Transgenexpressie in gekweekte cellen met behulp van ongezuiverde recombinante adeno-geassocieerde virale vectoren

Samenvatting

Recombinant adeno-geassocieerd virus (rAAV) wordt veel gebruikt voor klinische en preklinische genafgifte. Een ondergewaardeerd gebruik van rAAV's is de robuuste transductie van gekweekte cellen zonder dat zuivering nodig is. Voor onderzoekers die nieuw zijn op het gebied van rAAV, bieden we een protocol voor het klonen van transgencassettes, de productie van ruwe vectoren en de transductie van celculturen.

Samenvatting

Recombinante adeno-geassocieerde virale vectoren (rAAV) kunnen krachtige en duurzame transgenexpressie bereiken zonder integratie in een breed scala aan weefseltypes, waardoor ze een populaire keuze zijn voor genafgifte in diermodellen en in klinische omgevingen. Naast therapeutische toepassingen zijn rAAV's een nuttig laboratoriuminstrument voor het afleveren van transgenen die zijn afgestemd op de experimentele behoeften en wetenschappelijke doelen van de onderzoeker in gekweekte cellen. Enkele voorbeelden zijn exogene reportergenen, overexpressiecassettes, RNA-interferentie en op CRISPR gebaseerde tools, waaronder die voor genoombrede screenings. rAAV-transducties zijn minder schadelijk voor cellen dan elektroporatie of chemische transfectie en vereisen geen speciale apparatuur of dure reagentia om te produceren. Ruwe lysaten of geconditioneerde media die rAAV's bevatten, kunnen rechtstreeks aan gekweekte cellen worden toegevoegd zonder verdere zuivering om veel celtypen te transduceren - een ondergewaardeerde eigenschap van rAAV's. Hier bieden we protocollen voor het klonen van transgencassettes en demonstreren we hoe ruwe rAAV-preparaten kunnen worden geproduceerd en toegepast op gekweekte cellen. Als proof of principle demonstreren we de transductie van drie celtypes die nog niet gerapporteerd zijn in rAAV-toepassingen: placentacellen, myoblasten en organoïden van de dunne darm. We bespreken geschikte toepassingen voor ruwe rAAV-preparaten, de beperkingen van rAAV's voor genafgifte en overwegingen voor capsidekeuze. Dit protocol schetst een eenvoudige, goedkope en effectieve methode voor onderzoekers om productieve DNA-afgifte in celkweek te bereiken met behulp van rAAV zonder de noodzaak van moeizame titratie- en zuiveringsstappen.

Inleiding

Het ophelderen van de moleculaire basis van cellulaire functies vereist vaak de expressie van transgeen DNA in celkweek. Om tot expressie te worden gebracht, moeten transgenen door het selectieve membraan van een cel dringen en de kern bereiken ^1,2. Daarom is het vermogen om de fysieke barrières van de cel effectief te omzeilen en de centrale processen te manipuleren een noodzaak voor het toepassen van transgenese om nieuwe biologische fenomenen aan het licht te brengen. Eén benadering maakt gebruik van het intrinsieke vermogen van virussen om vreemd DNA af te leveren en tot expressie te brengen ^3,4.

Adeno-geassocieerd virus (AAV) is een van de kleinste zoogdiervirussen: het 4,7 kilobase (kb), enkelstrengs DNA-genoom bevat twee genen, rep (voor replicase) en cap (voor capside), verpakt in een 60-mer icosahedrale capside van 25 nm. De rep/cap-genen hebben meerdere promotors, leesframes en splice-producten die coderen voor ten minste negen unieke eiwitten die nodig zijn voor virale replicatie, productie en verpakking ^5,6. Bovendien bevatten beide uiteinden van het genoom secundaire structuren die omgekeerde terminale herhalingen (ITR's) worden genoemd en die nodig zijn voor DNA-replicatie, genoomverpakking en stroomafwaartse verwerking tijdens transductie 7,8,9,10. De ITR's zijn de enige DNA-elementen die nodig zijn voor de verpakking van het genoom in de capside, en daarom kan AAV worden gekloond voor transgenafgiftedoeleinden door de virale rep/cap-genen te vervangen door de keuze van een onderzoeker van regulerende elementen en/of genen van belang⁶. De resulterende recombinante AAV (rAAV), met een gemanipuleerd vectorgenoom (VG), wordt veel gebruikt in de kliniek voor menselijke gentherapie en heeft successen behaald¹¹. Een ondergewaardeerd gebruik van de vector is in het laboratorium; rAAV's kunnen efficiënt transgenexpressie bereiken in gekweekte cellen om aan de experimentele behoeften van een onderzoeker te voldoen¹².

De meest gebruikelijke methode voor het produceren van rAAV is door drievoudige plasmidetransfectie in HEK293- of 293T-cellen (Figuur 1). Het eerste plasmide, gewoonlijk het cis-plasmide genoemd, bevat het gewenste transgen geflankeerd door ITR's (pAAV). Afhankelijk van de toepassing zijn cis-plasmiden met gemeenschappelijke elementen, zoals sterke promotors of op CRISPR gebaseerde tools, te koop. De tweede is het pRep/Cap-plasmide dat de wild-type AAV-rep- en cap-genen bevat die in-trans worden geleverd - d.w.z. op een afzonderlijk, niet-ITR-bevattend plasmide dat regulerende en structurele elementen tot expressie brengt die vervolgens interageren met het cis-plasmide - en wordt daarom het transplasmide genoemd. Naast het fysiek omsluiten van de VG, beïnvloedt de capside cellulair tropisme^12,13. Door het serotype-specifieke cap-gen in-trans aan te bieden, zijn onderzoekers gemakkelijk in staat om de transductie-efficiëntie te maximaliseren door een geoptimaliseerd capside-serotype te kiezen voor hun gegeven doelcel. Ten slotte heeft AAV, als Dependoparvovirus, een helpervirus nodig om rep/cap-expressie van zijn virale promotors te activeren, bereikt door adenovirale helpergenen, geleverd op een derde plasmide zoals pAdΔF6^14,15. Na 72 uur triple-plasmidetransfectie kan de vector uit de producerende cellen in de kweekmedia worden vrijgegeven door herhaalde vries-/dooicycli. De volledige inhoud van de plaat wordt vervolgens verzameld en grote celresten worden verwijderd door centrifugeren; het resulterende media-supernatans is een rAAV-preparaat dat klaar is voor stroomafwaartse transducties.

Figuur 1: Overzicht van de productie van ruwe rAAV-vectoren. De productie en transductie van ruwe rAAV kan binnen 5 dagen worden bereikt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

rAAV kan gunstiger zijn voor transgenafgifte in vergelijking met andere transfectiemethoden, die vaak worden geassocieerd met cellulaire toxiciteit, lage efficiëntie en dure reagentia en apparatuur, zoals voor elektroporatie of transfectie op basis van chemicaliën/lipiden^16,17. rAAV omzeilt deze obstakels en biedt vaak krachtige transgenexpressie met minimale toxiciteit en minimale hands-on tijd. Belangrijk is dat het produceren van rAAV en het toepassen ervan in celkweek eenvoudig is en zelden zuivering van de vector uit de kweekmedia vereist (Figuur 1). Bovendien integreert rAAV zijn VG niet in het genoom van de gastheer, in tegenstelling tot de toediening van het lentivirale transgen, en verlaagt zo het risico op insertionele mutagenese¹⁸. Ondanks de potentiële voordelen van het gebruik van rAAV voor transgenafgifte, moet rekening worden gehouden met beperkingen. Belangrijk is dat de grootte van het transgen, inclusief de ITR's, niet groter mag zijn dan 4,9 kb vanwege fysieke beperkingen van de capside, waardoor het vermogen van een onderzoeker om effectief grote regulerende elementen en transgenen af te leveren, wordt beperkt. Bovendien, aangezien rAAV een niet-integrerend virus is, resulteert transductie in voorbijgaande transgenexpressie in delende cellen en is het mogelijk niet praktisch voor stabiele expressie. Methoden die gebruik maken van dubbele rAAV-afgeleverde Cas9- en homologie-gerichte reparatie (HDR)-sjablonen kunnen echter worden gebruikt om sequenties stabiel in te voegen op specifieke genomische loci als een onderzoeker dat wenst¹⁹.

