Isolatie en zuivering van bacteriële extracellulaire blaasjes uit menselijke uitwerpselen met behulp van dichtheidsgradiëntcentrifugatie

Samenvatting

Deze studie beschrijft een methode om bacteriële extracellulaire vesikels (BEV's) verrijkt uit menselijke uitwerpselen te isoleren en te zuiveren via dichtheidsgradiëntcentrifugatie (DGC), identificeert de fysieke kenmerken van BEV's op basis van morfologie, deeltjesgrootte en concentratie, en bespreekt de mogelijke toepassingen van de DGC-benadering in klinisch en wetenschappelijk onderzoek.

Samenvatting

Bacteriële extracellulaire blaasjes (BEV's) zijn nanoblaasjes die zijn afgeleid van bacteriën die een actieve rol spelen in de communicatie tussen bacteriën en bacteriën, waarbij bioactieve moleculen zoals eiwitten, lipiden en nucleïnezuren worden overgedragen die zijn geërfd van de ouderbacteriën. BEV's afgeleid van de darmmicrobiota hebben effecten in het maagdarmkanaal en kunnen verre organen bereiken, wat resulteert in aanzienlijke implicaties voor fysiologie en pathologie. Theoretisch onderzoek naar de soorten, hoeveelheden en rollen van BEV's afkomstig van menselijke uitwerpselen is cruciaal voor het begrijpen van de afscheiding en functie van BEV's uit de darmmicrobiota. Deze onderzoeken vereisen ook een verbetering van de huidige strategie voor het isoleren en zuiveren van BEV's.

Deze studie optimaliseerde het isolatie- en zuiveringsproces van BEV's door twee dichtheidsgradiëntcentrifugatiemodi (DGC) vast te stellen: Top-down en Bottom-up. De verrijkte verdeling van BEV's werd bepaald in fracties 6 tot en met 8 (F6-F8). De effectiviteit van de aanpak werd geëvalueerd op basis van deeltjesmorfologie, grootte, concentratie en eiwitgehalte. De terugwinningspercentages van deeltjes en eiwitten werden berekend en de aanwezigheid van specifieke markers werd geanalyseerd om het herstel en de zuiverheid van de twee DGC-modi te vergelijken. De resultaten gaven aan dat de top-down centrifugatiemodus lagere verontreinigingsniveaus had en een terugwinningspercentage en zuiverheid bereikte die vergelijkbaar waren met die van de bottom-upmodus. Een centrifugatietijd van 7 uur was voldoende om een fecale BEV-concentratie van 10⁸/mg te bereiken.

Afgezien van uitwerpselen, kan deze methode worden toegepast op andere soorten lichaamsvloeistoffen met de juiste modificatie volgens de verschillen in componenten en viscositeit. Concluderend kan worden gesteld dat dit gedetailleerde en betrouwbare protocol de gestandaardiseerde isolatie en zuivering van BEV's zou vergemakkelijken en zo een basis zou leggen voor latere multi-omics-analyse en functionele experimenten.

Inleiding

De darm wordt algemeen erkend als het orgaan dat de meest voorkomende microbiële gemeenschappen in het menselijk lichaam herbergt, met meer dan 90% van de bacteriën die betrokken zijn bij kolonisatie en vermenigvuldiging ^1,2. Uitgebreid bewijs heeft aangetoond dat de darmmicrobiota de darmmicro-omgeving moduleert en tegelijkertijd interageert met disfunctie in verre organen, voornamelijk via een verminderde darmbarrière ^3,4. Toenemend bewijs wijst op een correlatie tussen de onbalans van de darmmicrobiota en de progressie van inflammatoire darmaandoeni....

Protocol

De ethische commissie van het Nanfang Hospital, Southern Medical University, keurde deze studie goed, die werd uitgevoerd met de geïnformeerde toestemming van de deelnemers. Alle methoden die hierin worden gebruikt, voldoen aan de standaard operationele richtlijnen van de International Human Microbiome Standards (IHMS: http://www.microbiome-standards.org/). Alle daaropvolgende procedures voor vloeistofbehandeling moesten verplicht worden uitgevoerd binnen een bioveiligheidskast of een ultraschone bank.

1. Verzamelen en veraliseren van ontlastingsmonsters

1. Verdeel een ontlastingsmonsternemer, een verzegelde zak en e....

Resultaten

Bepaal de verdeling van BEV-verrijkte fracties
Om de verdeling van met bacteriële extracellulaire vesikels (BEV's) verrijkte fracties te bepalen, werd een blancocontrole ingesteld om de absorptiewaarden bij OD 340 nm te meten, en de dichtheid van elke fractie werd berekend op basis van de metingen en jodixanolrichtlijnen (stap 8.1). Tabel 2 geeft de dichtheidsresultaten weer, waaruit blijkt dat de fracties F4 tot en met F9 dichtheden vertoonden binnen het bereik dat doorgaans wordt ge.......

