Hier wordt een systeem gerapporteerd voor het bestuderen van het collectieve gedrag van nematoden door ze in bulk te kweken met behulp van hondenvoer-agarmedium. Dit systeem stelt onderzoekers in staat om grote aantallen dauerwormen te vermeerderen en kan worden toegepast op Caenorhabditis elegans en andere verwante soorten.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Het op grote schaal kweken van nematoden om hun collectieve gedrag te bestuderen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Dieren vertonen dynamisch collectief gedrag, zoals waargenomen bij zwermen vogels, scholen vissen en mensenmassa's. Het collectieve gedrag van dieren is onderzocht op het gebied van zowel biologie als natuurkunde. In het laboratorium gebruiken onderzoekers al ongeveer een eeuw verschillende modeldieren zoals de fruitvlieg en zebravis, maar het is een grote uitdaging gebleven om grootschalig complex collectief gedrag te bestuderen dat door deze genetisch handelbare modeldieren wordt georkestreerd. Dit artikel presenteert een protocol om een experimenteel systeem van collectief gedrag te creëren in Caenorhabditis elegans. De vermeerderde wormen klimmen op het deksel van de petriplaat en vertonen collectief zwermgedrag. Het systeem regelt ook de interacties en het gedrag van wormen door de vochtigheid en lichtstimulatie te veranderen. Dit systeem stelt ons in staat om de mechanismen te onderzoeken die ten grondslag liggen aan collectief gedrag door omgevingsomstandigheden te veranderen en de effecten van voortbeweging op individueel niveau op collectief gedrag met behulp van mutanten te onderzoeken. Het systeem is dus nuttig voor toekomstig onderzoek in zowel de natuurkunde als de biologie.
Inleiding
Zowel niet-wetenschappers als wetenschappers zijn gefascineerd door het collectieve gedrag van dieren, zoals in zwermen vogels en scholen vissen. Collectief gedrag is geanalyseerd op een breed scala van gebieden, waaronder natuurkunde, biologie, wiskunde en robotica. In het bijzonder is de fysica van actieve materie een groeiend onderzoeksveld dat zich richt op systemen die zijn samengesteld uit zelfrijdende elementen, dat wil zeggen dissipatieve systemen, zoals zwermen vogels, scholen vissen, biofilms van beweeglijke bacteriën, cytoskeletten die zijn samengesteld uit actieve moleculen en groepen zelfrijdende colloïden. De theorie van de fysica van de actieve materie stelt dat hoe complex het gedrag van individuen ook is, de collectieve bewegingen van enorme aantallen levende wezens worden beheerst door een klein aantal eenvoudige regels. Het Vicsek-model, een kandidaat voor een uniforme beschrijving van de collectieve beweging van zelfrijdende deeltjes, voorspelt bijvoorbeeld dat de uitlijningsinteractie op korte afstand van bewegende objecten nodig is om een geordende fase op lange afstand te vormen met excentrische fluctuaties in 2D, zoals in kuddesdieren1. Top-down experimentele benaderingen met betrekking tot de fysica van actieve materie ontwikkelen zich snel. Eerdere experimenten bevestigden de vorming van een geordende fase op lange afstand in Escherichia coli2. Andere recente werken gebruikten cellen 3,4, bacteriën5, beweeglijke colloïden6 of bewegende eiwitten 7,8. Eenvoudige minimale modellen zoals het Vicsek-model beschreven met succes deze echte fenomenen. In tegenstelling tot deze eencellige experimentele systemen, wordt collectief gedrag van dieren meestal in het wild waargenomen, omdat niemand zou kunnen hopen gecontroleerde experimenten uit te voeren met 10.000 echte vogels of vissen.
Biologen delen dezelfde interesse als natuurkundigen: hoe individuen met elkaar omgaan en zich functioneel gedragen als een groep. Een van de traditionele onderzoeksgebieden voor het analyseren van individueel gedrag is de neurowetenschappen, waarin de mechanismen die ten grondslag liggen aan gedrag zijn onderzocht op neuronaal en moleculair niveau. Tot nu toe zijn er veel neurowetenschappelijke bottom-up benaderingen ontwikkeld. Top-down benaderingen in de natuurkunde en bottom-up benaderingen in de biologie kunnen worden gefaciliteerd met behulp van modeldieren zoals de fruitvlieg, de worm Caenorhabditis elegans en de muis9. Er zijn echter weinig bevindingen over het grootschalige collectieve gedrag van deze modeldieren in het laboratorium10; Het is nog steeds moeilijk om genetisch handelbare modeldieren op grote schaal in het laboratorium te bereiden. Daarom is het in het huidige onderzoek naar collectief gedrag in de biologie en natuurkunde moeilijk geweest voor wetenschappers die gewoonlijk onderzoek doen in het laboratorium om het collectieve gedrag van dieren te bestuderen.
