Een inleiding tot het verwerken, aanpassen en interpreteren van transiënte absorptiegegevens

Summary

Dit protocol is voor beginners de toegang tot het verwerken, passen en interpreteren van voorbijgaande absorptiespectra. De focus van dit protocol ligt op het voorbereiden van datasets en het aanpassen met behulp van zowel kinetiek met één golflengte als wereldwijde levensduuranalyse. Uitdagingen in verband met transiënte absorptiegegevens en de aanpassing ervan worden besproken.

Abstract

Transient absorption (TA)-spectroscopie is een krachtige, in de tijd opgeloste spectroscopische methode die wordt gebruikt om de evolutie van processen in geëxciteerde toestand te volgen door veranderingen in het absorptiespectrum van het systeem. Vroege implementaties van TA waren beperkt tot gespecialiseerde laboratoria, maar de evolutie van commerciële kant-en-klare systemen heeft de techniek steeds meer beschikbaar gemaakt voor onderzoeksgroepen over de hele wereld. Moderne TA-systemen zijn in staat om grote datasets te produceren met een hoge energetische en temporele resolutie die rijk zijn aan fotofysische informatie. Het verwerken, passen en interpreteren van TA-spectra kan echter een uitdaging zijn vanwege het grote aantal geëxciteerde toestandskenmerken en instrumentele artefacten. Veel factoren moeten zorgvuldig worden overwogen bij het verzamelen, verwerken en aanpassen van TA-gegevens om de onzekerheid te verminderen over welk model of welke set aanpassingsparameters de gegevens het beste beschrijft. Het doel van het voorbereiden en aanpassen van gegevens is om zoveel mogelijk van deze externe factoren te verminderen en tegelijkertijd de gegevens te behouden voor analyse. Bij deze methode krijgen beginners een protocol voor het verwerken en voorbereiden van TA-gegevens, evenals een korte inleiding tot geselecteerde aanpassingsprocedures en -modellen, met name aanpassing met één golflengte en globale levensduuranalyse. Er wordt commentaar gegeven op een aantal veelvoorkomende uitdagingen op het gebied van gegevensvoorbereiding en methoden om deze aan te pakken, gevolgd door een bespreking van de uitdagingen en beperkingen van deze eenvoudige aanpassingsmethoden.

Introduction

Transient absorption (TA) spectroscopie is een tijd-opgeloste spectroscopische techniek die de evolutie van foto-geëxciteerde soorten volgt door middel van tijdsafhankelijke veranderingen in hun absorptiespectrum na excitatie met een lichtpuls. Omdat TA een absorptietechniek is, kunnen spectroscopische signalen die voortkomen uit toestanden die zowel stralingsovergangen ondergaan (d.w.z. toestanden die doorgaans een foton uitzenden) als niet-stralingsovergangen (toestanden die doorgaans niet-fluorescerend zijn en interne conversie ondergaan, intersysteemkruising ondergaan of deelnemen aan fotoreacties) en hun evolutie worden gevolgd ^1,2. Afhankelijk van de specifieke kenmerken van de excitatiebron en detectiemethode, biedt TA toegang tot kinetiek van femtoseconden tot voorbij microseconden en van de UV tot de verre IR, waardoor het een veelzijdig spectroscopisch hulpmiddel is. De commercialisering van TA-spectrometers is de afgelopen decennia aanzienlijk gevorderd, wat ertoe heeft geleid dat meer laboratoria en faciliteiten toegang hebben tot deze krachtige techniek².

Moderne TA-systemen zijn in staat om grote datasets te produceren met een hoge energetische en temporele resolutie. De datasets hebben over het algemeen de vorm van een 2D-matrix van transmissie- of extinctieverschilwaarden als functie van golflengte en tijdsvertraging ten opzichte van de excitatiepuls. Deze dataset kan worden bekeken als een tweedimensionale heatmap of een driedimensionale topografische kaart. De interpretatie van deze gegevens is complexer geworden omdat onderzoekers ernaar streven de volledige dataset op te nemen bij het genereren van pasvormen die hun systeem van belang het beste beschrijven³.

Hoewel TA een breed scala aan golflengten en tijdschalen kan bestrijken, richt dit protocol zich op een van de meest^{toegankelijke vormen 4}: breedbandspectroscopie in het UV-zichtbare gebied aangedreven door een femtoseconde gepulseerde laser. Een schema ^5,6 van een dergelijk instrument is weergegeven in figuur 1. Het experiment begint met het nemen van een puls van de laser en deze in twee kopieën te splitsen. Een kopie van de puls, de 'pomp' genaamd, wordt gebruikt om het monster te exciteren. Een apparaat zoals een optische parametrische versterker (OPA) wordt meestal gebruikt om de pomppuls om te zetten in de gewenste excitatiegolflengte ^5,7. De tweede kopie van de puls, de 'sonde' genoemd, gaat een mechanische vertragingsfase in, die de tijdvertraging tussen de pomp- en sondepulsen kan variëren door de afstand die de puls aflegt te variëren. De sondepuls met één golflengte wordt vervolgens omgezet in een witlichtcontinuüm met behulp van een saffier- of calciumfluoridekristal (CaF₂)⁸. De witlichtpuls wordt door het monster geleid en het spectrum wordt gemeten met behulp van een breedbanddetector zoals een CCD-camera (Charge-Coupled Device). Door veranderingen in het spectrum van de witlichtpuls met en zonder de pomp te meten, kunnen veranderingen in het absorptiespectrum van het monster dat door de pomp, ΔA(T), wordt geïnduceerd, worden gemeten. Geïnteresseerde lezers worden doorverwezen naar deze nuttige recensie⁹ voor meer informatie over het detectieproces.

In alle vormen van TA-spectroscopie worden de ΔA(t)-spectra berekend door het verschil te nemen tussen de absorptie van de grondtoestand, een_sonde, en die van de aangeslagen toestand, een_pomp+sonde, bij een gegeven tijdsvertraging, t, tussen de twee pulsen ^2,5,9,10.

(1)

Merk op dat een_sonde gelijk is aan het steady-state absorptiespectrum van het monster en tijdonafhankelijk is; de tijdresolutie van het experiment komt voort uit de vertraging tussen de pomp en de sonde, vastgelegd in A_pomp+sonde(t). Een simulatie van deze gegevens is weergegeven in figuur 2A.

In tegenstelling tot steady-state absorptiespectra kunnen TA-spectra zowel positieve als negatieve eigenschappen hebben vanwege het verschil dat in vergelijking 1 wordt genomen. Positieve kenmerken zijn het resultaat van nieuwe absorberende soorten die door de pomppuls worden gecreëerd en kunnen geëxciteerde chromofoortoestanden, triplettoestanden, geometrische herschikkingen, solvatie-effecten of fotoproducten in geëxciteerde toestand vertegenwoordigen³. Algemene richtlijnen voor het identificeren van deze kenmerken en het toewijzen ervan aan chemische soorten zullen in de discussie worden gepresenteerd. Negatieve kenmerken kunnen het gevolg zijn van het bleekmiddel in de grondtoestand (GSB) of de gestimuleerde emissie (SE) (Figuur 2B). De GSB is te wijten aan het verlies van grondtoestandspopulatie na absorptie van de pomppuls. Moleculen die tot de aangeslagen toestand zijn gepromoveerd, absorberen niet langer in hetzelfde gebied als hun grondtoestand; daarom wordt er minder van de sondepuls geabsorbeerd en kan het verschil in vergelijking 1 in dat gebied negatief zijn. De GSB wordt gekenmerkt door dezelfde spectrale vorm als die van de absorptie in de grondtoestand, maar met een tegengesteld teken. SE-signalen zijn het gevolg van emissie van een geëxciteerde soort die wordt gestimuleerd door de sondepuls³. Emissie van deze soorten resulteert in meer licht dat de detector bereikt, wat gelijk staat aan minder absorptie op die golflengten. Het SE-signaal zal een vergelijkbare spectrale vorm hebben als het spontane emissiespectrum van de soort, maar met een minteken en een andere frequentieweging¹⁰.

Naast informatie over soorten in geëxciteerde toestand, kunnen TA-spectra een aantal artefacten en externe kenmerken bevatten die de onderliggende dynamiek kunnen verstoren en de toewijzing van absorptiebanden kunnen verdoezelen11. Onjuiste behandeling van deze artefacten bij de voorbereiding en analyse van de gegevens kan leiden tot de toepassing van ongeschikte fotofysische modellen op de gegevens en bijgevolg tot misleidende conclusies¹¹. Daarom richt het eerste deel van dit protocol zich op het correct verwerken van TA-datasets nadat ze zijn verzameld. Het doel van deze sectie is om onderzoekers die nieuw zijn in TA te voorzien van een reeks richtlijnen die zullen helpen bij het ontwikkelen van een intuïtie en waardering voor de rigoureuze voorbereiding en verwerking van hun gegevens.

Nadat een dataset is verwerkt, is er een overvloed aan tools en modellen beschikbaar voor het passen en interpreteren van de spectra met verschillende niveaus van complexiteit en nauwkeurigheid¹⁰. Het doel van het tweede deel van dit protocol is om de lezer voor te bereiden op het toepassen van single-wavelength fitting en globale analyse op gegevens en om richtlijnen te geven over wanneer deze modellen geschikt zijn voor het beschrijven van hun gegevens. Commerciële software is nu direct beschikbaar voor het voorbereiden en verwerken van TA-gegevens, zoals Surface Xplorer ^12,13 van Ultrafast-systemen (gratis te downloaden en te gebruiken, zie Materiaaltabel). Andere gratis alternatieven zijn vrijgegeven door academische onderzoekers, zoals Glotaran¹⁴. Glotaran is een gratis softwareprogramma dat is ontwikkeld voor globale en doelanalyse van tijdopgeloste spectroscopie- en microscopiegegevens. Het dient als een grafische gebruikersinterface (GUI) voor het R-pakket TIMP¹⁴. Bovendien kunnen gebruikers programmeertalen zoals Python gebruiken om hun eigen codes te schrijven die de analyse uitvoeren. Elk van deze passende software- en programmeeroplossingen heeft positieve eigenschappen waardoor ze een belangrijke bijdrage leveren. Voor het doel van deze studie kunnen we slechts één software presenteren voor de visuele component van deze activiteit. Een diepgaande bespreking van elke passende software valt buiten het bestek van dit artikel.

