Kwantificerings-, levensvatbaarheidsbeoordeling en visualisatiestrategieën voor Acinetobacter-biofilms

Summary

Dit protocol beschrijft de bereiding van het inoculum, de kwantificering van de biofilm op microtiterplaten met behulp van kristalviolette kleurstof, het aantal levensvatbare stoffen in biofilms en de visualisatie van biofilms van Acinetobacter.

Abstract

Acinetobacter veroorzaakt nosocomiale infecties en de vorming van biofilm kan bijdragen aan de overleving op droge oppervlakken zoals ziekenhuisomgevingen. Kwantificering en visualisatie van biofilm zijn dus belangrijke methoden om het potentieel van Acinetobacter-stammen om nosocomiale infecties te veroorzaken te beoordelen. De biofilms die zich op het oppervlak van de microplaat vormen, kunnen worden gekwantificeerd in termen van volume en celaantallen. Biofilmvolumes kunnen worden gekwantificeerd door te kleuren met kristalviolet, te wassen, te kleuren met ethanol en vervolgens de opgeloste kleurstof te meten met behulp van een microplaatlezer. Om het aantal cellen dat in de biofilms is ingebed te kwantificeren, worden de biofilms afgeschraapt met behulp van celschrapers, geoogst in de zoutoplossing, krachtig geroerd in aanwezigheid van glasparels en verspreid op Acinetobacter-agar. Vervolgens worden de platen gedurende 24-42 uur bij 30 °C geïncubeerd. Na incubatie worden de rode kolonies opgesomd om het aantal cellen in biofilms te schatten. Deze haalbare telmethode kan ook nuttig zijn voor het tellen van Acinetobacter-cellen in biofilms van gemengde soorten. Acinetobacter-biofilms kunnen worden gevisualiseerd met behulp van fluorescerende kleurstoffen. Een in de handel verkrijgbare microplaat die is ontworpen voor microscopische analyse wordt gebruikt om biofilms te vormen. Vervolgens worden de aan de onderkant bevestigde biofilms gekleurd met SYTO9- en propidiumjodidekleurstoffen, gewassen en vervolgens gevisualiseerd met confocale laserscanmicroscopie.

Introduction

Van Acinetobacter is bekend dat het nosocomiale infecties veroorzaakt, en de menselijke infectie, vooral in zorginstellingen, wordt steeds vaker gemeld¹. Het is wijdverbreid in ziekenhuizen, zorginstellingen en voedselgerelateerde omgevingen ^2,3,4. Het kan gedurende een lange periode overleven in omgevingen zoals ziekenhuisoppervlakken zoals bedhekken, nachtkastjes, het oppervlak van ventilatoren en gootstenen⁴. Een dergelijke persistentie op omgevingsoppervlakken kan een van de belangrijke factoren zijn die bijdragen aan de nosocomiale infecties van Acinetobacter⁴.

Biofilm is een vorm van microbieel leven en is een microbiële matrix die bestaat uit levende microbiële cellen en extracellulaire polymere stoffen (EPS) uit de cellen⁵. De microbiële cellen zijn ingebed in de matrix en zijn vaak zeer goed bestand tegen omgevingsinvloeden zoals hitte, zouten, droogte, antibiotica, ontsmettingsmiddelen en schuifkrachten ^6,7.

Acinetobacter kan biofilms vormen op oppervlakken, wat suggereert dat het kan bijdragen aan een verlengde overleving op omgevingsoppervlakken, inclusief ziekenhuisoppervlakken, en een verhoogde resistentie tegen antibioticabehandeling ^8,9. Bovendien zou de biofilmvorming van Acinetobacter sterk geassocieerd kunnen zijn met klinische resultaten bij de mens^. Daarom zou de vervormbaarheid van de biofilm van Acinetobacter-stammen een van de indicatoren kunnen zijn bij het voorspellen van de overleving van het milieu en menselijke infecties ^8,10.

De aan het oppervlak bevestigde biofilms kunnen worden gekwantificeerd en gevisualiseerd om de vervormbaarheid van de biofilm te beoordelen. Om aan het oppervlak gehechte biofilms te kwantificeren, worden de biofilms normaal gesproken gekleurd door biofilmkleurende kleurstoffen zoals kristalviolet, en worden de kleurstoffen geëlueerd in oplossing en gemeten op optische dichtheid¹¹. Visualisatie van biofilms is een andere goede benadering om de vormbaarheid van biofilm te beoordelen¹¹. De confocale laserscanmicroscopie (CLSM) visualisatiemethode die gebruik maakt van specificiteit met behulp van fluorescerende kleurstoffen zou nuttiger kunnen zijn om de morfologie van biofilm te karakteriseren in vergelijking met andere technieken zoals SEM^12,13.

