Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Gemodificeerde In Vivo Matrix Gel Plug Assay voor Angiogenesestudies

2K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65567

⸱

30 juni 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Pingyang Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University, 2School of Pharmaceutical Sciences, Wenzhou Medical University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

De hier gepresenteerde methode kan het effect van reagentia op angiogenese of vasculaire permeabiliteit in vivo evalueren zonder kleuring. De methode maakt gebruik van dextran-FITC-injectie via de staartader om neovaten of vasculaire lekkage te visualiseren.

Samenvatting

Er zijn verschillende modellen ontwikkeld om angiogenese in vivo te onderzoeken. De meeste van deze modellen zijn echter complex en duur, vereisen gespecialiseerde apparatuur of zijn moeilijk uit te voeren voor latere kwantitatieve analyse. Hier presenteren we een gemodificeerde matrix gelplug-assay om angiogenese in vivo te evalueren. In dit protocol werden vasculaire cellen gemengd met matrixgel in de aan- of afwezigheid van pro-angiogene of anti-angiogene reagentia, en vervolgens subcutaan geïnjecteerd in de rug van ontvangende muizen. Na 7 dagen wordt fosfaatbufferzoutoplossing met dextran-FITC via de staartader geïnjecteerd en gedurende 30 minuten in vaten gecirculeerd. Matrixgelpluggen worden verzameld en ingebed met weefselinbeddingsgel, waarna secties van 12 μm worden gesneden voor fluorescentiedetectie zonder kleuring. In deze test kan dextran-FITC met een hoog molecuulgewicht (~150.000 Da) worden gebruikt om functionele vaten aan te duiden voor het detecteren van hun lengte, terwijl dextran-FITC met een laag molecuulgewicht (~4.400 Da) kan worden gebruikt om de permeabiliteit van neovaten aan te geven. Concluderend kan dit protocol een betrouwbare en handige methode bieden voor de kwantitatieve studie van angiogenese in vivo.

Inleiding

Angiogenese, het proces van vorming van neovaten uit reeds bestaande vaten, speelt een cruciale rol in veel fysiologische en pathologische processen, zoals embryonale ontwikkeling, wondgenezing, atherosclerose, tumorontwikkeling, enz.1,2,3,4,5. Dit dynamische proces omvat verschillende stappen, waaronder de afbraak van de matrix, vasculaire celproliferatie, migratie en zelforganisatie om buisvormige structuren te vormen en de stabilisatie van de neovaten6. Het is aangetoond dat het bevorderen van angiogenese van cruciaal belang is bij de behandeling van myocardinfarct, beroerte en andere soorten ischemische ziekten7, terwijl het remmen van angiogenese wordt beschouwd als een veelbelovende strategie bij de behandeling van kankers8 en reumatoïde aandoeningen9. Angiogenese wordt beschouwd als een organiserend principe voor de ontdekking van geneesmiddelen10. De constructie van een betrouwbare en handige methode om de omvang van angiogenese te beoordelen, is dus van cruciaal belang voor mechanisch onderzoek of het ontdekken van geneesmiddelen bij angiogenese-afhankelijke ziekten.

Er zijn verschillende in vitro en in vivo modellen ontwikkeld om angiogenesete evalueren 11. Hiervan kunnen tweedimensionale (2D) modellen, zoals matrix gelbuisvormingstest12, geen functionele buisvormige structuren vormen. De diermodellen, zoals het ischemiemodel13,14 van de achterpoten, kunnen het angiogeneseproces reproduceren, maar zijn complex en vereisen een laserspikkelbeeldvormingssysteem. 3D-modellen van vasculaire morfogenese, zoals matrixgelplug-assay, bieden een eenvoudig platform dat het proces van angiogenese in vivo15 kan nabootsen, maar de detectie van angiogenese vereist immunohistochemie of immunofluorescentiekleuring 16,17,18, die variabel en slecht gevisualiseerd zijn.

