Methodenartikel

Fenotypische profilering van dopaminerge neuronen in de middenhersenen van menselijke stamcellen

DOI:

10.3791/65570

⸱

7 juli 2023

 ,  , 
1Ksilink

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft de celkweek van dopaminerge neuronen in de middenhersenen, gevolgd door immunologische kleuring en het genereren van neuronale fenotypische profielen op basis van verworven microscopisch kleine beelden met een hoog gehalte die de identificatie van fenotypische variaties als gevolg van genetische of chemische modulaties mogelijk maken.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ziekte van Parkinson (PD) is gekoppeld aan een reeks celbiologische processen die dopaminerge (mDA) neuronenverlies in de middenhersenen veroorzaken. Veel van de huidige in vitro PD-cellulaire modellen missen complexiteit en houden geen rekening met meerdere fenotypes. Fenotypische profilering in humaan geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC)-afgeleide mDA-neuronen kan deze tekortkomingen aanpakken door tegelijkertijd een reeks neuronale fenotypes in een PD-relevant celtype parallel te meten. Hier beschrijven we een protocol voor het verkrijgen en analyseren van fenotypische profielen van in de handel verkrijgbare menselijke mDA-neuronen. Een neuronspecifiek fluorescerend kleuringspaneel wordt gebruikt om de nucleaire, α-synucleïne, tyrosinehydroxylase (TH) en microtubuli-geassocieerd proteïne 2 (MAP2) gerelateerde fenotypes te visualiseren. Het beschreven fenotypische profileringsprotocol is schaalbaar omdat het gebruik maakt van platen met 384 putjes, automatische vloeistofverwerking en high-throughput microscopie. Het nut van het protocol wordt geïllustreerd met behulp van gezonde donor mDA-neuronen en mDA-neuronen die de PD-gekoppelde G2019S-mutatie dragen in het Leucine-rijke repeat kinase 2 (LRRK2)-gen. Beide cellijnen werden behandeld met de LRRK2-kinaseremmer PFE-360 en fenotypische veranderingen werden gemeten. Daarnaast laten we zien hoe multidimensionale fenotypische profielen kunnen worden geanalyseerd met behulp van clustering of machine learning-gestuurde gesuperviseerde classificatiemethoden. Het beschreven protocol zal vooral interessant zijn voor onderzoekers die werken aan het modelleren van neuronale ziekten of het bestuderen van effecten van chemische verbindingen in menselijke neuronen.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bij de ziekte van Parkinson (PD) zijn verschillende celbiologische processen verstoord. Mitochondriale disfunctie, oxidatieve stress, eiwitafbraakdefecten, verstoring van vesiculaire handel en endolysosomale functie zijn bijvoorbeeld vaak in verband gebracht met dopaminerge (mDA) neuronenverlies in de middenhersenen, worden vaak waargenomen bij PD1. Daarom lijkt PD meerdere ziektemechanismen te omvatten die met elkaar kunnen interageren en elkaar kunnen verergeren. Een nuttige manier om dit mechanistische samenspel te onderzoeken, is het creëren van een uitgebreide fenotypische vingerafdruk of profiel van dopaminerge (mDA) neuronen in de middenhersenen.

Fenotypische profilering is een benadering waarbij een profiel van een steekproef wordt gemaakt op basis van een verzameling meetbare kenmerken, en ten tweede worden voorspellingen gedaan over een steekproef op basis van dit profiel 2,3. Het doel van profilering is om een breed scala aan kenmerken vast te leggen, waarvan sommige mogelijk niet eerder in verband zijn gebracht met een ziekte of behandeling3. Hierdoor kan profilering onverwachte biologische processen aan het licht brengen. Fenotypische profilering is meestal gebaseerd op fluorescerend gekleurde cellen, en gestandaardiseerde assays, zoals Cell Painting, zijn ontwikkeld om fenotypische profielen te creëren4. Recentelijk is fenotypische profilering bijvoorbeeld toegepast voor de karakterisering van kleine moleculen of de nauwkeurige voorspelling van PD-subtypes uitsluitend op basis van van patiënten afgeleide fibroblasten 5,6. Ondanks deze vooruitgang is fenotypische profilering zelden toegepast op postmitotisch gedifferentieerde cellen, zoals van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) afgeleide mDA-neuronen die PD-gekoppelde mutaties tot expressie brengen, zoals LRRK2 G2019S. Belangrijke uitdagingen van iPSC-afgeleide modellen zijn onder meer de aanwezigheid van subtiele of variabele pathologische kenmerken in differentiatiebatches of genotypen, en het feit dat geïsoleerde PD-fenotypes niet de volledige complexiteit van de ziekte weergeven. Bovendien, hoewel iPSC-neuronale modellen fysiologisch relevant zijn, worden ze zelden gebruikt in PD-onderzoeksprocessen vanwege zorgen over technische complexiteit 7,8.