Dit artikel biedt een stapsgewijze procedure voor (1) het verwerken van TA-gegevens, (2) het aanpassen van TA-gegevens met behulp van kinetiek met één golflengte en globale analyse, en (3) het extraheren van gegevens en het aanpassen ervan aan andere modellen. Er is een set representatieve TA-gegevens opgenomen die de lezer als praktijk kan gebruiken (aanvullend bestand 1 en aanvullend bestand 2). De gegevens zijn een meting van een monster van 165 μM van 1,4-bis(5-fenyloxazol-2-yl)benzeen (POPOP) in ethanol, geëxciteerd bij 330 nm en verzameld over een bereik van −5 ps tot 5,5 ns. Bovendien werd een "blanco" monster dat alleen ethanol bevatte en geen monster bevatte, verzameld onder dezelfde experimentele omstandigheden over een bereik van -5 ps tot 5 ps, dat wordt gebruikt bij het voorbereiden van de gegevens voor montage (stap 1). Spectra werden verzameld met behulp van een ultrasnelle transiënte absorptiespectrometer. Het monster werd in een cuvet met een weglengte van 2 mm geplaatst en voortdurend geroerd. De beschreven verwerkings- en montageprocedure is gebaseerd op de Surface Xplorer-software die gegevens in het *.ufs-formaat past en die hierin het "aanpassingsprogramma" wordt genoemd. Programma's voor het converteren van datasets in andere formaten naar *.ufs-bestanden zijn beschikbaar¹⁵. Hoewel de details van dit protocol specifiek zijn voor Surface Xplorer, zijn de volgende stappen generaliseerbaar voor elk softwarepakket, commercieel of zelfgebouwd. Bovendien kunnen de resultaten van de gegevensverwerking worden geëxtraheerd en aangepast met behulp van deze andere softwarepakketten. Een ondersteunend informatiedossier (aanvullend dossier 3) geeft aanvullend advies over de montage.

Protocol

1. Gegevens voorbereiden voor montage

1. Laad de SAMPLE-dataset in de Fitting-software. De gegevens worden weergegeven zoals weergegeven in aanvullende figuur 1.
2. Als er verstrooid excitatielicht aanwezig is binnen het optische detectievenster van het experiment, gebruik dan de optie Verstrooid licht aftrekken (aanvullende figuur 2). Als er geen verstrooid excitatielicht in de gegevens aanwezig is, gaat u verder met stap 1.5.
   OPMERKING: Verstrooid licht wordt meestal waargenomen wanneer de excitatiegolflengte binnen het optische venster valt. Verstrooid licht verschijnt als een scherp negatief (bleekmiddel) kenmerk op de excitatiegolflengte (of een diffractievolgorde, of golflengte geproduceerd in de OPA) die niet varieert met de tijd.
3. Klik op het menu Surface en klik vervolgens op de optie Verstrooid licht aftrekken (aanvullende afbeelding 2). Er verschijnt een nieuw venster.
4. Klik in het nieuwe venster op de pijltjestoetsen om het aantal achtergrondspectra in te stellen op gemiddeld (aanvullende figuur 3) om achtergrondcorrectie uit te voeren. Het gebruik van tien spectra geeft een goed uitgangspunt en het aantal kan naar wens worden aangepast. Klik op Accepteren om de aftrekking uit te voeren (ga verder met stap 1.7).
   OPMERKING: Achtergrondspectra worden getrokken uit de eerste spectra die in de dataset aanwezig zijn en gaan vervolgens tijdelijk verder met behulp van zoveel achtergrondspectra als nodig is om het gemiddelde van het achtergrondsignaal te nemen; Als u er echter te veel gebruikt, begint u spectra te gebruiken die het signaal van belang bevatten, dus gebruik er niet te veel. Bij gegevens met een lang tijdvenster wordt de spreidingsfunctie mogelijk niet weergegeven aan het einde van het tijdvenster van gegevens. Dit kan gebeuren als het tijdvenster langer is dan de integratietijd van de camera of om andere redenen, afhankelijk van de manier waarop het TA-experiment is opgebouwd. Om dit te corrigeren, kan de optie voor het instellen van het tijdsbereik worden gebruikt zoals beschreven in aanvullend bestand 3.
5. Voor gegevens waarbij er geen verstrooid licht aanwezig is in het optische venster, klikt u op het menu Surface en vervolgens op de optie Achtergrond aftrekken .
6. Klik in het venster dat verschijnt op de pijltjestoetsen rechtsonder voor "Aantal spectra" naar gemiddelde (kies 10) en klik op Accepteren.
   OPMERKING: Achtergrondspectra in deze optie werken hetzelfde als in de optie "Verstrooid licht aftrekken". Beginnen met tien spectra levert een goede middeling op. Er kunnen meer spectra worden gebruikt, maar er moet voor worden gezorgd dat er niet te veel worden gebruikt om te voorkomen dat spectra worden opgenomen die interessante signalen bevatten. De gebruikershandleiding voor Surface Xplorer beschrijft de verschillen in de correctie die is toegepast voor de "Verstrooid licht aftrekken" vs. de meer basale "Achtergrond aftrekken"-correctie. Het is belangrijk om de juiste correctie toe te passen voor het artefact¹⁶.
7. Gegevens in de buurt van de randen van het optische venster kunnen een zeer lage signaal-ruisverhouding hebben als gevolg van de vorm van het sondespectrum en/of het monster dat te veel van het witte licht absorbeert. Gegevens met ruis in deze regio's bemoeilijken de analyse. Verwijder deze nutteloze delen van het spectrum. Klik op de eindgolflengten op het spectrum (tegel linksonder), typ nieuwe waarden in (aanvullende figuur 4) en klik op enter. Kies een golflengtebereik waarmee de ruisende gegevens aan de randen van het venster worden verwijderd. Voor de verstrekte gegevens is het bereik 340-680 nm.
8. Voltooi de aanpassing van het spectrale venster aan het gewenste golflengtebereik. Klik op het menu Surface en klik vervolgens op Bijsnijden (aanvullende afbeelding 5). Er verschijnt een pop-upvenster.
   1. Klik op OK. Klik op het menu Bestand en klik vervolgens op Bestand opslaan als. Klik vervolgens op OK. Sluit deze gegevensset.
      OPMERKING: Wees voorzichtig bij het bijsnijden, aangezien de functie gegevens bijsnijdt langs zowel de golflengte- als de tijdvertragingsas, waarbij alle andere gegevens worden verwijderd. Zorg ervoor dat het tijdvertragingsvenster het deel van de gegevens bevat dat moet worden bewaard. Het wordt ook sterk aanbevolen om bijgesneden gegevens op te slaan als een nieuw, correct gelabeld bestand om het onbewerkte gegevensoppervlak intact te laten als back-up.
9. Voor gegevens die op de fs- of ps-tijdschalen worden verzameld, moet een chirp-correctie worden toegepast. Open het gegevensoppervlak met alleen het oplosmiddel of substraat (geen monster) dat in dezelfde experimentele opstelling is genomen als de gegevens. Dit voorbeeld wordt de 'lege' experimentuitvoering genoemd. Voer dezelfde reeks stappen uit op de 'lege' gegevens (van stap 1.2 tot stap 1.8) die zijn uitgevoerd op de voorbeeldgegevens.
   OPMERKING: Het wordt sterk aanbevolen om een dergelijk "blanco" experiment uit te voeren onder dezelfde omstandigheden als de steekproef, maar met een korter tijdvenster (bijvoorbeeld ~ −5 ps tot 5 ps) om een groot aantal punten rond tijd nul te garanderen. Deze "blanco" run mag alleen uit oplosmiddel of substraat bestaan, afhankelijk van het type monster, en wordt gebruikt om de chirp-kromming vast te stellen. Bij de voorbereiding van de "blanco" tot nu toe moet dezelfde achtergrondcorrectie en bijsnijding worden uitgevoerd als bij de voorbeeldgegevens. Als er geen "leegte" is uitgevoerd, kan de chirp-correctie rechtstreeks op de dataset worden uitgevoerd.
10. Start het chirp-correctieproces. Klik in de heatmap-tegel (linksboven) op het dradenkruis en sleep de verticale lijncomponent naar het blauwe uiteinde van het spectrum. Begin op het blauwe golflengtebereik nabij het begin van het spectrale venster. Klik op het menu Kinetiek en klik vervolgens op Fit Solvent Response.
    OPMERKING: De respons van het geschikte oplosmiddel mag alleen worden uitgevoerd op een "blanco" monster dat geen signaal genereert na tijd nul. Pogingen om deze fit-functie toe te passen op een dataset die gegevens bevat over een molecuul of materiaal van belang, zal ertoe leiden dat het programma probeert de gegevens te passen in plaats van de IRF (instrument response function). Voor "lege" monsters moet het enige aanwezige signaal een coherent artefact zijn dat voortkomt uit kruisfasemodulatie. Cross-fasemodulatie vindt alleen plaats waar de pomp- en sondebundels elkaar overlappen en geeft daarom een spoor van de chirp-kromming die kan worden aangebracht met behulp van de optie "Fit Solvent Response". Het handmatig plaatsen van punten is vereist voor gegevens zonder een begeleidende "blanco" om te gebruiken voor correctie en wordt in meer detail beschreven in aanvullend bestand 3.