Hier beschrijven we een protocol voor een gemodificeerde matrix gel plug assay waarbij vasculaire cellen werden gemengd met matrix gel en subcutaan geïnjecteerd in de rug van muizen om een plug te vormen. In de plug moeten vasculaire cellen de matrix afbreken, zich vermenigvuldigen, migreren en zichzelf organiseren om uiteindelijk functionele bloedvaten te vormen met bloedstroom in de interne omgeving. Daarna wordt fluorescerend gelabeld dextran geïnjecteerd via de staartader, om door de plug te stromen, en het label wordt gevisualiseerd om neovaten aan te geven. De inhoud van angiogenese kan kwantitatief worden geëvalueerd aan de hand van de lengte van de bloedvaten. Deze methode kan functionele vaten vormen die niet kunnen worden geproduceerd in 2D-angiogenesemodellen12, en vereist geen complex kleuringsproces zoals in gewone matrixgelplugtest11. Het vereist ook geen dure specifieke instrumenten zoals laserspikkelbloedstroombeeldvormingssysteem in ischemiemodel 13,14,19 van de achterpoten. Deze methode is veelzijdig, goedkoop, kwantificeerbaar en gemakkelijk uit te voeren, en kan worden gebruikt om het pro- of anti-angiogene vermogen van geneesmiddelen te bepalen of kan worden gebruikt in mechanisch onderzoek dat betrokken is bij angiogenese.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures waarbij proefdieren betrokkenwaren, zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Wenzhou Medical University (XMSQ2021-0057, 19 juli 2021). Alle reagentia en verbruiksartikelen staan vermeld in de materiaaltabel.

1. Bereiding van kweekmedium

  1. 10x M199 kweekmedium: Los M199-poeder op tot een concentratie van 10x met 90 ml gedeïoniseerd water en voeg 10 ml foetaal runderserum (FBS) toe en passeer vervolgens door een filter van 0,22 μm. Bewaar het medium maximaal 2 maanden bij 4 °C.
  2. Volledig endotheelkweekmedium: Voeg 50 ml FBS, 5 ml penicilline/streptomycine en 5 ml endotheelcelgroeisupplement toe aan 460 ml endotheelcelmedium (ECM). Bewaar het medium maximaal 1 maand bij 4 °C.

2. Voorbereiding van vasculaire cellen

  1. Kweek 1 x 105 vasculaire cellen (primair gekweekte endotheelvoorlopercellen14, endotheelcellen of endotheelcellijnen) met 8 ml volledig endotheelkweekmedium in weefselkweekschaal van 100 mm bij 37 °C en 5% CO2 tot 70% confluentie.
  2. Verwijder het kweekmedium en spoel de schaal 2x met 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om losse cellen en vuil te verwijderen. Verwijder PBS en voeg 3 ml 0,25% trypsine met 2,21 mM EDTA toe en incubeer gedurende 1 minuut bij 37 °C.
  3. Neutraliseer de trypsine met 7 ml volledig endotheelkweekmedium en spoel de cellen voorzichtig van het kweekschaaltje. Bevestig de celloslating onder een lichtmicroscoop (40x vergroting).
  4. Vang de celsuspensie op in een buisje van 15 ml en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 400 x g . Verwijder het supernatans en resuspendeer de cellen met 5 ml volledig endotheelkweekmedium.
  5. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer en verplaats de suspensie met 2 x 106 cellen naar een steriele buis van 1,5 ml. Elke plug bevat 1,5 x 106 cellen, extra 25% cellen worden gebruikt in geval van afval. Elke groep bevat minimaal 3 stekkers.
    OPMERKING: Na proeven bleek dat 1,5 x 106 cellen in 300 μL matrixgel leidden tot de juiste ontwikkeling van angiogenese en daarom werd gekozen voor experimenten.
  6. Centrifugeer de celsuspensie bij 400 x g gedurende 5 minuten tot de pelletcellen en verwijder vervolgens het supernatant.

3. Voorbereiding van matrixgel

  1. Koel steriele buisjes van 1,5 ml met celpellets voor in een waterbad van 4 °C. Koel 30 g insulinespuiten van 1 ml voor in een koelkast van 4 °C.
  2. Matrixgel volledig ontdooien in een waterbad van 4 °C. Niet mengen of vortexen. 10x M199 voorkoelen en reagens/geneesmiddel-of-interest testen in een waterbad van 4 °C.
  3. Meng voorgekoelde matrixgel met 10x M199 met 10% FBS en het te testen reagens in een volumeverhouding van 8,8:1:0,2 om een matrixgel en M199-mengsel te krijgen dat 1% FBS en het reagens bevat.
  4. Resuspendeer de cellen met 400 μL van het matrixgelmengsel, meng voorzichtig om belletjes te voorkomen. Houd de buis op ijs totdat de muizen klaar zijn voor injectie. Bewaar het matrixgelmengsel de hele tijd op ijs om stolling te voorkomen.
    OPMERKING: Hier werd 300 μL matrixgelmengsel met 1,5 x 106 cellen gebruikt om een gelplug te vormen. Bereid 25% extra gel volgens 25% extra cellen in stap 2.

