Methodenartikel

Isolatie en zuivering van bacteriële extracellulaire blaasjes uit menselijke uitwerpselen met behulp van dichtheidsgradiëntcentrifugatie

DOI:

10.3791/65574

⸱

1 september 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Laboratory Medicine, Nanfang Hospital, Southern Medical University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deze studie beschrijft een methode om bacteriële extracellulaire vesikels (BEV's) verrijkt uit menselijke uitwerpselen te isoleren en te zuiveren via dichtheidsgradiëntcentrifugatie (DGC), identificeert de fysieke kenmerken van BEV's op basis van morfologie, deeltjesgrootte en concentratie, en bespreekt de mogelijke toepassingen van de DGC-benadering in klinisch en wetenschappelijk onderzoek.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bacteriële extracellulaire blaasjes (BEV's) zijn nanoblaasjes die zijn afgeleid van bacteriën die een actieve rol spelen in de communicatie tussen bacteriën en bacteriën, waarbij bioactieve moleculen zoals eiwitten, lipiden en nucleïnezuren worden overgedragen die zijn geërfd van de ouderbacteriën. BEV's afgeleid van de darmmicrobiota hebben effecten in het maagdarmkanaal en kunnen verre organen bereiken, wat resulteert in aanzienlijke implicaties voor fysiologie en pathologie. Theoretisch onderzoek naar de soorten, hoeveelheden en rollen van BEV's afkomstig van menselijke uitwerpselen is cruciaal voor het begrijpen van de afscheiding en functie van BEV's uit de darmmicrobiota. Deze onderzoeken vereisen ook een verbetering van de huidige strategie voor het isoleren en zuiveren van BEV's.

Deze studie optimaliseerde het isolatie- en zuiveringsproces van BEV's door twee dichtheidsgradiëntcentrifugatiemodi (DGC) vast te stellen: Top-down en Bottom-up. De verrijkte verdeling van BEV's werd bepaald in fracties 6 tot en met 8 (F6-F8). De effectiviteit van de aanpak werd geëvalueerd op basis van deeltjesmorfologie, grootte, concentratie en eiwitgehalte. De terugwinningspercentages van deeltjes en eiwitten werden berekend en de aanwezigheid van specifieke markers werd geanalyseerd om het herstel en de zuiverheid van de twee DGC-modi te vergelijken. De resultaten gaven aan dat de top-down centrifugatiemodus lagere verontreinigingsniveaus had en een terugwinningspercentage en zuiverheid bereikte die vergelijkbaar waren met die van de bottom-upmodus. Een centrifugatietijd van 7 uur was voldoende om een fecale BEV-concentratie van 108/mg te bereiken.

Afgezien van uitwerpselen, kan deze methode worden toegepast op andere soorten lichaamsvloeistoffen met de juiste modificatie volgens de verschillen in componenten en viscositeit. Concluderend kan worden gesteld dat dit gedetailleerde en betrouwbare protocol de gestandaardiseerde isolatie en zuivering van BEV's zou vergemakkelijken en zo een basis zou leggen voor latere multi-omics-analyse en functionele experimenten.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De darm wordt algemeen erkend als het orgaan dat de meest voorkomende microbiële gemeenschappen in het menselijk lichaam herbergt, met meer dan 90% van de bacteriën die betrokken zijn bij kolonisatie en vermenigvuldiging 1,2. Uitgebreid bewijs heeft aangetoond dat de darmmicrobiota de darmmicro-omgeving moduleert en tegelijkertijd interageert met disfunctie in verre organen, voornamelijk via een verminderde darmbarrière 3,4. Toenemend bewijs wijst op een correlatie tussen de onbalans van de darmmicrobiota en de progressie van inflammatoire darmaandoeningen (IBD)5,6, evenals cognitieve stoornissen via de darm-hersenas 5,6,7,8. Bacteriële extracellulaire blaasjes (BEV's) geproduceerd door bacteriën spelen een belangrijke rol in deze pathologische processen.