Protocol

1. Plasmide-acquisitie

OPMERKING: Dit protocol zal een gen van belang (GOI) klonen in een ITR-bevattend plasmide met een cytomegalovirus (CMV)-promotor en een SV40-polyadenyleringssequentie (pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40). Dit plasmide kan echter zonder verder klonen worden gebruikt om rAAV's te produceren, met een handige dubbele EGFP- en Luciferase-reporter. Plasmiden met verschillende regulerende elementen of voor verschillende toepassingen, zoals voor op CRISPR gebaseerde experimenten, zijn online beschikbaar en zullen vergelijkbare kloonstappen volgen als hieronder (zie discussie voor aanvullende kloonstappen). Bovendien kunnen rep/cap- of transplasmiden voor verschillende serotypen worden gebruikt - dit protocol gebruikt rep/cap voor AAV-serotype 2.

1. Koop bacteriële steken die een ITR-bevattend cis-plasmide , een adenovirus-helperplasmide, een rep/cap-plasmide en een plasmide met een Indonesische overheid bevatten. Streep de bacteriën op individuele agarplaten die antibiotica bevatten die specifiek zijn voor de resistentie van elk plasmide. Incubeer de bacteriën 's nachts bij 30 °C om te groeien.
   OPMERKING: Als een plasmide met een Indonesische overheid niet direct beschikbaar is voor aankoop, kan een synthetisch DNA-fragment (zie materiaaltabel) online worden gekocht. Bovendien kan een synthetisch DNA-fragment worden gebruikt om desgewenst het hele PCR-proces over te slaan.
2. Kies een enkele kolonie van elk bord en kweek in 3 ml Luria Bertani (LB)-buffer aangevuld met het bijbehorende antibioticum bij 30 °C gedurende een nacht, schuddend bij 180 tpm. Breng 1 ml van de bacteriën over in een steriele erlenmeyer van 250 ml met 50 ml LB-buffer, aangevuld met het bijbehorende antibioticum. Schud bij 30 °C, 180 rpm gedurende een nacht.
3. Breng de bacteriën over in een conische buis van 50 ml en centrifugeer gedurende 20 minuten op 3.000 x g, kamertemperatuur. Gooi supernatant weg. Isoleer het plasmide met behulp van een endotoxine-arme of -vrije midiprep-kit volgens de instructies van de fabrikant.
   OPMERKING: ITR's zijn onstabiele structuren. Om ITR-deleties of -mutaties te voorkomen, moeten bacteriële cellen worden gekweekt bij 30 °C om de celdeling te vertragen en fouten in de replicatie te beperken. Om de plasmideopbrengst en zuiverheid te verhogen, is een midiprep- of maxiprep-kit ideaal. Het wordt aanbevolen om een endotoxine-arme of -vrije kit te gebruiken om stroomafwaartse endotoxinebesmetting van cellen te verminderen. Het is niet nodig om plasmide-isolatie uit te voeren in een laminaire stromingskap, aangezien besmetting van het plasmidepreparaat niet waarschijnlijk is als het op een standaardbank wordt uitgevoerd.

