Statische krachttrainingsmethode voor type 2 diabetische muizen

Summary

Dit protocol biedt een eenvoudige methode om statische trainingsapparatuur voor muizen te maken. Het apparaat handhaaft de isometrische spiercontractie van de ledematen van muizen om het interventie-effect van traditionele lichaamsbeweging op diabetes type 2 (T2DM) te verifiëren en biedt nieuwe oefentherapie voor de klinische behandeling van T2DM.

Abstract

De behandeling van diabetes mellitus type 2 (T2DM) is een grote moeilijkheid bij het verbeteren van de gezondheid van de patiënt. Lichaamsbeweging is een van de belangrijkste interventies voor T2DM. Statische krachttraining is een van de belangrijkste vormen van traditionele sporten in China. Onderzoek toont aan dat statische krachttraining een effectieve klinische methode is voor T2DM-interventie, maar er is geen experimenteel apparaat dat geschikt is voor statische training bij muizen. Een van de moeilijkheden bij de overgang van klinisch naar fundamenteel onderzoek is het ontwerpen van geschikte experimentele apparaten. Om het mechanisme van statische trainingsinterventie bij T2DM verder te bestuderen, wordt in dit artikel een eenvoudige methode geïntroduceerd voor het maken van een statisch trainingsapparaat voor muizen. Dit apparaat heeft de voordelen van eenvoudige bediening, goedkoop materiaal en hoge haalbaarheid. Eerdere studies die onder dit protocol zijn uitgevoerd, hebben aangetoond dat statische training de bloedglucosespiegel effectief kan verlagen en de mitochondriale functie van skeletspiercellen bij T2DM-muizen kan verbeteren. Het doel van de introductie van dit apparaat is om onderzoek naar het mechanisme van traditionele lichaamsbeweging bij de interventie van T2DM te bevorderen en om een basis te leggen voor de kwantitatieve interventie van lichaamsbeweging.

Introduction

Diabetes mellitus type 2 (T2DM) is een chronische ziekte die wordt gekenmerkt door insulineresistentie en β-celdisfunctie die een aanzienlijke bedreiging vormt voor de wereldwijde gezondheid^. Lichaamsbeweging is een cruciale interventie bij de behandeling van diabetes type 2. Talrijke onderzoeken hebben aangetoond dat traditionele Chinese trainingsmethoden, zoals Tai Chi en Ba Duan Jin, de bloedsuikerspiegel en de kwaliteit van leven van personen met T2DM 2,3,4,5 aanzienlijk verbeteren. Om deze bewegingen uit te voeren, moet de trainer gedurende een bepaalde tijd een stabiel lichaam en gewrichtspositie aanhouden. De statische positie wordt ondersteund door statische spiercontracties uit te voeren, die gewoonlijk statische sterkte⁶ worden genoemd.

Het mechanisme van statische krachttrainingsinterventie bij T2DM is echter niet opgehelderd. Om deze vraag te beantwoorden zijn dierproeven essentieel. Tijdens isometrische oefeningen worden de spieren geactiveerd, behouden ze een constante lengte en bereiken ze veilig maximale spanning⁷. Bij experimenten met statische krachttraining is het proefdier nodig om isometrische spiercontracties uit te voeren en deze toestand van spiercontractie te behouden. Het implementeren van statische krachttraining op muizen, ratten en andere proefdieren is een groot probleem geworden in het onderzoek. Ten eerste hebben dieren moeite om commando's te gehoorzamen en hun spieren samen te trekken als dat nodig is. Ten tweede is het moeilijk voor het dier om een stabiele positie onder weerstand te behouden en kan het doel van isometrische spiercontractie niet worden bereikt. Hoewel dieren naar behoefte kunnen trainen, is het belangrijk om zorgen met betrekking tot dierenwelzijn aan te pakken, zoals het verlichten van stress en angst, het minimaliseren van pijn en het verbeteren van de algehele omstandigheden. Dit protocol heeft betrekking op een statisch trainingsmodel voor ratten ^8,9, en hier introduceren we een eenvoudig apparaat voor statische training van muizen. Wanneer de achterpoten van muizen worden opgetild, trekken hun buikspieren samen als gevolg van de oprichtende reflex, de voorpoten grijpen de dwarsbalk aan de voorkant vast en vervolgens trekken de voorste en achterste ledematen samen tegen de zwaartekracht in. De muizen kunnen niet bewegen nadat ze de korte stang hebben vastgepakt, waardoor hun spieren in een staat van isometrische contractie zijn.

