Fentanyl analoge screening met behulp van LC-TIMS-TOF MS/MS

Samenvatting

Een methode voor het screenen van fentanyl-analogen op basis van hun retentietijd, mobiliteit en fragmentatiepatroon van massaspectrometrie.

Samenvatting

Het gebruik van fentanyl en de opkomst van fentanyl-analogen in de afgelopen decennia is een toenemende zorg geworden voor de gemeenschap in het algemeen. Fentanyl en zijn analogen leveren de belangrijkste bijdrage aan fatale en niet-fatale overdoses in de Verenigde Staten. De meest recente gevallen van fentanyl-gerelateerde overdosering worden in verband gebracht met illegaal vervaardigde fentanyl en de daarmee gepaard gaande extreme potentie. In dit werk beschrijven we een high-throughput analytisch protocol voor het screenen van fentanyl-analogen. Het gebruik van complementaire vloeistofchromatografie, spectrometrie voor de mobiliteit van ingesloten ionen en tandem-massaspectrometrie maakt het mogelijk om honderden fentanyl-analogen uit een enkel monster in één scan te scheiden en toe te wijzen. De beschreven benadering maakt gebruik van de recente ontwikkeling van data-afhankelijke acquisitie en data-onafhankelijke acquisitie met behulp van parallelle accumulatie in de mobiliteitsval, gevolgd door sequentiële fragmentatie met behulp van botsing-geïnduceerde dissociatie. De fentanyl-analogen worden met vertrouwen toegewezen op basis van hun retentietijd, mobiliteit en MS-fragmentatiepatroon.

Inleiding

Fentanyl en zijn analogen leveren de belangrijkste bijdrage aan fatale en niet-fatale overdoses in de Verenigde Staten ^1,2. Het Center for Disease Control and Prevention (CDC) meldde dat het aantal sterfgevallen door synthetische opioïden als gevolg van een overdosis van 2013 tot en met 2021 meer dan 258.000 bedroeg. Alleen al in 2021 konden meer dan 68,000 sterfgevallen door een overdosis worden toegeschreven aan synthetische opioïden, in totaal 82% van alle overdosisgerelateerde sterfgevallen in het land³. Sinds 2013 zijn honderden fentanyl-analogen geïdentificeerd, met verschillende potentie⁴. Met de opkomst van illegaal vervaardigde fentanyl-analogen blijft de synthetische opioïde van schema II zelf de meest populaire synthetische opioïde die beschikbaar is in de Verenigde Staten³. Volgens het Center for Forensic Science Research and Education (CFSRE) was fluorofentanyl het meest gerapporteerde fentanyl-analoog in 2022, waarbij nu in hoog tempo extra niet-fentanylgerelateerde synthetische opioïden in het vluchtige drugsaanbod worden geïntroduceerd⁵.

Vanwege de overweldigende hoeveelheid fentanyl en fentanyl-gerelateerde analogen die op de drugsmarkt circuleren, heeft de DEA een fentanyl-handtekeningprofileringsprogramma geïmplementeerd, genaamd Operation Death Dragon, om de methodologie te volgen die wordt gebruikt om deze verbindingen te synthetiseren in de hoop drugsvangsten terug te koppelen aan hun oorsprong⁶. In 2018 werd 94% van de drugsvangsten geïdentificeerd als gesynthetiseerd door de Janssen-methode, terwijl de resterende 6% werd gesynthetiseerd met de Siegfried-methode⁶. Het belangrijkste verschil tussen de twee methoden is de aanwezigheid van het fentanylanaloog, benzylfentanyl, gedetecteerd als een onzuiverheid in de Janssen-methode, terwijl de aanwezigheid van despropionylfentanyl (4-ANPP), een metaboliet/voorloper van fentanyl, een onzuiverheid is die wordt gedetecteerd bij het synthetiseren met de Siegfried-methode⁷.