BEV's zijn deeltjes op nanoschaal die bacteriële derivaten inkapselen, met diameters variërend van 20 tot 400 nm. Van hen is aangetoond dat ze interacties tussen bacteriën en hun gastheerorganismen vergemakkelijken 9,10. Ondanks hun onzichtbaarheid hebben deze deeltjes steeds meer aandacht gekregen van onderzoekers vanwege hun toekomstige brede toepassingen als diagnostische biomarkers, therapeutische doelen en voertuigen voor medicijnafgifte. Menselijke uitwerpselen, vaak gebruikt als biospecimens voor het bestuderen van BEV's, voornamelijk afkomstig van darmbacteriën, bevatten een complex mengsel van onder andere water, bacteriën, lipiden, eiwitten, onverteerde voedselresten en geëxfolieerde epitheelcellen. De ingewikkelde fecale samenstelling vormt een uitdaging voor de isolatie en zuiverheid van BEV's, waardoor een uitgebreide, objectieve en realistische analyse van BEV's wordt belemmerd. Vandaar dat effectieve strategieën om interferentie door verontreinigende componenten te minimaliseren en de opbrengst van BEV's te verbeteren, naar voren zijn gekomen als kritieke problemen die onmiddellijke aandacht verdienen.

Bestaande isolatiestrategieën zijn grotendeels gebaseerd op technieken zoals ultrasnelle centrifugatie (UC), dichtheidsgradiëntcentrifugatie (DGC) en grootte-uitsluitingschromatografie (SEC)12,13,14,15,16,17. Momenteel is DGC een van de meest toegepaste methoden op het gebied van BEV-scheiding, die twee sedimentatie-zwevende modi omvat, "Top-down" en "Bottom-up", die worden bepaald door de initiële laadpositie van het monster. Deze methodologieën onderscheiden extracellulaire vesikels (EV's) van andere componenten op basis van verschillen in grootte en dichtheid, wat variabele zuiverheid en terugwinningspercentages oplevert. Eerder onderzoek heeft aangetoond dat enkelvoudige benaderingsstrategieën onvoldoende zijn om EV's adequaat te scheiden van oplosbare eiwitten in lichaamsvloeistofmonsters, zoals lipoproteïne in bloed18 en Tamm-Horsfall-eiwit in urine19. Bovendien overlapt de grootteverdeling van eukaryote extracellulaire vesikels (EEV's) vaak met die van BEV's, waardoor verdere methodologische verbeteringen nodig zijn om de BEV-opbrengst te optimaliseren. Bijgevolg hangt het bevorderen van de studie van BEV's af van de ontwikkeling van effectieve scheidings- en zuiveringsmethoden. Met name Tulkens et al 15 gebruikten een orthogonale biofysische strategie om fecale BEV's te scheiden van EEV's, waarbij de centrifugatietijd van een bottom-up DGC-modus maximaal18 uur was. Deze studie daarentegen heeft het teruggebracht tot 7 uur, waardoor de gradiënt-ultracentrifugatietijd aanzienlijk werd bespaard en het proces werd vereenvoudigd.

In de huidige studie hebben we fecale BEV's geïsoleerd en gezuiverd met behulp van twee DGC-modi onder geoptimaliseerde bufferomstandigheden, na BEV's te hebben verrijkt met een reeks differentiële centrifugatiesnelheden, van lage tot extreem hoge snelheid. Evaluaties op basis van morfologie, deeltjesgrootte en concentratie wezen op een lovenswaardige prestatie van deze verbeterde methode. Deze studie zou als basis kunnen dienen voor toekomstig onderzoek, waarbij de toepassingen ervan worden uitgebreid naar een breder domein en inzicht wordt geboden in de heterogeniteit van BEV's binnen het menselijk lichaam. Het draagt ook bij aan de standaardisatie van BEV-scheidings- en analysetechnieken.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De ethische commissie van het Nanfang Hospital, Southern Medical University, keurde deze studie goed, die werd uitgevoerd met de geïnformeerde toestemming van de deelnemers. Alle methoden die hierin worden gebruikt, voldoen aan de standaard operationele richtlijnen van de International Human Microbiome Standards (IHMS: http://www.microbiome-standards.org/). Alle daaropvolgende procedures voor vloeistofbehandeling moesten verplicht worden uitgevoerd binnen een bioveiligheidskast of een ultraschone bank.