Protocol

Alle dierproeven zijn goedgekeurd door de Animal Care and Use Committee van de Nanjing University of Chinese Medicine (toestemmingnr. 202209A033). Er werd gekozen voor gezonde mannelijke C57BL/6J-muizen met SPF-graad, een leeftijd van 8 weken en een lichaamsgewicht van 20 ± 4 g. De muizen werden gehuisvest in een licht/donker-cyclus van 12 uur bij een temperatuur van 20-22 °C en een relatieve vochtigheid van 45%-50% werd gehandhaafd. De dieren eten en drinken vrijelijk.

1. Opstellen van een muismodel van T2DM

1. Voer de muizen eerst 1 week op een regulier dieet en laat de muizen wennen aan de nieuwe omgeving van het dierencentrum. Zorg na 1 week voor een vetrijk dieet (dieetsamenstelling: 20,0% reuzel, 10,0% sucrose, 2,5% cholesterol, 1,0% cholaat, 66,5% conventioneel dieet) gedurende een periode van 4 weken.
2. Injecteer muizen vanaf de 1e^{dag van} de 5e^week intraperitoneaal met streptozotocine-oplossing in een dosis van 35 mg/kg elke dag gedurende 3 opeenvolgende dagen. Bereid 1 ml van de streptozotocine-oplossing met 10 mg streptozotocinepoeder, met 0,1 M/l natriumcitraatbuffer als oplosmiddel.
   OPMERKING: De injectie moet binnen 30 minuten na het bereiden van de oplossing worden voltooid en de oplossing moet tijdens gebruik uit de buurt van licht worden gehouden.
3. Test willekeurig de bloedglucose op dag 5 en dag 7 nadat de eerste injectie met streptozotocine-oplossing is toegediend. Dieren met twee willekeurige bloedsuikerspiegels hoger dan 16,7 mM/L worden beschouwd als succesvolle T2DM-modellen.
4. Begin met trainingsinterventie op dag 8 na de eerste injectie met streptozotocine-oplossing.

2. Groepering en behandeling bij muizen

1. Verdeel de T2DM-muizen in een modelgroep, een trainingsgroep en een metforminegroep met behulp van de methode met willekeurige getallentabel, met 6 muizen in elke groep.
2. Voer geen interventie uit voor de modelgroep.
3. Maal metformine tabletten tot poeder en los op in zuiver water. Geef metformine aan de metforminegroep via een maagsonde in een dosis van 200 mg/kg, eenmaal per dag, gedurende 3 weken.
4. Laat de trainingsgroep 30 minuten statische krachttraining doen, één keer per dag, 5 dagen per week, gedurende 3 weken. Elke maandag- tot en met vrijdagmiddag wordt er getraind.
5. Wijs willekeurig 6 niet-T2DM-muizen toe als controlegroep. Deze muizen ondergaan geen modellering en interventie.

3. Vervaardiging van het statische krachttrainingsapparaat

1. Bereid een 5 mm dikke transparante acrylplaat voor met afmetingen van 20 cm x 20 cm. Gebruik een doorzichtig bord om de training van de muizen te observeren.
2. Pak houten stokjes met een diameter van 3 mm en een rol tape met een breedte van 1 cm. Gebruik een papiersnijder om twee stokjes van 4 cm lang en vier stokjes van 1 cm lang te knippen.
3. Bevestig twee stokjes met elk een lengte van 1 cm met plakband aan de uiteinden van een stok met een lengte van 4 cm (figuur 1A). De korte stokken moeten aan dezelfde kant worden bevestigd als de lange stok.
4. Leg het transparante bord op een vlakke ondergrond en bevestig twee sets van 1 cm korte stokjes aan de plaat met een heet lijmpistool. Zorg ervoor dat de houten stokken van 4 cm niet in contact komen met het bord. Zorg voor een opening van 2 cm tussen de lange stok en het bord om de muizen op hun plaats te houden (Figuur 1B). Laat de twee lange stokken uitgelijnd en evenwijdig zijn, met een afstand van 6 cm ertussen (Figuur 1C).