In deze studie hebben we een methode ontwikkeld voor de grootschalige teelt van nematoden om hun collectieve gedrag te bestuderen. Dit systeem stelt ons in staat om omgevingsomstandigheden te veranderen en het effect van voortbeweging op individueel niveau op collectief gedrag te onderzoeken met behulp van mutanten10. In de fysica van actieve materie kunnen de parameters van het wiskundige model worden gecontroleerd in zowel experimenten als simulaties, waardoor verificatie van dat model mogelijk is voor het identificeren van uniforme beschrijvingen. Genetica wordt gebruikt om het neurale circuitmechanisme te begrijpen dat ten grondslag ligt aan collectief gedrag11.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Bereiding van wormen
OPMERKING: Bereid de wildtype N2 Bristol stam12 en ZX899 stam (lite-1(ce314); ljIs123[mec-4p::ChR2, unc-122p::RFP])13 voor op de observatie van respectievelijk collectief gedrag en optogenetische experimenten. Onderhoud de ZX899-soort onder donkere omstandigheden.
- Deponeer vier goed gevoede volwassen wormen op een plaat van 60 mm met 14 ml nematodengroeimedium (NGM) met agar en bezaaid met E. coli OP5012.
- Kweek F1-wormen tot verhongering in de NGM-plaat bij 23 °C gedurende 7 dagen. De opbrengst van F1-wormen is op dit moment ongeveer 100 wormen/plaat. De stadia van wormen bestaan uit een gemengde populatie van dauer en uitgehongerde L1-larven.
2. Bereiding van middelgrote borden met hondenvoeragar (DFA)
- Autoclaaf een glazen fles met 2 g hondenvoer in poedervorm en 5 ml 1% agarmedium en koel deze af tot kamertemperatuur (Figuur 1A).
OPMERKING: In dit experiment kan ander hondenvoer van verschillende fabrikanten worden gebruikt.
3. Inoculatie van wormen op DFA-mediumplaten
- Breng kleine hoeveelheden (ongeveer 0,5 g) DFA-medium over in het midden van een NGM-plaat die is ingezaaid met E. coli OP50 (Figuur 1B). Giet voor optogenetische experimenten 40 μL 50 μM all-trans-retinal, de cofactor van kanaal rodopsine 2, op de DFA voordat wormen worden geïnoculeerd.
- Verzamel de uitgehongerde wormen van vier NGM-platen met behulp van geautoclaveerd water.
- Leg een klein stukje hondenvoer (ongeveer 0,5 g) op het DFA-medium, op ongeveer 2 mm afstand van het deksel van het bord.
- Verlicht de NGM-plaat gedurende 15 minuten met ultraviolet licht op een schone bank om besmetting te voorkomen.
- Inoculeer de verzamelde wormen (ongeveer 400 wormen) op het DFA-medium op NGM-platen. Sluit de plaat niet af met parafilm om te voorkomen dat de luchtvochtigheid in de petriplaat toeneemt en waterdruppels ontstaan die wormen op een deksel vangen.
- Vermeerder de wormen bij 23 °C en laat ze ongeveer 10-14 dagen tot aan het deksel van het bord klimmen.
OPMERKING: Omdat het aantal wormen op de deksels na 10-14 dagen nauwelijks toenam, werd aangenomen dat de wormen waarschijnlijk geen voedsel meer hadden.
4. Observatie van collectief gedrag
- Plaats op de dag van het experiment een nieuwe NGM-plaat zonder E. coli en agarmedium voor hondenvoer op een aluminium plaat op de tafel van een macrozoommicroscoop (Figuur 2A). Houd de onderkant van deze nieuwe NGM-plaat minimaal 5 minuten op 23 °C met behulp van een Peltier-temperatuurregelaar (Figuur 2B). Vervang vervolgens het deksel van deze nieuwe NGM-plaat door het deksel van de plaat waar de wormen op zijn geklommen. Gebruik de objectieflens (x2, NA = 0.5) als een objectief met een lage vergroting (Figuur 2A).
- Verhoog de temperatuur van de onderkant van de petriplaat van 23 °C naar 26 °C om de vochtigheid in die plaat te veranderen (Figuur 2).
- Maak beelden van het binnenoppervlak van het plaatdeksel met de camera op 20 frame s−1 (aanvullende video S1).
- Sla de verkregen afbeeldingen op in het Tagged Image File-formaat.
5. Optogenetisch experiment
- Gebruik een kwiklamp van 100 W om blauw licht te leveren, gefilterd met een filterset. Regel de verlichtingstijd nauwkeurig met behulp van een elektromagnetisch sluitersysteem (afbeelding 2B).
- Houd de ZX899 onder deze omstandigheden gedurende 5 minuten op DFA voordat het blauw licht gaat branden.