De levensvatbare cellen in biofilms kunnen worden geteld om het aantal levensvatbare cellen in biofilms te schatten¹¹. De levensvatbare cellen die in biofilms zijn ingebed, worden losgemaakt, verdund, verspreid op agarplaten, geïncubeerd en geïnventariseerd. Omdat het hogere aantal cellen waarschijnlijk aan de infectieuze dosis voldoet, kan het meer gedetailleerde informatie geven over biofilms, zoals infectiepotentialen geassocieerd met het aantal cellen^13,14.

Dit artikel presenteert stap-voor-stap protocollen om (1) oppervlaktegebonden biofilms te kwantificeren, (2) levensvatbare cellen in de biofilms te tellen en (3) de biofilms te visualiseren met behulp van CLSM van Acinetobacter. De gepresenteerde protocollen beschrijven de methoden om de biofilmvormbaarheid van Acinetobacter-isolaten te beoordelen en hun biofilms te karakteriseren.

Protocol

1. Bereiding van bacterieel entmateriaal

1. Verwijder de injectieflacon met glycerolbouillon die bij -80 °C is bewaard.
2. Verwijder de bacteriestam (2-10 μL) uit de injectieflacon met behulp van een steriele pipetpunt.
   OPMERKING: Acinetobacter-stammen , A. bouvetii (13-1-1), A. junii (13-1-2), A. pittii (13-2-5), A. baumannii (13-2-9), A. radioresistens (20-1) en A. ursingii (24-1) worden in dit protocol gebruikt.
3. Inoculeer een in de handel verkrijgbare bloedagarplaat (tryptische soja-agar aangevuld met 5% schapenbloed, zie Materiaaltabel) met de bacteriën.
   OPMERKING: Andere media, zoals voedingsagar of MacConkey-agar, kunnen ook worden gebruikt.
4. Streep het agaroppervlak met behulp van een steriele lus met intermitterende vlammen om het te verdunnen.
5. Plaats de agarplaat ondersteboven in een incubator en incubeer gedurende 20-24 uur een nacht bij 30 °C.
6. Kies een enkele kolonie van de bacteriecultuur met een steriele naald en inoculeer 5 ml steriele hersenhartinfusiebouillon (BHI, zie Materiaaltabel) met de kweek.
7. Incubeer de geënte bouillon in een schudincubator bij 30 °C gedurende 20-24 uur gedurende ongeveer 150 omw/min.
8. Breng 1 ml van de nachtcultuur over in een steriele microcentrifugebuis en centrifugeer de nachtcultuur bij 6.000 × g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT).
9. Verwijder het supernatans met een pipet.
10. Resuspendeer de pellet met behulp van een draaikolk in 1 ml steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
11. Centrifugeer bij 6.000 × g gedurende 10 minuten bij RT en verwijder het supernatant.
12. Resuspendeer de pellet in steriele tienvoudig verdunde BHI met behulp van vortex tot een optische dichtheid van ongeveer 0,1 bij 600 nm.
    OPMERKING: De optische dichtheid van ongeveer 0,1 komt overeen met ongeveer 10,7 kve/ml.

2. Kwantificering van biofilm met behulp van kristalviolet

1. Voeg 200 μL inoculum toe aan elk putje van een steriele polystyreenplaat met 96 putjes (zie Materiaaltabel) en voeg 200 μL gedeïoniseerd water toe aan elk van de buitenste putjes om te voorkomen dat de binnenste putjes uitdrogen¹⁵.
2. Voeg 200 μL tienvoudig verdunde BHI toe aan elk putje van dezelfde plaat als een negatieve controle.
3. Incubeer de plaat gedurende 24 uur bij 25 °C.
4. Verwijder het supernatans met een pipet.
   OPMERKING: Meerkanaalspipet is vaak handiger voor meerdere monsters.
5. Voeg voorzichtig 300 μL PBS toe aan elk putje en verwijder het supernatans met een pipet.
   OPMERKING: Meerkanaalspipet is vaak handiger voor meerdere monsters.
6. Herhaal stap 2.5 nog twee keer.
7. Voeg 200 μL kristalviolette oplossing (1%) (zie materiaaltabel) toe aan elk putje en incubeer gedurende 30 minuten bij RT.
8. Herhaal stap 2.4-2.6.
9. Voeg 200 μL absolute ethanol toe aan elk putje en incubeer gedurende 15 minuten bij RT. Meng grondig door meerdere keren op en neer te pipetteren.
10. Breng 100 μL elutie over van elk putje naar een nieuwe plaat met 96 putjes.
11. Meet de extinctie bij 595 nm met behulp van een microplaatlezer (zie Materiaaltabel).
12. Wanneer de extinctie hoger is dan 2,0, moet het monster op de juiste wijze worden verdund tot een extinctie van minder dan 2,0 in absolute ethanol en moet worden gemeten zoals in stap 2.11. Bereken vervolgens de absorptie van het monster (eindwaarde) door de waargenomen waarde te vermenigvuldigen met de verdunningsfactor.
13. Bereken de werkelijke extinctie van de monsters door de gemiddelde waarde van de negatieve controle af te trekken van de waarde van elk putje van de testmonsters op dezelfde putplaat.