2. Klonen van interessant gen in AAV ITR-bevattend plasmide

1. Open de plasmidekaart met de Indonesische overheid in software voor het bekijken van DNA.
   OPMERKING: De volledige cassette, inclusief de ITR's, mag niet groter zijn dan 4.9 kb vanwege fysieke verpakkingsbeperkingen van de capside. Bovendien kan PCR-amplificatie niet worden bereikt via ITR's vanwege secundaire structuren. Als zodanig wordt Gibson-assemblage niet aanbevolen voor het klonen van rAAV-transgenen.
   1. Klik op het tabblad Sequentie om de volledige sequentie van het plasmide weer te geven. Scroll naar het 5' meest gelegen gebied van de GOI-sequentie en klik op de eerste nucleotide terwijl je naar binnen sleept in de richting van het genlichaam om een voorwaartse primer te maken. Laat los zodra een smelttemperatuur (Tm) van ~55 °C is bereikt.
   2. Klik op Primer doorsturen. Voeg handmatig de sequentie voor een EcoRI-restrictieplaats (5' GAATTC 3') toe aan het 5' meest uiteinde van de primersequentie. Voeg bovendien zes extra willekeurige basen toe aan het einde van 5' van deze beperkingsplaats om het enzym efficiënt te laten interageren met het DNA. Klik op Primer toevoegen. Zie figuur 2 voor een representatief voorbeeld.
   3. Controleer de primer om er zeker van te zijn dat deze geen haarspelden of primerdimeren kan vormen (behalve de restrictieplaats die palindromisch is). Als er haarspeldbochten ontstaan, verander dan de willekeurige volgorde van de zes extra bases. Zorg er bovendien voor dat de primer nergens anders op het plasmide bindt.
   4. Herhaal de stappen om een omgekeerde primer te maken op het 3' meest gelegen gebied van de Indonesische overheid naar het genlichaam. Klik op Reverse Primer en voeg een NotI-beperkingssite toe (5' GCGGCCGC 3').
      OPMERKING: De Indonesische overheid mag geen EcoRI- of NotI-restrictieplaatsen bevatten – als dat het geval is, moeten andere restrictie-enzymen worden gebruikt.
2. Amplificeer de Indonesische overheid in een PCR-reactie van 50 μl. Gebruik de vereiste afzonderlijke componenten uit tabel 1.
   1. Plaats de reactie in een thermocycler en volg de cyclusparameters uit tabel 2 voor de programmering. Als primers een andere T m hebben, gebruik dan de onderste T_m voor het programma.
   2. Controleer de amplificatie van het juiste PCR-fragment door 1 μL gelladende kleurstof (6x) toe te voegen aan 5 μL PCR-reactie. Voer een DNA-ladder en het PCR-mengsel uit op een 0,8% agarosegel met ethidiumbromide en visualiseer met UV-licht.
      LET OP: Ethidiumbromide is een bekend mutageen.
   3. Als er een enkele, specifieke band op de gel verschijnt, reinig dan het resterende PCR-product in de PCR-stripbuis met behulp van een op kolommen gebaseerde PCR-reinigingskit volgens de instructies van de fabrikant. Als er meerdere banden verschijnen (als gevolg van niet-specifieke versterking), snijd dan de gewenste band weg en zuiver het DNA met behulp van een gelextractiekit volgens de instructies van de fabrikant.
3. Verteer het gezuiverde PCR-product en het pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40-ruggengraatplasmide in een reactie van 50 μl met de vereiste afzonderlijke componenten uit tabel 3 gedurende 1 uur bij 37 °C. Een grotere hoeveelheid pAAV-plasmide-DNA is vereist vanwege het verwachte inefficiënte herstel na gelextractie.
   OPMERKING: De gebruikte restrictie-enzymen zijn high-fidelity (HF) versies. Regular NotI kan niet worden gebruikt met CutSmart buffer. Als er verschillende enzymen worden gebruikt, kan een verschillende incubatietemperatuur en buffer nodig zijn.
   1. Zuiver het verteerde PCR-product met een op kolommen gebaseerde PCR-reinigingskit volgens de instructies van de fabrikant.
   2. Bereid het verteerde pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40 ruggengraatplasmide voor op gelelektroforese door 10 μL gelladende kleurstof (6x) toe te voegen aan 50 μL verteringsreactie. Laad een DNA-ladder, verteringsreactie en 250 ng onverteerd plasmide (negatieve controle) op een 0,8% agarosegel met ethidiumbromide met brede tandputjes. Visualiseer met UV-licht, snijd het gewenste fragment weg (~4,5 kb) en zuiver het DNA met behulp van een gelextractiekit volgens de instructies van de fabrikant.
4. Ligate het verteerde PCR-product en verteerde pAAV-ruggengraatplasmide in een ligatiereactie van 20 μL met de vereiste afzonderlijke componenten uit tabel 4. Gebruik formule 1 om de benodigde hoeveelheid PCR-producten te berekenen. Gebruik doorgaans een molaire verhouding van 3:1 van PCR-product (insert) tot ruggengraat (pAAV), met een massa van 50 ng ruggengraat.
   Formule 1
5. Voer een negatieve controle uit door het PCR-product te vervangen door water. Incubeer ligatiereacties bij 16 °C 's nachts of bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
6. Ontdooi een injectieflacon met competente, recombinatie-deficiënte bacteriële cellen (zoals Stbl3-cellen) op ijs en plaats 50 μL in een buisje van 1,5 ml. Voeg 3 μL van de ligatiereactie rechtstreeks toe aan de cellen en incubeer gedurende 30 minuten op ijs.
   OPMERKING: ITR's zijn onstabiele structuren en vereisen daarom recombinatie-deficiënte bacteriestammen om ITR-deletie en recombinatiegebeurtenissen te beperken. DH5α-cellen kunnen met tussenpozen worden gebruikt voor vermeerdering (een of twee keer), maar worden niet aanbevolen voor langdurig gebruik. De ITR-integriteit moet regelmatig worden gecontroleerd na de midiprep-zuivering.
   1. Geef de bacteriën een warmteschok in een waterbad van 42 °C gedurende 30 seconden en breng ze vervolgens onmiddellijk over op ijs gedurende 2 minuten. Voeg 200 μL LB-buffer toe en schud gedurende 1 uur bij 30 °C, 180 rpm.
   2. Verdeel 125 μl van het mengsel over een agarplaat met het bijbehorende antibioticum en incubeer gedurende een nacht (~18 uur) bij 30 °C. Kies meerdere klonen en plaats ze in een steriele plastic kweekbuis met 3 ml LB met het bijbehorende antibioticum. 's Nachts schudden bij 30 °C, 180 tpm.
      OPMERKING: Om ITR-deleties of -mutaties te voorkomen, moeten bacteriële cellen worden gekweekt bij 30 °C om de celdeling te vertragen en fouten in replicatie te beperken. Bovendien moeten kleinere kolonies worden geplukt, omdat kolonies zonder ITR's een groeivoordeel kunnen hebben ten opzichte van andere.
   3. Pipetteer 1,8 ml van elke cultuur in een buis van 2 ml en centrifugeer op 6.000 x g gedurende 3 minuten op kamertemperatuur. Isoleer het DNA met behulp van een miniprep-kit. Bewaar de resterende 1,2 ml cultuur bij 4 °C. Controleer de juiste klonen door middel van DNA-sequencing of diagnostische restrictie-enzymvertering.
      OPMERKING: Sanger-sequencing van de insert wordt aanbevolen, maar processiviteit door middel van ITR's is niet haalbaar met standaardmethoden. ITR's moeten worden geverifieerd door middel van restrictiesamenvatting, zoals hieronder beschreven.
   4. Voeg 50 ml LB-buffer met het bijbehorende antibioticum toe aan een steriele erlenmeyer van 250 ml. Voeg 500 μl van de resterende cultuur toe aan de kolf en schud bij 30 °C, 180 rpm tot een OD₆₀₀ van 0,2-0,5 is bereikt (~18 uur). Breng de bacteriën over in een conische buis van 50 ml en centrifugeer gedurende 20 minuten bij 3.000 x g, 4 °C. Isoleer het DNA met behulp van een endotoxine-arme of -vrije midiprep-kit.
   5. Controleer de ITR-integriteit met 20 μL diagnostisch restrictie-enzymdigestaat met behulp van XmaI (of SmaI). Bereid een reactie voor met 500 ng plasmide, 0,5 μL enzym en 1x buffer; incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C. Voer de reactie uit op een 0,8% agarose-gel. Als ITR's intact zijn, geeft de spijsvertering een band van ~2,9 kb en een andere band ter grootte van de cassette. Als deze duidelijke band niet in acht wordt genomen, is de ITR mogelijk niet intact en moet het klonen opnieuw worden uitgevoerd.
      OPMERKING: Plasmiden die XmaI (of SmaI) restrictieplaatsen bevatten (naast die in de ITR's) zullen extra banden op de gel hebben.

Figuur 2: Representatief voorbeeld voor primerontwerp. Voorwaarts en achterwaarts primerontwerp voor een mScarlet-transgen (representatief voorbeeld). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aantal	Bestanddeel
X μL	Sjabloon DNA (25 ng)
1 μL	F primer (10 μM)
1 μL	R primer (10 μM)
1 μL	dNTP (10 mM)
10 μL	Phusion Buffer (5x)
1 μL	Phusie Polymerase
X μL	Water
50 μL	Eindvolume

Tabel 1: PCR-amplificatiereagentia. De benodigde componenten voor een succesvolle PCR-reactie.

Stap	Temperatuur	Tijd
Initiële denaturatie	98 °C	1 minuut
30 cycli	98 °C	10 seconden
	Tm van Primer	jaren '30 seconden
	72 °C	30 s per KB
Laatste verlenging	72 °C	10 min
Houden	4 °C	Onbeperkt

Tabel 2: PCR-amplificatieprogrammering. De vereiste cyclusparameters voor een succesvolle PCR-reactie.

Aantal	Bestanddeel
X μL	PCR-product (1 μg) of pAAV-plasmide (3 μg)
5 μL	Buffer (10x)
1 μL	EcoRI-HF
1 μL	NotI-HF
X μL	Water
50 μL	Eindvolume

Tabel 3: Reagentia voor de spijsvertering. De benodigde componenten voor een succesvolle verteringsreactie.

Aantal	Bestanddeel
X μL	Invoegen (X ng)
X μL	Ruggengraat (50 ng)
2 μL	T4 DNA Ligase Buffer (10x)
1 μL	T4 DNA-ligase
X μL	Water
20 μL	Eindvolume

Tabel 4: Ligatiereagentia. De benodigde componenten voor een succesvolle ligatiereactie.

3. Vectorproductie met drievoudige plasmidetransfectie

OPMERKING: De volgende waarden zijn geoptimaliseerd voor een enkel putje van een plaat met 6 putjes die een uiteindelijk ruw bereidingsvolume van 2 ml oplevert. Alle waarden kunnen 10x worden opgeschaald voor een plaat van 15 cm die een eindvolume van 20 ml oplevert of 4x worden verkleind voor een plaat met 24 putjes en een eindvolume van 500 μL.