We hebben eerder een robuuste methodologie ontwikkeld om meerdere PD-gerelateerde pathofysiologische fenotypes te meten in menselijke mDA-neuronen die zowel gevoelig zijn voor genetische als door chemische verbindingen geïnduceerde fenotypische veranderingen. Dit artikel beschrijft in detail een verder geoptimaliseerde versie van deze methodologie om fenotypische profielen te maken van mDA-neuronen (Figuur 1). Dit protocol heeft verschillende voordelen ten opzichte van de eerder beschreven fenotypische profileringsbenaderingen, zoals het gebruik van hoogwaardige mDA-neuronen en technische reproduceerbaarheid. Voor het eerst maakt dit protocol fenotypische profilering mogelijk in fysiologisch relevante post-mitotische mDA-neuronen na chemische verstoringen op een zeer schaalbare manier. Volledig gedifferentieerde en gecryopreserveerde mDA-neuronen zijn in de handel verkrijgbaar, waardoor de differentiatievariabiliteit van batch tot batch aanzienlijk wordt verminderd. Ten tweede kan de technische variabiliteit verder worden verminderd door gebruik te maken van een goed gedefinieerd experimenteel ontwerp (d.w.z. kweekduur of het vermijden van randputten), geautomatiseerde vloeistofbehandeling en geautomatiseerde microscopie. Daarnaast worden hier de eerste stappen van fenotypische profielanalyse met behulp van unsupervised clustering of supervised classificatiebenaderingen beschreven, waarbij wordt aangegeven hoe fenotypische profileringsgegevens kunnen worden geanalyseerd. Dit protocol zal nuttig zijn voor onderzoekers die geïnteresseerd zijn in fenotypische veranderingen van mDA-neuronen geïnduceerd door genetische of chemische verstoringen, met name wanneer een zeer schaalbare onderzoeksopzet vereist is, bijvoorbeeld tijdens screeningcampagnes of wanneer de effecten van een kleiner aantal verbindingen moeten worden bestudeerd, bijvoorbeeld om toxische effecten te bepalen. Samenvattend wordt verwacht dat de toepassing van fenotypische profilering van menselijke neuronen een waardevolle techniek is om complexe ziektegerelateerde fenotypes te bestuderen en de cellulaire effecten van kandidaat-geneesmiddelen te karakteriseren.

figure-introduction-1
Figuur 1: Schematische weergave van het experimentele protocol voor het genereren van op afbeeldingen gebaseerde fenotypische profielen van menselijke iPSC-afgeleide mDA-neuronen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Voorbereiding van medium en platen voor het zaaien van neuronen (dag 1)

  1. Om de platen voor te bereiden op het zaaien van neuronen op dag 1, verwarmt u laminine vlak voor gebruik tot kamertemperatuur (RT). Bereid de laminineoplossing voor door de laminine-stockoplossing (0,1 mg/ml) 1/10 te verdunnen in koud PBS+/+ (met Ca 2+ en Mg2+).
    OPMERKING: Alle reagentia staan vermeld in de materiaaltabel. De samenstelling van oplossingen en buffers wordt beschreven in de tabellen 1 tot en met 4.
  2. Voeg vervolgens 25 μL van de laminineoplossing toe aan elk putje van een Poly-D-Lysine (PDL) voorgecoate plaat met 384 putjes en incubeer een nacht bij 4 °C. De gecoate platen kunnen maximaal een week bij 4 °C worden bewaard.
    OPMERKING: Het protocol kan hier maximaal een week worden gepauzeerd. Sluit de platen af met plastic folie.
  3. Bereid Complete Maintenance Media voor en bewaar ze maximaal een maand bij 4 °C (tabel 1).