Het gebruik van gas- en vloeistofchromatografie in combinatie met massaspectrometrie (respectievelijk GC-MS en LC-MS) voor de gerichte screening en kwantificering van synthetische opioïden wordt regelmatig toegepast in toxicologische laboratoria. GC-MS wordt beschouwd als de gouden standaard voor de detectie van drugsmisbruik in biologische monsters. Toegang tot openbaar beschikbare spectrale massabibliotheken⁸ en instrumentatie die op de markt wordt gebracht als plug-and-play-systemen⁹ zijn enkele redenen waarom GC-MS een integraal onderdeel is gebleven in laboratoria voor zowel uitgebreide screening als gerichte kwantificering ^9,10. De huidige GC-MS-kwantificeringsmethoden in de literatuur hebben echter de neiging om een beperkt aantal analyten¹¹ te hebben en snel verouderd te raken en niet toepasbaar te zijn op de huidige casussen. Wat nog belangrijker is, is dat de limieten van detectie en kwantificering niet vergelijkbaar zijn met LC-MS-methoden (< 1 ng/ml)¹², waardoor de kans op vals-negatieve resultaten toeneemt. Een dergelijke vergelijking tussen GC-MS en LC-MS, waarbij naar postmortale monsters werd gekeken, merkte op dat van de 134 positief geïdentificeerde gevallen van carfentanil, een van de krachtigste synthetische opioïden tot nu toe, 104 van die gevallen negatief werden gescreend op carfentanil met behulp van GC-MS¹³. In laboratoria voor geneesmiddelenanalyse wordt GC-MS vaker gebruikt en kan het worden aangepast voor synthetische opioïden vanwege de hoge concentratie van de geanalyseerde monsters. Toch wordt GC-MS nog steeds gebruikt in combinatie met aanvullende technieken zoals Fourier transformatie-infraroodspectroscopie (FT-IR) en scanning-elektronenmicroscopie (SEM) voor de bevestiging van deze verbindingen¹⁴. De toepassing van GC-MS op de analyse van biologische monsters in de forensische toxicologie vereist monstervoorbereidingsmethoden die de extractie van deze verbindingen omvatten met behulp van vloeistof-vloeistofextractie (LLE) of vastefase-extractie (SPE)¹⁵. LLE kan worden uitgevoerd met een verscheidenheid aan oplosmiddelen, maar in een laboratorium met een hoge productie is LLE mogelijk niet kostenefficiënt of tijdig. LLE verbruikt grote hoeveelheden oplosmiddelen en een monstervolume, terwijl het alternatief, SPE, kan worden geautomatiseerd en een minimaal monstervolume¹⁶ vereist. Een recente GC-MS-studie rapporteerde de scheiding van 20 verschillende isomere fentanyl-analogen met behulp van drie afzonderlijke GC-thermische programma's¹⁷. Hoewel de basislijnscheiding tussen isomeren succesvol was, is de toepasbaarheid van deze methode op relevante forensische zaken en workflows beperkt.

LC-MS is populair geworden in forensisch onderzoek, vooral vanwege de beperkingen van GC-MS als het gaat om niet-vluchtige en warmtegevoelige verbindingen^18,19. LC-MS-screening met behulp van triple quadrupoles (QQQ) en ionenvalinstrumentatie is succesvol geweest bij het detecteren van synthetische opioïden in lage concentraties (<1 ng/ml)12,20,21,22,23,24. Meestal worden deze LC-MS-methoden gebruikt als secundaire bevestigingsmethoden als aanvulling op immunoassay en/of GC-MS-resultaten. In 2017 ontwikkelden Shoff et al. van het toxicologisch laboratorium van de Miami-Dade County Medical Examiner Department (MDME) een uitgebreide screeningmethode voor 44 opioïde-gerelateerde verbindingen met behulp van ultrahogedrukvloeistofchromatografie (UHPLC) - ionenval-MS^{n 13}. Net als bij gerichte MRM-methoden, maakte deze ionenvalmethode gebruik van een geplande voorloperlijst (SPL) met retentietijden, voorloperdoelionen en primaire dochterionen voor MS 3-spectrale fragmentatie waar mogelijk. Wat deze screeningsmethode onderscheidt van methoden die zijn ontwikkeld op drievoudige quadrupolen en lineaire quadrupoolionenvallen, is het extra detail dat in de spectrale gegevens wordt geboden. Wat deze screeningsmethode niet kan bieden, is kwantitatieve analyse, die zelden wordt ontwikkeld op ionenvalinstrumenten, evenals de identificatie van onbekenden¹³. LC-QQQ-methoden voor synthetische opioïden kunnen tegelijkertijd een vooraf gedefinieerde doellijst screenen en kwantificeren. Het gebruik van meervoudige reactiemonitoring (MRM) overgangen voor de identificatie en kwantificering van verbindingen is een betrouwbare techniek voor gegevensverzameling en is de meest gebruikte techniek in de literatuur voor de detectie van synthetische opioïden^12,20. Gerapporteerde lineaire bereiken voor de kwantificering van een reeks synthetische opioïden variëren van 0,01-100 ng/ml, waarbij krachtigere synthetische opioïden, zoals carfentanil, worden gedetecteerd in het sub-ng/ml-bereik^{1 1,24,25,26,27}.