1. Maak een voorraad polyethyleeniminehydrochloride (PEI) MAX van 1 μg/μL door 100 mg PEI MAX op te lossen in 100 ml gedestilleerd water. Pas de pH aan naar 7,1 met NaOH. Filter steriliseer het mengsel met een filter van 0,22 μm en vries aliquots van 1 ml in bij -20 °C voor langdurige opslag. Eenmaal ontdooid, bewaar het reagens gedurende 1 maand bij 4 °C.
2. Zaad 3 x 10 5 HEK293 of HEK293T cellen in een plaat met 6 putjes met voorverwarmde Dulbecco's gemodificeerde adelaarsmedium (DMEM,^4,5 g/L glucose, 110 mg/L natriumpyruvaat) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS). Groei tot ~75%-90% confluentie in een incubator ingesteld op 37 °C en 5% CO₂ (Figuur 3).
   OPMERKING: Er is waargenomen dat cellen gekweekt met penicilline/streptomycine (P/S) de opbrengst van de vectorproductie verminderen. Het gebruik van de juiste steriele techniek omzeilt de noodzaak om P/S te gebruiken, en daarom wordt aanbevolen om HEK293-cellen niet te kweken met antibioticum²⁰. Als P/S vereist is bij stroomafwaartse transducties, wordt aanbevolen om na de oogst P/S toe te voegen aan de ruwe bereiding.
3. Bereid in een buisje van 2 ml een mengsel met 1,3 μg pAAV2/2 (Rep/Cap, serotype 2), 1,3 μg pAAV.GOI, 2,6 μg pAdΔF6 en serumvrije (SF) DMEM (4,5 g/l glucose, 110 mg/l natriumpyruvaat) in een totaal volume van 100 μl (zie aanvullende tabel 1 voor gemakkelijke berekeningen).
4. Bereid een negatieve controle voor in een apart buisje door pRep/Cap te vervangen door een niet-verwant plasmide. De negatieve controle houdt rekening met onverpakte pAAV.GOI-plasmide dat aanwezig is in het ruwe preparaat en dat mogelijk cellen zou kunnen transfecteren tijdens transductie, hoewel zeldzaam.
   OPMERKING: Endotoxine-laag of -vrij maxiprep of midiprep-plasmide is ideaal voor drievoudige transfectie en produceert over het algemeen een hogere titervector in vergelijking met miniprep-DNA, hoewel miniprep-DNA kan worden gebruikt voor snelle en vuile voorlopige tests.
5. Voeg 5,2 μL PEI MAX toe aan het plasmidemengsel; dit is een plasmide:PEI-mengsel met een verhouding van 1:1. Meng goed door 10-15 keer te pulseren op een vortexmixer die op 7 staat. Als er meerdere vectorpreparaten worden geproduceerd, voeg dan PEI toe aan elk plasmidemengsel met gespreide tijdsintervallen van 1 minuut (d.w.z. preparaat 1 bij t = 0 min, preparaat 2 bij t = 1 min, enz.) om voldoende timing te hebben om putjes op te zuigen en de reactie in de volgende stappen te verdunnen.
   OPMERKING: Er is waargenomen dat een verhouding van 1:1 plasmide:PEI optimaal is. Individuele gebruikers kunnen deze verhouding echter optimaliseren voor maximale efficiëntie. Raadpleeg de discussie voor het uitvoeren van PEI-optimalisatie (zie ook aanvullende tabel 2).
6. Incubeer elk buisje gedurende precies 15 minuten en verdun de reactie vervolgens met 1,9 ml SF DMEM (4,5 g/l glucose, 110 mg/l natriumpyruvaat) voor een eindvolume van 2 ml. Pipetteer voorzichtig 2x om te mengen. Overmenging verstoort plasmide/PEI-complexen en resulteert in een lagere transfectie-efficiëntie.
7. Zuig media uit de put en voeg het plasmide:PEI-mengsel voorzichtig toe aan de zijkanten van de put om cellulaire loslating te voorkomen. Incubeer de cellen gedurende 72 uur bij 37 °C en 5% CO₂ . Cellyse en -onthechting tijdens de incubatie is een normaal proces van rAAV-productie (Figuur 4).

Figuur 3: HEK293-cellen klaar voor transfectie. De ideale samenvloeiing (75%-90%) van HEK293-cellen die nodig zijn voor drievoudige plasmidetransfectie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: HEK293 cellen na transfectie. Het verschijnen van HEK293-cellen voor en na 1, 2 of 3 dagen na transfectie met pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40, pAAV2/2, pAdΔF6 en 1:1 verhouding van plasmide:PEI. Schaalbalken: 400 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Oogsten van preparaten voor ruwe vectoren

1. Vries de hele plaat van getransfecteerde cellen gedurende 30 minuten bij -80 °C in, gevolgd door een dooi gedurende 30 minuten bij 37 °C. Herhaal dit voor een totaal van drie vries-/dooicycli. Verwijder het deksel niet - de plaat moet van binnen steriel blijven. Platen kunnen op -80 °C blijven totdat ze klaar zijn om door te gaan naar de volgende stappen.
   NOTITIE: Een niet-bevochtigde incubator werkt het beste voor ontdooien, waardoor condensatie aan de buitenkant van platen tot een minimum wordt beperkt, wat kan leiden tot onbedoelde besmetting.
2. Voer de volgende twee stappen uit in een laminaire stromingskap met behulp van aseptische technieken. Meng elk putje door te pipetteren om een maximale verstoring van de cellen te garanderen. Breng lysaat over in een buis van 2 ml en centrifugeer gedurende 15 minuten op 15.000 x g, kamertemperatuur om celresten te verwijderen.
3. Breng het supernatans voorzichtig over in een nieuw buisje van 2 ml. Dit ruwe preparaat kan onmiddellijk worden gebruikt zonder titratie of zuivering. Vector kan enkele maanden bij 4 °C of jarenlang bij -20 °C worden bewaard.
   OPMERKING: Indien nodig kunnen titers worden berekend door middel van kwantitatieve PCR (qPCR) door het aantal vectorgenomen (VG) in DNase-resistente deeltjes te kwantificeren. Als zodanig worden titers gegeven in eenheden van VG/ml. Vector die enkele maanden bij 4 °C wordt bewaard, moet vóór gebruik opnieuw worden getitreerd, omdat vector buiswanden kan samenvoegen en/of binden, waardoor de titer van het preparaat wordt verminderd.

5. Transductie

1. Plaat het gewenste celtype (bijv. Huh7) in een plaat met 96 putjes bij een doelconfluentie van 50%-75%, afhankelijk van de duur van de transductie. Een grotere samenvloeiing kan leiden tot een verminderde AAV-transductie-efficiëntie.
2. Voeg vector (bijv. CMV.mScarlet) toe aan cellen zonder de titer van het ruwe preparaat te kennen voor toepassingen waarbij de dosis niet relevant is, zoals het testen van een panel van capsiden voor transductie in een nieuw celtype. Voer een 1:3 verdunningsreeks van het ruwe preparaat uit in serumvrije (SF) media om de optimale hoeveelheid vector te verkrijgen die nodig is voor de toepassing. Zuig media op van een plaat met 96 putjes en voeg 50-100 μL verdund ruw preparaat toe aan de putjes. Incubeer cellen bij 37 °C en 5% CO₂ .
   OPMERKING: Serum kan antilichamen bevatten die de AAV-vector kunnen neutraliseren en de transductie-efficiëntie kunnen verminderen. Serum kan echter worden gebruikt tijdens transductie voor gevoelige celtypen.
3. Verwijder de vector na 48 uur posttransductie (hpt) en was de cellen eenmaal met voorverwarmde fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Vectoren kunnen ook worden verwijderd en vervangen door serumbevattende media zodra 2 hpt voor gevoelige celtypen. Voer voor veel toepassingen 's nachts incubatie uit om cellen te transduceren en 's ochtends putjes te vervangen door verse serumbevattende media. Robuuste celtypen, zoals Huh7 en U2-OS, hoeven niet van media te worden gewisseld.
4. Beëindig de transductie door cellen gedurende 10 minuten in 4% paraformaldehyde (PFA) te fixeren. Afhankelijk van de toepassing kunnen ook verschillende afsluitmethoden worden gebruikt (bijv. lysis). Voor de meeste celtypen vindt piekexpressie plaats bij 48 hpt en is dus een gemeenschappelijk experimenteel eindpunt.