2. Ontdooien van neuronen (dag 0)

  1. Om de neuronen op dag 0 te ontdooien, verwarmt u een waterbad voor tot 37 °C en brengt u de Complete Maintenance Media in evenwicht met RT, beschermd tegen licht.
  2. Haal de injectieflacon met de in de handel verkregen bevroren neuronen (zie Materiaaltabel) uit de tank met vloeibare stikstof en plaats deze op droogijs. Plaats de injectieflacon vervolgens 2 minuten in het waterbad. Zodra de vloeistof volledig is ontdooid, desinfecteert u de injectieflacon met 70% ethanol.
  3. Zuig de ontdooide neuronen op met een P1000-pipet (ongeveer 370 μL) en breng ze over in een centrifugebuis van 50 ml zonder op en neer pipetteren. Spoel vervolgens de injectieflacon met 630 μL Complete Maintenance Medium, doseer druppel voor druppel (hoek van 45°) in de tube van 50 ml. Schud langzaam tijdens het doseren.
    OPMERKING: Het is van cruciaal belang om het medium langzaam, druppel voor druppel, af te geven om osmotische breuk van de cellen te voorkomen. Een hoek van 45° en lichte agitatie minimaliseren de hoge lokale osmotische druk tijdens het pipetteren.
  4. Voeg op dezelfde manier 1 ml Complete Maintenance Medium toe aan de centrifugebuis van 50 ml met een P1000-pipet. Voeg vervolgens langzaam 2 ml Compleet Onderhoudsmedium toe. Voorzichtig roeren tijdens het doseren.
  5. Tel de cellen. Maak een microbuisje met 10 μL Trypan Blue en 10 μL celsuspensie en voeg toe aan een telkamerglaasje (10 μL). Voer tellingen uit met behulp van een geautomatiseerde cellenteller (zie Materiaaltabel) of handmatig.
  6. Centrifugeer na het tellen de buis van 50 ml met de neuronen bij 400 x g gedurende 5 minuten bij RT en verwijder het supernatant. Resuspendeer de pellet voorzichtig met een P1000-pipet en 1 ml Compleet Onderhoudsmedium. Voeg vervolgens het benodigde volume toe om de gewenste concentratie te bereiken (300.000 cellen/ml, zie ook volgende stap).

3. Zaaien van neuronen op voorbereide platen (dag 0)

  1. Om neuronen op dag 0 op de voorbereide platen te zaaien, haalt u de gecoate platen uit de koelkast, plaatst u ze onder de kap van de celkweek en laat u ze ongeveer 30 minuten in evenwicht zijn met RT.
  2. Vlak voor het zaaien 15 μL coatingoplossing opzuigen met een geautomatiseerde vloeistofverwerker of een 16-kanaals pipet. Laat ongeveer 10 μL per putje over om beschadiging van de coating te voorkomen.
  3. Doseer vervolgens 50 μL van de celoplossing met 300.000 cellen/ml (bereid in stap 2.6) per putje met een 16-kanaals pipet, wat resulteert in 15.000 gezaaide neuronen per putje en een uiteindelijk volume per putje van 60 μL.
  4. Vermijd in een plaat met 384 putjes het gebruik van kolommen 1, 2, 23, 24 en rijen A, B, O en P om mogelijke randeffecten te minimaliseren die van invloed kunnen zijn op de fenotypische profielen. Vul de ongebruikte lege putjes met 80 μL PBS. Incubeer de platen bij 37 °C en 5% CO2 .