3. Levensvatbaarheid van biofilm

1. Voeg 1 ml inoculum (stap 1) toe aan elk putje van een steriel polystyreen 12-wells plaat¹⁵. Incubeer de plaat gedurende 24 uur bij 25 °C. Verwijder het supernatans met een pipet.
2. Voeg voorzichtig 1,5 ml steriele PBS toe aan elk putje en verwijder het supernatans met een pipet. Voeg 1 ml steriele PBS toe aan elk putje.
3. Schraap de bodem- en wandoppervlakken van de put af met behulp van gemonteerde celschrapers.
4. Breng de geoogste celsuspensie over in een steriele plastic buis (10-1) met 9 ml zoutoplossing (0,85% NaCl) en ^10-20 glasparels (zie materiaaltabel).
   NOTITIE: Om achtergebleven biofilmresten op het bodemoppervlak van de put op te vangen, kan het opnieuw worden gesuspendeerd en met een pipet met behulp van zoutoplossing uit de ^10-1-buis worden overgebracht.
5. Draai de ^10-1 buis gedurende 60 s op een maximale snelheid.
6. Maak een 10-voudige seriële verdunning door 1 ml over te brengen in de volgende steriele buis (10-2) met 9 ml zoutoplossing (0,85 % NaCl) tot ^10-7.
7. Verdeel 100 μl uit elke verdunning op Acinetobacter-agar (zie materiaaltabel) en incubeer de agarplaten gedurende 24-42 uur bij 30 °C.
8. Tel handmatig het aantal typische rode kolonies op elke plaat in het bereik tussen 10 en 250.
9. Bereken het aantal levensvatbare cellen in de biofilm van elk putje met behulp van de onderstaande vergelijking:
   Levensvatbare cellen = Aantal kolonies × Verdunningsfactoren × 10

4. Biofilmvisualisatie met behulp van confocale laserscanmicroscopie (CLSM)

1. Voeg 200 μL inoculum toe aan elk putje van een steriele plaat met 96 putjes die bedoeld is voor microscopische analyse.
2. Incubeer de plaat gedurende 24 uur bij 25 °C.
3. Verwijder het supernatans met een pipet.
4. Voeg voorzichtig 300 μL gefilterd gedeïoniseerd water toe aan elk putje en verwijder het supernatans met een pipet.
5. Herhaal stap 4.4.
6. Bereid het mengsel van SYTO 9 en propidiumjodide (zie materiaaltabel) verdund in gefilterd gedeïoniseerd water tot een eindconcentratie van respectievelijk 10 μM en 60 μM.
7. Voeg het mengsel toe aan elk kuiltje van 200 μL en incubeer de plaat gedurende 20-30 minuten bij RT in het donker.
8. Herhaal stap 4.3-4.4
9. Visualiseer de aan de onderkant bevestigde biofilms met behulp van CLSM met de excitatiegolflengte van 488 nm en 561 nm en het emissiegolflengtebereik van respectievelijk 499-535 nm en 568-712 nm.

Results

Volgens het protocol werden de biofilms van Acinetobacter-isolaten , oorspronkelijk geïsoleerd uit keukenoppervlakken, gevormd op een polystyreenplaat met 96 putjes, gekleurd met kristalviolet, en de kleurstoffen werden opgelost in ethanol en gemeten op biofilmmassa (Figuur 1). Het aantal biofilms varieerde sterk afhankelijk van de stammen, variërend van OD 0,04 tot 1,69 (figuur 1). Op basis van de criteria die zijn vastgesteld door Stepanović et

Discussion

Met behulp van het beschreven protocol werd de biofilmvorming van Acinetobacter-isolaten in verschillende mate gemeten, gevisualiseerd en werden de levensvatbare cellen in de biofilms geschat (Figuur 1, Figuur 2 en Figuur 3).

In dit protocol werden twee verschillende temperaturen gebruikt, 30 °C voor de groei en 25 °C voor de biofilmvorming van Acinetobacter. 30 °C werd gebruikt omdat ve...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well cell culture plate	SPL	30096	Polystyreen 96-well plate
BHI (Brain Heart Infusion) bouillon	Merck KGaA	1.10493.0500
Blood Agar Base Plate	KisanBio	MB-B1005-P50	Groeimedium voor Acinetobacter
CHROMagar Acinetobacter	CHROMagar	AC092	Selectieve plaat voor Acinetobacter
Kristalviolet oplossing	Sigma-Aldrich	V5265
Filmtracer LIVE/DEAD biofilm levensvatbaarheidskit	Invitrogen	L10316	SYTO9 en propidiumjodide
Microplaatlezer	Tecan	Infinite M200 PRO NanoQuant	Biofilm meting
RBC Glass Plating Beads	RBC	RG001	Glazen kralen
μ-Plate 96 Well Black	ibidi	89621	Microplaat bedoeld voor CLSM