6. Variaties op de transductiemethode per celtype

OPMERKING: Verschillende celtypen vereisen verschillende kweekomstandigheden. Daarom moet de toevoeging van vector voor transductie worden geoptimaliseerd op basis van de behoeften van het celtype. Hieronder staan zeer specifieke transductieprotocollen voor de celtypen die in de representatieve resultaten zijn opgenomen, ter illustratie van enkele variaties van transductieprotocollen die een onderzoeker mogelijk voor zijn eigen behoeften wil proberen.

1. Organoïden van de dunne darm van muizen
   1. Leid muizen dunne darm organoïden (mSIO's) af van een dunne darm crypte prep van C57BL/6J muizen. Veranker organoïden in 90% basale membraanmatrix en kweek in platen met 24 putjes die ofwel organoïde groeimedium (zonder antibiotica) of pre-transductiemedium bevatten (50% Wnt3a-geconditioneerd medium [intern geproduceerd met behulp van L Wnt-3A-cellen in organoïde groeimedium], 10 mM nicotinamide, 10 μM ROCK-remmer en 2,5 μM CHIR99021) gedurende één passage (5-7 dagen) vóór transductie bij 37 °C en 5% CO₂.
   2. Spoel de organoïden voorafgaand aan de transductie met D-PBS, verstoor de koepels van de basale membraanmatrix door te pipetteren en dissocieer de organoïden in kleine celclusters door ze gedurende 10 minuten bij 37 °C in dissociatiemedium te incuberen en verder te pipetteren.
   3. Stop het celdissociatieproces door 5% FBS toe te voegen aan DMEM/F-12 met 15 mM HEPES, celclusters over te brengen in centrifugebuizen en celclusters op te vangen door 5 minuten te centrifugeren bij 1000 x g, kamertemperatuur.
   4. Resuspendeer de celclusters in transductiemedium (pre-transductiemedium met 10 μg/ml polybreen of organoïde groeimedium met 10 μg/ml polybreen) en breng over in platen met 48 putjes, gevolgd door de toevoeging van AAV-ruwe preparaten ter verpakking CMV.mScarlet voor transductie.
   5. Voer de transductie van organoïden uit door de plaat gedurende 1 uur te centrifugeren bij 600 x g en 37 °C en vervolgens nog eens 6 uur bij 37 °C te incuberen. Verzamel getransduceerde organoïden in microcentrifugebuisjes van 1,5 ml, centrifugeer gedurende 5 minuten op 1000 x g, kamertemperatuur, en zet op ijs.
   6. Na verwijdering van het supernatant de getransduceerde organoïden resuspenderen in 90% basaalmembraanmatrix in pre-transductiemedium of organoïde groeimedium en zaaddruppeltjes van 20 μL in een putje van een voorverwarmd kamerglas.
   7. Na een incubatietijd van 10 minuten in de incubator de druppel inbedden in 350 μl voortransductiemedium of organoïde groeimedium en incuberen bij 37 °C in de incubator. Bepaal de transductie-efficiëntie 2-5 dagen na transductie door de getransduceerde organoïden af te beelden op een confocale microscoop en schat het percentage rode fluorescerende cellen per organoïde.
2. BeWo-cellen
   1. 24 uur vóór transductie, plaat humaan placenta-choriocarcinoom BeWo-cellen op 10.000 cellen per putje van 96-wells plaat. Verdun ruwe AAV-preparaten die CMV.mScarlet verpakken tot 1:1 in serumvrij F12-K BeWo-medium tot een totaal volume van 50 μL per putje. Zuig het medium op uit het putje en vervang het door 50 μL verdunde AAV per putje.
   2. Incubeer cellen bij 37 °C 's nachts (~18 uur) en voeg vervolgens 100 μL F12-K BeWo-medium met 10% FBS toe om het totale volume op 150 μl te brengen. Incubeer cellen gedurende nog eens 6 uur voor een totaal van 24 uur posttransductie (hpt).
   3. Kleuring voor beeldvorming levende cellen gedurende 30 minuten met Hoechst-kleurstof in F12-K-medium en vervang het medium vervolgens door fenolvrije DMEM met 10% FBS, 1x glutamax-supplement en 1x natriumpyruvaatsupplement voor beeldvorming. Beeldvorming van levende cellen uitvoeren op een confocale microscoop met behulp van DAPI (voor Hoechst-beeldvorming) en mCherry- (voor mScarlet-beeldvorming) filtersets met 37 °C en 5% CO₂.
3. Hepa1-6 en Huh7 cellen
   1. Plaat muizen Hepa1-6 levercellen en menselijke Huh7 levercellen in DMEM (4,5 g/L glucose, 110 mg/L natriumpyruvaat, 10% FBS) bij 5.000 cellen per putje van een plaat met 96 putjes 24 uur voor transductie.
   2. Voeg 50 μl onverdunde ruwe AAV-preparaten ter verpakking van CMV.mScarlet rechtstreeks toe aan de cellen en incubeer gedurende 48 uur bij 37 °C. Was de cellen eenmaal in PBS, fixeer ze in 4% PFA en kleur ze gedurende 10 minuten met Hoechst-kleurstof. Voer beeldvorming uit op een confocale microscoop met behulp van de filtersets DAPI (voor Hoechst-beeldvorming) en mCherry (voor mScarlet-beeldvorming).
4. C2C12- en HSkMC-cellen
   1. Plaat ongedifferentieerde muizen C2C12-myoblasten en ongedifferentieerde myoblasten van menselijke primaire skeletspiercellen (HSkMC) bij 5.000 cellen per putje van een plaat met 96 putjes, 72 uur vóór transductie.
   2. Verdun ruwe AAV-preparaten die CMV.mScarlet verpakken tot 1:1 in DMEM (4,5 g/L glucose, Penn/Streptokokken, 20% FBS) voor C2C12-myoblasten of groeimedia voor skeletspiergroeimedia voor HSkMC-myoblasten. Differentieer HSkMC-myoblasten naar myotubes door de media te veranderen in differentiatiemedia.
   3. Incubeer myoblasten en myotubes in verdunde AAV-preparaten gedurende 24 uur bij 37 °C. Kleuring van levende cellen met Hoechst-kleurstof gedurende 10 minuten en beeld af met een confocale microscoop met behulp van de filtersets DAPI (voor Hoechst-beeldvorming) en mCherry (voor mScarlet-beeldvorming).