11. Er wordt een nieuw venster "Fit solvent response" geopend. Klik op de knop Passend maken (aanvullende afbeelding 6). De fitting genereert een fit to the instrument response function met behulp van de eerste en tweede afgeleiden van een Gaussiaans. Klik op de knop Opslaan en klik vervolgens op x om het scherm te sluiten.
    OPMERKING: De rode passende lijn moet goed overeenkomen met de gegevenspunten (blauwe holle vierkanten) over het hele tijdsbereik, met name het grote object dat in de buurt van tijd nul wordt gezien (0.1-2.0 ps). De fit zal het meeste succes hebben als er een hoog aantal punten rond tijd nul is, wat kan worden bereikt door een kort tijdvertragingsvenster te gebruiken voor het "lege" experiment en een groot aantal punten te behouden. Als de pasvorm niet goed lijkt overeen te komen met de gegevenspunten, vinkt u het vakje "Gaussiaans (R0) toevoegen" aan en probeert u de aanpassing opnieuw. Deze optie voegt een som van de Gauss-component toe aan de eerste en tweede afgeleiden en past mogelijk beter bij de IRF-kenmerkvorm op deze golflengte. Als de oplosmiddelresponsfitting het IRF-signaal nog steeds niet opvangt, selecteer dan een andere golflengte.
12. Voer dit proces (stappen 1.10-1.11) minstens vijf keer uit, aangezien er vijf punten nodig zijn om een piep goed te corrigeren. De punten moeten indien mogelijk over het hele spectrale venster worden verdeeld. Sommige oplosmiddelen/substraten genereren mogelijk geen waarneembaar signaal in delen van het spectrale venster, afhankelijk van de experimentele omstandigheden. Er kunnen meer punten worden toegevoegd/gebruikt als dat nodig is om een acceptabele pasvorm te produceren. Als u klaar bent, sluit u de "lege" gegevensset.
    OPMERKING: Elk opgeslagen punt wordt als een nieuwe rij naar een Excel-bestand in de werkmap geschreven zodra de gebruiker op Opslaan klikt. Als een ongewenst punt wordt opgeslagen, kan het punt uit het Excel-bestand worden verwijderd door de rij van het ongewenste punt te verwijderen.
13. Open de bijgesneden en op de achtergrond afgetrokken gegevensset opnieuw. Klik op het menu Surface en klik vervolgens op de optie Chirp-correctie . Dit zal een nieuw scherm openen met drie vensters en een menu rechtsonder (aanvullende figuur 7).
14. Voeg de chirp-correctie toe die zojuist is gemaakt. Klik op de optie Toevoegen uit bestand , selecteer het Excel-bestand dat eindigt op "pascoëfficiënten" en klik op OK. De chirp-correctie fit wordt nu weergegeven in het venster linksboven als een zwarte lijn met X-markeringen (aanvullende afbeelding 8).
    OPMERKING: De chirp-correctie wordt weergegeven als een ononderbroken lijn; de X-markeringen langs de lijn zijn de punten die worden gegenereerd door het responsproces van het geschikte oplosmiddel. Punten kunnen handmatig worden toegevoegd door het dradenkruis aan te passen en op Toevoegen te klikken. Punten kunnen ook worden verwijderd door ze te markeren en op Verwijderen te drukken. Verdere punten kunnen met de hand worden bewerkt door waarden in de lijst rechtsonder in te typen. Ten slotte kan de huidige correctie, indien gewenst, ook als bestand worden opgeslagen voor later hergebruik met behulp van de knop Opslaan in bestand .
15. Klik op de knop Voorbeeld van chirp-correctie . Hiermee wordt tijdelijk de chirp-correctie toegepast. Bekijk de correctie in het venster linksboven om er zeker van te zijn dat de gegevens tijdelijk zijn afgevlakt en dat er geen kromming meer waarneembaar is.
    1. Als u tevreden bent met de chirp-correctie, klikt u op de knop Toepassen en afsluiten . Als u niet tevreden bent, herhaalt u stap 1.10-1.14 en kiest u meer (of andere) golflengten voor de chirp-correctie totdat een bevredigende correctie is verkregen.
       OPMERKING: Als u de chirp-correctie toepast, wordt de tijd nul aangepast aan de rechtgetrokken lijn zoals deze in het voorbeeld wordt weergegeven. Er kan een tijdelijke verkeerde uitlijning zijn tussen de "blanco" en het gegevensoppervlak.
16. Klik op het menu Bestand en klik vervolgens op Bestand opslaan als. Typ een geschikte naam voor het bestand om aan te geven dat er een chirp-correctie is toegepast. Klik vervolgens op OK.
17. Sommige verstrooiingsfuncties in de gegevens worden mogelijk niet volledig verwijderd bij het aftrekken op de achtergrond. Deze kenmerken hebben invloed op de pasvorm en produceren foutieve montageresultaten. Lokaliseer dergelijke functies in de gegevens die moeten worden verwijderd. De verstrooiingsfunctie kan het gemakkelijkst worden geïdentificeerd in het negatieve tijdgebied.
    1. Klik in de heatmap-tegel linksboven op het dradenkruis en sleep het naar het negatieve tijdgebied. Blijf binnen het negatieve tijdsgebied en gebruik het dradenkruis om de golflengten te bepalen waarop de verstrooiingsfunctie begint en eindigt. Let op het golflengtebereik van de verstrooiingsfunctie (voor de verstrekte gegevensset is het functiebereik 654 nm tot 672 nm).
       OPMERKING: Wanneer u bepaalt of een object moet worden verwijderd, sleept u het horizontale dradenkruis op en neer door de tijdassen om het spectrale bereik van het object te visualiseren. Verstrooiingskenmerken hebben doorgaans zeer luidruchtige kinetische sporen van één golflengte, dus het spectrale bereik van de functie kan ook worden geverifieerd met behulp van de kinetische sporen.
18. Begin met de onderste (blauwe) golflengte (d.w.z. 654 nm), klik op de golflengte aan de rechterkant van het spectrum (tegel linksonder) en typ de waarde van het onderste (blauwe) functiebereik.
19. Snijd de gegevens bij door op het menu Surface te klikken en klik vervolgens op Bijsnijden. Klik op OK in het pop-upmenu. Sla de bijgesneden gegevens op met een unieke bestandsnaam om aan te geven aan welke kant van de gegevens dit is (blauw of links wordt aanbevolen). Sluit het bestand.
20. Open het bestand met de toegepaste chirp-correctie die is opgeslagen in stap 1.16. Ga verder naar de hogere (rode) golflengte van de functie. Klik op de golflengte aan de linkerkant van het spectrum (tegel linksonder) en typ de waarde van het hogere bereik van het object in.
21. Snijd de gegevens bij door op het menu Surface te klikken en klik vervolgens op Bijsnijden. Klik op OK in het pop-upmenu. Sla de bijgesneden gegevens op met een unieke bestandsnaam om aan te geven aan welke kant van de gegevens dit is (rood of rechts wordt aanbevolen).
22. Combineer de twee bestanden door op het menu Bestand te klikken en klik vervolgens op Meerdere oppervlakken combineren. Selecteer in het nieuwe venster beide zijden van de gegevens (d.w.z. rechts en links of blauw en rood). Gebruik ctrl + klik om elk bestand te selecteren. Controleer of beide bestanden zijn geselecteerd in het vak "Bestandsnaam:" en klik vervolgens rechtsonder op OK. Wanneer de voortgangsbalk eindigt, zijn de gegevens gecombineerd.
    OPMERKING: Een willekeurig aantal bestanden kan op deze manier worden gecombineerd. Gegevens kunnen worden samengevoegd over meerdere sneden in zowel de tijd- als de golflengte-as.
23. Klik op het menu Bestand , klik vervolgens op Bestand opslaan als en kies een unieke bestandsnaam om aan te geven dat het gecombineerd is (Gecombineerd of Samengesteld aanbevolen). Klik vervolgens op OK om het bestand op te slaan.
    OPMERKING: Zie sectie 3 voor informatie over het opslaan van gegevens uit het venster met onbewerkte gegevens voor latere weergave en plot. De gegevens in de heatmap (tegel linksboven) zouden moeten verschijnen zoals in figuur 3 en zijn nu klaar om te worden gemonteerd. Het visualiseren van de representatieve spectra, zoals weergegeven in figuur 3, wordt beschreven in stap 3.1.2.