4. Gemiddelde verandering of samengestelde behandeling (dag 3)

  1. Afhankelijk van het aantal putjes een geschikte hoeveelheid Complete Maintenance Medium voorverwarmen bij RT. Beschermen tegen licht.
  2. Als een mediumwissel nodig is, gaat u verder met stap 4.4. Als een samengestelde behandeling gewenst is, controleer dan de concentratie van de samengestelde voorraad en het gebruikte oplosmiddel (water, DMSO, methanol, enz.).
  3. Bereid een 1,5x geconcentreerde samengestelde oplossing voor alle gewenste concentraties die moeten worden getest. Bereid de samengestelde verdunningen voor met behulp van Complete Maintenance Medium.
    OPMERKING: Gebruik als neutrale controle het betreffende oplosmiddel in dezelfde concentratie als de geteste verbinding. Als meerdere of onbekende verbindingen in verschillende concentraties worden gebruikt, is het raadzaam om een afzonderlijk dosis-responsexperiment uit te voeren om de effecten van oplosmiddelen op het fenotypische profiel te meten.
  4. Als een automatisch pipetteersysteem wordt gebruikt, voeg dan 60 μl van de 1,5x samengestelde oplossing toe aan een bewaarplaat met 384 putjes. U kunt ook een 16-kanaals pipet gebruiken. Als een mediumwissel nodig is, voeg dan 60 μL Compleet Onderhoudsmedium toe.
  5. Gebruik het automatische pipetteersysteem om 40 μL medium per putje uit de neuronbevattende plaat te zuigen en weg te gooien om 20 μL/putje te behouden. Voeg vervolgens 40 μL/putje 1,5x samengestelde oplossing uit de 384-wells bewaarplaat toe aan elk putje om de gewenste eindconcentratie te verkrijgen.
    NOTITIE: Het is van cruciaal belang om geen volledige mediumwisselingen uit te voeren, maar om altijd restmedium in de put te laten om schade aan het neuronale tapijt of de coating te voorkomen.
  6. Als neuronale kweek langer dan de 6 dagen wordt uitgevoerd die in dit protocol worden beschreven, verander dan het medium elke 2-3 dagen.

5. Neuronfixatie en kleuring (dag 6 tot 7)

  1. Om de neuronen op dag 6 en 7 te fixeren en te kleuren, maakt u gebruik van een geautomatiseerde vloeistofverwerker voor alle doseer- en wasstappen. U kunt ook een 16-kanaals pipet gebruiken.
  2. Bereid een 10% Triton X-100 oplossing door Triton X-100 te verdunnen in 1x PBS. Draai totdat de oplossing homogeen is. Bewaren bij 4 °C.
  3. Om de neuronen te fixeren, doseert u 20 μL/putje 16% PFA, wat resulteert in een eindconcentratie van 4%. Incubeer de plaat gedurende 30 minuten bij RT en was hem drie keer met 1x PBS. Laat 20 μL/putje PBS over na de laatste wasbeurt.
    LET OP: PFA wordt erkend als een gevaarlijke stof waarvan bekend is dat deze orale, dermale en respiratoire toxiciteit veroorzaakt. Het vormt ook een bedreiging voor de ogen en kan leiden tot genetische mutaties en kanker. Een juiste omgang met PFA vereist het gebruik van geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen, zoals oog- en gelaatsbescherming, naast het zorgen voor een goede ventilatie. Het is belangrijk om het vrijkomen van PFA in het milieu te voorkomen.
  4. Voor permeabilisatie en blokkering bereidt u een 2x blokkerende oplossing (tabel 2).
  5. Voeg 20 μL/putje 2x blokkeringsoplossing (1x eindconcentratie) toe, incubeer gedurende 1 uur bij RT en was eenmaal met PBS. Bewaar 20 μL/putje PBS na het wassen.
  6. Voor primaire antilichaamkleuring (zie Materiaaltabel) bereidt u een 2x primaire kleuringsbuffer voor (tabel 3).
  7. Voeg 20 μL/putje 2x primaire kleuringsbuffer (1x eindconcentratie) toe en incubeer een nacht bij 4 °C. De volgende ochtend op dag 7 drie keer wassen met PBS. Laat na het wassen 20 μL/putje PBS staan.
  8. Voor secundaire antilichaamkleuring (zie Materiaaltabel) bereidt u een 2x secundaire kleuringsbuffer voor (tabel 4).
  9. Voeg 20 μL/putje 2x secundaire kleuringsbuffer toe (1x eindconcentratie), incubeer gedurende 2 uur bij RT uit de buurt van licht en was driemaal met PBS. Laat 100 μL PBS/welle staan na de laatste wasbeurt.
    1. Voeg aluminium afdichting toe aan de plaat om verdamping te minimaliseren. U kunt de plaat ook afdekken met plastic folie en aluminiumfolie. Ga verder met beeldacquisitie of bewaar de plaat bij 4 °C.
      OPMERKING: Het protocol kan hier maximaal een week worden gepauzeerd. Als achtergrondfluorescentie wordt waargenomen, overweeg dan om de blokkeertijd te verlengen. Als de kleuring onvoldoende is, probeer dan de primaire antilichaamconcentratie of incubatietijd te verhogen.