Resultaten

Het vinden van een optimale capside voor het transduceren van gekweekte cellen van belang
Een verscheidenheid aan celtypen werd getransduceerd om het tropisme van verschillende capside-serotypen te bepalen (Figuur 5). De natuurlijke serotypen AAV2¹⁴, AAV4 21, AAV5 22, AAV8 23, AAV9 24 en de gemanipuleerde capsidevarianten Anc80 25, DJ 26, LK03²⁷ en^{KP1 28} werden verpakt met een vectorgenoom dat mScarlet tot expressie brengt onder een CMV-promotor, gekloond met behulp van de methoden die in dit protocol worden verstrekt. Niet-getitreerde ruwe vectorpreparaten werden verdund in de juiste kweekmedia en de cellen werden gedurende 24+ uur getransduceerd en in beeld gebracht (figuur 5B). De transductie-efficiëntie werd berekend door het aandeel van het totale aantal cellen dat mScarlet+ was, of het aandeel cellen in een enkel z-vlak dat mScarlet+ was (voor organoïden van de dunne darm van muizen; Figuur 5C). Transductie-efficiënties (mScarlet+-cellen) worden niet verstrekt voor gedifferentieerde C2C12- en HSkMC-myotubes, maar eerder voor ongedifferentieerde C2C12- en HSkMC-myoblasten (Figuur 5A).

AAV2 en KP1 waren de krachtigste serotypen in alle geteste cellijnen (Figuur 5A). Er werd ook waargenomen dat vergelijkbare celtypen afkomstig van verschillende soorten met verschillende efficiëntie worden getransduceerd. Hepa1-6 (een van muizen afgeleide levercellijn) vertoont bijvoorbeeld een duidelijke afname van de transductie in vergelijking met Huh7 (een van mensen afgeleide levercellijn) bij gebruik van AAV2 (Figuur 5B). Bovendien spelen verschillende mediacondities een belangrijke rol tijdens de transductie. Organoïden van de dunne darm van muizen (mSIO's) gekweekt in pre-transductiemedia worden minder effectief getransduceerd in vergelijking met organoïde groeimedia (Figuur 5C). Bovendien transduceert AAV2 op efficiënte wijze ongedifferentieerde HSkMC-myoblasten en gedifferentieerde HSkMC-myotubes (Figuur 5B), hoewel kwantitatieve analyse van myotubes moeilijk is en daarom niet wordt verstrekt.

De hoge transductie-efficiëntie die voor verschillende celtypen in figuur 5 is waargenomen, laat zien dat ruwe vectorpreparaten effectief kunnen worden gebruikt om een verscheidenheid aan celtypen te transduceren zonder verdere stappen zoals zuivering en titratie. Er moet echter zorgvuldig worden nagedacht bij het kiezen van een capside om de afgifte van transgen te maximaliseren. Veel andere cellijnen en capsiden zijn eerder getest en gepubliceerd, zij het met gezuiverde vectorpreparaten¹².

Een vectordeeltje-onafhankelijk effect van mediacondities kan de efficiëntie van de transductie beïnvloeden. Het is echter algemeen aanvaard dat tropisme (d.w.z. celtype-specifieke opname en expressie van vector) een eigenschap is die capside-specifiek is²⁹. Er is nog niet waargenomen dat een vergelijking tussen op de dosis afgestemde ruwe en gezuiverde preparaten het cellulaire tropisme beïnvloedt. Daarom kunnen preparaten van ruwe vectoren op dezelfde manier worden gebruikt als gezuiverde vectoren in celkweek.

Figuur 5: Ruwe vectortransductie van verschillende celtypen . (A) Percentage mScarlet+ na toevoeging van verschillende AAV-vectoren die een mScarlet-transgen bevatten. (B) Cellen die mScarlet tot expressie brengen, geleverd door AAV-serotype 2. Schaalbalken: 100 μm (Hepa1-6, Huh7, C2C12 en HSkMC), 200 μm (BeWo), 20 μm (mSIO). Afkortingen: hpt = uren na transductie. (C) Dunne darmorganoïden (mSIO's) van muizen werden ofwel rAAV behandeld in pre-transductiemedia of organoïde groeimedia. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende tabel 1: Werkblad voor drievoudige plasmidetransfectie. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel 2: PEI-optimalisatiewerkblad. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Klonen
Het kloonprotocol is niet beperkt tot het hierboven gebruikte pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40-plasmide en kan eenvoudig worden gewijzigd op basis van de experimentele behoeften van een onderzoeker. Veel ITR-bevattende plasmiden zijn direct online te koop. Er zijn bijvoorbeeld plasmiden beschikbaar die zowel Cas9 als een sgRNA-kloonplaats bevatten, maar die weinig extra stappen vereisen, zoals oligonucleotide-gloeien en PNK-behandeling³⁰. Bovendien kunnen plasmiden worden gevonden die een meervoudige kloonplaats (MCS) bevatten met alleen ITR's en geen interne regulerende elementen³¹. Als er verschillende plasmiden moeten worden gebruikt, zijn de restrictie-enzymen (RE) die voor de spijsvertering worden gebruikt meestal de enige elementen die in dit protocol moeten worden gewijzigd. Een beperking van rAAV is echter de beperkte laadcapaciteit. Vanwege de fysieke beperkingen van de capside mag het vectorgenoom niet groter zijn dan 4,9 kb, inclusief de ITR's.

Bij het isoleren van plasmide uit bacteriën is het van cruciaal belang om een endotoxine-arme of -vrije midiprep- of maxiprep-kit te gebruiken om schade aan cellen tijdens drievoudige plasmidetransfectie of -transductie te verminderen. Plasmide uit miniprep-kits bevat vaak hogere onzuiverheden, verlaagde concentraties en minder supercoiled DNA, die allemaal de stroomafwaartse productie van rAAV kunnen beïnvloeden en daarom niet worden aanbevolen.

Het is van cruciaal belang om de structuur en eigenschappen van ITR's tijdens het klonen te begrijpen. Ten eerste is het buitengewoon moeilijk om PCR via de ITR te gebruiken. Kloonontwerpen die PCR-amplificatie via ITR's vereisen, moeten worden vermeden en bovendien moet het gebruik van de Gibson-kloontechniek worden beperkt. Als zodanig is het klonen van restrictie-enzymen de voorkeursmethode voor klonen in ITR-bevattende plasmiden. Bovendien zijn bepaalde primers voor Sanger-sequencing mogelijk niet compatibel als het gesequencede gebied de ITR bevat. In plaats daarvan wordt aanbevolen om primers te gebruiken die de sequentie van de ITR's naar het vectorgenoomlichaam leiden om nauwkeurigere sequentieresultaten te krijgen. Ten tweede zijn ITR's vatbaar voor deleties, herschikkingen en mutaties wanneer ze worden omgezet in bacteriën voor plasmide-amplificatie^32,33. Om deze gebeurtenissen te verzachten, wordt aanbevolen om recombinatie-deficiënte competente bacteriestammen, zoals Stbl3, te gebruiken en deze bij 30 °C te incuberen om de celdeling te vertragen. Ten slotte is opgemerkt dat kleinere kolonies kunnen overeenkomen met klonen zonder herschikking of deleties, aangezien kolonies zonder ITR's een groeivoordeel kunnen opleveren en groter kunnen zijn. Daarom wordt aanbevolen om kleine kolonies te plukken.

Vector productie
De succesvolle productie van rAAV-vector kan door meerdere elementen worden beïnvloed. Een kritische factor is de gezondheid van HEK293- of 293T-cellen die worden gebruikt voor transfectie. Over het algemeen zijn lage passagecijfers ideaal, omdat cellen met een hoge passage genotypische en fenotypische afwijkingen kunnen vertonen die rAAV-titers kunnen verminderen. Bovendien moet de dichtheid van de gezaaide cellen 75%-90% confluentie zijn voor een effectieve productie. Schaarse cellen genereren lage vectoropbrengsten omdat er minder cellen beschikbaar zijn om vectoren te produceren, terwijl overwoekerde cellen niet efficiënt worden getransfecteerd.