4. Voorbereiding van de muis

  1. Verdoof de 6-8 weken oude mannelijke Nu/Nu-muis (18-25 g) in de kamer van het anesthesieapparaat voor dieren met isofluraan (3% isofluraan in 100% zuurstof bij een debiet van 1 l/min). Na succesvolle anesthesie, bevestigd door de afwezigheid van een oprichtreflex en een teenknijpreflex, verplaatst u de muis uit de kamer, verplaatst u de muis uit de kamer en plaatst u een anesthesiemasker op de muis en verandert u de concentratie isofluraan in 1,5% in 100% zuurstof bij een debiet van 1 l/min.
    NOTITIE: Bied het dier thermische ondersteuning met behulp van een verwarmingskussen tijdens de procedure.
  2. Gebruik dierenartszalf op de ogen om uitdroging te voorkomen. Plak de ledematen van de muizen op het operatiebord in buikligging.

5. Injectie van het matrixgelmengsel

  1. Doe 300 μL van het matrixgelmengsel in een insulinespuit van 1 ml met een naald van 30 G. Vermijd luchtbelvorming. Laad de matrixgel snel (binnen 2 minuten) om stollen gedurende deze tijd te voorkomen. Plaats de insulinespuit gevuld met matrixgel onmiddellijk op ijs.
  2. Reinig de huid op de rug van muizen met 75% alcoholpads. Injecteer subcutaan 300 μL matrixgelmengsel in één kant van de rug van muizen.
  3. Verwijder de naald voorzichtig van de injectieplaats om lekkage van het matrixgelmengsel te voorkomen. Controleer of er een kleine bult op de injectieplaats is (Figuur 1).
  4. Plaats de muis 2 minuten op het verwarmingskussen om het matrixgelmengsel te laten stollen en een plug te vormen.
  5. Herhaal stap 5.2. tot en met 5.4. om een plug aan de andere kant van de achterkant van de muis te maken. Markeer de randen van de bulten met een markeerstift.
  6. Observeer de muis totdat deze weer voldoende bij bewustzijn is om sternale lighouding te behouden. Plaats de muis in een aparte kooi totdat deze volledig is hersteld. Huisvest de muizen in proefdierlaboratorium van SPF-klasse bij 22 ± 2 °C met een licht/donkercyclus van 12 uur gedurende 7 dagen.

6. Dextran-FITC-injectie via de staartader

  1. Na 7 dagen matrixgelinjectie 0,5 mg dextran-FITC resuspenderen met 500 μL dubbel gedestilleerd water (ddH2O) en vervolgens krachtig vortex om de dextran-FITC-oplossing te verkrijgen in de uiteindelijke concentratie van 1 μg/μL.
    OPMERKING: Gebruik dextran-FITC met een molecuulgewicht van ~150 kDa voor angiogenese-test en gebruik dextran-FITC met een molecuulgewicht van ~4 kDa voor vasculaire permeabiliteitstest.
  2. Doe 50 μl dextran-FITC-oplossing in de 29G-spuiten.
  3. Bevestig de muis op het injectie-instrument voor de staartader. Reinig de staart met een watje met 75% alcohol en injecteer voorzichtig 50 μL dextran-FITC door de staartader.
  4. Druk de injectieplaats gedurende 1 minuut samen met een wattenstaafje om het bloeden te stelpen en plaats de muizen vervolgens 30 minuten terug in de kooi.
  5. Herhaal stap 6.3. en 6.4. totdat alle muizen een dextran-FITC-injectie hebben gekregen.

7. Matrix gel plug collectie

  1. Injecteer intraperitoneaal 1% pentobarbitalnatrium in PBS (200 mg/kg lichaamsgewicht) en euthanaseer de muizen met een door de IACUC goedgekeurde procedure.
  2. Knip de huid langs de gemarkeerde rand van de plug af met een chirurgische schaar en verwijder de huid boven de matrixgelplug.
  3. Vang de plug op en spoel deze af in een klein bekerglas met 1x PBS om overtollig bloed weg te spoelen (Figuur 2A). De kleur van de plug kan ruwweg de mate van bloedovervloed en het gehalte aan neovaten afbakenen (Figuur 3A).