De scheiding van isomere synthetische opioïden is aangepakt in LC-MS-methoden. Een van die methoden scheidde 174 isomere fentanylanalogen binnen een looptijd van 16 minuten met behulp van een bifenylkolom²⁸. Bovendien creëren fluctuaties in LC-afhankelijke parameters zoals kolomefficiëntie, mobiele fase-pH en drukveranderingen retentietijdverschuivingen waarmee rekening moet worden gehouden in gerichte assays met consistente monitoring en grotere verzamelvensters (>0,4 min), wat kan resulteren in mogelijke overlapping van deze eenmaal opgeloste isomeren. Aanvullende chromatografische technieken voor de scheiding van isomeren zijn onderzocht, waaronder het gebruik van 2-dimensionale vloeistofchromatografie (2D-LC)²⁹; En hoewel deze techniek de mogelijkheid heeft om orthogonale scheiding van verbindingen te bieden, wegen de nadelen op tegen de voordelen, waaronder buitensporige looptijden, kosten, moeilijkheid bij de ontwikkeling van methoden en bruikbaarheid in vergelijking met alternatieve scheidingen³⁰.

Hoge resolutie massaspectrometrie (HRMS) wordt steeds betrouwbaarder voor de identificatie van synthetische opioïden. Verschillende instrumentatiebedrijven hebben gerichte methoden op de markt gebracht die zijn ontwikkeld voor het identificeren van een breed scala aan synthetische opioïden in complexe biologische matrices 19,28,31. Deze methoden kunnen, in tegenstelling tot eerder besproken methoden, analytische gegevens opslaan voor analyse met terugwerkende kracht. Monsters die eerder met onbepaalde resultaten zijn geanalyseerd, kunnen dus later opnieuw worden bezocht voor de ontdekking van nieuw geïdentificeerde verbindingen. Wat HRMS onderscheidt van QQQ is nauwkeurige massa-identificatie. Hoewel beide MS-technieken nauwkeurig kunnen kwantificeren bij lage concentraties, is bewezen dat HRMS effectiever is voor de eerste screening en ontdekking van onbekende verbindingen 32,33,34. HRMS, met name met time-of-flight (TOF) MS-analysatoren, heeft een voortrekkersrol gespeeld bij de ontdekking van NPS, waardoor forensische testlaboratoria tijdgevoelige gegevens over nieuwe verbindingen kunnen leveren aan zowel wetshandhavers als de wetenschappelijke gemeenschap om de verspreiding van sommige van deze verbindingen op te schalen en tegelijkertijd het bewustzijn en onderwijs te vergroten^. Het gebruik van TOF voor de opsporing van drugsmisbruik is uiterst uitgebreid geworden, met methoden die meer dan 600 verbindingen bevatten, gescheiden binnen een chromatografisch programma van 10 minuten. Eerdere studies zijn gerapporteerd over de voordelen van trapped ion mobility spectroscopy (TIMS) gekoppeld aan TOF voor de detectie en scheiding van isomere opioïden³⁵.

Door gebruik te maken van de orthogonaliteit tussen vloeistofchromatografie, mobiliteitsspectrometrie van ingesloten ionen en massaspectrometrie, biedt de gepresenteerde methode een brede karakterisering van fentanyl-analogen op basis van de retentietijd, het isotopenpatroon, de mobiliteit en het fragmentatiepatroon.

Protocol

1. Voorbereiding van het monster

1. Bewaar de fentanyl analoge screeningskit bij -20 °C na ontvangst. Resuspendeer elk monster tot een eindconcentratie van 400 μg/ml door toevoeging van 500 μl zuivere methanol van LC/MS-kwaliteit.
2. Meng met een plaatmixer of vortexer op 400 rpm gedurende 1 uur of vortex op gemiddelde snelheid gedurende 15 min. Bewaar de injectieflacons na resuspensie bij -20 °C.
3. Verdun elke standaard tot een eindconcentratie van 1 ng/ml met behulp van zuivere methanol van LC/MS-kwaliteit.
4. Groepeer de normen in groepen, zodat elke groep geen isomere standaarden bevat. Zie aanvullende tabel 1 voor de uitsplitsing van de 14 groepen fentanylnormen.