Variaties tussen reagenspartijen, celvoorraden en algemene variabiliteit van lab tot lab dragen bij aan verschillen in transfectie-efficiëntie en productietiter. Een optimaliseerbare factor die tot titerverbeteringen kan leiden, is de plasmide:PEI-verhouding in transfectiereacties. Het is van cruciaal belang om verse (<1 maand oude) PEI MAX te gebruiken. Het wordt aanbevolen om een plasmide:PEI-verhouding van 1:1 als uitgangspunt te gebruiken, en als de transfectie of transductie-efficiëntie slecht lijkt, test dan verschillende verhoudingen. Titeroptimalisatie is het gemakkelijkst als een transgen wordt gebruikt met een visuele uitlezing, zoals het CMV.Luc.IRES.EGFP-reportertrangen dat hierin wordt gebruikt als uitgangsmateriaal voor klonen. Om de optimalisatie uit te voeren, volgt u protocolstap 3 met behulp van een plaat met 12 putjes en verkleint u de plasmidemassa's en reagensvolumes met twee (de uiteindelijke plasmidemassa is 2,6 μg). Pas het PEI-volume dienovereenkomstig aan om overeen te komen met verhoudingen van 1:0.75 tot 1:3, met toenemende stappen van 0.25 (Figuur 6). Verdun elke reactie na 15 minuten met 950 μL SF-media. Voor het gemak kan een mastermix met de drievoudige plasmiden worden gemaakt en afzonderlijk worden gepipetteerd in buisjes van 1,5 ml voordat PEI wordt toegevoegd - zie aanvullend bestand 2. Oogst de vector, transduceer cellen van belang en afbeelding. Het putje met de hoogste transductie-efficiëntie (aandeel GFP+-cellen) komt overeen met de hoogste titer en de meest optimale verhouding van PEI:DNA.

Figuur 6: PEI-optimalisatieworkflow. Schema van de stappen die nodig zijn voor PEI-optimalisatie. Meerdere verhoudingen van plasmide: PEI worden getest om de optimale verhouding te bepalen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Oogst- en titeroverwegingen
De vries-/dooitechniek die wordt gebruikt om de rAAV-vector te oogsten, lyseert HEK293-cellen effectief op een manier die verenigbaar is met het directe gebruik van het geklaarde lysaat om gekweekte cellen te transduceren. Bepaalde rAAV-serotypen, zoals AAV1, AAV8 en AAV9, komen vrij uit cellen tijdens de vectorproductie en kunnen worden geoogst uit het gekweekte celmedium zonder vries-/dooicycli³⁴. De hier beschreven methode levert doorgaans titers op in de orde van grootte van 1 x 10¹⁰ VG/ml bij gebruik van AAV2-capsiden en 1 x 10¹¹ VG/ml voor AAV8. Hoewel hogere titers kunnen worden bereikt door wasmiddel of andere lysis op basis van chemicaliën, zijn deze schadelijk voor cellen bij stroomafwaarts gebruik en vereisen ze dat rAAV's verder uit het lysaat worden gezuiverd. Een lagere titer is een afweging die een onderzoeker moet overwegen bij het bepalen of ruwe preparaten geschikt zijn voor hun onderzoeksbehoeften, maar de marginaal lagere titers die worden geproduceerd door de hier beschreven methoden kunnen veel celtypen zeer goed transduceren (zie representatieve resultaten). Naast de transfectie-efficiëntie en celgezondheid variëren vectortiters afhankelijk van de capside die wordt gebruikt tijdens de productie van rAAV en de grootte en sequentie van het transgen binnen de VG³⁵.

Bij het oogsten van ruwe vectorpreparaten kan plasmide-DNA aanwezig zijn dat werd gebruikt tijdens de transfectie van drievoudig plasmide en, hoewel zeldzaam, resulteren in stroomafwaartse transfectie tijdens transductie. Bovendien kunnen onverpakte VG's zich binden aan de buitenkant van capsiden en een aangeboren immuunrespons oproepen op naakt en vreemd enkelstrengs DNA^36,37. Daarom kan het voor gevoelige celtypen nodig zijn dat vectorpreparaten DNase worden verteerd en gezuiverd om onverpakte VG's en plasmide te verwijderen.

Als men de titer van een ruw preparaat wil berekenen, kan qPCR worden uitgevoerd om het aantal verpakte VG in DNase-resistente deeltjes (DRP) te kwantificeren. In het kort wordt een kleine hoeveelheid ruw preparaat DNase-verteerd om plasmide-DNA, verontreinigende nucleïnezuren of gedeeltelijk verpakt VG te verwijderen. Het monster wordt vervolgens onderworpen aan qPCR en de beschermde VG in DRP's wordt gekwantificeerd, wat resulteert in een titer met eenheden van vectorgenoom per ml ruw preparaat³⁸. Het wordt niet aanbevolen om vectortitratie uit te voeren met behulp van ELISA-gebaseerde assays die capsidetiters kwantificeren. In vergelijking met het wildtype AAV-virus heeft rAAV last van een aandeel lege en gedeeltelijk verpakte capsiden³⁹. ELISA zal alle capsiden kwantificeren, ongeacht hun genoominhoud, en zal de transduceerbare eenheden overschatten die aanwezig zijn in een preparaat, waarvoor een verpakte VG nodig is.

Overwegingen bij transductie
Veel factoren zijn van invloed op rAAV-transducties en er moeten de juiste overwegingen worden gemaakt voor elk nieuw experiment. Afhankelijk van de promotor die de transgenexpressie aanstuurt, kan het begin van de expressie al 4 uur na transductie (hpt) optreden, en de piekexpressie wordt doorgaans bereikt door 48 hpt. Het is belangrijk om rekening te houden met de tijdsduur vanaf het eerste zaaien van cellen tot het experimentele eindpunt. Dit is om de beginsamenvloeiing van de cellen in te schatten en ervoor te zorgen dat ze aan het einde van het experiment niet overgroeien. Als cellen te veel samenvloeien, kan het cellulaire gedrag veranderen als gevolg van een stressreactie en kan het experimentele resultaten verwarren. Sommige celtypen, zoals U2-OS, kunnen overgroei/contactremming vrij goed verdragen. Bovendien zijn ze bestand tegen lange perioden (48 uur+) in serumvrij geconditioneerd medium - het product van dit productieprotocol. Voor gevoelige celtypen kan het echter nodig zijn om het ruwe preparaat in serum toe te voegen of te verdunnen met een speciaal groeimedium om de gezondheid tijdens de transductie te behouden. Een licht verminderde transductie-efficiëntie door het gebruik van serumbevattende media is een mogelijke afweging voor de gezondheid van de cel en moet door de onderzoeker worden overwogen.

Doorgaans is voor snel delende cellen een startconfluentie van ongeveer 50% optimaal voor toepassingen die 48 hpt worden beëindigd. De confluentie kan echter dienovereenkomstig worden aangepast op basis van de behoeften van het experiment. Het wordt niet aanbevolen om onsterfelijke cellijnen van het monolaagtype met een confluentie van meer dan 75% te transduceren vanwege verminderde transductie-efficiëntie. De meeste gekweekte celtypen zijn met succes getransduceerd en gezond na een nacht incubatie met ruwe rAAV-preparaten, gevolgd door een verandering naar verse serumbevattende media in de ochtend.