2. Een pasvorm uitvoeren

1. Laad het goed voorbereide gegevensoppervlak.
2. Bepaal welke montage zal worden uitgevoerd en ga naar de juiste sectie.
   OPMERKING: Dit protocol biedt twee opties voor het aanpassen van gegevens: stap 2.3 presenteert kinetische tracering met één golflengte en stap 2.4 presenteert globale analyseaanpassing.
3. Fitting met enkele golflengte
   1. Om een enkele kinetische pasvorm in te stellen, verplaatst u de cursor (in de tegels linksboven of linksonder) naar de gewenste golflengte. Klik op het menu Kinetiek en klik vervolgens op Kinetisch aanpassen. Begin voor de verstrekte dataset met 632 nm.
   2. In het nieuwe venster dat wordt geopend (aanvullende afbeelding 9), ziet u dat de belangrijkste aanpassingsparameters en seed-waarden zijn ingesteld in de linkerbovenhoek van het venster onder het programmalogo in het vak naast dit gebied onder de tekst "current fit @ wavelength".
   3. Klik op de pijltjestoetsen om het aantal levens aan te passen (d.w.z. het aantal exponentiële vervaltijden dat wordt gebruikt om de gegevens aan te passen) in het vak "Eindige levensduur". Kies voor de verstrekte dataset 2 levens. Eén tot 3 levens zijn typisch als uitgangspunt.
   4. Als het datasignaal verder reikt dan het verzamelde tijdvenster, moet een "oneindige" levensduurcomponent worden opgenomen. Klik hiervoor op het selectievakje Oneindige levensduur gebruiken . Als de gegevens volledig zijn teruggevallen tot de basislijn, vink dit vakje dan niet aan. Vink het vakje niet aan voor de verstrekte gegevensset.
      OPMERKING: De "oneindige levensduur" zorgt ervoor dat er een signaalverschuiving blijft (d.w.z. het programma zal de pasvorm niet dwingen om terug te vervallen naar de basislijn). Het gebruik van een oneindige component is vereist wanneer het signaal op die golflengte niet binnen het tijdsbereik van het experiment naar de basislijn vervalt.
   5. Voer gokwaarden in voor de levensduur en bijbehorende amplitudes, de responstijd van het instrument en tijd nul om het aanpassingsproces te ondersteunen (aanvullende afbeelding 10). Klik op de gewenste parameter. Klik in het venster met de waarde, typ een gokwaarde en klik vervolgens op de knop voor de eerste gok om de waarde in te stellen. Voor de verstrekte dataset zijn de juiste schattingswaarden: 0 = 0 ps, IRF = 0,25 ps, A1 = 0,6, t1 = 100 ps, A2 = 0,08, t2 = 1100 ps.
      OPMERKING: "0" is de schatting van tijd nul, "IRF" is de responstijd van het instrument, "A" verwijst naar de amplitude van een bepaalde exponentiële (zie vergelijking 3) en "t" is de levensduur/tijdconstante. Door goede gokwaarden te geven, krijgt het programma een redelijke pasvorm. Kies 'A'-waarden die binnen de waarden van het A-bereik in de gegevensset vallen. Kies "t"-waarden voor tijdbereiken waarin significante verandering wordt waargenomen in het kinetische spoor. De beste manier om intuïtie te krijgen over hoe gokwaarden de pasvorm beïnvloeden, is door verschillende sets gokwaarden uit te proberen en de pasvormen die ze produceren te observeren. Als een of meer van deze parameters bekend zijn, kan die parameter worden ingesteld en "gefixeerd", zodat deze niet varieert met de pasvorm (aanvullende figuur 11).
   6. Wanneer alle gokparameters zijn ingevoerd, klikt u op de knop Passen . Een representatieve pasvorm wordt weergegeven in figuur 4.
      OPMERKING: Als u de pasvorm toepast, wordt de gegevensplot gevuld met de pasvormlijn en een restplot die kan worden gebruikt om de kwaliteit van de pasvorm te beoordelen. Fit-parameters, zoals de levensduur en bijbehorende amplitudes, tijd nul en responstijd van het instrument, worden ook ingevuld in het vak linksboven. Gebruik verschillende fitparameters om het aantal levens te bepalen en de opname/uitsluiting van een "oneindige" tijdcomponent die het beste bij de gegevens past.
   7. Sla de pasvorm op door op de knop Opslaan te klikken (aanvullende afbeelding 9).
      OPMERKING: Zie sectie 3 voor informatie over het opslaan van gegevens uit het venster met onbewerkte gegevens voor latere weergave en plot.
4. Globale analyse fitting
   1. Klik op het menu Surface en klik vervolgens op de optie Hoofdcomponenten via SVD . Er verschijnt een nieuw venster (aanvullende figuur 12).
      OPMERKING: Het venster rechtsboven toont de belangrijkste kinetische sporen en linksonder toont de belangrijkste spectra. De tegel linksboven toont een grafiek van het restoppervlak dat is ontstaan door het verschil tussen het oorspronkelijke oppervlak en een oppervlak dat is gemaakt door de geselecteerde hoofdcomponenten.
   2. Klik op de pijltjestoetsen om het "Aantal hoofdcomponenten" in te stellen (aanvullende afbeelding 12). Kies voor de opgegeven gegevensset 15.
      OPMERKING: Bij het bepalen van het aantal hoofdcomponenten dat moet worden gekozen, is een manier om het aantal te blijven verhogen totdat zowel de hoofdspectra als de hoofdkinetische sporen op een ruispatroon lijken. Een andere manier om te bepalen hoeveel hoofdcomponenten u moet kiezen, is door te kijken naar de waarden van de gewichtscoëfficiënt die links van de legenda in de tegel rechtsboven worden weergegeven. Ga door met het toevoegen van hoofdcomponenten totdat deze waarde 0,01 bereikt. Over het algemeen is het raadzaam om er voor de goede orde nog een paar toe te voegen. Dit kan ertoe leiden dat er maar liefst 15 of meer hoofdcomponenten worden geselecteerd.
   3. Klik op de knop Opslaan . Opgeslagen hoofdcomponenten zijn nodig om door te gaan naar de volgende stap.
      OPMERKING: Elk hoofdonderdeel is een weergave van de verminderde complexiteit van het oorspronkelijke gegevensoppervlak. Het gebruik van hoofdcomponenten zal resulteren in een vereenvoudigd oppervlak in vergelijking met de ruwe gegevens die worden geanalyseerd. Rekening houden met de meeste belangrijke kenmerken van het gegevensoppervlak is erg belangrijk voor het verkrijgen van een nauwkeurige pasvorm, dus het is essentieel om voldoende hoofdcomponenten te gebruiken om die kenmerken vast te leggen. Het gebruik van meer hoofdcomponenten zal de pasvorm niet in gevaar brengen. Daarom, als er enige twijfel bestaat over het aantal hoofdcomponenten dat moet worden geselecteerd, gebruik dan meer hoofdcomponenten in plaats van minder. Houd er rekening mee dat het gebruik van te veel de aanpassoftware kan vertragen.
   4. Na het opslaan van de hoofdcomponenten keert het programma terug naar het hoofdscherm en kan nu worden geprobeerd globaal te passen. Klik op het menu Surface en klik vervolgens op de optie Global Fit . Er wordt een nieuw venster geopend (aanvullende afbeelding 13).
      OPMERKING: De belangrijkste kinetische sporen worden weergegeven in de tegel rechtsboven. De tegel linksboven geeft een oppervlak van het pasoppervlak weer in vergelijking met het onbewerkte oppervlak. Op de tegel linksonder worden de decay-associated difference spectra (DADS) weergegeven die door de pasvorm zijn gegenereerd. Ten slotte kunnen op de tegel rechtsonder de fitparameters worden ingesteld, inclusief het aantal exponentiële functies dat moet worden gebruikt en of een oneindige functie moet worden gebruikt.
   5. Gebruik de pijltjestoetsen naast het "aantal exp." om het aantal exponentiële functies in te stellen dat in de pasvorm moet worden opgenomen. Als het datasignaal verder reikt dan het verzamelde tijdvenster, moet een "oneindige" levensduurcomponent worden opgenomen. Klik hiervoor op het selectievakje Offset (Ainf) gebruiken . Kies voor de opgegeven gegevensset 2 en klik niet op het vakje. Als de gegevens volledig zijn teruggevallen tot de basislijn, vink dit vakje dan niet aan.
      OPMERKING: Fit-parameters kunnen worden vastgesteld voordat een fit wordt uitgevoerd door op de labelkolom in het vak rechtsonder onder de globale fitcoëfficiënten te klikken. Het label wordt rood en verandert in een (vaste) indicator op het label. Elke waarde die in het vak aan de rechterkant wordt getypt, wordt gebruikt voor die parameter in plaats van vrij te variëren voor de pasvorm. Voorzichtigheid is geboden bij het vaststellen van waarden voor een pasvorm, omdat dit de pasvormresultaten kan beïnvloeden.
   6. Klik op de knop Passen . De voortgang van de pasvorm wordt weergegeven via een kleine laadbalk in het midden van het scherm. Na voltooiing van de voortgang van de pasvorm worden de vensters gevuld met gegevens van de pasvorm (Figuur 5 en aanvullende Figuur 14). Bekijk de pasresultaten visueel.
      OPMERKING: Informatie van zowel de belangrijkste kinetische pasvorm als de DADS worden gebruikt om te bepalen of de pasvorm de moeite waard is om te redden of te slecht is. Over het algemeen geldt dat als de pasvorm van de hoofdsporen goed overeenkomt met de gegevens en er geen of zeer weinig kenmerken in de plot zijn, de pasvorm kan worden geaccepteerd. Het is eenvoudig om meerdere pasvormen te controleren door het aantal levens te wijzigen en/of de knop "Offset (Ainf) gebruiken" aan of uit te vinken. De beste pasvorm die wordt geproduceerd na controle van meerdere variaties van de fittingparameters, moet worden geaccepteerd.
   7. Klik op de knop Opslaan . Hiermee wordt de momenteel getoonde pasvorm samen met de gegevens opgeslagen in een Excel-bestand.
      OPMERKING: Het Excel-bestand wordt opgeslagen op dezelfde bestandslocatie als de gegevensset. Als er extra aanpassingen worden uitgevoerd en moeten worden opgeslagen, worden alle eerdere versies overschreven. Geef daarom elke oude pasvorm een unieke naam voordat u een nieuwe pasvorm genereert en opslaat. Parameters die zijn opgeslagen van de pasvorm omvatten alleen de tijd nul, IRF, levensduur en de bijbehorende DADS. Dit bestand bevat geen informatie over de plot of de aanpassing aan de belangrijkste kinetische sporen. Het opslaan van de belangrijkste kinetische sporen wordt beschreven in stap 3.3. Zie stap 3.0 voor informatie over het opslaan van gegevens uit het venster met onbewerkte gegevens voor latere weergave en plot.

3. Extraheren van ruwe gegevens en pasvormen uit de passende software voor plotten

OPMERKING: Onbewerkte gegevens of pasvormen die zijn geproduceerd op basis van aanpassing met één golflengte of globale analyse kunnen worden geëxporteerd naar csv-bestanden die in een reeks andere programma's kunnen worden geopend.

1. Ruwe gegevens extraheren voor plotten
   1. Om de heatmap van de dataset te exporteren, klikt u op het menu Bestand en vervolgens op Exporteren naar CSV (aanvullende afbeelding 15). Dit opent een venster, klik op OK om het csv-bestand op te slaan in dezelfde map als het gegevensbestand dat is geopend met dezelfde naam als het gegevensbestand.
      OPMERKING: Onbewerkte gegevens kunnen ook worden geëxporteerd door met de rechtermuisknop op het heatmap-venster te klikken en op Gegevens exporteren naar klembord te klikken. Hierdoor worden de gegevens tijdelijk opgeslagen, zodat ze in een softwaredocument naar keuze van de gebruiker kunnen worden geplakt. Plak de gegevens in een Excel-bestand en sla de gegevens op.
   2. In het venster kunnen meerdere spectra worden weergegeven ter vergelijking of om een figuur te maken. Sleep de horizontale cursor (in de heatmap, linksboven) naar een gewenst tijdstip. Druk op Ctrl + S om het spectrum te selecteren en op te slaan in het spectrale venster (linksonder). Voeg zoveel tijdstippen toe als nodig is om de voortgang van de gegevens weer te geven (5-10 spectra), zoals te zien is in figuur 3.
      OPMERKING: Het aantal spectra dat wordt gekozen om de gegevens weer te geven en de temporele rangschikking van deze spectra kunnen sterk afhangen van het specifieke monster en de experimentele omstandigheden. De bovenstaande aanbeveling is een algemene richtlijn, maar de specifieke kenmerken van het experiment moeten bepalen welke delen van de dataset worden benadrukt.
   3. Exporteer als gegevens door met de rechtermuisknop op het venster met de spectra te klikken. Klik op de optie Gegevens exporteren naar klembord . De gegevens worden tijdelijk opgeslagen. Plak deze gegevens in het gewenste softwaredocument (bijv. Excel) en sla op.
   4. Meerdere kinetische sporen kunnen op dezelfde manier worden weergegeven in het kinetische venster als in het spectravenster. Sleep de verticale cursor (in de heatmap, linksboven) naar een gewenste golflengte. Druk op Ctrl + X om de tijdtracering te selecteren en op te slaan in het kinetische venster (rechtsboven). Voeg zoveel tijdstippen toe als gewenst. Hierdoor wordt het huidige kinetische spoor tijdelijk in het venster opgeslagen.
   5. Exporteer als gegevens door met de rechtermuisknop te klikken op het venster met de kinetische sporen. Klik op de optie Gegevens exporteren naar klembord . De gegevens worden tijdelijk opgeslagen. Plak deze gegevens in het gewenste softwaredocument (bijv. Excel) en sla op.
2. Gegevens extraheren uit een enkele golflengtefitting voor weergave
   1. Klik op het menu Kinetics en klik vervolgens op Fit Kinetic om het venster met de aangepaste gegevens te openen.
   2. Klik met de rechtermuisknop op het pasvenster (d.w.z. de centrale tegel in het enkele pasvenster). Klik op Gegevens exporteren naar klembord. Hierdoor wordt het tijdelijk opgeslagen, zodat het in een ander softwareprogramma kan worden geplakt.
      OPMERKING: De resterende plot onder de fit-gegevens kan niet worden geëxporteerd en moet in plaats daarvan opnieuw worden gemaakt op basis van de fit-gegevens. De fit exporteert zowel de ruwe gegevens als de fit-lijn, die vervolgens kan worden gebruikt om het residu opnieuw te maken. Het residu wordt gemaakt door de fit-waarde op elk tijdstip van de gegevens af te trekken en een plot te maken die vergelijkbaar is met wat wordt weergegeven in het venster "Fit Kinetics".
   3. Plak deze gegevens in het gewenste softwaredocument (bijv. Excel) en sla op.
      OPMERKING: Exporteren naar het klembord bevat alleen de onbewerkte gegevens en de fit-lijngegevens voor elke exponentiële waarde die in de fit wordt gebruikt. De parameters van de pasvorm, zoals de levensduur, amplitudes en dergelijke, worden niet opgenomen en moeten worden geëxporteerd door de waarden uit de aanpassoftware te kopiëren.
3. Gegevens extraheren uit globale levensduuranalyse voor weergave en analyse
   1. Klik op het Surface-menu en klik vervolgens op de optie Global Fit om het venster met de aangepaste gegevens te openen.
   2. De precisie voor de waarden van zowel de optische dichtheids- als de tijdvertragings-/golflengte-assen moet worden aangepast voor respectievelijk de hoofdcomponenten (tegel rechtsboven) en DADS (tegel linksonder). Plaats de muis op het venster van de hoofdcomponent totdat het instellingenvak rechtsonder verschijnt.
   3. Klik snel op de x.xx-knop , beweeg de muis over "Precisie" en klik op 6 in het menu om het aantal decimalen in te stellen.
   4. Plaats de muis op het venster van de hoofdcomponent totdat het instellingenvak rechtsonder verschijnt. Klik snel op de y.yy-knop , beweeg de muis over "Precisie" en klik op 6 in het menu om het aantal decimalen in te stellen.
   5. Klik met de rechtermuisknop op het venster Principal Kinetic Traces . Klik op Gegevens exporteren naar klembord. Hierdoor wordt het tijdelijk opgeslagen, zodat het in een ander softwareprogramma kan worden geplakt.
   6. Plak deze gegevens in het gewenste softwaredocument (bijv. Excel) en sla op.
      OPMERKING: De gegevens worden opgeslagen als een reeks kolommen met eerst de tijdvertragingen, vervolgens de belangrijkste kinetische sporen gevolgd door de fit-lijn. Er zal één set zijn voor elke hoofdcomponent die is geselecteerd bij de voorbereiding op een globale analyse. De DADS-spectra zijn al opgeslagen in het kader van de montageprocedure in stap 2.4.7.