2. Voorbereiding van HPLC mobiele fasen

1. Bereid mobiele fase A (MPA) voor met behulp van 5 mM/L ammoniumformiaat (NH₄HCO₂) in H₂O met 0,05% mierenzuur (85%).
   1. Weeg 0,078 g NH₄HCO₂ af, giet in een maatkolf van 250 ml en vul met water tot ongeveer 2/3^rd. Draai om goed te mengen.
   2. Eenmaal volledig opgelost, voeg 0,125 ml mierenzuur (85%) toe. Vul met water tot de vullijn (250 ml) en meng.
2. Bereid mobiele fase B (MPB) voor met 0,05% mierenzuur in een mengsel van methanol en acetonitril van 1:1.
   1. Giet 125 ml acetonitril in een maatkolf en voeg methanol toe tot het de vullijn bereikt.
   2. Draai om goed te mengen. Voeg 0,125 ml 0,05% mierenzuur toe aan de kolf en meng om te homogeniseren.

3. Ontwikkeling van de HPLC-methode

1. Open de LC-software naar het startscherm. Maak in de voorbeeldtabel, die zich in het midden van het venster bevindt, een nieuw protocol.
   1. Annoteer de kolom van de injectieflacon met de locatie van het monster. Annoteer de voorbeeld-ID-kolom met behulp van de indeling YYYYMMDD_NAME (representatieve descriptor). Annoteer de volumekolom met het gewenste injectievolume (15 μL).
2. Annoteer de kolom met het gegevenspad met de locatie waar de gegevens worden opgeslagen.
3. Invoer van de HPLC-methode
   1. Selecteer Nieuw op de balk in de voorbeeldtabel in het midden van het scherm. Selecteer onder de scheidingsmethode de vervolgkeuzepijl en klik op Nieuwe methode in het pop-upvenster.
   2. Er verschijnt een nieuw venster met het label scheidingsmethode, hier bewerkt u de acquisitietijd of de systeemmethode van het instrument control framework (ICF).
   3. Dubbelklik op de knop Methode bewerken voor het ICF-systeem om de pop-up te openen om de binaire gradiënt te bewerken, zoals te zien is in afbeelding 1.
   4. Onder het tabblad binaire gradiënt bevindt zich aan de linkerkant een visuele weergave van de gradiënt en aan de rechterkant de uitsplitsing van de gradiënt, stel de tijdstempels, het debiet en de MPA- en MPB-concentraties in.
   5. Zorg ervoor dat de stoptijd is ingesteld op 18 min, het debiet op 0.400 ml/min en de druklimiet min en max op 0 psi en 6000 psi.
   6. Stel de tijdstempelconcentraties als volgt in:
      Stel bij 0.00 min de B-concentratie in op 20.0.
      Stel na 1.50 minuten de B-concentratie in op 25.0.
      Stel na 3.00 minuten de B-concentratie in op 27.0.
      Stel om 6.00 minuten de B-concentratie in op 27.0.
      Stel bij 6.50 min de B-concentratie in op 30.0.
      Stel om 7.00 minuten de B-concentratie in op 95.0.
      Stel om 16.00 uur de B-concentratie in op 95.0.
      Stel om 16.50 minuten de B-concentratie in op 20.0.

4. Initialisatie van de HPLC

1. Plaats in de HPLC-kolomsectie de LC-kolom (monolithische C18 HPLC-kolom 100 mm x 4,6 mm) en kolombeschermers (beschermkolom 5 mm x 4,6 mm). Let op de minimale en maximale kolomdruk.
2. Voer een voorbeeldblanco uit (dezelfde bufferoplossing) om te testen op eventuele lekken en een basislijn te maken. Zoek naar lekken. Lekken kunnen worden waargenomen door drukfluctuaties in de kolom. Als er lekken zijn, bepaal dan waar ze vandaan kunnen komen en draai de verbindingen vast.
3. Voer een voorbeeldblanco uit (dezelfde bufferoplossing) met behulp van het gewenste LC-programma om de kolom voor te conditioneren.

