op in aceton in een concentratie van 3 mg / ml. Incubeer gedurende 15 minuten bij RT met periodiek mengen. Filtreer de oplossingen met een filter van 0,22 μm een of twee keer, afhankelijk van het neerslagniveau dat in de oplossing achterblijft.
      OPMERKING: Bescherm de stockoplossing tegen licht.
   3. Om de werkoplossing te bereiden, verdunt u de stamoplossing in een verhouding van 1:500 in 1x DPBS. Voeg 200 μL van de werkoplossing toe aan het monster gedurende 30 minuten bij RT op een schudder en bescherm het tegen licht.
   4. Was 3 keer met 1x PBS en bewaar de monsters bij 4 °C, ondergedompeld in 200 μL DPBS.
      OPMERKING: Als u een experiment uitvoert op transwells in plaats van een plaat met 96 putten, kunnen monsters worden gemonteerd op een dia met montagemedia, bedekt met een glazen afdekplaat en verzegeld met transparante nagellak. Er moet voor worden gezorgd dat het monster wordt gemonteerd met de cellen naar boven gericht.
2. BODIPY kleuringsprotocol
   1. Los BODIPY voor stamoplossing op in watervrij dimethylsulfoxide (DMSO) om een stamconcentratie van 3,8 mM te bereiken.
   2. Voor PFA-vaste monsters, verdun BODIPY-voorraad op 1:300 in 1x DPBS. Voeg 200 μL toe aan cellen en incubeer 's nachts op een rocker bij RT.
   3. Was 3 keer met 1x DPBS en bewaar de monsters bij 4 °C, ondergedompeld in 200 μL DPBS.
      OPMERKING: Als u een experiment uitvoert op transwells in plaats van een plaat met 96 putten, kunnen monsters worden gemonteerd op een dia met montagemedia, bedekt met een glazen afdekplaat en verzegeld met transparante nagellak. Er moet voor worden gezorgd dat het monster wordt gemonteerd met de cellen naar boven gericht.
3. APOE immunostaining protocol
   1. Combineer 1x DPBS met 1% runderserumalbumine (BSA), 0,5% Tween 20 en 0,5% Triton-X 100 om een bufferoplossing te creëren.
   2. Voor PFA-vaste monsters, blokkeer en permeabiliseer het monster in 200 μL van de bufferoplossing gedurende 1 uur bij RT.
   3. Voeg APOE primair antilichaam verdund op 1:100 toe in de bufferoplossing en incubeer een nacht bij RT.
   4. Was de monsters de volgende dag 3 keer met 1x DPBS.
   5. Voeg een secundair antilichaam met een verdunning van 1:1000 toe in de bufferoplossing en voeg 200 μL van de oplossing toe aan de cellen gedurende 1 uur bij RT.
   6. Was 3 keer met 1x DPBS en bewaar monsters bij 4 °C, ondergedompeld in 200 μL DPBS.
      OPMERKING: Als u een experiment uitvoert op transwells in plaats van een plaat met 96 putten, kunnen monsters worden gemonteerd op een dia met montagemedia (Fluoromount), bedekt met een glazen afdekplaat en verzegeld met transparante nagellak. Er moet voor worden gezorgd dat het monster wordt gemonteerd met de cellen naar boven gericht.