Afbeelding 1: Monteer de stokken en bevestig ze aan het transparante bord. (A) Plak de stok van 1 cm aan beide uiteinden van de stok van 4 cm. (B) Gebruik smeltlijm om de 1 cm lange stok en het transparante bord met elkaar te verbinden, en de spleetlengte is 2 cm. (C) Twee stokjes van 4 cm op een afstand van 6 cm van elkaar. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Statische krachttraining bij muizen

1. Knip twee stukken wollen garen van 15 cm lang. Gebruik een schuifknoop om een stuk wollen garen aan elk van de bovenste enkels van de muis te binden (Figuur 2A).
   OPMERKING: Elastisch touw kan de houding van muizen niet bepalen, en henneptouw zal de enkels van muizen dragen, dus hier wordt gekozen voor nietelastisch maar zacht wollen garen.
2. Leg het bord horizontaal op tafel met de stokken omhoog. Druk de muis voorzichtig tussen twee lange stokken en plaats de kop en staart op één lijn met de openingen onder de stokjes.
3. Haal het garen door de opening aan het einde van de draad. Pas vervolgens het garen aan totdat de enkels van de muis goed tegen de rand van de stok passen.
4. Zet het wollen garen vast met tape (Figuur 2B). Het uiteinde van het wollen garen moet worden vastgezet, anders klimt de muis over de gevallen wol. Trek de wol zo strak mogelijk aan, anders komt de muis gemakkelijk los.
5. Keer het transparante bord om. Pak 2 dozen van dezelfde hoogte (15-20 cm hoog) aan weerszijden van het transparante bord. Leg het bord horizontaal op een bepaalde hoogte. De doos bevindt zich aan beide uiteinden van de kop en staart van de muis. Als het te hoog is, zal de onderzoeker het niet gemakkelijk kunnen hanteren; Als het te laag is, kan de muis het tafelblad raken.
6. Zodra het bord is omgedraaid, hangt de muis ondersteboven. Door de oprichtende reflex krullen muizen hun achterlijf en strekken ze hun voorpoten uit om hun achterpoten of stokken vast te pakken. Plaats in dit stadium een stok van 20 cm voor de muis en leid hem voorzichtig om de stok met zijn voorpoten vast te pakken. Herhaal het proces totdat de muis bedreven is in het vastpakken van de mobiele stick.
7. Gebruik de stok om de voorpoot van de muis te verplaatsen naar een andere stok van 4 cm op het transparante bord. Pas de hoek van de stok voortdurend aan zodat de muizen de stilstaande stok van 4 cm op het bord actief kunnen vastpakken (Figuur 2C).
8. Herhaal de vorige stap terwijl de muis de voorpoot loslaat totdat de muis uitgeput is. Na 30 minuten waren de meeste ratten niet in staat om hun bovenlichaam op te tillen en de stok met hun voorpoten vast te pakken.
   OPMERKING: Voordat de interventie wordt uitgevoerd, is een week gewenningstraining op muizen noodzakelijk. De initiële trainingsduur is 10 minuten per dag, die vervolgens elke dag met 5 minuten moet worden verhoogd tot een totaal van 30 minuten per dag.
9. Laat na 30 minuten training de muis onmiddellijk los en ontwar de wol om rode en gezwollen voeten door langdurig binden te voorkomen.
   1. Als er na de training huidlaesies op de enkel van de muizen verschijnen, stop dan met het trainen van de muizen en zoek professionele hulp bij dierenarts totdat de enkel gezond is.
   2. Sommige muizen kunnen er af en toe in slagen zichzelf te bevrijden door intense strijd tijdens de training. De muizen worstelen als hun achterpoten niet stevig vastzitten. Om letsel door strijd te voorkomen, observeert u de muizen tijdens de training. Wanneer blijkt dat de achterpoten niet stevig vastzitten of de muizen beginnen te worstelen, maak de muizen dan los en fixeer ze opnieuw.
      OPMERKING: Eerdere experimenten hebben aangetoond dat het ondersteboven hangen van muizen gedurende 30 minuten per dag, 5 dagen per week, geen enkelslijtage veroorzaakt, op voorwaarde dat ze te zijner tijd worden bevrijd¹⁰. Muizen kunnen in 1-3 sessies leren en wennen aan de training.