1. Verzamelen en veraliseren van ontlastingsmonsters

  1. Verdeel een ontlastingsmonsternemer, een verzegelde zak en een ijsdoos en geef de deelnemers uitgebreide instructies over het aanschaffen en bewaren van de monsters.
  2. Instrueer elke deelnemer om hun ontlastingsmonster te verzamelen met behulp van de meegeleverde monsternemer en om het binnen 24 uur bij een temperatuur van 4 °C naar het laboratorium te vervoeren.
  3. Gebruik na ontvangst in het laboratorium een steriele lepel om minder dan 3,5 g ontlasting in een vooraf gewogen centrifugebuis van 50 ml te doen. Noteer het gewicht van het fecale monster op de buis voor volgende voorbehandelingsprocedures.
    PAUZEPUNT: Als onmiddellijke verwerking van de monsters niet haalbaar is, wijs het monster dan toe voor langdurige opslag bij -80 °C na de juiste notatie.

2. Voorbereiding van het uitwerpselenmonster

  1. Koel 500 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bij 4 °C. Filtreer de voorgekoelde PBS door een polyethersulfon (PES)-filter van 0,22 μm met behulp van een injectiespuit van 50 ml in tien centrifugatiebuisjes van 50 ml.
  2. Plaats twee buisjes van 50 ml op ijs, elk met 3,5 g fecale monsters. Voeg 35 ml PBS toe aan elke buis.
    NOTITIE: Bereken de benodigde hoeveelheid PBS voor het oplossen van ontlasting en zorg voor een maximale monsterconcentratie van 10% (m/v). Als u extra monsters verwerkt, gebruik dan indien nodig meer buisjes.
  3. Schud de monsters gedurende 2 uur bij 4 °C bij 300 tpm of plaats ze gedurende 8 uur ten minste 4 °C totdat de ontlasting zichtbaar volledig in suspensie is.

3. Centrifugeren met differentiële snelheid

  1. Koel de koelcentrifuge met hoge snelheid tot 4 °C.
  2. Pas het gewicht van de twee buisjes met de in stap 2.3 met PBS bereide monsters aan om een totaalgewicht van 0,1 g te bereiken.
  3. Centrifugeer de monsters bij 3.000 × g gedurende 20 minuten bij 4 °C.
  4. Pipetteer het supernatans voorzichtig in twee schone centrifugebuisjes van 50 ml, waarbij u ongeveer 1 ml boven de pellet laat. Gebruik voor dit proces een plastic pasteurpipet voor eenmalig gebruik.
  5. Pas het gewicht van de twee buisjes aan met PBS om een totaalgewicht van minder dan ± 0.1 g te bereiken.
  6. Centrifugeer het overgebrachte supernatans bij 12.000 × g gedurende 30 minuten bij 4 °C.
  7. Zuig het supernatans op met een spuit van 20 ml, verwijder de naald van de spuit en filtreer het door filters van 0,22 μm in buisjes van 50 ml. Op dit punt moet het supernatansvolume ongeveer 30 ml zijn.
    OPMERKING: Als er na het centrifugeren van 12.000 × g nog steeds een aanzienlijke hoeveelheid onzuiverheid zichtbaar is, moet de centrifugeerstap bij 12.000 × g gedurende 30 minuten bij 4 °C worden herhaald. Als u dit niet doet, kan dit leiden tot een aanzienlijk verlies van BEV's als gevolg van verstopping van de poriën tijdens filtratie.

