Unieke aanpak voor het isoleren van beenmergneutrofielen bij ratten met vergelijkbare capaciteit

Samenvatting

Dit onderzoek schetst twee technieken voor het isoleren van overvloedige neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) uit het beenmerg van ratten. De ene methode combineert een commerciële neutrofielenisolatiekit met dichtheidsgradiëntcentrifugatie, terwijl de andere alleen dichtheidsgradiëntcentrifugatie gebruikt. Beide benaderingen leveren functionele NET's op die die van perifere bloedneutrofielen overtreffen.

Samenvatting

Het primaire doel van dit onderzoek was het ontwikkelen van een betrouwbare en efficiënte aanpak voor het isoleren van neutrofiele extracellulaire vallen (NET's) uit het beenmerg van ratten. Deze inspanning kwam voort uit beperkingen die verband houden met de traditionele methode om NET's uit perifeer bloed te extraheren, voornamelijk als gevolg van de schaarste aan beschikbare neutrofielen voor isolatie. De studie onthulde twee verschillende methoden voor het verkrijgen van neutrofielen van ratten uit het beenmerg: een gestroomlijnde eenstapsprocedure die bevredigende zuiveringsniveaus opleverde, en een meer tijdrovend tweestapsproces dat een verbeterde zuiveringsefficiëntie vertoonde. Belangrijk is dat beide technieken een aanzienlijke hoeveelheid levensvatbare neutrofielen opleverden, variërend van 50 tot 100 miljoen per rat. Deze efficiëntie weerspiegelde de resultaten die werden verkregen door neutrofielen te isoleren uit zowel menselijke als muizenbronnen. Het is veelbetekenend dat neutrofielen afkomstig van het beenmerg van ratten vergelijkbare mogelijkheden vertoonden om NET af te scheiden in vergelijking met neutrofielen verkregen uit perifeer bloed. De op beenmerg gebaseerde methode produceerde echter consequent aanzienlijk grotere hoeveelheden van zowel neutrofielen als NET's. Deze aanpak toonde het potentieel aan om aanzienlijk grotere hoeveelheden van deze cellulaire componenten te verkrijgen voor verdere stroomafwaartse toepassingen. Met name deze geïsoleerde NET's en neutrofielen zijn veelbelovend voor een reeks toepassingen, op het gebied van ontstekingen, infecties en auto-immuunziekten.

Inleiding

Neutrofielen vormen een cruciale subset van leukocyten die een cruciale rol spelen in de aangeboren immuunrespons. Ze worden gekenmerkt door meerlobbige kernen en korrels die verschillende proteasen en antimicrobiële peptiden bevatten¹. Neutrofielen werken voornamelijk door degranulatie, fagocytose en de vorming van NET's. De waarneming van NET's werd voor het eerst gedaan door Takei et al. in 1996 tijdens een experiment waarbij neutrofielen werden gestimuleerd met phorbolmyristaatacetaat (PMA)². Vervolgens werd het proces van NET-vorming in 2004 door Brinkmann et ^al.3 "NETosis" genoemd. Hun onder....

Protocol

De studie werd uitgevoerd onder een projectlicentie (nr. 20211404A) verleend door de Animal Ethics Committee van het West China Hospital, Sichuan University, in overeenstemming met de richtlijnen van de Animal Ethics Committee van het West China Hospital, Sichuan University voor de verzorging en het gebruik van dieren. In overeenstemming met ethische richtlijnen werden de ratten die in dit onderzoek werden gebruikt, gehouden in een gecontroleerde omgeving met een licht/donkercyclus van 12 uur, een temperatuur van 22-24 °C en een luchtvochtigheid van 50%-60%. De ratten kregen ad libitum toegang tot voedsel en water. De dieren die in deze studie werden gebruikt, waren 6....

Resultaten

Het hierin beschreven protocol schetst twee verschillende methoden, elk gekenmerkt door verbeterde zuivering of gestroomlijnde stappen. Beide methoden leverden ongeveer 0,5 x 10^8-1 x 10⁸ neutrofielen per rat op. Flowcytometrie-analyse, waarbij gebruik werd gemaakt van de annexine V-FITC/PI-apoptosedetectiekit, vertoonde een cellevensvatbaarheid van meer dan 90%, vergelijkbaar met die van muizen en mensen (Figuur 1). Hoewel besmetting met lymfocyten onvermijdelijk leek t.......

Discussie

De isolatie van neutrofielen vormt een cruciale stap in het bestuderen van NETosis, waarbij de selectie van een geschikte isolatiemethode van het grootste belang is voor het verkrijgen van betrouwbare resultaten. Een belangrijke factor om af te wegen is het optreden van lymfocytenbesmetting tijdens isolatie. Het aanpakken van deze uitdaging is vooral belangrijk bij het isoleren van neutrofielen van ratten uit het beenmerg. Ondanks het duidelijke dichtheidsbereik van neutrofielen (1,0814-1,0919, met een piek van 1,0919) i.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
A488-geconjugeerd donkey antirabbit IgG(H + L)	Invitrogen, USA	A32790
A594-geconjugeerd donkey anti-mouse IgG(H + L)	Invitrogen, USA	A32744
A594-geconjugeerd goat anti-Mouse IgG1	Invitrogen, USA	A21125
Anti-rat myeloperoxidase	Abcam, Engeland	ab134132
Anti-rat neutrofiel elastase	Abcam, Engeland	ab21595
Celigo Image Cytometer	Nexelom, USA	200-BFFL-5C
DNase I	Sigma, USA	10104159001
fetaal bovien serum (FBS)	Gibco, USA	10099141C
Hank'’s Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco, USA	C14175500BT
Hoechst	Thermofisher, USA	33342
Isoflurane	RWD, China	R510-22-10
Mowiol	Sigma, USA	81381
Normal Donkey Serum	Solarbio, China	SL050
Paraformaldehyde	biosharp, China	BL539A
Penicillin-streptomycin	Hyclone, USA	SV30010
Percoll	GE, USA	P8370-1L
Phorbol 12-myristaat 13-acetaat (PMA)	Sigma, USA	P1585
Picogreen dsDNA Assay Kit	Invitrogen, USA	P11496
Rat neutrofiel isolatiekit	Solarbio, China	P9200
Rodent erytrocyt lysis buffer	Solarbio, China	R1010
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) media	Hyclone, USA	SH30809.01B
RWD Universal Animal Anesthesie Machine	RWD, China	R500
Sprague Dawley (SD) ratten	Dashuo, China
SytoxGreen	Thermofisher, USA	S7020
Tris-EDTA (TE) buffer	Solarbio, China	T1120
Triton-X-100	Biofroxx, Duitsland	1139ML100