Fenotypische profilering van dopaminerge neuronen in de middenhersenen van menselijke stamcellen

Summary

Dit protocol beschrijft de celkweek van dopaminerge neuronen in de middenhersenen, gevolgd door immunologische kleuring en het genereren van neuronale fenotypische profielen op basis van verworven microscopisch kleine beelden met een hoog gehalte die de identificatie van fenotypische variaties als gevolg van genetische of chemische modulaties mogelijk maken.

Abstract

De ziekte van Parkinson (PD) is gekoppeld aan een reeks celbiologische processen die dopaminerge (mDA) neuronenverlies in de middenhersenen veroorzaken. Veel van de huidige in vitro PD-cellulaire modellen missen complexiteit en houden geen rekening met meerdere fenotypes. Fenotypische profilering in humaan geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC)-afgeleide mDA-neuronen kan deze tekortkomingen aanpakken door tegelijkertijd een reeks neuronale fenotypes in een PD-relevant celtype parallel te meten. Hier beschrijven we een protocol voor het verkrijgen en analyseren van fenotypische profielen van in de handel verkrijgbare menselijke mDA-neuronen. Een neuronspecifiek fluorescerend kleuringspaneel wordt gebruikt om de nucleaire, α-synucleïne, tyrosinehydroxylase (TH) en microtubuli-geassocieerd proteïne 2 (MAP2) gerelateerde fenotypes te visualiseren. Het beschreven fenotypische profileringsprotocol is schaalbaar omdat het gebruik maakt van platen met 384 putjes, automatische vloeistofverwerking en high-throughput microscopie. Het nut van het protocol wordt geïllustreerd met behulp van gezonde donor mDA-neuronen en mDA-neuronen die de PD-gekoppelde G2019S-mutatie dragen in het Leucine-rijke repeat kinase 2 (LRRK2)-gen. Beide cellijnen werden behandeld met de LRRK2-kinaseremmer PFE-360 en fenotypische veranderingen werden gemeten. Daarnaast laten we zien hoe multidimensionale fenotypische profielen kunnen worden geanalyseerd met behulp van clustering of machine learning-gestuurde gesuperviseerde classificatiemethoden. Het beschreven protocol zal vooral interessant zijn voor onderzoekers die werken aan het modelleren van neuronale ziekten of het bestuderen van effecten van chemische verbindingen in menselijke neuronen.

Introduction

Bij de ziekte van Parkinson (PD) zijn verschillende celbiologische processen verstoord. Mitochondriale disfunctie, oxidatieve stress, eiwitafbraakdefecten, verstoring van vesiculaire handel en endolysosomale functie zijn bijvoorbeeld vaak in verband gebracht met dopaminerge (mDA) neuronenverlies in de middenhersenen, worden vaak waargenomen bij PD¹. Daarom lijkt PD meerdere ziektemechanismen te omvatten die met elkaar kunnen interageren en elkaar kunnen verergeren. Een nuttige manier om dit mechanistische samenspel te onderzoeken, is het creëren van een uitgebreide fenotypische vingerafdruk of profiel van dopaminerge (mDA) neuronen in de midden....

Protocol

1. Voorbereiding van medium en platen voor het zaaien van neuronen (dag 1)

1. Om de platen voor te bereiden op het zaaien van neuronen op dag 1, verwarmt u laminine vlak voor gebruik tot kamertemperatuur (RT). Bereid de laminineoplossing voor door de laminine-stockoplossing (0,1 mg/ml) 1/10 te verdunnen in koud PBS+/+ (met Ca 2+ en Mg²⁺).
   OPMERKING: Alle reagentia staan vermeld in de materiaaltabel. De samenstelling van oplossingen en buffers wordt beschreven in de tabellen 1 tot en met 4.
2. Voeg vervolgens 25 μL van de laminineoplossing toe aan elk putje van een Poly-D-Lysine (....