Capside-serotype is een belangrijke factor waarmee rekening moet worden gehouden bij het produceren van rAAV om een doelcel te transduceren, aangezien de capside de primaire determinant is van cellulair tropisme en daaropvolgende transgenexpressie¹³. AAV2 is een veelgebruikt serotype vanwege het vermogen om vele soorten gekweekte cellen effectief te transduceren¹². Deze eigenschap van AAV2 kan worden toegeschreven aan heparinesulfaatproteoglycanen (HSPG's) die dienen als de primaire hechtingsfactor voor AAV2 en de hoge niveaus van HSPG's op gekweekte cellen vanaf de aanpassing tot het groeien in een schaal⁴⁰. Andere capsiden, zoals AAV9, zijn minder effectief in het transduceren van brede celtypen en kunnen worden verklaard door hun afhankelijkheidshechtingsfactoren die niet tot uiting komen in deze setting⁴¹. Daarom raden we AAV2 aan als eerste keus capside in gekweekte cellen als een gewenste doelcel niet eerder in de literatuur is getest met rAAV.

Houd er rekening mee dat een belangrijke beperking van preparaten voor ruwe vectoren is dat ze niet geschikt zijn voor het transduceren van diermodellen. In vivo studies vereisen dat preparaten worden gezuiverd en aan een kwaliteitsbeoordeling worden onderworpen.

Transgenexpressie en mogelijke integratieoverwegingen
rAAV's resulteren niet op betrouwbare wijze in permanente expressie van het transgen. Na verloop van tijd kunnen VG's het zwijgen worden opgelegd en kan transgene expressie worden stopgezet na verschillende passages⁴². Bovendien blijven de meeste VG's episomaal en bevatten rAAV's niet de virale Rep-eiwitten die frequente integratie in het gastheergenoom zouden mediëren zoals bij een wild-type virale lysogene infectie of replicatie van VG's zouden bevorderen⁴³. Als gevolg hiervan zullen episomen in getransduceerde cellen uiteindelijk worden verdund tussen dochtercellen door middel van delingen.

Integratie op basaal niveau is een mogelijkheid voor al het geleverde transgene DNA-materiaal. ITR-bevattende VG's zijn echter gevoelig voor integratie met een hogere frequentie⁴⁴. Daarom kan permanente expressie van een transgen worden waargenomen in een kleine subset van cellen. Gebruikers moeten deze mogelijkheid overwegen, vooral bij het gebruik van rAAV om DNA-knippende enzymen, zoals Cas9, af te leveren, aangezien dubbelstrengs breuken kunnen resulteren in een nog grotere frequentie van integratie en permanente expressie⁴⁵. Hoewel dit rAAV een goede kandidaat maakt voor het leveren van homologiegerichte reparatiesjablonen voor endogene tagging of gentoevoeging, moet de mogelijkheid van Cas9-insertie worden overwogen^19,46.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Snapgene DNA viewing sofrware	Snapgene
pAAV.CMV.Luc.IRES.EGFP.SV40	AddGene	105533
pAAV2/2 (Rep/Cap)	AddGene	104963
pAdΔF6	AddGene	112867
LB Agar Carbenicillin	Sigma-Aldrich	L0418
Boekel Scientific Economy Digital Incubator	Boekel Scientific	133000
LB medium, powder	MP Biomedicals	113002042
Carbencillin (Disodium)	GoldBio	C-103-5
New Brunswick I26 Shaker	Eppendorf	M1324-0000
50 mL Centrifuge Tubes	Corning	430828
Centrifuge 5810 R	Eppendorf	22627040
QIAGEN Plasmid Plus Midi Kit	Qiagen	12945
PCR PULL-APART 8-TUBE STRIPS	USA Scientific	1402-3900
Mastercycler nexus	Eppendorf	6333000022
dNTP	Thermo Fisher Scientific	18427013
5x Phusion Buffer	NEB	B0518S	Verstrekt bij aankoop van Phusion Polymerase
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	M0530S
Gel Loading Dye, Orange (6X)	NEB	B7022S
DNA Clean & Concentrator-100	Zymo	D4029
Zymoclean Gel DNA Recovery Kit	Zymo	D4001
NotI-HF	NEB	R3189S
EcoRI-HF	NEB	R3101S
CutSmart Buffer (10x)	NEB	B6004S	Verstrekt bij aankoop van restrictie-enzym
UltraPure Agarose	Thermo Fisher Scientific	16500100
Ethidium Bromide	Sigma-Aldrich	E1510
T4 DNA Ligase	NEB	M0202S
T4 DNA Ligase Reaction Buffer	NEB	B0202S	Verstrekt bij aankoop van T4 Ligase
Eppendorf Safe-Lock Tubes (1.5mL)	Eppendorf	22363204
Precision Microprocessor Water Bath	Thermo Scientific	51221046
Sterile Plastic Culture Tubes	Fisher Scientific	149566B
2.0 mL Microcentrifuge Tube	Thomas Scientific	1149Y01
ZR Plasmid Miniprep - Classic	Zymo	D4015
Xma1	NEB	R0180S
Sma1	NEB	R0141S
HEK 293T cells	ATCC	CRL-3216
Falcon 6-well	Corning	353046
Gibco DMEM, high glucose, pyruvate	Thermo-Fisher	11995065
Sanyo MCO-18AIC(UV) CO2 Incubator	Marshall Scientific	MCO-18AIC
PEI MAX (Polyethylenimine Hydrochloride)	Polysciences	24765-100
Mixer Vortex Genie 2	Electron Microscopy Sciences	102091-234
Sanyo Ultra Low Freezer	Sanyo	14656-15267-16219
INCU-Line IL 10 with transparent window	VWR	390-0384
Eppendorf Microcentrifuges	Eppendorf	05-400-005
Falcon 96-well	Corning	353072
C57BL/6J mice	JAX	strain #000664
organoid growth medium	STEMCELL Technologies	6005
L Wnt-3A cells	ATCC	CRL-2647
nicotinamide	Sigma	N0636-100G
ROCK inhibitor	STEMCELL Technologies	72302
CHIR99021	STEMCELL Technologies	72052
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane	Fisher	356231
24-well plate	Fisher	08-772-1
D-PBS	Thermo Fisher Scientific	14-190-250
TrypLE Express	Fisher	12604013
DMEM/F-12 with 15 mM HEPES	STEMCELL Technologies	36254
polybrene	Millipore Sigma	TR-1003-G
48-well plates	Fisher	08-772-3D
Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass	Fisher	12-565-470
BeWo cells	ATCC	CCL-98
F-12K Medium	ATCC	30-2004
Hepa1-6	ATCC	CRL-1830
Huh7	UC Berkeley BSD Cell Culture Facility	HUH-7
C2C12	ATCC	CRL-1772
HSkMC	ATCC	PCS-950-010
Skeletal Muscle Cell Growth Medium	Sigma	C-23060
Skeletal Muscle Differentiation Medium	Sigma	C-23061
Invitrogen EVOS Digital Color Fluorescence Microscope	Fisher Scientific	12-563-340
Perkin Elmer Opera Phenix	Perkin Elmer	HH14001000
PhenoPlate 96-well	Perkin Elmer	6055302
DMEM, high glucose, no glutamine, no phenol red	Thermo-Fisher	31053028
GlutaMAX Supplement	Thermo-Fisher	35050079
Sodium Pyruvate	Thermo-Fisher	11360070
pAAV2/5 (Rep/Cap)	Addgene	104964
pAAV2/8 (Rep/Cap)	Addgene	112864