Results

De bereiding en analyse van een monster van 1,4-bis[2-(5-fenyloxazolyl)]benzeen, POPOP in ethanol werd uitgevoerd volgens de hierboven beschreven procedure. De metingen werden uitgevoerd met behulp van een ultrasnelle transiënte absorptiespectrometer, zoals beschreven in figuur 1, met vloeibare oplossingen in cuvetten van 2 mm met behulp van een verstelbare cuvethouder en een magnetische roerder om menging te garanderen. De monsters werden gemeten in omgevingsomstandigheden zonder extra controles voor temperatuur of atmosfeer. Het optische venster van 340 nm tot 680 nm werd gegenereerd met behulp van een calciumfluoridekristal. Tweehonderdvijftig (250) tijdstippen werden verzameld tussen −5 ps en ~5500 ps, en er werd gemiddeld drie scans genomen om de uiteindelijke dataset te genereren, Figuur 3. De POPOP-gegevens zijn opgesteld zoals beschreven in het protocol. Een voorbeeld van suboptimale chirp-correctie wordt weergegeven in aanvullende figuur 16. Kinetische aanpassing met één golflengte werd uitgevoerd op POPOP, waarbij 632 nm werd geselecteerd als de golflengte van belang. Daarnaast werd een globale analyse uitgevoerd op POPOP zoals beschreven in het protocol.

De kinetische aanpassing van POPOP met één golflengte bij 632 nm produceerde twee levens. Deze levens mochten variëren en er werden geen verdere aanpassingen gedaan. De uiteindelijke verkregen parameters waren als volgt: t0 = −0,1176 ps, IRF = 0,436 ps, A1 = 0,0956, t1 = 1,614 ps, A2 = 0,0646, t2 = 522,2 ps (figuur 4). Deze resultaten zijn goed in overeenstemming met de vervolgens uitgevoerde globale analyse en de gerapporteerde emissielevensduurwaarden voor POPOP (τ = 1,35 ns)¹⁷. Een voorbeeld van een aanpassing met één golflengte met te weinig componenten met een levensduur wordt getoond en besproken in aanvullende figuur 16.

Globale analyse-aanpassing op POPOP werd uitgevoerd na het selecteren van 15 hoofdcomponenten (pc's) bij het uitvoeren van SVD. Na montage werden twee levens geselecteerd, er werden geen parameters vastgesteld. De uiteindelijke parameters die uit de fitting werden verkregen, waren als volgt: t0 = −0,1586 ps, tp (IRF) = 0,4408 ps, t1 = 1459 ps, t2 = 267,5 ps. De verval-geassocieerde verschilspectra zijn weergegeven in figuur 5. De resultaten kwamen goed overeen met die van enkelvoudige kinetische fitting bij 632 nm en de levensduurwaarden voor POPOP¹⁷. Twee voorbeelden van suboptimale globale analyse worden getoond en besproken in aanvullende figuur 16.