- Verlicht ZX899-wormen die aan het deksel van een petriplaat zijn bevestigd op de microscooptafel die op 23 °C wordt gehouden.
- Maak beelden van het binnenoppervlak van het plaatdeksel met een camera op 20 frame s−1 (aanvullende video S2).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Hier werden wild-type dauer-wormen gebruikt voor collectieve gedragsobservaties. Wormen werden gedurende ongeveer 10-14 dagen bij 23 °C gekweekt en klommen naar het binnenoppervlak van het deksel van een DFA-mediumplaat. Op de experimentele dag werd alleen het deksel overgebracht op een nieuwe NGM-plaat zonder E. coli en DFA-medium. De onderkant van deze petriplaat werd aanvankelijk op 23 °C gehouden met behulp van het Peltier-systeem, waarna de temperatuur werd verhoogd tot 26 °C. Er werd een film onder de mic...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In deze studie tonen we een protocol voor het voorbereiden van een systeem voor het grootschalige collectieve gedrag van C. elegans in het laboratorium. De op DFA gebaseerde methode werd oorspronkelijk vastgesteld met Caenorhabditis japonica14 en Neoaplectana carpocapsae Weiser15, die beide niet-modeldieren zijn. Deze methode werd echter niet toegepast om collectief gedrag te onderzoeken. De C. elegans is een genetisch handelbaar modeldie...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Dankbetuigingen
We danken het Caenorhabditis Genetics Center voor het leveren van de soorten die in dit onderzoek zijn gebruikt. Deze publicatie werd ondersteund door JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Scientific Research (B) (subsidienummer JP21H02532), JSPS KAKENHI Grant-in-Aid op het project Innovative Areas "Science of Soft Robot" (subsidienummer JP18H05474), JSPS KAKENHI Grant-in-Aid for Transformative Research Areas B (subsidienummer JP23H03845), de PRIME van het Japanse Agentschap voor Medisch Onderzoek en Ontwikkeling (subsidienummer JP22gm6110022h9904), JST-Mirai-programma (subsidienummer JPMJMI22G3), en het JST-FOREST-programma (subsidienummer JPMJFR214R).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Escherichia coli en C. elegans stammen | |||
| E. coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center | OP50 | Voedsel voor C. elegans. Uracil auxotroof. E. coli B. |
| lite-1(ce314); ljIs123[mec-4p::ChR2, unc-122p::RFP] | auteur | ZX899 | lite-1(ce314) mutant dragende de genen die ChR2 en RFP tot expressie brengen onder de controle van de mec-4 en unc-122 promotor, respectievelijk |
| N2 Bristrol | Caenorhabditis Genetics Center | Wild-type C. elegans stam | |
| Voor wormcultivatie | |||
| Agar gezuiverd, poeder | Nakarai tesque | 01162-15 | Voor bereiding van NGM platen |
| All-trans retinal | Sigma-Aldrich | R2500 | Voor optogenetica |
| Bacto pepton | Becton Dickinson | 211677 | Voor bereiding van NGM platen |
| Calcium chloride | Wako | 036-00485 | Voor bereiding van NGM platen |
| Cholesterol | Wako | 034-03002 | Voor bereiding van NGM platen |
| di-Photassium hydrogenfosfaat | Nakarai tesque | 28727-95 | Voor bereiding van NGM platen |
| Hondenvoer | Nihon Pet Food | VITA-ONE | Voor bereiding van hondenvoer agar medium |
| LB bouillon, Lennox | Nakarai tesque | 20066-95 | Voor cultivatie van E. coli OP50 |
| Magnesium sulfate watervrij | TGI | M1890 | Voor bereiding van NGM platen |
| Petri schotels (60 mm) | Nunc | 150270 | Voor bereiding van NGM platen |
| Kalium Diwaterstoffosfaat | Nakarai tesque | 28720-65 | Voor bereiding van NGM platen |
| Natrium Chloride | Nakarai tesque | 31320-05 | Voor bereiding van NGM platen |
| Observatie | |||
| Computer | CT oplossing | CS6229 | Windows10 Pro met Intel Xeon Gold 6238R CPU en 768 GB RAM |
| CMOS Camera | Hamamatsu photonics | ORCA-Lightning C14120-20P | Voor data-acquisitie |
| CMOS Camera | Olympus | DP74 | Voor data-acquisitie |
| Microscoop met SZX-MGFP set | Olympus | MVX10 | Voor data-acquisitie |
| x2 Objectieflens | Olympus | MV PLAPO 2XC | Werkafstand 20 mm en numerieke apertuur 0.5 |
| Shutter controle | |||
| Shutter | OptoSigma | BSH2-RIX | Voor het controleren van het tijdelijke patroon van lichtverlichting |
| Shutter controller | OptoSigma | SSH-C2B-A | Voor het controleren van het tijdelijke patroon van lichtverlichting |
| Temperatuur controle | |||
| Peltier temperatuurregelaar | VICS | WLVPU-30 | Voor het regelen van de luchtvochtigheid binnen een Petri schotel |
| UNI-THEMO CONTROLLER | Ampere | UTC-100 | Voor het regelen van de luchtvochtigheid binnen een Petri schotel |
| Data acquisitie software | |||
| HCImage | Hamamatsu photonics | Voor data-acquisitie |
Referenties
- Vicsek, T., Czirók, A., Ben-Jacob, E., Cohen, I., Shochet, O. Novel type of phase transition in a system of self-driven particles. Physical Review Letters. 75 (6), 1226-1229 (1995).