5. Ontwikkeling van de TIMSTOF MS/MS-methode

1. Open de timsControl-applicatie. Aan de linkerkant van het venster bevinden zich de MS- en TIMS-instellingen.
   1. Stel onder MS-instellingen het begin en einde van de scan in op respectievelijk 50 m/z en 1800 m/z. Selecteer de positieve modus voor de ionenpolariteit en selecteer parallelle accumulatie-seriële fragmentatie voor de scanmodus.
   2. Stel onder TIMS-instellingen de modus in op aangepast, 1/K0 start op 0.40 Vs/cm², 1/K0 einde op 1.85 Vs/cm², ramptijd ingesteld op 150.0 ms en MS-gemiddelde ingesteld op 1.
2. Voer in de onderste selectie van tabbladen onder Bron de volgende wijzigingen uit in de twee instellingsvakken.
   1. Stel in de bron de offset van de eindplaat in op 500 V, het capillair op 4500 V, de vernevelaar op 3.0 bar, het droge gas op 10.0 l/min en de droge temperatuur op 200 °C.
   2. Zorg er in de instellingen van de spuitpomp voor dat de spuit Hamilton 1 ml is, actief is ingeschakeld en dat het debiet is ingesteld op 80.0 μl/u.
3. Voer op het tabblad Afstemmen de volgende wijzigingen uit in de instellingentabbladen voor Algemeen, Verwerking en TIMS.
   1. Stel op het tabblad Algemene instellingen de volgende secties in: overdracht, botsingscel, quadrupool, focus pre TOF en detectie.
      1. Stel onder de overdrachtsinstellingen de afbuiging 1 delta in op 70.0 V, trechter 1 RF op 341.0 Vpp, CID-energie op 0.0 eV, trechter 2 RF op 300.0 Vpp, meerpolige RF op 300.0 Vpp.
      2. Zorg er onder de instellingen van de botsingscel voor dat de botsingsenergie is ingesteld op 6.0 eV en de botsing RF op 1200.0 Vpp.
      3. Zorg er bij de quadrupoolinstellingen voor dat de ionenenergie is ingesteld op 6.0 eV en de lage massa op 250.00 m/z.
      4. Stel onder de focus pre TOF-instellingen de overdrachtstijd in op 75.0 μs en de pre-pulsopslag op 5.0 μs.
   2. Stel op het tabblad verwerkingsinstellingen de volgende secties in: detectie van massaspectrapieken en detectie van mobiliteitspieken.
      1. In de piekinstellingen van de massaspectra deselecteert u de som van de intensiteiten (oppervlakte) en stelt u de absolute drempel in op 667.
   3. Stel onder het tabblad TIMS de volgende secties in: offsets, ionenwijzigingsregeling en geavanceerde parameters.
      1. Stel onder de offsets-instelling Δt1 in op -20.0 V, Δt2 op -100.0 V, Δt3 op 40.0 V, Δt4 op 80.0 V, Δt5 op 0.0 V, Δt6 op 120.0 en botsingscel op 250.0 V.
      2. Klik onder de instellingen voor de ionenladingsregeling op het vakje om de doelintensiteit in te schakelen en in te stellen op 5.00 M.
      3. Schakel onder de geavanceerde parameters de accumulatie van het slot naar het mobiliteitsbereik in.
4. Stel op het tabblad MS/MS de scanmodus in op parallelle accumulatie-seriële fragmentatie en stel de volgende secties in: voorloperionen, planning, actieve uitsluiting, instellingen voor botsingsenergie, instellingen voor isolatiebreedte en TIMS-stappen.
   1. Stel onder precursorionen het aantal parallelle accumulatie-seriële fragmentatiehellingen in op 8, laadminimum op 1 en laadmaximum op 5.
   2. Schakel onder planningsinstellingen de herhalingen van de voorloper in. Vink onder actieve uitsluiting het vakje aan om de release in te schakelen en in te stellen op 0.40 minuten daarna.
   3. Pas de instellingen voor de botsingsenergie en de isolatiebreedte niet aan. Klik op het TIMS-stappenvak om in te schakelen.

6. Mobiliteit en massakalibratie

1. Voer kalibratie uit voor zowel m/z- als mobiliteitsdomeinen. Selecteer onder de m/z-kalibratie-instellingen een van de vooraf geladen afstemmixprofielen in de referentielijst die in het vervolgkeuzemenu verschijnen.
2. Om te kalibreren, laadt u de spuit voor de TOF met een afstemmixoplossing. Gebruik aan de rechterkant van het venster de instellingen met de titel kalibratiemodus voor de verschillende kalibratietypen die moeten worden ingesteld om de hoogste score te behalen.
3. Zorg ervoor dat de score zo dicht mogelijk bij 100% ligt. Schakel tussen lineair, quadradisch en verbeterd kwadratisch om de beste score te behalen.
4. Kalibreren voor mobiliteit volgens de stappen 6.1-6.3 die worden gebruikt voor het kalibreren van m/z.
5. Eenmaal gekalibreerd, slaat u de MS-methode op door het tabblad Methode op de bovenste balk te selecteren. Selecteer in het vervolgkeuzemenu Opslaan als om een nieuw bestand met de MS-methode te genereren.