Figuur 1: Schematische weergave van het femtoseconde breedband transiënte absorptie-instrument dat in dit protocol wordt beschreven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Simulatie van TAS-gegevens en bijdragen aan het TAS-signaal. (A) Gaussiaanse curven die een absorptiespectrum in de grondtoestand simuleren (blauwe stippellijn) en een spectrum van geëxciteerde toestand (rode stippellijn, rood verschoven ten opzichte van het spectrum van de grondtoestand). De verschilspectra van deze twee spectra (paarse, ononderbroken lijn) is het verschilspectrum zoals bekeken in TA. De verschillen tussen de grond- en geëxciteerde spectra zijn ter illustratie overdreven. (B) Een representatief TA-verschilspectrum van POPOP bij 1,04 ps na excitatie bij 330 nm. De stippellijnen tonen de absorptie in de grondtoestand en de steady-state emissie van POPOP. Gemarkeerde regio's tonen gemeenschappelijke TA-kenmerken, bleekmiddel in de grondtoestand (GSB), gestimuleerde emissie (SE) en excitatie-toestandsabsorptie (ESA) die in deze gegevens worden waargenomen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Voorbereide gegevens voor POPOP die het resultaat zijn van de toepassing van stap 1 - Voorbereiding van gegevens. De gegevens worden weergegeven als de gecorrigeerde heatmap en representatieve spectra. Deze resultaten laten zien hoe de gegevens eruit moeten zien nadat de correcties zijn toegepast en men klaar is om een fit op de dataset toe te passen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Resultaten van de aanpassing met één golflengte van POPOP bij 632 nm na toepassing van stap 2.3 - Aanpassing met één golflengte. De figuur toont (bovenste sectie) de verkregen levensduur in tabelvorm, (middelste sectie) de gegevens (blauwe stippen) en de fit met de gegevens (rode fit-lijn), en (onderste sectie) de resterende plot. Merk op dat in het gedeelte "huidige pasvorm" de amplitudes (A) worden weergegeven als de ΔA-waarden uit de gegevens die de bijdrage van die specifieke levensduurcomponent op t0 vertegenwoordigen. Wanneer de huidige pasvorm echter wordt opgeslagen en wordt weergegeven in de tabel "Pasvormcoëfficiënten", is de standaardinstelling om de genormaliseerde amplitudes weer te geven. Deze instelling kan worden gewijzigd door het vinkje uit het vakje naast het label "Pasvormcoëfficiënten" "Genormaliseerd" uit te vinken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Resultaten van de globale analyse van de aanpassing van de POPOP verkregen na stap 2.4 van de aanpassing. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Voorbeeld van gestimuleerde Raman-verstrooiing waargenomen in experimentele TA-gegevens. In deze dataset (niet de POPOP-gegevens die in de zelfstudie worden getoond) werd het monster geëxciteerd bij 550 nm (aangegeven door de stippellijn). Raman-verstrooiing wordt gezien rond tijd nul en verschijnt over het algemeen zowel op het blauwe (anti-Stokes Raman-verstrooiing) als op het rood (Stokes Raman-verstrooiing) van de golflengte van pompexcitatie. Gestimuleerde Raman-verstrooiing is van korte duur, meestal slechts rond ~ 200 fs, omdat het optreedt als gevolg van de interactie van de sondestraal met het monster op hetzelfde moment als de pompstraal, waardoor het Raman-proces wordt gestimuleerd. De functie kan echter niet worden vermeden en moet worden verwijderd door bij te snijden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende afbeelding 1: Hoofdmenu wanneer de gegevens voor het eerst worden geladen. Over het algemeen zijn er in deze aanpassingssoftware optievakken die in de rechterbenedenhoek van een venster verschijnen wanneer er met de muis over het venster wordt gereden. Met deze vakken kunt u de cursorinteractie met het venster wijzigen, door selecties te verplaatsen, in te zoomen of de geselecteerde vensters te pannen. Er zijn ook opties om de precisie van zowel de x-as als de y-as schalen voor het venster aan te passen en om de weergave om te schakelen van lineair naar logaritmisch. De assen kunnen ook worden vergrendeld of ontgrendeld. Als een as is vergrendeld, blijft deze op het opgegeven zoomniveau of -bereik. Wanneer ontgrendeld, schakelt het bereik over om de volledige set gegevens te bevatten. Andere opties maken het mogelijk om de weergave van getallen en de kleuring van rasters aan te passen, indien aanwezig. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende afbeelding 2: Oppervlaktemenu voor het aftrekken van strooilicht. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende afbeelding 3: Verstrooid lichtscherm aftrekken - de spectra instellen op gemiddelde. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende afbeelding 4: Bijsnijdbereik instellen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 5: Dataset bijsnijden. Bijgesneden gegevens worden permanent verwijderd. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende afbeelding 6: Pas het oplosmiddelresponsvenster en het voorbeeld van de aanpassing van de oplosmiddelrespons (in de rode lijn) aan op de gegevens (blauwe stippen). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende afbeelding 7: Chirp-correctievenster met "lege" voorbeeldgegevens. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 8: Chirp-correctie samen met de dataset. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende afbeelding 9: Enkelvoudig Kinetic Fit-venster. Bovendien kan de gebruiker met een schuifregelaar bovenaan de golflengte selecteren waarop de pasvorm moet worden uitgevoerd. Het selecteren van een geschikte golflengte vereist kennis van de spectroscopie van het systeem om te identificeren waar interessante processen plaatsvinden. Voorbeelden hiervan zijn ladingsoverdrachtsproducten, tripletvorming of fotoproductvorming, waarvan bekend is dat de spectrale kenmerken correleren met specifieke golflengten. Deze specifieke golflengten kunnen worden aangepast om de levensduur van die specifieke gebeurtenissen te verkrijgen. Bovendien kan een selectie van golflengten worden gebruikt om validatie te bieden aan een geselecteerd globaal fit-model. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende afbeelding 10: Instellen van Single Kinetic Fit-parameters. Individuele pasvormparameters kunnen desgewenst met de hand worden vastgelegd of gewijzigd om de pasvorm te verfijnen en de standaarddeviatie van het residu te minimaliseren. Opmerking: Parameters kunnen eenvoudig worden aangepast door op de waarde in het vak te klikken en vervolgens aan te passen met behulp van een schuifregelaar of door handmatig een waarde in te typen. De weergegeven fitting wordt in real-time aangepast als de waarden worden gewijzigd. Wanneer een acceptabele pasvorm is bereikt, kan de pasvorm worden geëxporteerd door met de rechtermuisknop op het pasvormscherm te klikken, waardoor de gegevens naar het klembord kunnen worden geëxporteerd om in een gewenst programma te worden geplakt of als een afbeelding voor snelle weergave. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende afbeelding 11: Het beperken en fixeren van waarden van Single Kinetic Fit-parameters kan worden gedaan als een of meer parameters bekend zijn. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende afbeelding 12: Enkelvoudige waarde-ontledingsvenster met hoofdcomponenten die laat zien hoe het spoor en de componenten eruit zullen zien als er voldoende hoofdcomponenten zijn toegevoegd. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende afbeelding 13: Globaal Fit-venster voordat globale analyse-fit wordt gegenereerd. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 14: Global Fit-venster met de resultaten van de globale analyse. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende afbeelding 15: Bestandsmenu voor het opslaan en exporteren van bestanden. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende afbeelding 16: Voorbeelden van suboptimale chirp-correctie en -aanpassing. (A) vertoont een slechte enkelvoudige kinetische pasvorm. Het type gestructureerd residu dat in paneel A wordt weergegeven, geeft meestal aan dat er een extra levensduur nodig is om de gegevens te passen. Merk op dat het residu bij kortere tijden onder nul daalt en bij langere levensduur boven de nullijn wordt getild. (B) demonstreert een correcte chirp-correctie met behulp van de voorbeeldknop, waarbij kenmerken worden rechtgetrokken en er geen kromming in de gegevens aanwezig is. (C) toont een onjuiste chirp-correctie aan waarbij er een merkbare kromming aanwezig is in het blauwe deel van het spectrum, wat aangeeft dat de chirp-functie in dit gebied overcorrigeert. (D) vertoont een slechte globale levensduuranalyse waarin overfitting (inclusief te veel parameters) heeft geresulteerd in "symmetrische" DADS (die eruitzien als spiegelbeelden van elkaar over de x-as) met vergelijkbare levensduurbereiken die elkaar in wezen opheffen. Wanneer deze kenmerken worden waargenomen, mag de pasvorm niet worden gebruikt. (E) vertoont een slechte globale fit waarbij te veel parameters hebben geresulteerd in een zeer korte levensduur met een zeer grote amplitude. Het probleem dat aanwezig is in (E) kan zich ook voordoen als artefacten rond tijd nul niet goed worden gecorrigeerd en de aanpassing gericht wordt op het minimaliseren van het residu door te veel nadruk te leggen op de zeer korte levensduur (een levensduur die fysiek niet betekenisvol is). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 17: Voorbeeld van TAS-gegevens met Raman-verstrooiing. Verstrooiing is aanwezig rond tijd nul en valt samen met de excitatiegolflengte van de pomp. Verstrooiing bestaat uit een reeks scherpe pieken met een zeer intens positief piekblauw van de pompexcitatie en een negatief piekrood van de pompexcitatie. Deze functie kan redelijkerwijs niet worden voorkomen en moet uit de gegevens worden bijgesneden om te voorkomen dat de passende resultaten worden verstoord. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 1: Bestand dat de gegevensset voor deze zelfstudie bevat (POPOP data_POPOP-inEtOH.ufs). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: Bestand met een lege gegevensset voor deze zelfstudie (POPOP data_BLANK.ufs). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend dossier 3: Ondersteunende informatiebestanden met aanvullende opmerkingen over het aanpassen van de oplosmiddelrespons, het corrigeren voor scatting en het aftrekken van oppervlakken. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Algemene overwegingen bij het voorbereiden van gegevens
Het aanpassen van TA-gegevens lijkt op het eerste gezicht relatief eenvoudig, en het zou kunnen worden verwacht dat er één duidelijk correct "antwoord" zou moeten resulteren voor een bepaalde dataset. Zoals in het protocol wordt benadrukt, zijn er echter veel factoren bij het verzamelen van gegevens, het voorbereiden van gegevens en het analyseren van gegevens die zorgvuldig moeten worden overwogen en die kunnen leiden tot onzekerheid over welk model of welke reeks passende parameters de gegevens het beste beschrijft. Het doel van het voorbereiden en aanpassen van gegevens is om zoveel mogelijk van deze externe factoren te verminderen, terwijl de gegevens behouden blijven voor analyse. De taak die voor een beginner ligt, lijkt misschien ontmoedigend, omdat er veel te overwegen valt. Om intuïtie op te bouwen over het aanpasproces, wordt de beginner aangemoedigd om te proberen dezelfde gegevens meerdere keren op iets verschillende manieren voor te bereiden om te controleren hoe dramatisch de stappen voor het voorbereiden van gegevens van invloed zijn op de beste pasvorm. Bovendien kunnen twee verschillende onderzoekers dezelfde gegevens voorbereiden en passen en de resultaten vergelijken. Dit proces kan de eerste paar keer tijdrovend zijn, maar als u dit doet, kan de beginner intuïtie ontwikkelen over hoe gegevens consequent kunnen worden voorbereid voor toekomstige monsters. Zoals elke vaardigheid, zal het tijd kosten om deze gegevensvoorbereiding en aanpassing te ontwikkelen, en de beginner wordt aangemoedigd om geduldig en gedisciplineerd te zijn bij het experimenteren met en leren van het proces. De dataset die in dit onderzoek wordt gebruikt, is bedoeld om de beginner de kans te geven om direct naast de tutorial te passen en om de resultaten direct te vergelijken met die in de tutorial.

De gegevens kunnen achtergrondkenmerken bevatten die bij alle vertragingen aanwezig zijn (aanvullende figuur 2 en aanvullende figuur 3), zoals verstrooiing van de pompstraal en spontane emissie van het monster. Deze ongewenste kenmerken moeten worden verwijderd om het voorbijgaande absorptiesignaal van de betrokken soort te isoleren¹¹. Het verwijderen van dergelijke kenmerken wordt gedaan door het kiezen, middelen en verwijderen van de bijdrage van een aantal spectra met een negatief tijdsverschil. Bij het selecteren van achtergrondspectra is het belangrijk om ervoor te zorgen dat er geen kenmerken worden opgenomen die deel kunnen uitmaken van het proces dat van belang is, voor verwijdering. Achtergrondkenmerken die door het oplosmiddel worden veroorzaakt, zoals absorptie door onzuiverheden of het oplosmiddel zelf, kunnen ook worden waargenomen in TA-gegevens. Wanneer het oplosmiddel een signaal produceert, moet een "lege" dataset met alleen het oplosmiddel dat onder exact dezelfde experimentele omstandigheden als het monster is uitgevoerd, worden afgetrokken van de monsterdataset. Details over deze procedure zijn opgenomen in aanvullend dossier 3.

De chirp-correctie is een andere factor om zorgvuldig te overwegen. Chirp treedt op wanneer de sondepuls naar het monster gaat en breder wordt als gevolg van onvolkomenheden in stuurspiegels of door het passeren van dispersieve optica zoals lenzen of filters. Het eindresultaat is dat fotonen met een lagere energie in de sondepuls (d.w.z. de rode kant van het sondespectrum) eerder bij het monster aankomen dan fotonen met een hogere energie (d.w.z. de blauwe kant van het sondespectrum). Dit heeft tot gevolg dat de "tijdnul" van de TA-spectra wordt uitgesmeerd over enkele femtoseconden of picoseconden¹⁸, wat zich manifesteert als een duidelijke curve in de ruwe dataset die begint in de blauwe golflengten en vervolgens afvlakt naarmate deze het rood nadert (aanvullende figuur 7). Chirp is het meest merkbaar op kortere tijdschalen, zoals die toegankelijk zijn voor ultrasnelle TA. Deze golflengte-afhankelijke tijd nul kan worden gecorrigeerd zoals beschreven in het protocol, maar de toepassing van dit proces kan lastig en subjectief zijn. Het hebben van een "blanco" monster of meting van de Kerr-respons van het oplosmiddel kan de subjectieve aard van handpickpunten voor de chirp-correctie minimaliseren die nodig is om de polynoompasvorm te genereren die wordt gebruikt om de chirp aan te passen en te corrigeren. Het doel van de chirp-correctie is om de duidelijke "curve" van de tijd nul te verwijderen. Het kan meerdere pogingen vergen om de chirp aan te passen om de beste chirp-gecorrigeerde gegevens te verkrijgen. De gegevens kunnen meerdere keren worden aangepast met verschillende chirp-correcties om inzicht te krijgen in de impact die de chirp-correctie heeft op de waarden van de korte TA-levensduur.