Figuur 2: Fixatiemethode bij de muis. (A) Bind de bovenkant van de enkel vast met een schuifknoop. (B) Het uiteinde van het touw wordt door de opening geleid en strak getrokken en vervolgens met tape vastgezet. (C) Statische krachttraining bij muizen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Results

Volgens het bovenstaande protocol worden de achterpoten van de muis gefixeerd en grijpen de voorpoten autonoom de voorste stang vast. Het smalle bewegingsbereik houdt de muis in een relatief vaste positie. Van de spieren van muizen kan worden bevestigd dat ze samentrekken door de spieren van hun buik en benen aan te raken. Dit komt overeen met de behoefte aan de staat van isometrische spiercontractie bij statische krachttraining. Het trainen van muizen volgens het protocol, met de toename van de trainingstijden, zal de muizen helpen zich aan te passen aan de training en tegelijkertijd hun verlangen om te worstelen verminderen. Een strijd om te ontsnappen kan worden vermeden.

Effecten op de bloedglucose en insulinespiegel bij T2DM-muizen
In totaal werden 24 C57BL/6J-muizen willekeurig verdeeld in de controlegroep (n=6) en de T2DM-modelgroep (n=18). De T2DM-muizen werden vervolgens willekeurig verdeeld in de modelgroep, de trainingsgroep en de metforminegroep. Er werd geen modellering of interventie gegeven aan de controlegroep en er werd geen interventie gegeven aan de muizen in de modelgroep. De muizen in de trainingsgroep kregen 30 minuten statische krachttraining eenmaal per dag, 5 dagen per week gedurende 3 weken. Muizen in de metforminegroep kregen gedurende 3 weken eenmaal daags metformine 200 mg/kg. De resultaten van nuchtere bloedglucose (FBG) na 3 weken interventie worden weergegeven in figuur 3A. Zoals uit de figuur blijkt, waren de FBG-niveaus van de muizen van het T2DM-model significant hoger dan die van de controlemuizen. Muizen getraind in statische training vertoonden significant lagere FBG-niveaus in vergelijking met de modelgroep, wat suggereert dat statische training effectief is in het verminderen van FBG bij T2DM-muizen. De nuchtere seruminsulinespiegels (FINS) in de modelgroep waren significant lager dan in de controlegroep, zoals weergegeven in figuur 3B. In de trainings- en metforminegroep stegen de FINS-waarden in vergelijking met de modelgroep. In figuur 3C hadden muizen in de modelgroep een significant hogere insulineresistentie-index (HOMA-IR) dan die in de controlegroep, terwijl de HOMA-IR van de statische trainings- en metforminegroepen significant lager was dan die van de modelgroep, wat hun werkzaamheid aantoont bij het verlichten van de insulineresistentietoestand van T2DM-muizen. Deze resultaten tonen aan dat de statische krachttrainingsstrategie die door dit regime wordt geboden, vergelijkbare effecten heeft als metformine bij het reguleren van de bloedglucosespiegel van T2DM-muizen.