6. Beeldautomatisering en -verwerking

1. Geautomatiseerde beeldscan
   OPMERKING: Zeiss LSM 800 omgekeerde confocale scanmicroscoop en ZEN 3.2 (blauwe editie) software werden gebruikt in dit onderzoek. Zorg ervoor dat de 96-putplaat minimaal 60 minuten voor de opname tot RT is opgewarmd om brandpuntsvlakdrift tijdens de scan te voorkomen als gevolg van een verandering in de brekingsindex van het medium met temperatuurverandering.
   1. Maak met behulp van een confocale microscoop en een 40x-objectief een scanprofiel met de juiste fluorescerende kanalen voor de gebruikte lipidenmarker en eventuele aanvullende antilichamen.
   2. Gebruik het selectievakje Tegels om afbeeldingsautomatisering in te stellen. Om de 96-putplaat te kalibreren, moet u ervoor zorgen dat de juiste monsterdragermetingen worden ingevoerd en geselecteerd. Klik vervolgens op de knop Kalibreren om de plaat te kalibreren volgens de instructies, waarvoor het 10x-objectief moet worden gebruikt.
   3. Kies de weergave Geavanceerde instellingen om de juiste putten te selecteren en voeg 3 verschillende afbeeldingspunten toe in de buurt van het midden van de put met behulp van de functie Posities . Dit kan handmatig worden gedaan onder het subtabblad Positie of willekeurig met behulp van het tabblad Positie-instelling en het selecteren van Instellen door provider. Herhaal dit voor alle putjes van dezelfde kleuring.
   4. Voor optimale scherpstelling en Z-stack positionering tijdens automatisering gaat u naar het tabblad Focus Strategy om Focus Surface/Z-waarden gebruiken die zijn gedefinieerd door Tiles Setup te selecteren. Alternatieve methoden kunnen andere focusstrategieën gebruiken, maar het wordt aanbevolen om deze instelling te gebruiken voor de meest consistente resultaten.
   5. Klik op het tabblad Tegels op Posities verifiëren en stel handmatig het centrale Z-vlak voor elke positie in. De instellingen in het subtabblad Opties geven opdracht tot het verkrijgen van afbeeldingen, dus controleer dit voordat u begint met het maken van de afbeelding. Als u afbeeldingen wilt ophalen in de volgorde waarin de posities zijn geselecteerd, schakelt u de selectievakjes Tegelgebieden/Posities en Dragerputten/Container uit. Selecteer Scènes splitsen in afzonderlijke bestanden voor eenvoudige beeldverwerking.
   6. Zorg ervoor dat het tabblad Z-Stack is ingesteld op Centreren, dat er een bereik wordt ingevoerd naar de voorkeuren van de gebruiker en dat de knop Optimaal is geselecteerd om het segmentinterval in te stellen.
   7. Na het optimaliseren van de tabbladen Acquisitiemodus, Kanalen, Focusstrategie, Z-Stack en Tegels , start u het experiment.
2. Beeldverwerking
   1. Maak met behulp van een batch-beeldverwerkingsmethode maximale projecties van elke Z-stack met de methode Extended Depth of Focus .
   2. Gebruik een batch-beeldverwerkingsmethode om de maximale projectiebestanden te exporteren als 16-bits TIFF-afbeeldingen. Stel de compressie in op Geen en zorg ervoor dat Originele gegevens is aangevinkt. Het resulterende beeld moet een maximale projectie grijswaarden TIFF zijn van alleen het fluorescentiekanaal waarop de lipidemarker wordt uitgedrukt.

7. Segmentatie en kwantificering

OPMERKING: Het LipidUNet-programma is getraind op 40x-afbeeldingen van een 96-putplaat. Het wordt ten zeerste aanbevolen om afbeeldingen te gebruiken die zijn verkregen met behulp van een 40x-objectief.

1. Installeer de LipidUNet-software. LipidUNet kan worden gedownload van de volgende GitHub-repository: https://github.com/RPEGoogleMap/LipidUNet
2. Identificeer de TIFF-afbeeldingen die Nile Red, Bodipy of APOE vertegenwoordigen en verplaats ze naar een map met de naam imgs in een map met de naam Nile_Red, Bodipy of APOE, afhankelijk van de gebruikte methode.
   OPMERKING: Exacte naamgevingsconventies moeten worden gebruikt voor het LipidUNet-programma om de mappen te herkennen.
3. Open de LipidUNet-software (afbeelding 4).
4. Selecteer op het tabblad Voorspellen van de software de relevante map (Nile_Red, Bodipy of APOE) door op het beletselteken te klikken en naar de benoemde map te navigeren. Controleer of het LipidUNet-programma de afbeeldingen correct heeft geïdentificeerd door de klassevermelding te controleren.
5. Selecteer een waarschijnlijkheidsdrempel voor het algoritme tussen 0,01 en 0,99. Een hogere waarde elimineert meer valse positieven, maar kan meer valse negatieven veroorzaken, en lagere waarden kunnen meer valse positieven introduceren terwijl meer valse negatieven worden geëlimineerd. Een waarde van 0,65 is de standaardwaarde en wordt aanbevolen.
6. Klik op Voorspellen.
   OPMERKING: De software zal automatisch door alle afbeeldingen itereren en een nieuwe map maken met de naam predicted_masks in de geselecteerde map.
7. Gebruik een maskeranalysetool om de gegenereerde maskers te doorlopen en een kwantitatieve telling te geven van de gedrempelde lipidenafzettingen uit de maskerafbeeldingen.
8. Analyseer de gegenereerde tellingen om behandelingsomstandigheden te vergelijken.