Artefacten die op "tijd nul" verschijnen
Verschillende artefacten kunnen worden waargenomen in de buurt van "tijd nul" in TA-gegevens, waaronder Rayleigh-verstrooiing, gestimuleerde Raman-verstrooiing en cross-fasemodulatie. Rayleigh-verstrooiing van de pompstraal is elastische verstrooiing die optreedt zonder een verandering in energie. Deze functie verschijnt op dezelfde golflengte als de pomppuls. Gestimuleerde Raman-verstrooiing kan gepaard gaan met het pompverstrooiingssignaal¹⁹. Raman-verstrooiing, die het gevolg is van inelastische verstrooiing van een pompfoton, produceert pieken bij zowel hogere (anti-Stokes) als lagere (Stokes) energie dan de invallende pompenergie. In TA-gegevens wordt gestimuleerde Raman-verstrooiing waargenomen als gevolg van de gelijktijdige bestraling van het monster met de pomp- en sondebundels. Wanneer de sondestraal tegelijkertijd met de pompstraal in wisselwerking staat met het monster, stimuleert dit het Raman-proces. Daarom vindt de gestimuleerde Raman-verstrooiing plaats rond tijd nul en resulteert in extra pieken in spectra binnen de eerste paar honderd femtoseconden (Figuur 6, waargenomen in het donkerdere blauwe spectrum in het gemarkeerde gebied en aanvullende figuur 17). Cross-fasemodulatie is het gevolg van modulatie van de brekingsindex van het oplosmiddel door interactie met het intense elektrische veld van een puls.

Gestimuleerde Raman-verstrooiing kan worden onderscheiden van cross-fasemodulatie omdat de Raman-pieken verschijnen bij specifieke frequenties die overeenkomen met trillingsmodi van het oplosmiddel. Omdat het een Raman-proces is, kunnen zowel Stokes- als anti-Stokes-lijnen aan weerszijden van de excitatie worden waargenomen. Gechloreerde oplosmiddelen zoals methyleenchloride vertonen zeer prominente Raman-banden vanwege de grote polariseerbaarheid van chloor. De spectrale signaturen van kruisfasemodulatie zijn uniek voor een oplosmiddel, maar zijn niet zo gemakkelijk te voorspellen als Raman-verstrooiingskenmerken.

Afhankelijk van de kinetiek van het monster dat wordt gemeten, kunnen Rayleigh-verstrooiing, Raman-verstrooiing en cross-fasemodulatie overlappen met vroege kenmerken van de TA-gegevens en kan het een uitdaging zijn om uit de gegevens te verwijderen. In principe zijn deze kenmerken te zien in een nette oplosmiddelmeting en afgetrokken van de gegevens, kunnen data-analyseprogramma's passende functies hebben om rekening te houden met deze kenmerken, maar in de praktijk kan dit moeilijk zijn. Wanneer het te moeilijk is om deze artefacten af te trekken zonder de steekproefgegevens in gevaar te brengen, is het misschien beter om de gecompromitteerde spectra rond tijd nul uit te snijden om de artefacten te elimineren. Als u dit doet, heeft dit het ongelukkige neveneffect dat de eerste ongeveer 300 fs aan gegevens worden verwijderd, maar dat de montage later betrouwbaarder wordt. In de loop van het analyseren van meerdere datasets van dezelfde en verschillende monsters, zal de beginner intuïtie krijgen bij het bereiken van deze balans tussen het aftrekken van het achtergrondoppervlak versus het uitsnijden van de eerste 100-200 fs-gegevens.

Algemene bijsnijding kan nodig zijn voor delen van de spectra die een lage signaal/ruis bevatten. Instabiliteit in de sondestraal in bepaalde regio's, lage intensiteit van sondelicht, te hoge monsterconcentraties (waardoor een groot deel van de invallende sonde wordt geblokkeerd), lage pompintensiteit en de absorptiedoorsnede van het monster zijn typische boosdoeners van lage signaal-ruisverhouding die het passen van gegevens een uitdaging kunnen maken. In deze gevallen kan het bijsnijden van de dataset aan weerszijden van het optische venster om een gewenst niveau van signaal-ruisverhouding te bereiken, het aanpassingsproces helpen.

Een dataset is klaar voor analyse zodra deze voldoende is bijgesneden om slechte delen van de dataset te verwijderen, de chirp is gecorrigeerd en achtergrondspectra zijn gemiddeld en afgetrokken. Deze procedure moet resulteren in gegevens die alleen die delen bevatten die het meest relevant zijn voor de fotofysica en fotochemie van belang. Het is inderdaad duidelijk dat er een zekere mate van subjectiviteit in dit proces zit. Het doel bij het voorbereiden van gegevens is om een balans te vinden tussen het verwijderen van artefacten, zodat ze de aanpassing niet verstoren, maar niet om zoveel te verwijderen dat het de integriteit van de gegevensset in gevaar brengt, waardoor de interpretatie ervan wordt belemmerd. Het vinden van deze balans kost tijd en ervaring om de intuïtie op te bouwen voor wat een artefact is en wat data is. Het passen (en opnieuw aanpassen) van dezelfde set gegevens op meerdere verschillende dagen, of het laten passen van twee onderzoekers in dezelfde gegevens, kan een manier zijn om menselijke fouten en de subjectiviteit van gegevensvoorbereiding en -analyse te minimaliseren.

Algemene overwegingen voor montage en interpretatie
Nadat de ruwe TA-spectra zijn verwerkt, moeten ze worden geïnterpreteerd en gemodelleerd om informatie te extraheren over de soorten en de dynamiek die aanwezig is in het systeem van belang. Dit proces kan worden omschreven als een procedure in drie stappen die de initiële spectrale interpretatie, kwantitatieve modellering/aanpassing en toewijzing van de spectrale interpretatie aan het model/de aanpassing omvat.

Initiële spectrale interpretatie: In de spectrale interpretatiestap is het doel om kenmerken die aanwezig zijn in de TA-spectra toe te wijzen aan elektronische toestanden die toegankelijk zijn in de fotofysische of fotochemische evolutie van het systeem. Om te beginnen moeten verschillende staten worden geïdentificeerd. In dit werk verwijzen toestanden naar unieke elektronische toestanden die deel uitmaken van de fotofysische of fotochemische evolutie van het systeem. Een toestand, bijvoorbeeld vertegenwoordigd door één specifieke potentiële energiecurve (PEC), bezit een reeks karakteristieke pieken die het absorptiespectrum vertegenwoordigen. Een verandering die plaatsvindt binnen een enkele toestand wordt een proces genoemd. Een fotofysisch proces kan in TA-spectra verschijnen als een piekverschuiving of een verandering in de breedte van het spectrum. Het belangrijkste aspect van een proces is dat de bevolking van de staat hetzelfde blijft (d.w.z. het proces vindt plaats binnen een bepaalde PEC); Het is de verdeling van energie binnen de staat die verandert. Een verandering in de bevolking van een staat wordt een overgang genoemd. Tijdens een overgang evolueert het systeem naar een andere PEC (d.w.z. elektronische toestand). Transities kunnen bestaan uit interne conversie (IC), intersystem crossing (ISC), ladingsoverdracht, energieoverdracht, vorming van nieuwe producten of terugkeer naar de grondtoestand. Richtlijnen voor het toewijzen van statussen, processen en overgangen worden in de volgende paragrafen besproken.

Statussen toewijzen
De eerste stap in dit proces is het toewijzen van spectrale kenmerken aan specifieke chemische soorten of toestanden. De S_1-toestand in TA moet een levensduur laten zien die overeenkomt met de fluorescentielevensduur die is afgelegd met behulp van tijdopgeloste emissiespectroscopie. Een triplettoestand kan worden geverifieerd als de levensduur wordt gedoofd door zuurstof. Als een radicaal anion of kation wordt vermoed in de fotofysische evolutie, kan spectro-elektrochemie of chemische oxidatie/reductie worden uitgevoerd om de radicale soort te genereren, en kan een absorptiespectrum van die soort worden verkregen en vergeleken met de TA-bandvorm. Elektronenspinresonantie (ESR)-spectroscopie kan worden uitgevoerd om de aanwezigheid van vrije radicalen te verifiëren. Een uitstekende zelfstudielezing, georganiseerd door de ACS-afdeling Anorganische Chemie, geeft een overzicht van TA en dergelijke overwegingen bij het toewijzen van functies²⁰. Nadat banden aan soorten zijn toegewezen, is de volgende stap in het interpreteren van TA-spectra het kwalitatief beschrijven van de dynamische processen die in het systeem plaatsvinden. Deze stap is van vitaal belang omdat het de onderzoeker een idee geeft van welke modellen geschikt zijn om hun systeem te beschrijven en hen een basislijn geeft om de fitparameters mee te vergelijken.

Wijzigingen binnen een staat
Trillingskoeling, geometrische herschikking of solvatie zijn extreem snelle processen (sub-ps tot 10's ps) die met TA kunnen worden waargenomen. Trillingskoeling wordt waargenomen als een snelle blauwe verschuiving van het TA-spectrum op een tijdschaal van enkele picoseconden 21,22,23. Geometrische herschikking kan plaatsvinden op de tijdschaal van 10 ps. Solvatiedynamiek wordt waargenomen als een roodverschuiving en vernauwing van het spectrum gedurende enkele picoseconden in conventionele dipolaire vloeistoffen, maar oplosmiddelen met een hoge viscositeit zoals glycerol, polyethyleenglycol (PEG), ionische vloeistoffen en diepe eutectische oplosmiddelen kunnen een solvatiedynamiek vertonen die optreedt in de loop van meerdere nanoseconden 24,25,26.

Veranderingen in een staatspopulatie
Reacties worden gekenmerkt door een verandering in de intensiteit van een band, waarbij een afname van de intensiteit gepaard gaat met een afname van de concentratie van de chemische soorten en vice versa voor een toename. In sommige gevallen zijn zowel de reactant als de productsoort zichtbaar in de spectra, terwijl in andere gevallen de producttoestanden te kortstondig zijn of te ver roodverschoven om te kunnen worden waargenomen. Vaak kunnen toestand-tot-toestandsovergangen worden waargenomen door de aanwezigheid van een isosbestisch punt in de spectra.

Kwantitatief modelleren/aanpassen: Een model moet dan worden aangepast aan de gegevens om kwantitatieve informatie over de dynamiek van het systeem te extraheren. Zoals eerder beschreven in de inleiding, is er een breed scala aan modellen om te gebruiken. Dit protocol richt zich op twee van de meest voorkomende methoden: aanpassing met één golflengte en globale analyse. De methode met één golflengte omvat het passen van individuele golflengtesporen van de spectra in een functionele vorm, meestal een som van exponentiële getallen:

(2)

waarin ΔA(t) het TA-signaal op een gekozen golflengte is, n het aantal exponentiële componenten, en a_ide amplitude van de exponentiële component, i, met tijdconstante τ_i. Er kunnen verschillende componenten worden toegevoegd totdat de pasvorm de experimentele gegevens reproduceert. Het doel van elk aanpassingsproces is om de gegevens te modelleren met voldoende levensduur om de gegevens goed te reproduceren, maar niet om de gegevens te overbelasten door te veel componenten op te nemen. Daarom worden gewogen goodness-of-fit-parameters zoals , gebruikt om te helpen bepalen wanneer de gegevens geschikt zijn binnen experimentele onzekerheden⁵.