8. Inbedding van matrixgelplug en sectievoorbereiding

  1. Bedek de knop van de weefselinbeddingscassette met ongeveer 0.5 ml weefselinbeddingsgel en plaats vervolgens onmiddellijk de matrixgelplug op de weefselinbeddingsgel in de gewenste richting zoals weergegeven in afbeelding 2B. Sluit vervolgens de plug in met extra weefselinbeddingsgel.
  2. Zet de cassettes 12 uur in een vriezer van -80 °C om te stollen.
  3. Voor de voorbereiding van dikke secties verwijdert u het gestolde plugblok en snijdt u 12 μm dikke secties met behulp van de vriesmicrotoom volgens de instructie en monteert u deze op microscoopglaasjes.
  4. Snijd 5-10 secties van elk plugblok.

9. Kwantificering van angiogenese (figuur 3)

  1. Verkrijg fluorescentiebeelden van 5 onafhankelijke velden van de sectie met een omgekeerde fluorescentiemicroscoop bij een golflengte van 488 nm bij een vergroting van 10x.
  2. Open het afbeeldingsbestand met Image J-software (https://imagej.en.softonic.com/) en klik op de knop Angiogenesis Analyze . Klik vervolgens op HUVEC Phase Contrast analyseren knop en schakel over naar Tabel met statresultaten om informatie te verzamelen. Meet alle 5 verkregen fluorescentiebeelden voor elke sectie.
  3. Analyseer de totale lengte van neo-vaten uit verschillende groepen om het verschil in angiogenese tussen deze groepen statistisch te evalueren.
    OPMERKING: De totale lengte van de hoofdsegmenten geeft de totale lengte van neo-schepen aan. Het reagens dat de lengte van neovaten vergroot, wordt pro-angiogeen genoemd, terwijl het reagens dat de lengte van neovaten verkleint, anti-angiogeen is.

10. Kwantificering van de vasculaire permeabiliteit (figuur 4)

  1. Verkrijg fluorescentiebeelden van 5 onafhankelijke velden van de sectie met een omgekeerde fluorescentiemicroscoop bij een golflengte van 488 nm onder een vergroting van 20x.
  2. Open het afbeeldingsbestand met Image J-software. Klik op de knop Selectie uit de vrije hand en omcirkel het lekgebied, klik vervolgens op het menu Analyseren en selecteer de optie Meten om de gebiedsinformatie van het lekgebied te krijgen. Gebruik de verhouding tussen het lekgebied en het beeldgebied om de vasculaire permeabiliteit aan te geven.
  3. Analyseer de verhouding tussen het lekgebied en het gebied van het beeld van verschillende groepen om het verschil in vasculaire permeabiliteit tussen deze groepen statistisch te evalueren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Figuur 1 is het stroomschema dat laat zien hoe het mengsel van matrixgel, vasculaire cellen, kweekmedium en reagens moet worden bereid. Het mengsel werd vervolgens subcutaan geïnjecteerd in de rug van Nu/Nu-muizen en verwarmd met behulp van een verwarmingskussen om de coagulatie te versnellen om uiteindelijk een gelplug te vormen.

Figuur 2A is het stroomschema om vaten met fluorescerend gelabeld dextran aan te geven. Fluorescerend gel...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