7. Creëren van data onafhankelijke acquisitie (dia) parallelle accumulatie-seriële fragmentatie methode

1. Zodra een dataset is verzameld in data dependent acquisition (dda) parallelle accumulatie-seriële fragmentatie, voert u de experimenten uit in dia. Open de softwaretoepassing voor ionenmobiliteit en laad de dda-methode die in stap 6.5 is opgeslagen.
2. Laat alle instellingen hetzelfde, verwacht voor de MS-instelling, verander dit van parallelle accumulatie-seriële fragmentatie naar dia- parallelle accumulatie-seriële fragmentatie.
3. Selecteer aan de onderkant van het deelvenster het tabblad MSMS en klik vervolgens op Venstereditor om het pop-upvenster van het diavenster te openen dat wordt weergegeven in afbeelding 2.
4. Laad de eerder opgeslagen dda-gegevensset (.m-bestand) met behulp van de knop voor het openen van analyse bovenaan het pop-upvenster.
5. Linksonder verschijnt een heatmap met vensters met een polygoon van vensters die diagonaal over de grafiek lopen. Klik en sleep om het formaat van de polygoon te wijzigen zodat deze past bij de gegevens in de heatmap (hoeken zijn te selecteren door te dubbelklikken op de zijlijnen, er verschijnt een punt dat kan worden gesleept en verkleind).
6. Rechts van de vensters staan de vensterinstellingen. Stel de massabreedte in (50 is ga naar) en stel de horizontale overlapping in, beide in Da.
7. Stel het aantal mobiliteitsvensters per massa in, de breedte en de verticale overlapping.
8. Klik op Bereken vensters rechtsonder in het pop-upvenster om de vensters te zien die worden weergegeven met de nieuwe instellingen. Eenmaal geschikt, klikt u op Dia-PASEF Windows toepassen op Methode. Hierdoor wordt de pop-up gesloten en wordt deze teruggebracht naar het startscherm.

8. HPLC-ionenmobiliteit TOF-gegevensverwerking

1. Open de software voor gegevensanalyse. Klik in de linkerbovenhoek op het tabblad Bestand en selecteer Openen in de vervolgkeuzelijst. Selecteer in het venster Nieuwe bestanden de gewenste bestanden en klik op Openen.
2. Controleer de kalibratie. Klik met de rechtermuisknop op de bestandsnaam onder het analysevak en selecteer Eigenschappen. Er verschijnt een venster met het label bestand name_analysis eigenschappen. Selecteer Kalibratiestatus.
3. Selecteer in de vervolgkeuzelijst de optie Instrumentkalibratie voor de massaspectrometer. Controleer of de fout niet groter is dan 1 μg/ml. Selecteer Initiële mobiliteitskalibratie en controleer of de fout niet groter is dan 1 μg/ml.
4. Maak een chromatogram in de data-analysesoftware zoals hieronder beschreven.
   1. Klik met de rechtermuisknop op Chromatogram onder de bestandsnaam, selecteer Chromatogram bewerken. Klik in type op de vervolgkeuzelijst en selecteer Geëxtraheerde ionenchromatogram.
   2. Selecteer onder filter de optie Alle MS en selecteer in de scanmodus Alles. Dit is om de pieken voor het molecuul van belang te bekijken in plaats van alleen de fragmenten.
   3. Zoek daaronder naar de twee filteropties voor molecuulselectie: massa's of formule gemarkeerd in blauw.
   4. Als u massa's gebruikt om een ion te extraheren, vul dan de theoretische m/z van het betreffende molecuul in. Selecteer in dit geval (massa voor representatief resultaat) m/z.
   5. Als u een formule gebruikt om een ion te extraheren, voert u de formule voor het molecuul in, evenals de ionenvormen die van belang zijn voor het chromatogram. Selecteer in dit geval het geprotoneerde ion, [M+H]⁺.
   6. Zet de polariteit in de positieve modus.
5. Massa spectrum
   1. Klik met de rechtermuisknop op de basislijn van de piek van de compound en sleep naar de andere rand van de piek. Dit zal binnen die retentietijd een massaspectrum aan fragmenten creëren.
6. Genereren van Mobilogram
   1. Klik met de rechtermuisknop op het linkertabblad met de titel mobilogram en selecteer Mobilogram bewerken. Er verschijnt een venster met de titel mobilogramsporen bewerken. Volg de stappen 8.4.2-8.4.7 voor het bewerken van het chromatogram.
   2. Voeg in de invoer van de bewaartijd het bereik van de bewaartijd van de piek van belang toe.
   3. Zodra de parameters zijn geselecteerd, klikt u op Toevoegen gevolgd door Ok in de rechterbovenhoek van het venster voor het bewerken van mobilogramtraceringen.
   4. Na korte tijd zal de software de gewenste selecties verwerken en een chromatogram uitvoeren. Herhaal stap 8.6.1-8.6.3 voor alle ionen in het mengsel.
   5. Genereren van de samengestelde spectra
      1. Selecteer onder aan het spectrumweergavevenster de optie Profile MS en Fragment MS. Dit maakt het mogelijk om ionen van volledige scan en PASEF op te nemen.
      2. Klik in de spectrumweergave met de rechtermuisknop en selecteer Samengestelde spectra kopiëren. Met de spectrumgegevens die aan de rechterkant verschijnen, vindt u meer informatie over de verbinding, zoals resolutieoplossend vermogen, intensiteit en signaal-ruisverhouding (S/N).
   6. Gegevensverwerking
      1. Om de gegevens te verwerken, integreert u handmatig het chromatogram en de mobiliteitspieken om belangrijke informatie over het betreffende molecuul te verkrijgen.
      2. Klik met de rechtermuisknop op Zoeken en selecteer Alleen chromatogram of mobilogram integreren . Klik met de linkermuisknop en sleep om de gewenste piek te markeren. De informatie wordt weergegeven, waaronder retentietijd, gebied, S/N en mobiliteit.