Results

Fenotypische profilering in mDA-neuronen is een efficiënte manier om meerdere aspecten van cellulaire biologie en hun veranderingen tijdens de experimentele modulatie te kwantificeren. Om deze methodologie te illustreren, maakte deze studie gebruik van gecryopreserveerde LRRK2 G2019S en gezonde donor mDA-neuronen. Deze neuronen zijn ongeveer 37 dagen gedifferentieerd, zijn postmitotische en tot expressie gebrachte neuronale markers (TUBB3 en MAP2) en dopaminerge neuronenmarkers, waaronder tyrosinehydroxylase (TH) in comb.......

Discussion

Fenotypische profilering is een techniek om een groot aantal fenotypes in cellen te meten door fluorescerende kleuringen, microscopie en beeldanalyse toe te passen^. Fenotypische profielen kunnen worden verkregen en vergeleken tussen cellijnen of andere experimentele omstandigheden om complexe veranderingen in de celbiologie te begrijpen die onopgemerkt kunnen blijven bij het gebruik van een enkele uitlezing. Hier beschrijven we de toepassing van fenotypische profilering op menselijke iPSC-afgeleid.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti- chicken – Alexa 647	Jackson ImmunoRearch	703-605-155	Immunofluorescence
Anaconda		https://www.anaconda.com/download
Anti-Map2	Novus	NB300-213	Immunofluorescence
Anti-mouse - Alexa 488	Thermo Fisher	A11001	Immunofluorescence
Anti-rabbit - Alexa 555	Thermo Fisher	A21429	Immunofluorescence
Anti-Tyrosine Hydroxylase	Merck	T2928	Immunofluorescence
Anti-α-synuclein	Abcam	138501	Immunofluorescence
Bravo Automated Liquid Handling Platform with 384ST head	Agilent		If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Confocal microscope	Yokogawa	CV7000	The use of an automated confocal fluorescence microscope is recommended to ensure image quality consistency.
Countess Automated cell counter	Invitrogen		Cell counting before seeding. Can also be done using a manual counting chamber.
DPBS +/+	Gibco	14040-133	Buffer for washing
EL406 Washer Dispenser	BioTek (Agilent)		If no liquid handler is available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Formaldehyde Solution (PFA 16 %)	Euromedex	EM-15710-S	Fixation before staining
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	Nuclear staining
iCell Base Medium 1	Fujifilm	M1010	Base medium for neurons
iCell DPN, Donor#01279, Phenotype AHN, lot#106339, 1M	Fujifilm	C1087	Apparently healthy donor
iCell DPN, Donor#11299, Phenotype LRRK2 G2019S, phenotype PD lot#106139	Fujifilm	C1149	Donor carrying LRRK2 G2019S mutation
iCell Nervous System Supplement	Fujifilm	M1031	Supplement for base medium
iCell Neural Supplement B	Fujifilm	M1029	Supplement for base medium
Jupyter Python Notebook	In-house development	https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling	Notebook to perform phenotypic profile visualization and classification from raw data.
Laminin	Biolamina	LN521	Plate coating
PFE-360	MedChemExpress	HY-120085	LRRK2 kinase inhibitor
PhenoLink	In-house development	https://github.com/Ksilink/PhenoLink	Software for image analysis
PhenoPlate 384w, PDL coated	Perkin Elmer	6057500	Pre-coated plate for cell culture and imaging. This plate allows imaging of all wells using all objectives of the Yokogawa CV7000 microscope.
Storage plates Abgene 120 µL	Thermo Scientific	AB-0781	Necessary for compound dispensing using the Vprep pipetting system. If not available, the use of an electronic multichannel pipette is recommended.
Triton	Sigma	T9284	Permeabilization before lysis
Trypan Blue	Sigma	T8154-20ML	Determination of living cells
Vprep Pipetting System	Agilent		Medium change and compound dispensing. Alternatively, an electronic multichannel pipette can be used.