We presenteren een betrouwbare en handige methode voor de kwantitatieve evaluatie van angiogenese in vivo zonder kleuring. In dit protocol werden vasculaire cellen gemengd met matrixgel in aanwezigheid van pro-angiogene of anti-angiogene reagentia, en vervolgens subcutaan geïnjecteerd in de rug van Nu/Nu-muizen om een gelplug te vormen (Figuur 1). Na 7 dagen vorming van gelpluggen werd dextran-FITC intraveneus geïnjecteerd en gedurende 30 minuten gecirculeerd. De gelplug werd verzam...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door de Natural Science Foundation van de provincie Zhejiang (LY22H020005) en de National Natural Science Foundation of China (81873466).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Adhesion Microscope SlidesCITOTEST188105
Anesthesia SystemRWDR640-S1
Cell CounterInvitrogenAMQAX1000
Cell Culture DishCorning430167
CryoslicerThermo FisherCryoStar NX50
Dextrans-FITC-150kDaWEIHUA BIOWH007N07
Dextrans-FITC-4kDaWEIHUA BIOWH007N0705
Embedding CassettesCITOTEST80203-0007
Endothelial Cell MediumScienCell35809
Endothelial Growth SupplementsScienCell1025
Fetal Bovine SerumGibco10100147C
Fibroblast Growth Factor 1AtaGenix9043p-082318-A01FGF1
Fluorescence MicroscopeNikonECLIPSE Ni
Heating PadBoruida30-50-30
Insulin SyringeBD300841
IsofluraneRWDR510-22-10
Laboratory BalanceSartoriusBSA124S-CW
MatrigelCorning356234Matrix gel
Medium 199 powderGibco31100-035
MicrotubesAxygenMCT-150-C
Optimal Cutting Temperature (OCT) CompoundSUKURA4583Tissue embedding gel
Palmitate AcidKunChuangKC001
Penicillin-Streptomycin LiquidSolarbioP1400
Phosphate Buffer SalineSolarbioP1022
Surgical InstrumentsRWDRWD
Tail Vein Injection InstrumentKEW BASISKW-XXY
Trypsin-EDTA SolutionSolarbioT1320
Ultra-Low Temperature FreezereppendorfU410
Vascular Endothelial Growth FactorCHAMOTCM058-5HPVEGF
```

Referenties

  1. Bikfalvi, A. History and conceptual developments in vascular biology and angiogenesis research: a personal view. Angiogenesis. 20 (4), 463-478 (2017).
  2. Carmeliet, P., Jain, R. Principles and mechanisms of vessel normalization for cancer and other angiogenic diseases. Nature reviews Drug discovery. 10 (6), 417-427 (2011).
  3. De Palma, M., Biziato, D., Petrova, T. Microenvironmental regulation of tumour angiogenesis. Nature reviews Cancer. 17 (8), 457-474 (2017).
  4. Griffioen, A., Molema, G. Angiogenesis: potentials for pharmacologic intervention in the treatment of cancer, cardiovascular diseases, and chronic inflammation. Pharmacological reviews. 52 (2), 237-268 (2000).
  5. Viallard, C., Larrivée, B. Tumor angiogenesis and vascular normalization: alternative therapeutic targets. Angiogenesis. 20 (4), 409-426 (2017).
  6. Craig, M., Sumanas, S. ETS transcription factors in embryonic vascular development. Angiogenesis. 19 (3), 275-285 (2016).
  7. Losordo, D., Dimmeler, S. Therapeutic angiogenesis and vasculogenesis for ischemic disease. Part I: angiogenic cytokines. Circulation. 109 (21), 2487-2491 (2004).
  8. Folkman, J. Anti-angiogenesis-new concept for therapy of solid tumors. Annals of Surgery. 175 (3), 409-416 (1972).
  9. Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).
  10. Folkman, J. Opinion - Angiogenesis: an organizing principle for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 6 (4), 273-286 (2007).
  11. Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).
  12. Fan, X., et al. Interleukin-1β augments the angiogenesis of endothelial progenitor cells in an NF-κB/CXCR7-dependent manner. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 24 (10), 5605-5614 (2020).
  13. Dai, X., et al. Nrf2 transcriptional upregulation of IDH2 to tune mitochondrial dynamics and rescue angiogenic function of diabetic EPCs. Redox Biology. 56, 102449(2022).
  14. Yan, X., et al. Liraglutide Improves the Angiogenic Capability of EPC and Promotes Ischemic Angiogenesis in Mice under Diabetic Conditions through an Nrf2-Dependent Mechanism. Cells. 11 (23), 3821(2022).
  15. Koh, W., Stratman, A., Sacharidou, A., Davis, G. In vitro three dimensional collagen matrix models of endothelial lumen formation during vasculogenesis and angiogenesis. Methods in enzymology. 443, 83-101 (2008).
  16. Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425-532 (2018).
  17. Malinda, K. In vivo matrigel migration and angiogenesis assay. Methods in molecular biology (Clifton, NJ). , 287-294 (2009).
  18. Rezzola, S., et al. In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays. Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).
  19. Dai, Q., et al. FGF21 promotes ischaemic angiogenesis and endothelial progenitor cells function under diabetic conditions in an AMPK/NAD+-dependent manner. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 25 (6), 3091-3102 (2021).
  20. Gavard, J., Gutkind, J. S. VEGF controls endothelial-cell permeability by promoting the beta-arrestin-dependent endocytosis of VE-cadherin. Nature cell biology. 8 (11), 1223-1234 (2006).
  21. Birdsey, G. M., et al. The endothelial transcription factor ERG promotes vascular stability and growth through Wnt/β-catenin signaling. Developmental Cell. 32 (1), 82-96 (2015).
  22. Yan, X., et al. A Novel CXCR4 antagonist enhances angiogenesis via modifying the ischaemic tissue environment. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 21 (10), 2298-2307 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Angiogenese assayIn vivo angiogeneseVasculaire cellenVaatpermeabiliteitDextran FITCEndotheelcultuurSubcutane injectieInbedding van weefselFluorescentiedetectie
Gemodificeerde In Vivo Matrix Gel Plug Assay voor Angiogenesestudies
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleid

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.