6. Beeldvorming van fluorescerend gekleurde neuronen (dag 7)

  1. Maak afbeeldingen van de vergulde, gekweekte en gekleurde neuronen op dag 7. Gebruik bij voorkeur een geautomatiseerde confocale fluorescentiemicroscoop (zie Tabel met materialen). U kunt ook handmatig afbeeldingen verkrijgen.
  2. Verwerf de Hoechst-, TH-, α-synucleïne- en MAP2-kanalen met behulp van respectievelijk 405 nm, 488 nm, 561 nm en 647 nm lasers (Afbeelding 2).
    OPMERKING: Om voldoende gedetailleerde gegevens voor fenotypische profilering te genereren, gebruikt u een 40x-objectief en verkrijgt u 16 velden/put met behulp van Z-stacks bestaande uit 3 Z-segmenten gescheiden door 2 μm. In het geval dat er pipetteergerelateerde schade is in het neuronale tapijt, probeer dan te voorkomen dat u deze gebieden in beeld brengt.
  3. Pas afhankelijk van de microscoop en camera de belichtingstijden en excitatie-intensiteiten voor elk van de vier fluorescentiekanalen afzonderlijk aan om een optimaal dynamisch bereik van de fluorescerende intensiteiten te verkrijgen.
    OPMERKING: Beeldvormingssoftware biedt vaak een histogram om de ideale belichtingstijd te bepalen. Als het histogram te veel naar links is verschoven in het lage signaalbereik, is de belichtingstijd te kort of is de excitatie-intensiteit te laag. Als er een scherpe klif is op het maximale signaalniveau aan de rechterkant, dan is de signaalwaarde verzadigd. Verminder in dit geval de excitatie-intensiteit of verkort de belichtingstijd.
  4. Sla afbeeldingen op in een verliesvrij en open formaat, zoals .tif.

7. Beeldverwerking (dag 8)

  1. Beeldsegmentatie en extractie van fenotypische kenmerken zijn vereist voor het maken van kwantitatieve fenotypische profielen. Gebruik de PhenoLink-software voor beeldsegmentatie en functie-extractie (Tabel met materialen). Instructies voor het installeren van PhenoLink zijn te vinden in de GitHub-repository (https://github.com/Ksilink/PhenoLink).
    OPMERKING: Beeldsegmentatie wordt gebruikt om verschillende objecten of regio's in een afbeelding te identificeren en te scheiden, terwijl fenotypische kenmerkextractie wordt gebruikt om relevante informatie uit die regio's te analyseren en te extraheren. Er zijn verschillende alternatieve softwareoplossingen beschikbaar, zoals CellProfiler10, ImageJ/FIJI11, Napari 12 of het Knime Analytics Platform13 om kwantitatieve informatie te extraheren uit meerkanaals fluorescentiebeelden.
  2. Voer beeldsegmentatie uit op voor belichting gecorrigeerde RAW-afbeeldingen. Bepaal de respectievelijke intensiteitsdrempels voor fluorescentiekanalen empirisch per plaat, zodat het achtergrondsignaal minimaal is en het gewenste gesegmenteerde signaal overeenkomt met het signaal in het onbewerkte beeld. Platen die op dezelfde dag worden verwerkt en gekleurd, vereisen doorgaans vergelijkbare kanaalintensiteitsdrempels voor segmentatie.
  3. Definieer de grootte en intensiteit van de kern om levende van dode cellen te scheiden. Als u 40x-afbeeldingen gebruikt, behoudt u alle andere standaardparameters en voert u de software uit. Per put zullen honderdzesentwintig kwantitatieve beeldkenmerken worden berekend (aanvullende tabel 1).
  4. Gebruik de resulterende kwantitatieve gegevens in tabelvorm om fenotypische profielen te construeren en fenotypische profielen van verschillende cellijnen of behandelingscondities te vergelijken. Elke rij komt overeen met een biologische toestand (put) en elke kolom komt overeen met een bepaald fenotypisch kenmerk.
    OPMERKING: We bieden een voorbeeld van een uitvoerbestand samen met de data-analysepijplijn om het gebruik ervan te illustreren (zie Materiaaltabel). Daarnaast toont figuur 3 de samenstelling van een fenotypisch profiel.