Figuur 3: Bloedsuiker- en insulinespiegels. (A) Vergelijking van nuchtere bloedglucosespiegels bij T2DM-muizen na 3 weken interventie. * p <0,05 vs. Controlegroep, # p <0,05 vs. Modelgroep. (B) Vergelijking van nuchtere seruminsulinespiegels bij T2DM-muizen na 3 weken interventie. * p <0,05 vs. Controlegroep, # p <0,05 vs. Modelgroep. (C) Vergelijking van de insulineresistentie-index bij T2DM-muizen na 3 weken interventie. * p <0,05 vs. Controlegroep, # p <0,05 vs. Modelgroep. Voor statistische analyse werd eenrichtingsvariantieanalyse (ANOVA) uitgevoerd. Kwantitatieve gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM (n=6). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Effecten op skeletspieren bij T2DM-muizen
De gastrocnemius van muizen werd waargenomen door middel van transmissie-elektronenmicroscopie. Vergeleken met controlemuizen waren de skeletspiermyocyten van T2DM-muizen gedegenereerd, was de structuur van myofibrillen los en was de sarcomeeropstelling onregelmatig (Figuur 4A, B). Na de statische training die in het protocol wordt beschreven, toont figuur 4C de strakke structuur van myogene vezels in de spierstructuur en de symmetrische opstelling van lokale spiersegmenten. Dit suggereert dat statische krachttraining de morfologie van skeletspieren bij T2DM-muizen kan reguleren. Aan de andere kant waren in de gastrocnemius van controlemuizen mitochondriën lokaal verdeeld, met intacte membranen, en lokaal verdeelde of gefuseerde mitochondriën (aangegeven met rode pijlen). Evenzo is in de skeletspier van muizen na statische krachttraining het aantal mitochondriën normaal; Sommigen van hen zijn duidelijk versmolten of verdeeld (rode pijl). In het T2DM-model bij muizen daarentegen is het aantal mitochondriën minder en is er een lage activiteit. (Zie afbeelding 4) Dit suggereert dat statische krachttraining de mitochondriale functie en activiteit in skeletspiercellen kan beïnvloeden.

Figuur 4: Effect van statische training op de skeletspieren van T2DM-muizen. (A) Controlegroep; (B) T2DM-modelgroep; (C) Statische trainingsgroep. De M staan voor mitochondriën. Witte schaalbalken vertegenwoordigen 50 μm en rode schaalbalken vertegenwoordigen 10 μm. De onderste afbeelding is een gedeeltelijke vergroting van de bovenste afbeelding. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Statische krachttraining kan vetophoping verminderen, helpen bij het afvallen en de stofwisseling verhogen⁸. Bovendien verbetert het de expressie van PGC-1α en mitochondriale biogenese in skeletspiercellen, wat leidt tot een verbeterd glucosemetabolisme bij muizen met diabetes mellitus type 2 en een daaruit voortvloeiende verlaging van de bloedglucosespiegels¹¹. Om de impact en het mechanisme van statische training op T2DM te bevestigen, moeten geschikte apparaten worden ontwikkeld voor het uitvoeren van statische training op proefdieren.

Dit protocol introduceert een apparaat voor statische training bij muizen. De benodigde apparatuur, zoals acrylplaten, stokken, wollen garen en hete lijmpistolen, zijn direct beschikbaar en de productiemethode is eenvoudig en gemakkelijk. Dit kan de kosten van het experiment effectief verlagen en de haalbaarheid en herhaalbaarheid ervan vergroten. Het handhaven van een vaste positie voor de muizen tijdens de training kan een uitdaging zijn bij het ontwerpen van een statisch trainingsapparaat. In dit protocol kunnen de poten van de muis aan de voorkant van de kleine stok worden vastgemaakt door de zachte wol aan te spannen. De oprichtende reflex zorgt ervoor dat de muis zijn bovenlichaam naar boven buigt, waardoor hij de stang voor hem met zijn voorpoten kan vastpakken. De stang is kort, waardoor het bewegingsbereik van de voorpoten beperkt is. Na twee of drie sessies adaptieve training waren de muizen in staat om een stabiele houding aan te nemen. Door de beperkte kracht van de voorpoten verliezen de muizen vaak hun grip op de dwarsbalk. Het is noodzakelijk voor de onderzoekers om muizen de hele tijd in de gaten te houden om hen te helpen de dwarsbalk met hun voorpoten vast te pakken en te voorkomen dat de muizen per ongeluk letsel oplopen. Door training kunnen de muizen 1-2 minuten per keer een vaste positie aanhouden, meerdere keren herhaald, gedurende ongeveer 30 minuten na uitputting. Als ze uitgeput waren, rolden de muizen niet meer met hun buik of tilden ze hun voorpoten niet meer op. Wanneer de muis door de stok werd geleid om met zijn voorpoten vast te grijpen, kon de muis grijpen, maar zijn bovenlichaam kon niet naar boven draaien. Maak de knoop zo snel mogelijk los na het neerleggen van muizen, wat enkeloedeem en slijtage effectief kan voorkomen.

