Kwantificerings-, levensvatbaarheidsbeoordeling en visualisatiestrategieën voor Acinetobacter-biofilms

Summary

Dit protocol beschrijft de bereiding van het inoculum, de kwantificering van de biofilm op microtiterplaten met behulp van kristalviolette kleurstof, het aantal levensvatbare stoffen in biofilms en de visualisatie van biofilms van Acinetobacter.

Abstract

Acinetobacter veroorzaakt nosocomiale infecties en de vorming van biofilm kan bijdragen aan de overleving op droge oppervlakken zoals ziekenhuisomgevingen. Kwantificering en visualisatie van biofilm zijn dus belangrijke methoden om het potentieel van Acinetobacter-stammen om nosocomiale infecties te veroorzaken te beoordelen. De biofilms die zich op het oppervlak van de microplaat vormen, kunnen worden gekwantificeerd in termen van volume en celaantallen. Biofilmvolumes kunnen worden gekwantificeerd door te kleuren met kristalviolet, te wassen, te kleuren met ethanol en vervolgens de opgeloste kleurstof te meten met behulp van een microplaatlezer. Om het aantal cellen dat in de biofilms is ingebed te kwantificeren, worden de biofilms afgeschraapt met behulp van celschrapers, geoogst in de zoutoplossing, krachtig geroerd in aanwezigheid van glasparels en verspreid op Acinetobacter-agar. Vervolgens worden de platen gedurende 24-42 uur bij 30 °C geïncubeerd. Na incubatie worden de rode kolonies opgesomd om het aantal cellen in biofilms te schatten. Deze haalbare telmethode kan ook nuttig zijn voor het tellen van Acinetobacter-cellen in biofilms van gemengde soorten. Acinetobacter-biofilms kunnen worden gevisualiseerd met behulp van fluorescerende kleurstoffen. Een in de handel verkrijgbare microplaat die is ontworpen voor microscopische analyse wordt gebruikt om biofilms te vormen. Vervolgens worden de aan de onderkant bevestigde biofilms gekleurd met SYTO9- en propidiumjodidekleurstoffen, gewassen en vervolgens gevisualiseerd met confocale laserscanmicroscopie.

Introduction

Van Acinetobacter is bekend dat het nosocomiale infecties veroorzaakt, en de menselijke infectie, vooral in zorginstellingen, wordt steeds vaker gemeld¹. Het is wijdverbreid in ziekenhuizen, zorginstellingen en voedselgerelateerde omgevingen ^2,3,4. Het kan gedurende een lange periode overleven in omgevingen zoals ziekenhuisoppervlakken zoals bedhekken, nachtkastjes, het oppervlak van ventilatoren en gootstenen⁴. Een dergelijke persistentie op omgevingsoppervlakken kan een van de belangrijke factoren zijn die bijdragen a....

Protocol

1. Bereiding van bacterieel entmateriaal

1. Verwijder de injectieflacon met glycerolbouillon die bij -80 °C is bewaard.
2. Verwijder de bacteriestam (2-10 μL) uit de injectieflacon met behulp van een steriele pipetpunt.
   OPMERKING: Acinetobacter-stammen , A. bouvetii (13-1-1), A. junii (13-1-2), A. pittii (13-2-5), A. baumannii (13-2-9), A. radioresistens (20-1) en A. ursingii (24-1) worden in dit protocol gebruikt.
3. Inoculeer een in de handel verkrijgbare bloedagarplaat (tryptische soja-agar aangevuld met 5% schapenbloed, zie Materiaaltabel) met d....

Results

Volgens het protocol werden de biofilms van Acinetobacter-isolaten , oorspronkelijk geïsoleerd uit keukenoppervlakken, gevormd op een polystyreenplaat met 96 putjes, gekleurd met kristalviolet, en de kleurstoffen werden opgelost in ethanol en gemeten op biofilmmassa (Figuur 1). Het aantal biofilms varieerde sterk afhankelijk van de stammen, variërend van OD 0,04 tot 1,69 (figuur 1). Op basis van de criteria die zijn vastgesteld door Stepanović et

Discussion

Met behulp van het beschreven protocol werd de biofilmvorming van Acinetobacter-isolaten in verschillende mate gemeten, gevisualiseerd en werden de levensvatbare cellen in de biofilms geschat (Figuur 1, Figuur 2 en Figuur 3).

In dit protocol werden twee verschillende temperaturen gebruikt, 30 °C voor de groei en 25 °C voor de biofilmvorming van Acinetobacter. 30 °C werd gebruikt omdat ve.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well cell culture plate	SPL	30096	Polystyrene 96-well plate
BHI (Brain Heart Infusion) broth	Merck KGaA	1.10493.0500
Blood Agar Base Plate	KisanBio	MB-B1005-P50	Growth media for Acinetobacter
CHROMagar Acinetobacter	CHROMagar	AC092	Selective plate for Acinetobacter
Crystal violet solution	Sigma-Aldrich	V5265
Filmtracer LIVE/DEAD biofilm viability kit	Invitrogen	L10316	SYTO9 and propidium iodide
Microplate reader	Tecan	Infinite M200 PRO NanoQuant	Biofilm measurement
RBC Glass Plating Beads	RBC	RG001	Glass beads
μ-Plate 96 Well Black	ibidi	89621	Microplate intended for CLSM