8. Fenotypische profielgeneratie en visualisatie (dag 8)

  1. Als u Python en Jupyter niet op uw computer hebt geïnstalleerd, installeert u de Anaconda-distributie en opent u de Jupyter-software. Download het meegeleverde Jupyter-notebook en alle andere meegeleverde bestanden en sla ze op in dezelfde map (zie Materiaaltabel). Open het Jupyter-notebookbestand met behulp van de Jupyter-software.
    OPMERKING: Anaconda is een gratis en open-source platform voor programmeertalen zoals Python. Dit platform wordt geleverd met de Python-interpreter Jupyter die het meegeleverde Jupyter-notebook kan uitvoeren om fenotypische profielen (https://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfiling) te maken en te analyseren.
  2. Voer het Jupyter-notebook cel voor cel uit met behulp van de Jupyter-software. De opgegeven voorbeeldgegevens .fth en vereisten .txt bestanden moeten zich in dezelfde map bevinden als het Jupyter-notebook. Elke Jupyter-notebookcel is geannoteerd om de functionaliteit ervan uit te leggen.
    OPMERKING: Het is van cruciaal belang om het Jupyter-notebook in de juiste volgorde te gebruiken, te beginnen met het laden en schalen van gegevens en om cel voor cel naar het einde te gaan. Alle gegevens en grafische uitvoer worden opgeslagen in een nieuw gemaakte map in de bronmap van het Jupyter-notebook. Figuur 4 geeft de workflow en de output van de workflow weer.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fenotypische profilering in mDA-neuronen is een efficiënte manier om meerdere aspecten van cellulaire biologie en hun veranderingen tijdens de experimentele modulatie te kwantificeren. Om deze methodologie te illustreren, maakte deze studie gebruik van gecryopreserveerde LRRK2 G2019S en gezonde donor mDA-neuronen. Deze neuronen zijn ongeveer 37 dagen gedifferentieerd, zijn postmitotische en tot expressie gebrachte neuronale markers (TUBB3 en MAP2) en dopaminerge neuronenmarkers, waaronder tyrosinehydroxylase (TH) in comb...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fenotypische profilering is een techniek om een groot aantal fenotypes in cellen te meten door fluorescerende kleuringen, microscopie en beeldanalyse toe te passen. Fenotypische profielen kunnen worden verkregen en vergeleken tussen cellijnen of andere experimentele omstandigheden om complexe veranderingen in de celbiologie te begrijpen die onopgemerkt kunnen blijven bij het gebruik van een enkele uitlezing. Hier beschrijven we de toepassing van fenotypische profilering op menselijke iPSC-afgeleid...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle auteurs zijn in dienst van Ksilink.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs willen alle collega's bij Ksilink bedanken voor hun waardevolle hulp en discussies die hebben geleid tot het ontwerp van het gepresenteerde protocol.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Anti- chicken – Alexa 647Jackson ImmunoRearch703-605-155Immunofluorescence
Anacondahttps://www.anaconda.com/download
Anti-Map2NovusNB300-213Immunofluorescence
Anti-mouse - Alexa 488Thermo FisherA11001Immunofluorescence
Anti-rabbit - Alexa 555Thermo FisherA21429Immunofluorescence
Anti-Tyrosine HydroxylaseMerckT2928Immunofluorescence
Anti-α-synucleinAbcam138501Immunofluorescence
Bravo Automated Liquid Handling Platform with 384ST headAgilentAls er geen vloeistofhandler beschikbaar is, wordt het gebruik van een elektronische multikanaals pipette aanbevolen.
Confocal microscope YokogawaCV7000Het gebruik van een geautomatiseerde confocale fluorescentiemicroscoop wordt aanbevolen om consistentie van beeldkwaliteit te garanderen.
Countess Automated cell counterInvitrogenCeltelling voor het zaaien. Kan ook worden gedaan met behulp van een handmatige telkamer.
DPBS +/+Gibco14040-133Buffer voor wassen
EL406 Washer Dispenser BioTek (Agilent) Als er geen vloeistofhandler beschikbaar is, wordt het gebruik van een elektronische multikanaals pipette aanbevolen.
Formaldehyde Solution (PFA 16 %)EuromedexEM-15710-SFixatie voor het kleuren
Hoechst 33342InvitrogenH3570Kernkleuring
iCell Base Medium 1FujifilmM1010Basismedium voor neuronen
iCell DPN, Donor#01279, Phenotype AHN, lot#106339, 1MFujifilmC1087Blijkbaar gezonde donor
iCell DPN, Donor#11299, Phenotype LRRK2 G2019S, phenotype PD lot#106139FujifilmC1149Donor met LRRK2 G2019S-mutatie 
iCell Nervous System SupplementFujifilmM1031Supplement voor basismedium
iCell Neural Supplement BFujifilmM1029Supplement voor basismedium
Jupyter Python NotebookIn-house developmenthttps://github.com/Ksilink/Notebooks/tree/main/Neuro/DopaNeuronProfilingNotebook om fenotypisch profielvisualisatie en classificatie uit te voeren op basis van ruwe gegevens.
LamininBiolaminaLN521Plaatcoating
PFE-360MedChemExpressHY-120085LRRK2-kinaseremmer
PhenoLinkIn-house developmenthttps://github.com/Ksilink/PhenoLinkSoftware voor beeldanalyse
PhenoPlate 384w, PDL coatedPerkin Elmer6057500Voorgecoate plaat voor celkweek en beeldvorming. Deze plaat maakt beeldvorming van alle putjes mogelijk met behulp van alle objectieven van de Yokogawa CV7000-microscoop.
Storage plates Abgene 120 µLThermo ScientificAB-0781Noodzakelijk voor het doseren van verbindingen met behulp van het Vprep pipetsysteem. Als dit niet beschikbaar is, wordt het gebruik van een elektronische multikanaals pipette aanbevolen.
TritonSigmaT9284Permeabilisatie voor lysering
Trypan BlueSigmaT8154-20MLBepaling van levende cellen
Vprep Pipetting System AgilentMediumverversing en verbindingen doseren. Als alternatief kan een elektronische multikanaals pipette worden gebruikt.