Nadat het verval naar tevredenheid is aangebracht, kunnen de parameters van het model worden gebruikt om de dynamiek van het systeem te karakteriseren. De resulterende tijdconstanten kunnen vervolgens worden geëxtraheerd en geïnterpreteerd. Helaas betekent het grote aantal overlappende kenmerken in TA-spectra dat een enkele golflengte in het spectrum dynamiek kan bevatten die overeenkomt met verschillende soorten waarvan de spectrale handtekeningen elkaar overlappen, wat betekent dat de tijdconstanten die uit een enkele golflengte worden geëxtraheerd, een composiet van meerdere samenvallende processen kunnen vertegenwoordigen. Bovendien zullen eventuele veranderingen in bandvorm en positie ook van invloed zijn op de amplitudes en tijdconstanten die worden geëxtraheerd uit montage met één golflengte. Deze problemen kunnen in sommige gevallen worden omzeild door een passende methode die 'bandvormanalyse' wordt genoemd, waarbij men een functionele vorm bepaalt of aanneemt voor de TA-banden van elke absorberende soort in het systeem. Deze vormen worden vervolgens gewogen door tijdsafhankelijke amplitudes en bij elkaar opgeteld om het waargenomen spectrum te reproduceren. Deze procedure wordt gewoonlijk gebruikt bij de analyse van in de tijd opgeloste fluorescentiespectra, maar de meer gecompliceerde vormen en overlappende componenten van TA-banden maken deze methode in slechts enkele eenvoudige gevallen houdbaar, zoals elders beschreven¹⁰.

Een ander nadeel van aanpassing met één golflengte is dat het niet intrinsiek profiteert van het brede spectrale bereik dat wordt geboden door moderne TA-experimenten. Men zou in principe elke afzonderlijke golflengte van de spectra methodisch kunnen passen, maar een dergelijke analyse is omslachtig, tijdrovend en rekenkundig duur. Om deze uitdaging het hoofd te bieden, kan een methode genaamd 'globale analyse' worden gebruikt om tegelijkertijd een hele set TA-spectra in te passen in een set gedeelde dynamische parameters⁴. Globale analyse, en een nauw verwante methode die doelanalyse wordt genoemd, zijn succesvolle en veelgebruikte methoden, maar ze hebben ook hun eigen unieke reeks nadelen en beperkingen. Zoals bij elk model, is het absoluut noodzakelijk om de aannames te begrijpen die worden gebruikt om het te maken, evenals de beperkingen die ze met zich meebrengen.

In globale analyse worden TA-spectra weergegeven door een matrix van m bij n, waarbij m staat voor het aantal golflengten dat in elk spectrum wordt gemeten en n voor het aantal verzamelde tijdstippen. Deze matrix wordt dan verondersteld ontleedbaar te zijn in het product van twee andere matrices:

(3)

waarin C(t) een n bij k matrix is en S(λ) een m bij k matrix. De waarde k vertegenwoordigt het aantal afzonderlijke spectrale componenten dat wordt gebruikt om de spectra te reproduceren. Elk van deze componenten vertegenwoordigt een absorberende soort met een unieke spectrale signatuur en dynamiek. De S(λ)-matrix vertegenwoordigt de TA-spectra van de k-componenten en C(t) hun tijdsafhankelijke concentraties. In de eenvoudigste en meest voorkomende implementatie van globale analyse wordt aangenomen dat elke component een enkelvoudige exponentiële kinetiek heeft (i = 1 in vergelijking 2, waarbij elke component zijn eigen tijdconstante krijgt toegewezen). Samengevat kan het volledige TA-spectrum worden weergegeven door de som van k-spectracomponenten, elk met zijn eigen karakteristieke absorptiespectrum en enkelvoudig exponentieel verval.

Wanneer de TA-spectra geschikt zijn, raadt de gebruiker hoeveel componenten (d.w.z. een waarde voor k) nodig zijn en maakt een schatting van de tijdconstante die gepaard gaat met een enkelvoudig exponentieel verval van die soorten. De fitter genereert dan C_guess(t) en lost vergelijking 3 voor S_fit(t) op. Vervolgens worden S_fit(λ) en C_guess(t) vermenigvuldigd zoals in vergelijking 3 om de gefitte spectra te creëren, ΔA(λ,t)_fit. Ten slotte worden de residuen, ΔA(λ,t)_exp − A(λ,t)_fit, geminimaliseerd en worden de optimale S_fit(λ) en tijdconstanten geretourneerd. De relatieve eenvoud van globale analyse, die een hele reeks spectra vertegenwoordigt met behulp van een handvol tijdconstanten en vaste spectrale componenten, maakt het een aantrekkelijke (en succesvolle) methode voor het ontwarren van de gecompliceerde bandvormen en dynamica die worden aangetroffen in TA-spectroscopie. Er moet echter voor worden gezorgd dat globale analyse een geschikt model is voor het onderhavige systeem.

Een belangrijke aanname in de globale analyse, geïllustreerd in vergelijking 3, is de volledige scheidbaarheid van de golflengte- en tijdgedeelten van de dynamiek, een eigenschap die 'bilineariteit' wordt genoemd. Deze aanname vereist dat de bandvormen van de componenten tijdonafhankelijk zijn (d.w.z. ze hebben een vaste spectrale vorm die niet varieert of verschuift met de tijd). Het enige dat tijdens het experiment verandert, zijn de relatieve populaties van elke component, weergegeven door C(t). Op lange tijdschalen, ~1 ns of zo, geldt deze veronderstelling meestal en kan globale analyse zonder veel zorgen worden gebruikt. Aan de andere kant resulteren processen in excitatietoestand, zoals trillingskoeling en solvatiedynamiek, prominent aanwezig op de ultrasnelle tijdschalen die toegankelijk zijn via femtoseconde TA, in tijdsafhankelijke veranderingen in de spectrale signatuur van een soort en een afbraak van bilineariteit. Dit betekent niet dat globale analyse een dataset niet kan reproduceren, sterker nog, het kan altijd een bevredigende fit opleveren op voorwaarde dat er voldoende componenten worden gebruikt. Het probleem ligt dan in het interpreteren van de spectra van de componenten en het toewijzen van de tijdconstanten aan bepaalde processen in geëxciteerde toestand, aangezien de componenten mogelijk niet langer overeenkomen met verschillende absorberende soorten. Daarom moet altijd voorzichtig worden omgegaan met het toepassen van globale analyse op situaties waarin bilineariteit niet kan worden verondersteld.

Toewijzing van de spectrale interpretatie aan het model/fitting: Zodra een fit is verkregen, moet de spectrale interpretatie in kaart worden gebracht op de levensduur die in de fit is verkregen. De levensduur van de fit wordt toegewezen aan zowel processen als reacties die werden geïdentificeerd in de eerste interpretatie van de spectra. Het is echter mogelijk dat de eerste beoordeling van de spectra en het aantal gefitte levens dat door het model wordt verkregen, niet onmiddellijk op elkaar worden afgestemd. In deze (veel voorkomende!) situatie moet de monteur teruggaan en de eerste interpretatie beoordelen. Misschien was er sprake van een trillingskoeling of een ander proces dat in de eerste beoordeling werd gemist, maar wel werd geïdentificeerd in het modellerings- en aanpassingsproces. Of misschien kunnen twee verschillende sets fitparameters de gegevens goed reproduceren en kan de eerste interpretatie bepalen welke set fitparameters wordt gekozen. In deze laatste stap moet de monteur heen en weer gaan tussen de interpretatie en de aanpassing om een beschrijving te vinden die leidt tot een plausibele fotofysische toewijzing van de soort en de dynamiek van het systeem. Andere aanpasprogramma's die sequentiële aanpasmodellen omvatten, zoals doelanalyse, kunnen ook worden verkend als aanvulling op de aanpasprogramma's die worden verkregen door globale analyse en de aanpassoftware die in dit artikel^{wordt gepresenteerd 4}.

Samengevat bespreekt dit protocol de voorbereiding en aanpassing van transiënte absorptiegegevens. Het doel is om de uitdagingen in verband met het proces onder de aandacht te brengen en commentaar te geven op manieren om deze uitdagingen op een praktische manier te vermijden of te verminderen. Het aanpassen van TA-gegevens kan, net als het aanpassen van de meeste gegevens die op technische gebieden worden aangetroffen, lastig en soms subjectief zijn. Daarom is het van cruciaal belang om op de hoogte te zijn van het proces en de beperkingen van de gegevens, de gegevensvoorbereiding en de wiskundige hulpmiddelen die worden gebruikt om de gegevens te modelleren en betekenis toe te kennen. Wetenschappers moeten data en modellering met een kritische blik benaderen.

Men kan proberen de subjectiviteit van hun aanvallen te verzachten. De gegevens kunnen bijvoorbeeld vanuit verschillende uitgangspunten en op verschillende dagen worden voorbereid en aangepast om ervoor te zorgen dat dezelfde pasvorm wordt geproduceerd. Gegevens die op verschillende dagen met verschillende monstervoorbereidingen zijn genomen, kunnen worden vergeleken. Meerdere onderzoekers kunnen dezelfde gegevens passen en hun resultaten vergelijken. Na verloop van tijd kunnen onderzoekers een intuïtie opbouwen over de gegevens die ze verkrijgen (op basis van de specifieke kenmerken van hun experimentele opstelling en experimentele parameters) waardoor ze meer vertrouwen kunnen hebben in hun pasvormen.

Er valt veel te leren over het aanpassen van TA-gegevens en de details van de modellen die in dit artikel worden besproken. Er worden verschillende uitstekende overzichtsartikelen enthousiast aanbevolen die diep op dit onderwerp ingaan ^4,10,27. Dit protocol is bedoeld als een beginnersingang tot het analyse- en aanpassingsproces dat de interesse wekt om het proces beter te begrijpen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
EtOH 200% Proof	Decon Laboratories Inc	CAS 64-17-5	Solvent used to prepare Sample
Helios transient absorption spectrometer	Ultrafast systems	https://ultrafast.systems/products/spectrometers-accessories/helios/	Transient absorption spectrometer
POPOP  1,4-Bis[2-(5-phenyloxazolyl)]benzene	Tokyo Chemical Industry	CAS 1806-34-4	Sample used for Examples
Surface Xplorer	Ultrafast systems	https://ultrafast.systems/products/spectrometers-accessories/surface-xplorer/	Fitting program