Discussie

Bacteriële extracellulaire blaasjes (BEV's) zijn lipide-dubbellaagse nanodeeltjes die door bacteriën worden uitgescheiden en een schat aan eiwitten, lipiden, nucleïnezuren en andere bioactieve moleculen bevatten, die bijdragen aan het mediëren van de functionele effecten van bacteriën²⁰. Van BEV's afkomstig van de darm is geverifieerd dat ze betrokken zijn bij de ontwikkeling van ziekten, zoals inflammatoire darmaandoeningen, de ziekte van Crohn en colorectale kanker, en ook het algemene metabolis.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1 % (w/v) glutaraldehyde (prepared from 2.5 % stock solution in deionized water)	ACMEC	AP1126	Morfologische observatie voor BEV's met behulp van TEM bij Stap 8.3.3
1 % (w/v) methylcellulose (prepared from original powder in deionized water)	Sigma-Aldrich	M7027	Morfologische observatie voor BEV's met behulp van TEM bij Stap 8.3.6
1.5 % (w/v) uranyl acetate (prepared from original powder in deionized water)	Polysciences	21447-25	Morfologische observatie voor BEV's met behulp van TEM bij Stap 8.3.5
1000 μL, 200 μL, 10 μL Pipette	KIRGEN	KG1313, KG1212, KG1011	De oplossing overbrengen
5 % (w/v) bovine serum albumin oplossing (prepared from the original powder in TBST buffer)	Fdbio science	FD0030	Gebruikt in western blotting voor blocking bij Stap 8.5.6
5 × laadbuffer	Fdbio science	FD006	Gebruikt in western blotting en Coomassie brilliant blue stain bij Stap 8.5.1
75 % (v/v) alcohol	LIRCON	LIRCON-500 mL	Oppervlaktedesinfectie
96-well plate	Rar	A8096	De absorptiewaarden meten
Anti-Calnexin antilichaam	Abcam	ab92573	Western blotting (Primair Antilichaam)
Anti-CD63 antilichaam	Abcam	ab134045	Western blotting (Primair Antilichaam)
Anti-CD9 antilichaam	Abcam	ab236630	Western blotting (Primair Antilichaam)
Anti-Flagellin antilichaam	Sino Biological	40067-MM06	Western blotting (Primair Antilichaam)
Anti-Integrin beta 1 antilichaam	Abcam	ab30394	Western blotting (Primair Antilichaam)
Anti-LPS antilichaam	Thermo Fisher	MA1-83152	Western blotting (Primair Antilichaam)
Anti-LTA antilichaam	Thermo Fisher	MA1-7402	Western blotting (Primair Antilichaam)
Anti-OmpA antilichaam	CUSABIO	CSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/	Western blotting (Primair Antilichaam)
Anti-Syntenin antilichaam	Abcam	ab133267	Western blotting (Primair Antilichaam)
Anti-TSG101 antilichaam	Abcam	ab125011	Western blotting (Primair Antilichaam)
Autoclaaf	ZEALWAY	GR110DP	Steriliseren voor benodigdheden en media die in het experiment worden gebruikt
Balans	Mettler Toledo	AL104	De tube met PBS-beladen monster balanceren
Bicinchoninic acid assay	Fdbio science	FD2001	Eiwitgehalte van BEV's meten bij Stap 8.2
BioRender	BioRender	https://app.biorender.com	Maak het schematische werkstroom van BEV's isolatie en zuivering getoond in Figuur 1
Bioveiligheidskast	Haier	HR1200- II B2	De procedures over feces monsterbehandeling uitvoeren
Centrifuge 5810 R; Rotor F-34-6-38	Eppendorf	5805000092; 5804727002, adapter: 5804774000	Voorbereiding voor BEV's (Stap 3)
Chemiluminescentie apparaat	BIO-OI	OI600SE-MF	Gebruikt in western blotting voor signaaldetectie bij Stap 8.5.12
Cytation 5	BioTek	F01	Microplate detector voor het meten van de absorptie (Stap 8.1) en fluorescentie (Figuur 6) waarden
Dil-labeled lagedichtheids-lipoproteïne	ACMEC	AC12038	Definieer de verdeling van storende componenten
Elektroforeseapparatuur	Bio-rad	1658033	Gebruikt in western blotting voor eiwitscheiding en overdracht bij Stap 8.5.2, 8.5.3, 8.5.5
Enhanced Chemiluminescence kit HRP	Fdbio science	FD8020	Gebruikt in western blotting voor signaaldetectie bij Stap 8.5.12
Escherichia coli	American Type Culture Collection	ATCC8739	Isoleer BEV's als positieve controle. Protocol: Los 25 g van de LB-poeder op in 1 L gedeïoniseerd water en autoclaveer. Breng de 800 μL van de bewaarde Escherichia coli over in het medium. Kweek bij 37 °C in de incubator shaker. Centrifugeer vervolgens 3, 000 × g gedurende 20 min bij 4 °C, 12, 000 × g gedurende 30 min bij 4 °C, filter de supernatant door een 0.22 μm membraan en voer ultra-snel centrifugeren uit bij 160, 000 × g gedurende 70 min bij 4 °C. Pellet gedefinieerd als ruwe BEV's uit Escherichia coli werd opgehangen in 1.2 mL PBS (Stap 3, 4).
Falcon tubes 50 mL	KIRGEN	KG2811	Voorbereiding voor BEV's (Stap 3)
Feto Protein Staining Buffer	Absci	ab.001.50	Coomassie brilliant blue staining bij Stap 8.5.4
Filterpapier	Biosharp	BS-TFP-070B	Morfologische observatie voor BEV's met behulp van TEM bij Stap 8.3 (De oplossing blotten)
Formvar/Carbon ondersteunde koper roosters	Sigma-Aldrich	TEM-FCF200CU50	Morfologische observatie voor BEV's met behulp van TEM bij Stap 8.3
HEPES poeder	Meilunbio	MB6078	Iodixanol buffers met verschillende concentraties voor dichtheidsgradiëntcentrifugatie voorbereiden
HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Fdbio science	FDM007	Western blotting (Secundair Antilichaam)
HRP Affini