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Panicker, N., Ge, P., Dawson, V. L., Dawson, T. M. The cell biology of Parkinson's disease. The Journal of Cell Biology. 220 (4), 202012095(2021).
  2. Caicedo, J. C., et al. Data-analysis strategies for image-based cell profiling. Nature Methods. 14 (9), 849-863 (2017).
  3. Chandrasekaran, S. N., Ceulemans, H., Boyd, J. D., Carpenter, A. E. Image-based profiling for drug discovery: due for a machine-learning upgrade. Nature Reviews Drug Discovery. 20 (2), 145-159 (2021).
  4. Bray, M. -A., et al. Cell Painting, a high-content image-based assay for morphological profiling using multiplexed fluorescent dyes. Nature Protocols. 11 (9), 1757-1774 (2016).
  5. Schiff, L., et al. Integrating deep learning and unbiased automated high-content screening to identify complex disease signatures in human fibroblasts. Nature Communications. 13 (1), 1590(2022).
  6. Ziegler, S., Sievers, S., Waldmann, H. Morphological profiling of small molecules. Cell Chemical Biology. 28 (3), 300-319 (2021).
  7. Cobb, M. M., Ravisankar, A., Skibinski, G., Finkbeiner, S. iPS cells in the study of PD molecular pathogenesis. Cell and Tissue Research. 373 (1), 61-77 (2018).
  8. Elitt, M. S., Barbar, L., Tesar, P. J. Drug screening for human genetic diseases using iPSC models. Human Molecular Genetics. 27 (R2), 89-98 (2018).
  9. Vuidel, A., et al. High-content phenotyping of Parkinson's disease patient stem cell-derived midbrain dopaminergic neurons using machine learning classification. Stem Cell Reports. 17 (10), 2349-2364 (2022).
  10. Stirling, D. R., Swain-Bowden, M. J., Lucas, A. M., Carpenter, A. E., Cimini, B. A., Goodman, A. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 433(2021).
  11. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  12. Sofroniew, N., et al. napari: a multi-dimensional image viewer for Python. , (2022).
  13. Berthold, M. R., et al. KNIME: The Konstanz Information Miner. Data Analysis, Machine Learning and Applications. , 319-326 (2008).
  14. Fathi, A., et al. Diverging Parkinson's Disease Pathology between patient-derived GBAN370S, LRRK2G2019S and engineered SNCAA53T iPSC-derived Dopaminergic Neurons. bioRxiv. , (2023).
  15. Wang, Y., Huang, H., Rudin, C., Shaposhnik, Y. Understanding How Dimension Reduction Tools Work: An Empirical Approach to Deciphering t-SNE, UMAP, TriMap, and PaCMAP for Data Visualization. Journal of Machine Learning Research. 22 (201), 1-73 (2021).
  16. Ke, G., et al. LightGBM: A highly efficient gradient boosting decision tree. Advances in Neural Information Processing Systems. 30, https://papers.nips.cc/paper/2017/hash/6449f44a102fde848669bdd9eb6b76fa-Abstract.html (2017).