Figuur 4: LipidUNet gebruikersinterface. De LipidUNet-software heeft verschillende secties om te selecteren voor de map met trainingsgegevens, waar afbeeldingen van lipideafzettingen correct zijn geïdentificeerd; de modelgewichtenlijst, die wordt geproduceerd op basis van de trainingsgegevens; en de map met voorspellingsgegevens waarin de gebruiker zijn afbeeldingen invoert voor segmentatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Results

Dit protocol biedt een workflow om lipideafzettingen te identificeren die zijn gekleurd door Nile Red, BODIPY en APOE. De ontwikkelde software kan automatisch lipideafzettingen identificeren en kwantificeren en presteert het beste wanneer het geschetste protocol is geoptimaliseerd. Voorbeelden van succesvol gedifferentieerde RPE (figuur 3A) en slecht gedifferentieerde RPE (figuur 3B) zijn opgenomen, omdat de kwaliteit van het celmodel van grote invloed is op de kwaliteit van de juiste beeldsegmentatie.

Twee van de drie markers die in het protocol worden beschreven, Nile Red en BODIPY, worden geïdentificeerd als kleine cirkelvormige punten die duidelijk helder zijn in fluorescerende afbeeldingen (figuur 5 en figuur 6). Een "positief" beeld uit het protocol zou een passende identificatie van deze verschillende afzettingen zijn (figuur 5A-D en figuur 5E-H). Een "negatief" resultaat zou een onjuiste segmentatie van het beeld laten zien door achtergrondfluorescentie als een afzetting te beschouwen, hetzij als gevolg van zwakke kleuring (figuur 6A-C en figuur 6D-F) of als gevolg van een hoge achtergrondintensiteit (figuur 6G-I).

APOE-afzettingen hebben verschillende maten en vormen en lijken meer ovaal of onregelmatig in plaats van de cirkelvormige afzettingen van Nijlrood en BODIPY. Deze afzettingen zijn ook minder punctate en de signaalintensiteit kan verschillen tussen afzettingen als gevolg van variaties in de permeabilisatie van het monster. Correcte identificatie identificeert elke afzetting, inclusief die welke minder verzadigd zijn (figuur 5I-L), terwijl onjuiste segmentatie deze afzettingen niet zal oppikken (figuur 6J-L). Daarom is het belangrijk om kleurings- en beeldvormingsmethoden te optimaliseren om drastische variatie te voorkomen. Een manier om dit te doen is door zorgvuldig aandacht te besteden aan de permeabilisatiestappen van het monster tijdens immunostaining. Om het fluorescerende signaal te optimaliseren, kunnen cellen worden gelyseerd voorafgaand aan fixatie en immunostaining voor APOE, wat resulteert in een gelijkmatige verzadiging en betere segmentatie van de APOE-afzettingen.

Voorzien zijn ook gesegmenteerde afbeeldingen van cellen gerijpt op een ander kweekplatform dan een 96-putplaat. De LipidUNet-software werd uitgevoerd op afbeeldingen van cellen gekweekt op een transwell, en terwijl de lipideafzettingen worden gedrempeld, zijn ook de poriën in het transwell-membraan dat (figuur 6M-O). Vanwege de gelijkenis in vorm en grootte, zal de LipidUNet-software in zijn huidige vorm zowel de lipideafzettingen als transwell-poriën zonder onderscheid maskeren.