Resultaten

De fentanyl analoge screeningskit van 250 analoge standaarden was verdeeld in 14 groepen: 12 groepen van 17 analogen en 2 groepen van 16 analogen, om m/z-interferenties te voorkomen. Elke analoog wordt verder gekenmerkt door hun m/z, retentietijd (RT), mobiliteit (K) en MS/MS-fragmentatiepatroon.

Voorbeelden van isomere scheidingen worden weergegeven in figuur 3 en figuur 4 voor respectievelijk de chemische formule C₂₂H₂₈N₂O₂ en C₂₁H₂₈N₂OS OS.

De fentanyl analoge screeningskit bevat vier isomeren met de chemische formule C₂₂H₂₈N₂O₂ (zie figuur 3). Inspectie van figuur 4 toont het [M+H]⁺ geëxtraheerde ionenchromatogram, de mobilogrammen, het isotopenpatroon en het MS/MS-fragmentatiepatroon. De methoxyacetylfentanyl en fentanylcarbamaat scheiden zich in de LC- en mobiliteitsdomeinen goed af van de para-methoxyacetylfentanyl en B-hydroxylfentanyl. Een duidelijke scheiding tussen para-methoxy-acetylfentanyl en B-hydroxylfentanyl wordt echter bereikt door hun fragmentatiepatronen.

De fentanyl analoge screeningskit bevat drie isomeren met de chemische formule C₂₁H₂₈N₂OS. Inspectie van figuur 4 toont het [M+H]⁺ geëxtraheerde ionenchromatogram, de mobilogrammen, het isotopenpatroon en het MS/MS-fragmentatiepatroon. De a-methylthiofentanyl en (±)-trans-3-methylthiofentanyl scheiden zich af in het LC-domein, maar niet in het mobiliteitsdomein. Bovendien scheiden (±)-trans-3-methylthiofentanyl en (±)-cis-3-methylthiofentanyl zich af in het mobiliteitsdomein en niet in het LC-domein. Dit toont de complementariteit van de LC en mobiliteitsscheiding aan, waardoor de identificatie van de isomere soorten wordt verbeterd door de orthogonaliteit van domeinen. Figuur 4D vat dit resultaat samen op basis van LC en mobiliteit.

Figuur 1: Hellingshoek in de software. ICF-systeem, methode, dialoog, gradiënten, tijdstippen toegepast tijdens de scheiding, afhankelijk van het percentage B-concentratie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: dia-PASEF vensterinstellingen. Onder dia-PASEF MS methoden zijn de MS/MS instellingen uniek. De grafiek aan de linkerkant toont de vensterpolygonen aangepast op basis van de gegevens die zijn vastgelegd in de dda-PASEF-methode. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Typisch geëxtraheerd ionenchromatogram, geëxtraheerd mobilogram en geamplificeerde MS-projectie voor isomere opioïden. (A) Structuren van methoxyacetylfentanyl, para-methoxyacetylfentanyl, β-hydroxyfentanyl, fentanylcarbamaat en de respectievelijke (B) typische retentietijd, (C) typische mobiliteit, (D) isomeer signaal, (E) grote fragmenten en (F) weergave van de fragmentatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Typische geëxtraheerde ionenchromatogrammen en geëxtraheerde mobilogrammen voor isomere opioïden. (A) Structuren van α-methylthiofentanyl, (±)-trans-3-methylthiofentanyl en (±)-cis-3-methylthiofentanyl. Voor de respectievelijke isomeren (B) typische retentietijd, (C) typische mobiliteit, (D) orthogonaliteit tussen de retentietijd en mobiliteit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende tabel 1: Mengselgroepen. Deze tabel geeft aan welke opioïden in elk van de 14 mengsels zitten die voor deze procedure zijn gemaakt. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