4. Centrifugeren met ultrahoge snelheid

  1. Reinig de rotor en de emmer door ze af te vegen met 75% (v/v) alcohol om eventuele restverontreiniging te verwijderen.
  2. Plaats een ultracentrifugebuisje van 38,5 ml in de slanghouder.
    NOTITIE: Selecteer de juiste ultracentrifugebuis op basis van het monstervolume. Vermijd ultraviolette straling en ongeschikte chemische reagentia voor het steriliseren van centrifugaalbuisjes, zoals aangegeven in de producthandleiding.
  3. Breng ongeveer 30 ml van het gefilterde fecale supernatans van stap 3.7 over in de ultracentrifugebuis.
  4. Vul de ultracentrifugebuis met ongeveer 8 ml PBS en laat een opening van 3 mm over vanaf de opening van de buis.
  5. Plaats de twee ultracentrifugebuisjes met de monsters in tegenoverliggende ultracentrifugatie-emmers, bijvoorbeeld emmer 1 komt overeen met 4 (1-4), 2-5, 3-6.
  6. Pas het gewicht van de twee emmers aan met PBS om een totaalgewicht van minder dan ± 0.005 g te bereiken.
  7. Monteer alle bakken op de rotor, ongeacht of de buizen geladen zijn.
  8. Start het vacuüm en centrifugeer de monsters bij 160.000 × g gedurende 70 minuten bij 4 °C.
  9. Laat het kamervacuüm los en open de deur zodra Ready wordt weergegeven op de startpagina van het instrument.
  10. Verwijder de rotor uit de ultracentrifuge.
  11. Verplaats de emmers van de rotor naar het rek en haal de buizen op met behulp van een tang.
  12. Gooi het supernatant weg, dat aan de onderkant zichtbare bruine korrels bevat.
  13. Resuspendeer de pellets door ze herhaaldelijk op en neer te pipetteren met een pipet van 1.000 μl met 1 ml voorgekoelde (4 °C) PBS totdat ze volledig zijn gesuspendeerd. Vul de buis met ongeveer 37 ml PBS en laat een opening van 3 mm vanaf de opening.
  14. Voer nog een ultracentrifugatie uit volgens de stappen 4.5-4.11 bij 160.000 × g gedurende 70 minuten bij 4 °C om gedeeltelijk aangehechte verontreinigende componenten van de buiswanden te verwijderen.
  15. Gooi het supernatant weg, keer de twee ultracentrifugebuisjes 5 minuten om en verwijder de resterende oplossing op de binnenwand met ruitenwissers.
    NOTITIE: Door de binnenwand te reinigen, wordt interferentie door resterende verontreiniging die zich aan de wand van de ultracentrifugebuis hecht, tot een minimum beperkt. Kies ruitenwissers die geen invloed hebben op de BEV-analyse, met name wat betreft de deeltjesgrootte.
  16. Resuspendeer de pellets in elke buis door ze op en neer te pipetteren met 1,2 ml voorgekoelde (4 °C) PBS met behulp van een pipet van 1.000 μl.
  17. Breng 1,2 ml van de PBS/BEV-oplossing over van een ultracentrifugebuisje naar een schoon microbuisje van 1,5 ml.
    PAUZEPUNT: De PBS/BEV-oplossing die uit één ultracentrifugebuis wordt verzameld, kan doorgaan naar stap 6. Bewaar de oplossing uit de andere tube bij -80 °C.