Figuur 5: Representatieve resultaten. (A,E,I) 96-well plated RPE zijn gekleurd met Hoechst nucleaire kleuring (blauw) en ofwel Nile Red (magenta), BODIPY (groen) of APOE (oranje) en zijn de maximale intensiteitsprojecties van een Z-stack. (B,F,J) De grijswaardeninvoerafbeeldingen voor de LipidUNet-software na beeldverwerking. (C,G,K) Maskers gegenereerd door LipidUNet, waarbij alle afzettingen correct worden geïdentificeerd. (D,H,L) De contouren van elk gemaskeerd deeltje zijn genummerd. Deze labels maken het mogelijk om elk deeltje in de afbeelding te verbinden met een item in de spreadheet met de onbewerkte gegevens. (A-D) toont Nile Red-kleuring en de software is in staat om de afzettingen tegen de achtergrond nauwkeurig te herkennen, ondanks een zwakker signaal. (E-H) toont een sterk contrast tussen het BODIPY-signaal en de achtergrond, wat ideaal is. LipidUNet identificeert elke afzetting in de afbeelding correct. (I-L) toont een sterk APOE-signaal en vertegenwoordigt de variabiliteit van signaalverzadiging die vaak wordt gezien met deze vlek. Niettemin is beeldsegmentatie in staat om de grenzen van elke APOE-afzetting te identificeren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Suboptimale resultaten. (A,D,G,J,M) 96-goed vergulde RPE zijn gekleurd met Hoechst nucleaire kleuring (blauw) en ofwel Nile Red (magenta), BODIPY (groen) of APOE (oranje) en zijn de maximale intensiteitsprojecties van een Z-stack. (B,E,H,K,N) De grijswaardeninvoerafbeeldingen voor de LipidUNet-software na beeldverwerking. (C,F,I,L,O) De onjuiste maskers gegenereerd door LipidUNet. Rode cirkels geven aan waar de software een lipideafzetting onjuist heeft geïdentificeerd. (A-C) Nile Red-verwerking is onjuist omdat de software de achtergrondkleuring als een afzetting heeft geïdentificeerd. Dit kan vaker gebeuren wanneer er een hoge achtergrond is, maar weinig lipideafzettingen in het beeld. Twee voorbeelden van BODIPY-kleuring worden getoond: een beeld van slechte kwaliteit door (D-F) zwakke BODIPY-kleuring en (G - I) een sterk BODIPY-signaal met hoge achtergrond. In beide gevallen is de software niet in staat om kleine, cirkelvormige lipideafzettingen te onderscheiden van de achtergrond cirkelvormige ring rond de kern. Hoewel kleuring en beeldvorming moeten worden geoptimaliseerd om deze fouten te voorkomen, is de meest recente versie van LipidUNet grotendeels verbeterd voor deze afbeeldingen. (J-L) Onjuiste APOE-segmentatie. Omdat de afzettingen meer variabel zijn in grootte en verzadiging van het signaal, heeft de software moeite met het herkennen van sommige afzettingen. (M-O) RPE gezaaid op een transwell en gekleurd met Nile Red. Een deel van de Z-stack wordt hier getoond met zowel Nile Red lipid deposits als transwell poriën. De software is niet in staat om onderscheid te maken tussen de twee, zoals blijkt uit de rode cirkel met transwell poriën en de groene pijl die wijst naar Nijl Rode afzettingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Mask Tool Comparison. (A,B,C) 96-well plated RPE met variabele hoeveelheden lipideafzetting worden geïdentificeerd met Nile Red (rood). De afbeeldingen worden gemaskeerd met behulp van drie verschillende veelgebruikte maskeringsmethoden, Find Maxima, Max Entropy en Renyi Entropy, en vergeleken met het door LipidUNet gegenereerde masker. De oorspronkelijke afbeelding gaat vergezeld van een handmatige telling van de lipideafzettingen, terwijl de maskers de voorspelde tellingen van elke segmentatiemethode weergeven. Het gemiddelde foutenpercentage werd voor elke segmentatiemethode berekend met behulp van de volgende formule: gemiddelde[(|Voorspelde telling - handmatige telling|/handmatige telling) x 100]. Het door LipidUNet gegenereerde masker identificeert nauwkeuriger lipideafzettingen over afbeeldingen met variabele afzetting in vergelijking met andere maskeringsmethoden (gemiddelde foutpercentages: 23% LipidUnet, 1164% Find Maxima, 851% Max Entropy, 203% Renyi Entropy). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Bestanddeel	Cat nummer	Voorraad Conc.	Laatste Conc.	Ml
MEM alfa	12571-063	Nv		500
N2 supplement	17502-048	Nv	1%	5
Warmte geïnactiveerde FBS	SH30071,03	Nv	5%	25
NMEM NEAA	11140-050	10mm	0.01mM	5
Natriumpyruvaat	11360-070	100mm	1mm	5
Penicilline-streptomycine	15140-122	10000u/ml	100U/ml	5
Taurine	T4571	50mg/ml	250ug/ml	2.5
Hydrocortison	H6909	18,1 mg / L	20ug/L	0.553
T3	T5516	20ug/L	0.013ug/l	0.33
Totaal volume, ml				548.383

Tabel 1: RPE-MM reagenssamenstelling. Een lijst van reagentia en optimale concentraties voor RPE-MM.

Discussion

Dit protocol biedt een methode om lipideafzettingen efficiënt te labelen, in beeld te brengen en te kwantificeren in monogene en polygene in vitro ziektemodellen voor degeneratieve oogziekten. De op AI gebaseerde software, LipidUNet, kan worden toegepast op drie veel voorkomende lipidemarkers, APOE, Nile Red en BODIPY, en biedt een snelle, automatische analysemethode waarmee kwantificering standaard en onbevooroordeeld kan zijn.

De belangrijkste beperking van LipidUNet is het feit dat de trainingsdataset voor de AI beperkt was tot 40x vergrotingsbeelden van cellen gekweekt in een 96-well plaat. Als gevolg van de trainingsbeeldenset is LipidUNet, in zijn huidige vorm, beperkt tot het analyseren van 40x vergrotingsbeelden. De software kan worden gebruikt om 40x afbeeldingen te analyseren van cellen gekweekt op andere kweekoppervlakken naast een 96-putplaat, maar er moet voor worden gezorgd dat de gegenereerde uitvoermaskers worden onderzocht om nauwkeurige drempelwaarden door de software te verifiëren. Er zijn meer beeldsets (met verschillende vergrotingen) nodig om het bereik uit te breiden van welke monsters / afbeeldingen het kan analyseren.