  17. Avazzadeh, S., Baena, J. M., Keighron, C., Feller-Sanchez, Y., Quinlan, L. R. Modelling Parkinson's Disease: iPSCs towards Better Understanding of Human Pathology. Brain Sciences. 11 (3), 373(2021).
  18. Sánchez-Danés, A., et al. Disease-specific phenotypes in dopamine neurons from human iPS-based models of genetic and sporadic Parkinson's disease. EMBO Molecular Medicine. 4 (5), 380-395 (2012).
  19. Oosterveen, T., et al. Pluripotent stem cell derived dopaminergic subpopulations model the selective neuron degeneration in Parkinson's disease. Stem Cell Reports. 16 (11), 2718-2735 (2021).
  20. Hughes, R. E., et al. Multiparametric high-content cell painting identifies copper ionophores as selective modulators of esophageal cancer phenotypes. ACS Chemical Biology. 17 (7), 1876-1889 (2022).
  21. Akbarzadeh, M., et al. Morphological profiling by means of the Cell Painting assay enables identification of tubulin-targeting compounds. Cell Chemical Biology. 29 (6), 1053-1064 (2022).
  22. Schiff, L., et al. Integrating deep learning and unbiased automated high-content screening to identify complex disease signatures in human fibroblasts. Nature Communications. 13 (1), 1590(2022).
  23. Way, G. P., et al. Morphology and gene expression profiling provide complementary information for mapping cell state. Cell Systems. 13 (11), 911-923 (2022).
  24. Feng, Y., Mitchison, T. J., Bender, A., Young, D. W., Tallarico, J. A. Multi-parameter phenotypic profiling: using cellular effects to characterize small-molecule compounds. Nature Reviews Drug Discovery. 8 (7), 567-578 (2009).
  25. Antonov, S. A., Novosadova, E. V. Current state-of-the-art and unresolved problems in using human induced pluripotent stem cell-derived dopamine neurons for parkinson's disease drug development. International Journal of Molecular Sciences. 22 (7), 3381(2021).
  26. Miller, J. D., et al. Human iPSC-based modeling of late-onset disease via progerin-induced aging. Cell Stem Cell. 13 (6), 691-705 (2013).
  27. Bezard, E., Gross, C. E., Brotchie, J. M. Presymptomatic compensation in Parkinson's disease is not dopamine-mediated. Trends in Neurosciences. 26 (4), 215-221 (2003).
  28. Wu, Y., Le, W., Jankovic, J. Preclinical Biomarkers of parkinson disease. Archives of Neurology. 68 (1), 22-30 (2011).
  29. Verstraelen, P., et al. Systematic quantification of synapses in primary neuronal culture. iScience. 23 (9), 101542(2020).
  30. Liu-Yesucevitz, L., et al. ALS-Linked mutations enlarge TDP-43-enriched neuronal RNA granules in the dendritic arbor. The Journal of Neuroscience. 34 (12), 4167-4174 (2014).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Phenotypic ProfilingDopaminergic NeuronsHuman Stem CellsParkinson s DiseaseMidbrain NeuronsHigh Throughput MicroscopyFluorescent StainingLRRK2 MutationImage SegmentationMachine Learning Classification

Gerelateerde artikelen