5. Oplossingsvoorbereiding voor dichtheidsgradiëntcentrifugatie

  1. Bereiding van 0,02 M HEPES-buffer
    1. Combineer 0,477 g HEPES-poeder en 0,8 g NaCl met 90 ml geautoclaveerd gedeïoniseerd water.
    2. Pas de pH aan tot 7,2 door 1 M natriumhydroxide (NaOH) toe te voegen. Breng het volume op 100 ml met gedeïoniseerd water en filtreer de oplossing door PES-membranen van 0,22 μm.
      LET OP: Natriumhydroxide is een sterke bijtende alkali. Operators moeten het zorgvuldig hanteren en bereiden in een zuurkast.
  2. Voorbereiding van de dichtheidsgradiëntbuffer
    1. Bereken het vereiste volume van elke dichtheidsgradiëntbuffer op basis van het aantal ultracentrifugebuisjes voor dichtheidsgradiëntcentrifugatie (stap 6) (In dit protocol waren de volumes voor 60%, 50%, 40%, 20% en 10% gradiëntoplossingen respectievelijk 2.5 ml, 3 ml, 6 ml, 6 ml en 6 ml).
    2. Voor de bereiding van een 50% (m/v) jodixanol-werkoplossing, meng de 0,02 M HEPES-buffer en 60% (m/v) jodixanol-bouillonoplossing in een volumeverhouding van 1:5 (0,5 ml:2,5 ml).
      OPMERKING: Gebruik een wegwerpspuit van 20 ml om de jodixanol-bouillonoplossing op te zuigen en vermijd het inbrengen van lucht.
    3. Om jodixanolbuffers met verschillende concentraties te bereiden, combineert u de 50% jodixanol-werkoplossing uit stap 5.2.2 met de HEPES-buffer verkregen in stap 5.1 met behulp van een pipet van 1.000 μl volgens de verhoudingen in tabel 1.
      NOTITIE: Voer stap 5 uit op een ultraschone werkbank met de lichten uit. Bewaar de geopende jodixanol bouillonoplossing in de koelkast bij 4 °C om bacteriegroei te voorkomen. Houd de jodixanoloplossing en de HEPES-buffer beschermd tegen licht.

6. Opzetten van een dichtheidsgradiëntcentrifugatiesysteem

  1. DGC-modus van bovenaf
    1. Combineer 500 μL PBS/BEV-oplossing geïsoleerd uit stap 4 met 3 ml PBS. Meng de oplossingen voorzichtig met een pipet van 1.000 μl om 3,5 ml PBS/BEV-oplossing te verkrijgen.
    2. Plaats een ultracentrifugebuisje van 31 ml op een schuimplaat met gaten en label het als "↓".
    3. Voeg verticaal 3 ml van de 50% iodixanoloplossing toe aan de bodem van de buis met behulp van een pipet van 1.000 μl.
    4. Kantel de buis in een hoek van 70° en plaats een buishouder of andere steun iets boven het niveau van de schuimplaat, onder de opening van de buis.
    5. Voeg 3 ml 40% jodixanoloplossing toe aan de 50% jodixanoloplossing met behulp van een pipet van 1.000 μl.
    6. Voeg 3 ml 20% jodixanoloplossing toe aan de 40% jodixanoloplossing met behulp van een pipet van 1.000 μl.
    7. Voeg 3 ml 10% jodixanoloplossing toe aan de 20% jodixanoloplossing met behulp van een pipet van 1.000 μl.
    8. Voeg 3,5 ml PBS/BEV-oplossing uit stap 6.1.1 toe aan de 10% jodixanoloplossing met behulp van een pipet van 1.000 μl.
    9. Zet de buizen voorzichtig weer rechtop.
      OPMERKING: Na het pipetteren moet de gelaagdheid zichtbaar zijn.
  2. Bottom-up DGC-modus
    1. Plaats een ultracentrifugebuis van 31 ml op een schuimplaat met gaten en label deze als "↑".
    2. Voeg verticaal 2,5 ml van de 60% iodixanol-voorraadoplossing toe aan de bodem van de buis. Meng het voorzichtig met 500 μL PBS/BEV-oplossing geïsoleerd uit stap 4 met behulp van een pipet van 1.000 μl om 3 ml 50% jodixanol/BEV-oplossing te verkrijgen.
    3. Kantel de buis in een hoek van 70° en plaats een buishouder of andere steun iets boven het niveau van de schuimplaat, onder de opening van de buis.
    4. Voeg 3 ml van de 40% jodixanoloplossing toe aan de 50% jodixanol/BEV-oplossing met behulp van een pipet van 1.000 μl.
    5. Voeg 3 ml van de 20% jodixanoloplossing toe aan de 40% jodixanoloplossing met behulp van een pipet van 1000 μl.
    6. Voeg 3 ml van de 10% jodixanoloplossing toe aan de 20% jodixanoloplossing met behulp van een pipet van 1000 μl.
    7. Voeg 3,5 ml PBS toe aan de 10% jodixanoloplossing met behulp van een pipet van 1.000 μl.
    8. Zet de buizen voorzichtig weer rechtop.
    9. Op dit punt bleef 200 μL van de in stap 4.17 verkregen suspensie over, die vervolgens kan worden geanalyseerd als een groep met de naam "UC".
      OPMERKING: Houd bij het overbrengen van oplossingen in stap 6 de pipetpunt altijd tegen de wand van de ultracentrifugebuis loodrecht op de as van de buis.