Het protocol heeft verschillende kritieke stappen. In de lipidenmarkerstap moet de gebruiker bevestigen dat zijn gekozen etiketteringsverbinding (BODIPY, APOE, Nile Red) zijn monster effectief heeft geëtiketteerd. Volwassen RPE-cellen zijn vaak zwaar gepigmenteerd, wat het fluorescerende signaal van antilichaamimmunokleuring kan aantasten. Wanneer het fluorescentiesignaal zwak is of wanneer er te veel achtergrondkleuring is, kan LipidUNet lipidedruppels niet nauwkeurig onderscheiden. Om een vergelijkbare reden moeten correct geselecteerde acquisitie-instellingen voor de automatische beeldvormingsstap van het protocol worden gebruikt. Als de verkregen afbeeldingen van slechte kwaliteit zijn, zal LipidUNet moeite hebben om afbeeldingen goed te maskeren en daarom zal de kwantificering onnauwkeurig zijn (figuur 6A-L). Ten slotte is de nabewerking van de afbeeldingen een belangrijke stap, omdat LipidUNet specifieke vereisten heeft om de software te laten werken.

In vergelijking met workflows voor lipidenanalyse die handmatige drempels gebruiken, of technieken die automatische drempeling in software zoals Fiji omvatten, biedt LipidUNet een onbevooroordeelde en betrouwbare segmentatie over afbeeldingen met variabele lipideafzetting, zoals weerspiegeld door een klein foutenpercentage bij de identificatie van lipidedeeltjes (figuur 7). De software maakt het mogelijk om door de gebruiker extra trainingsafbeeldingen in te voeren, waardoor beeldsets kunnen worden geanalyseerd die verder gaan dan die met een 40x vergrotingsdoel of zelfs die met een andere lipidenmarker, zoals beschreven in het protocol. In de toekomst zal de software worden getraind om 3D-beelden te analyseren, zodat de kwantificering van het lipidenafzettingsvolume mogelijk is. Degeneratieve oogziekten die lipidenafzetting impliceren als een belangrijke bijdrage aan pathologie komen veel voor en er wordt voorspeld dat de gevallen zullen toenemen naarmate de oudere bevolking zich uitbreidt¹³. Nauwkeurige ziektemodellen en efficiënte analyse-instrumenten, zoals we in dit protocol hebben geschetst, zullen de ontwikkeling van nieuwe therapeutische interventies mogelijk maken.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm Steriflip filter system	EMD Millipore	SCGP00525
1x Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	Gibco	14190-144
3,3',5-Triiodo-L-thyronine	Sigma	T5516
Albumin Bovine, Fraction V	MP Biomedical	160069
Alexa Fluor 555 rabbit anti-goat IgG (H+L)	Invitrogen	A21431	APOE secondary antibody
APOE primary antibody	Millipore Sigma	AB947
BODIPY 493/503	Invitrogen	D3922	Protect from light
Complement competent human serum	Millipore Sigma	S1-LITER
CTS N2 Supplement	Life Technologies	A13707-01
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30071.03
Fluoromount-G	SouthernBiotech	0100-01	Slide mounting media
Glass Cover Slips #1 1/2 22 mm x 22 mm	Electron Microscopy Sciences	72204-01
Glass Microscope Slide 25 mm x 75 mm- 1.2 mm Thick	Electron Microscopy Sciences	71870-01
Hydrocortisone	Sigma	H0396
MEM Alpha	Life Technologies	12571-063
MEM non-essential Amino Acids	Life Technologies	11140
Nile Red	Sigma	72485-100MG	Protect from light
Paraformaldehyde 16% Solution, EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15710
Penicillin-Strep	Life Technologies	15140-148
Phosphate Buffered Saline 10x	Gibco	70011-044
Rod Outer Segments (OS)	InVision Bioresources	98740
Sodium bicarbonate	Sigma Aldrich	S5761
Sodium Pyruvate	Life Technologies	11360-070
Sucrose	Sigma Aldrich	S1888
SYBR Green Master Mix	Bio-Rad	1725274
Taurine	Sigma	T0625
Triton X-100	Sigma	9002-93-1
Tween 20 Ultrapure	Affymetrix	9005-64-5
Vitronectin	Life Technologies	A14701SA
Y-27632 dihydrochloride	R&D Systems	1254