De hier gepresenteerde methode kan het effect van reagentia op angiogenese of vasculaire permeabiliteit in vivo evalueren zonder kleuring. De methode maakt gebruik van dextran-FITC-injectie via de staartader om neovaten of vasculaire lekkage te visualiseren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Gemodificeerde In Vivo Matrix Gel Plug Assay voor Angiogenesestudies
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Er zijn verschillende modellen ontwikkeld om angiogenese in vivo te onderzoeken. De meeste van deze modellen zijn echter complex en duur, vereisen gespecialiseerde apparatuur of zijn moeilijk uit te voeren voor latere kwantitatieve analyse. Hier presenteren we een gemodificeerde matrix gelplug-assay om angiogenese in vivo te evalueren. In dit protocol werden vasculaire cellen gemengd met matrixgel in de aan- of afwezigheid van pro-angiogene of anti-angiogene reagentia, en vervolgens subcutaan geïnjecteerd in de rug van ontvangende muizen. Na 7 dagen wordt fosfaatbufferzoutoplossing met dextran-FITC via de staartader geïnjecteerd en gedurende 30 minuten in vaten gecirculeerd. Matrixgelpluggen worden verzameld en ingebed met weefselinbeddingsgel, waarna secties van 12 μm worden gesneden voor fluorescentiedetectie zonder kleuring. In deze test kan dextran-FITC met een hoog molecuulgewicht (~150.000 Da) worden gebruikt om functionele vaten aan te duiden voor het detecteren van hun lengte, terwijl dextran-FITC met een laag molecuulgewicht (~4.400 Da) kan worden gebruikt om de permeabiliteit van neovaten aan te geven. Concluderend kan dit protocol een betrouwbare en handige methode bieden voor de kwantitatieve studie van angiogenese in vivo.
Inleiding
Angiogenese, het proces van vorming van neovaten uit reeds bestaande vaten, speelt een cruciale rol in veel fysiologische en pathologische processen, zoals embryonale ontwikkeling, wondgenezing, atherosclerose, tumorontwikkeling, enz.1,2,3,4,5. Dit dynamische proces omvat verschillende stappen, waaronder de afbraak van de matrix, vasculaire celproliferatie, migratie en zelforganisatie om buisvormige structuren te vormen en de stabilisatie van de neovaten6. Het is aangetoond dat het b....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle procedures waarbij proefdieren betrokkenwaren, zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Wenzhou Medical University (XMSQ2021-0057, 19 juli 2021). Alle reagentia en verbruiksartikelen staan vermeld in de materiaaltabel.
1. Bereiding van kweekmedium
- 10x M199 kweekmedium: Los M199-poeder op tot een concentratie van 10x met 90 ml gedeïoniseerd water en voeg 10 ml foetaal runderserum (FBS) toe en passeer vervolgens door een filter van 0,22 μm. Bewaar het medium maximaal 2 maanden bij 4 °C.
- Volledig endotheelkweekmedium: Voeg 50 ml FB....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Figuur 1 is het stroomschema dat laat zien hoe het mengsel van matrixgel, vasculaire cellen, kweekmedium en reagens moet worden bereid. Het mengsel werd vervolgens subcutaan geïnjecteerd in de rug van Nu/Nu-muizen en verwarmd met behulp van een verwarmingskussen om de coagulatie te versnellen om uiteindelijk een gelplug te vormen.
Figuur 2A is het stroomschema om vaten met fluorescerend gelabeld dextran aan te geven. Fluorescerend gel.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
We presenteren een betrouwbare en handige methode voor de kwantitatieve evaluatie van angiogenese in vivo zonder kleuring. In dit protocol werden vasculaire cellen gemengd met matrixgel in aanwezigheid van pro-angiogene of anti-angiogene reagentia, en vervolgens subcutaan geïnjecteerd in de rug van Nu/Nu-muizen om een gelplug te vormen (Figuur 1). Na 7 dagen vorming van gelpluggen werd dextran-FITC intraveneus geïnjecteerd en gedurende 30 minuten gecirculeerd. De gelplug werd verzam.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gefinancierd door de Natural Science Foundation van de provincie Zhejiang (LY22H020005) en de National Natural Science Foundation of China (81873466).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
```html
```
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Adhesion Microscope Slides | CITOTEST | 188105 | |
| Anesthesia System | RWD | R640-S1 | |
| Cell Counter | Invitrogen | AMQAX1000 | |
| Cell Culture Dish | Corning | 430167 | |
| Cryoslicer | Thermo Fisher | CryoStar NX50 | |
| Dextrans-FITC-150kDa | WEIHUA BIO | WH007N07 | |
| Dextrans-FITC-4kDa | WEIHUA BIO | WH007N0705 | |
| Embedding Cassettes | CITOTEST | 80203-0007 | |
| Endothelial Cell Medium | ScienCell | 35809 | |
| Endothelial Growth Supplements | ScienCell | 1025 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10100147C | |
| Fibroblast Growth Factor 1 | AtaGenix | 9043p-082318-A01 | FGF1 |
| Fluorescence Microscope | Nikon | ECLIPSE Ni | |
| Heating Pad | Boruida | 30-50-30 | |
| Insulin Syringe | BD | 300841 | |
| Isoflurane | RWD | R510-22-10 | |
| Laboratory Balance | Sartorius | BSA124S-CW | |
| Matrigel | Corning | 356234 | Matrix gel |
| Medium 199 powder | Gibco | 31100-035 | |
| Microtubes | Axygen | MCT-150-C | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | SUKURA | 4583 | Tissue embedding gel |
| Palmitate Acid | KunChuang | KC001 | |
| Penicillin-Streptomycin Liquid | Solarbio | P1400 | |
| Phosphate Buffer Saline | Solarbio | P1022 | |
| Surgical Instruments | RWD | RWD | |
| Tail Vein Injection Instrument | KEW BASIS | KW-XXY | |
| Trypsin-EDTA Solution | Solarbio | T1320 | |
| Ultra-Low Temperature Freezer | eppendorf | U410 | |
| Vascular Endothelial Growth Factor | CHAMOT | CM058-5HP | VEGF |
Referenties
- Bikfalvi, A. History and conceptual developments in vascular biology and angiogenesis research: a personal view. Angiogenesis. 20 (4), 463-478 (2017).
- Carmeliet, P., Jain, R. Principles and mechanisms of vessel....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