- Nishiguchi, D., Nagai, K. H., Chaté, H., Sano, M. Long-range nematic order and anomalous fluctuations in suspensions of swimming filamentous bacteria. Physical Review E. 95 (2), 020601-020606 (2017).
- Saw, T. B., et al. Topological defects in epithelia govern cell death and extrusion. Nature. 544 (7649), 212-216 (2017).
- Kawaguchi, K., Kageyama, R., Sano, M. Topological defects control collective dynamics in neural progenitor cell cultures. Nature. 545 (7654), 327-331 (2017).
- Chen, C., Liu, S., Shi, X., Chaté, H., Wu, Y. Weak synchronization and large-scale collective oscillation in dense bacterial suspensions. Nature. 542 (7640), 210-214 (2017).
- Bricard, A., Caussin, J. -B., Desreumaux, N., Dauchot, O., Bartolo, D. Emergence of macroscopic directed motion in populations of motile colloids. Nature. 503 (7474), 95-98 (2013).
- Sumino, Y., et al. Large-scale vortex lattice emerging from collectively moving microtubules. Nature. 483 (7390), 448-452 (2012).
- Schaller, V., Weber, C., Semmrich, C., Frey, E., Bausch, A. R. Polar patterns of driven filaments. Nature. 467 (7311), 73-77 (2010).
- Lin, A., et al. Imaging whole-brain activity to understand behaviour. Nature Reviews Physics. 4 (5), 292-305 (2022).
- Sugi, T., Ito, H., Nishimura, M., Nagai, K. H. C. elegans collectively forms dynamical networks. Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: a primer on Caenorhabditis elegans. Genetics. 200 (2), 387-407 (2015).
- Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).
- Stirman, J. N., et al. Real-time multimodal optical control of neurons and muscles in freely behaving Caenorhabditis elegans. Nature Methods. 8 (2), 153-158 (2011).
- Tanaka, R., Okumura, E., Yoshiga, T. A simple method to collect phoretically active dauer larvae of Caenorhabditis japonica. Nematological Research. 40 (1), 7-12 (2010).
- Hara, A. H., Lindegren, J. E., Kaya, H. K. Monoxenic mass production of the entomogenous nematode Neoaplectana carpocapsae. Weiser on dog food/agar medium. 16, 1-8 (1981).
- de Bono, M., Bargmann, C. I. Natural variation in a neuropeptide Y receptor homolog modifies social behavior and food response in C. elegans. Cell. 94 (5), 679-689 (1998).
- Artyukhin, A. B., Yim, J. J., Cheong, M. C., Avery, L. Starvation-induced collective behavior in C. elegans. Scientific Reports. 5, 10647(2015).
- Ding, S. S., Schumacher, L. J., Javer, A. E., Endres, R. G., Brown, A. E. Shared behavioral mechanisms underlie C. elegans aggregation and swarming. eLife. 8, 1181(2019).
- Chen, Y., Ferrell, J. E. C. elegans colony formation as a condensation phenomenon. Nature Communications. 12 (1), 4947(2021).
- Chiba, T., et al. Caenorhabditis elegans transfers across a gap under an electric field as dispersal behavior. Current Biology. 33 (13), 2668-2677 (2023).
- Ioannou, C. C., Guttal, V., Couzin, I. D. Predatory fish select for coordinated collective motion in virtual prey. Science. 337 (6099), 1212-1215 (2012).
- Couzin, I. D., Krause, J., Franks, N. R., Levin, S. A. Effective leadership and decision-making in animal groups on the move. Nature. 433 (7025), 513-516 (2005).
- Sumpter, D. J. T., Krause, J., James, R., Couzin, I. D., Ward, A. J. W. Consensus decision making by fish. Current Biology: CB. 18 (22), 1773-1777 (2008).
- Sugi, T., Nishida, Y., Mori, I. Regulation of behavioral plasticity by systemic temperature signaling in Caenorhabditis elegans. Nature Neuroscience. 14 (8), 984-992 (2011).
- Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8269-8274 (2014).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
