Geïntegreerde botvorming door in vivo endochondrale ossificatie met behulp van mesenchymale stamcellen

Summary

Bottherapie via endochondrale ossificatie door het implanteren van kunstmatig kraakbeenweefsel geproduceerd uit mesenchymale stamcellen heeft het potentieel om de nadelen van conventionele therapieën te omzeilen. Hyaluronzuurhydrogels zijn effectief bij het opschalen van uniform gedifferentieerde kraakbeentransplantaten en bij het creëren van geïntegreerd bot met vascularisatie tussen gefuseerde transplantaten in vivo.

Abstract

Conventionele botregeneratietherapie met mesenchymale stamcellen (MSC's) is moeilijk toe te passen op botdefecten die groter zijn dan de kritische grootte, omdat het geen mechanisme heeft om angiogenese te induceren. Het implanteren van kunstmatig kraakbeenweefsel vervaardigd uit MSC's induceert angiogenese en botvorming in vivo via endochondrale ossificatie (ECO). Daarom kan deze ECO-gemedieerde benadering in de toekomst een veelbelovende botregeneratietherapie zijn. Een belangrijk aspect van de klinische toepassing van deze ECO-gemedieerde benadering is het opstellen van een protocol voor het voorbereiden van voldoende kraakbeen om te worden geïmplanteerd om het botdefect te herstellen. Het is vooral niet praktisch om een enkele massa getransplanteerd kraakbeen te ontwerpen van een grootte die overeenkomt met de vorm van het eigenlijke botdefect. Daarom moet het te transplanteren kraakbeen de eigenschap hebben om integraal bot te vormen wanneer meerdere stukken worden geïmplanteerd. Hydrogels kunnen een aantrekkelijk hulpmiddel zijn voor het opschalen van weefselgemanipuleerde transplantaten voor endochondrale ossificatie om aan klinische vereisten te voldoen. Hoewel veel natuurlijk afgeleide hydrogels de vorming van MSC-kraakbeen in vitro en ECO in vivo ondersteunen, moet het optimale steigermateriaal om aan de behoeften van klinische toepassingen te voldoen nog worden bepaald. Hyaluronzuur (HA) is een cruciaal onderdeel van de extracellulaire matrix van het kraakbeen en is een biologisch afbreekbaar en biocompatibel polysacharide. Hier laten we zien dat HA-hydrogels uitstekende eigenschappen hebben om in vitro differentiatie van MSC-gebaseerd kraakbeenweefsel te ondersteunen en de endochondrale botvorming in vivo te bevorderen.

Introduction

Autoloog bot is nog steeds de gouden standaard voor het repareren van botdefecten als gevolg van trauma, aangeboren afwijkingen en chirurgische resectie. Autogene bottransplantatie heeft echter aanzienlijke beperkingen, waaronder donorpijn, risico op infectie en beperkt botvolume dat kan worden geïsoleerd van de patiënten 1,2,3,4. Er zijn tal van biomaterialen ontwikkeld als botvervangers, waarbij natuurlijke of synthetische polymeren worden gecombineerd met gemineraliseerde materialen zoals calciumfosfaat of hydroxyapatiet^....

Protocol

Dit protocol maakt gebruik van mannelijke naaktmuizen van 4 weken oud. Huisvest vier muizen in een kooi onder een licht/donker-cyclus van 12 uur bij 22−24 °C en een relatieve luchtvochtigheid van 50%−70%. Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de richtlijnen die zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de Tokyo Medical and Dental University (goedkeurings-ID: A2019-204C, A2020-116A en A2021-121A).

1. Bereiding van buffers en reagentia

1. Bereid mesenchymale stamcelgroeimedium (MSC-groeimedium) voor door de supplementenkit van MSC-groeimedium toe te voegen aan MSC-bas....

Results

MSC-ingekapselde HA-hydrogels werden gekweekt in chondrogenisch medium aangevuld met TGFβ3, een inductor van chondrogenese⁴¹ (stap 4.1). We vergeleken de eigenschappen van HA met die van collageen, waarvan is aangetoond dat het effectief is bij het maken van op MSC gebaseerde kunstmatige kraakbeentransplantaten voor endochondrale ossificatie, zoals eerder beschreven³⁸. Ongedifferentieerde MSC's werden niet opgenomen als negatieve controles in deze studie omdat is aangetoond.......

Discussion

Het gebruik van geschikte steigermaterialen die de overgang van hypertrofisch kraakbeen naar bot bevorderen, is een veelbelovende benadering om op MSC gebaseerde gemanipuleerde hypertrofische kraakbeentransplantaten op te schalen en botdefecten van klinisch significante grootte te behandelen. Hier laten we zien dat HA een uitstekend steigermateriaal is om de differentiatie van MSC-gebaseerd hypertrofisch kraakbeenweefsel in vitro te ondersteunen en om endochondrale botvorming in vivo te bevorderen

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25w/v% Trypsin-1mmol/L EDTA.4Na Solution	FUJIFILM Wako Pure Chemical	209-16941
Antisedan	Nippon Zenyaku Kogyo
ascorbate-2-phosphate	Nacalai Tesque	13571-14
Bambanker	GC Lymphotec	CS-02-001
basic fibroblastic growth factor	Reprocell	RCHEOT002
bovine serum albumin	FUJIFILM Wako Pure Chemical	012-23881	7.5 w/v%
Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4%	Invitrogen	C10283
dexamethasone	Merck	D8893
Domitor	Nippon Zenyaku Kogyo
Dormicum	Astellas Pharma
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Merck	D6429	high glucose
Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham	Merck	D6421
Fetal bovine serum	Hyclone	SH30396.03
Gentamicin sulfate	FUJIFILM Wako Pure Chemical	1676045	10 mg/mL
Haccpper Generator	TechnoMax	CH-400-5QB	50 ppm hypochlorous acid water
Human Mesenchymal Stem Cells	Lonza	PT-2501
HyStem Cell Culture Scaffold Kit	Merck	HYS020
IL-1ß	PeproTech	AF-200-01B
ITS-G supplement	FUJIFILM Wako Pure Chemical	090-06741	×100
L-Alanyl-L-Glutamine	FUJIFILM Wako Pure Chemical	016-21841	200mmol/L (×100)
L-proline	Nacalai Tesque	29001-42
L-Thyroxine	Merck	T1775
MSCGM Mesenchymal Stem Cell Growth Medium BulletKit	Lonza	PT-3001
paraffin	FUJIFILM Wako Pure Chemical	165-13375
PBS / pH7.4 100ml	Medicago	09-2051-100
TGF-β3	Proteintech	HZ-1090
Vetorphale	Meiji Seika Kaisha
Visiocare Ointment	SAVAVET/SAVA Healthcare
β-glycerophosphate	FUJIFILM Wako Pure Chemical	048-34332