De analytische scheiding van biologische monsters met een hoog isomeer gehalte kan analytisch uitdagend zijn. In dit artikel is de beschreven methode gericht op het karakteriseren van 29 isomeersets, voor een totaal van 185 analogen uit een standaardkit van 250 opioïden. Tijdens de voorbereiding van de testgroep is het belangrijk om ervoor te zorgen dat er geen twee analogen met m/z zijn die niet experimenteel kunnen worden onderscheiden. De hier beschreven gegevens maken gebruik van standaarden die niet afkomstig zijn uit een op mensen gebaseerde matrix, als deze methode moet worden gebruikt in een veldexperiment; Aanvullende proeven met behulp van de matrix van belang zijn nodig om de toepasbaarheid van de methode te waarborgen. De matrix kan ervoor zorgen dat de analyten anders ioniseren dan in een matrixvrij experiment, waardoor het absoluut noodzakelijk is om te bepalen welke gangbare ionenvormen zullen worden waargenomen. In de analyse is de identificatie gebaseerd op de isotopenpatronen van de meest voorkomende vormen (bijv. [M+H]⁺¹ en [M+Na]⁺¹).

De keuze van het LC-programma is van cruciaal belang in gevallen waarin de isomeren niet gescheiden zijn in het mobiliteitsdomein. Het verkleinen van de helling van de gradiënt kan de specificiteit van de methode vergroten door het verschil tussen de chromatografische pieken te vergroten.

Tijdens data-analyse is het belangrijk dat niet-relevante signalen worden genegeerd bij het bepalen van de retentietijd en mobiliteit. De voordelen van HRMS zorgen voor smalle m/z-vensters (typische massaresolutie van ~50.000) met extra mobiliteitsfiltering, waardoor de chemische ruis wordt verminderd.

De hier beschreven methode biedt een referentiebibliotheek voor het screenen op fentanyl-analogen uit een onbekend monster. Het gerapporteerde RT-, K-, isotopen- en MS-fragmentatiepatroon worden gebruikt als kwalificaties tijdens de gegevensverwerking en onbekende toewijzing. In vergelijking met traditionele MRM LC-QQQ-analyse, terwijl vergelijkbare LOD haalbaar zijn 13,19,27, is het unieke voordeel dat er wordt gescreend op alternatieve opioïden die niet zijn opgenomen in de database die is gegenereerd met behulp van de FID-kit. Elke nieuwe opioïde vereist de analyse met behulp van een synthetische standaard voor de definitieve validatie.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Ammonium formate for HPLC	Fluka	17843-50G
Eppendorf Snap-Cap Microcentrifuge Safe-Lock Tubes	Fisher	05-402-25
ESI-L Low Concentration Tuning mix	Agilent	G1969-85000
Fentanyl Analog Screening (FAS) Kit	Cayman Chemical	9003237, 9003286, 9003380, 9003381	kit van 250 synthetische opioïden, 210 fentanyl analogen, verdeeld in een kit en emergente panelversies 1-4
Formic acid Optima LC/MS	Fisher	A117-50
Onyx guard column (5 x 4.6 mm)	Phenomenex	CHO-7649	guard column voor C18 kolommen
Onyx monolithic C18 HPLC column (100 x 4.6 mm)	Phenomenex	CHO-7643	reverse phase C18 LC kolom
Optima grade acetonitrile	Fisher	A996-4
Optima grade methanol	Fisher	A454-4
Optima grade water	Fisher	W7-4
Pipette	Fisher	05-719-510	kit van 1-10 µL, 10-100 µL, en 100-1000 µL pipette
Pipette tips 10µL	Fisher	94060100
Pipette tips 1000µL	Fisher	94056710
Pipette tips 200µL	Fisher	94060310
Plate mixer	IKA	MS 3 D S1	IKA MS 3 digitaal
Prominence LC-20 CE ultrafast liquid chromatograph	Shimadzu, Japan		uitgerust met DGU-20A5, LC-20AD, SIL-20AC, CTO-20A, SPD-M20A, CBM-20A, SPD-20A
timsTOF Pro	Bruker Daltonics Inc., Billerica, MA		timsTOF instrument met PASEF