Voorlopige experimenten geven aan dat, na een periode van statische training, de bloedglucosespiegel van T2DM-muizen significant daalde in vergelijking met de controlegroep van modelmuizen. Skeletspieren zijn een cruciaal onderdeel van het perifere glucosemetabolisme en zijn essentieel voor het handhaven van de bloedglucosehomeostase¹². Elektronenmicroscopieanalyses gaven aan dat ernstige degeneratie optrad in gastrocnemiuscellen van T2DM-muizen, terwijl statische training de degeneratie van spierweefsel bleek te verminderen. Deze bevindingen suggereren dat statische training betrokken kan zijn bij de regulatie van de skeletspierfunctie. Onderzoek heeft aangetoond dat het behoud van de skeletspierfunctie aanzienlijk wordt beïnvloed door de mitochondriale^dynamiek13. We zagen een duidelijke vermindering van het aantal mitochondriën en een gebrek aan mitochondriale activiteit in de gastrocnemius-spiercellen van de T2DM-muismodelgroep in vergelijking met wilde muizen en statische trainingsmuizen. Deze bevindingen suggereren dat statische training de skeletspierfunctie kan bevorderen door de mitochondriale functie in skeletspiercellen te verbeteren. Op basis van de voorgaande experimentele resultaten kan worden vastgesteld dat statische training de bloedglucose en het insulinemetabolisme bij T2DM-muizen aanzienlijk kan verbeteren. Het interventiemechanisme kan in verband worden gebracht met de regulatie van de mitochondriale functie van de skeletspieren door statische training.

Dit protocol heeft enkele beperkingen. Aanvankelijk was het moeilijk om de achterpoten van muizen door één persoon individueel te binden, omdat één persoon de achterpoten moest vastpakken terwijl een ander de binding uitvoerde. Met een paar aanpassingen en toenemende vaardigheid van de kant van de experimentator, werden de muizen ontvankelijker. Dit maakte een onafhankelijke binding van de achterpoten mogelijk. Bovendien kan de zachte wol de blauwe plekken in de enkels van de muizen verminderen.

Concluderend biedt dit protocol een eenvoudige methode om statische trainingsapparatuur voor muizen te maken. Op dezelfde manier kan eenvoudige statische trainingsapparatuur voor ratten worden gemaakt door de grootte van planken en stokken te vergroten. Het apparaat kan de isometrische spiercontractie van de ledematen van muizen handhaven om het interventie-effect van traditionele Chinese lichaamsbeweging op T2DM te verifiëren en een nieuw perspectief te bieden voor de klinische behandeling van T2DM.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acrylic boards			Transparante acrylplaten met een dikte van 5mm. De afmetingen moeten groter zijn dan 20cm×20cm
Boxes			Twee dozen met dezelfde hoogte (15~20cm)
ELISA KIT		H203-1-2	Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute
Hot melt glue gun			Vermijd contact met de pistoolsnuit om brandwonden te voorkomen
Knives			Geen speciale vereiste
Metformin tablets		1396309	Sigma
scissors			Geen speciale vereiste
Sticks			Verschillende houten stokken met een diameter van 3mm
Streptozotocin		S0130	Sigma
Tape			Geen speciale vereiste
Transmission Electron Microscope (TEM)		HT7700	HITACHI