7. Centrifugatie van de dichtheidsgradiënt en fractieverzameling

  1. Pas het gewicht van de twee buizen aan met PBS om een totaal gewicht binnen ± 0.005 g te bereiken.
  2. Plaats de buisjes in de emmers volgens stap 4.5 en dompel ze gedurende 7 uur bij 4 °C onder druk van 160.000 × g .
  3. Verzamel de fracties met behulp van een pipet (1000 μL) van boven naar beneden tegen de zijwand in de volgende volgorde: 3 ml, 2 ml, 1 ml, 1 ml, 1 ml, 1 ml, 1 ml, 1 ml, 1 ml, 1,5 ml en 3 ml in een ultracentrifugebuis van 38,5 ml.
    NOTITIE: Houd de zichtlijn op hetzelfde niveau als het vloeistofoppervlak.
  4. Voer ultracentrifugatie uit voor elke fractie die is verkregen in stap 7.3 volgens stap 4 bij 160.000 × g gedurende 70 minuten bij 4 °C.
  5. Verwijder het supernatans en keer de ultracentrifugebuisjes gedurende 5 minuten om.
  6. Resuspendeer de pellets in 200 μl voorgekoelde (4 °C) PBS met behulp van een pipet van 200 μl.
  7. Breng de PBS/BEV-oplossing over in een schone microbuis van 1,5 ml.
  8. Label de breuken van F1 tot F10 en analyseer ze op basis van stap 8.
    PAUZEPUNT: Als de in stap 7.8 verkregen monsters niet onmiddellijk kunnen worden verwerkt, bewaar ze dan bij -80 °C.

8. Karakterisering en kwantitatieve analyse van de verzamelde fracties

  1. Bepaal de extinctiewaarden (OD 340 nm) van elke fractie met behulp van een microplaatdetector met een blanco regeling om de overeenkomstige dichtheid te berekenen.
    OPMERKING: Vervang de PBS/BEV-oplossing (stap 6.1.1 en stap 6.2.2) door PBS om een blanco regeling tot stand te brengen.
    1. Bereid 100 μl van elk 0%, 5%, 10%, 12,5% en 20% jodixanoloplossing verdund met 0,02 M HEPES op basis van 50% stockoplossing (stap 5.2.2) als standaarden, overeenkomend met dichtheden van respectievelijk 1,0058 g/ml, 1,0318 g/ml, 1,058 g/ml, 1,0708 g/ml en 1,111 g/ml.
    2. Voeg 50 μl van elke fractie van de blancocontrole (bereid in stap 7.3) en 50 μl van elke standaardoplossing (bereid in stap 8.1.1) toe om putjes van een plaat met 96 putjes te dupliceren.
    3. Stel de golflengte in op 340 nm, meet de optische dichtheid van het eindpunt en bereken de dichtheid van elke fractie.
    4. Identificeer F4-F9 als het bereik van BEV-fracties op basis van hun dichtheid.
  2. Bepaal de eiwitconcentratie van de BEV-fracties met behulp van de bicinchoninezuurtest (BCA).
    1. Verdun de stof in het door de fabrikant verstrekte PBS om een standaardeiwitoplossing van 0,5 μg/μl te bereiden.
    2. Voeg de standaardeiwitoplossing (bereid in stap 8.2.1) toe met verschillende volumes volgens de instructies van het reagens, en vul elk putje van een plaat met 96 putjes aan met PBS tot een totaal volume van 20 μl.
    3. Voeg 20 μl van de in stap 7.8 bereide monsters en de monsters die overblijven na de in stap 6.2.9 gedefinieerde CU aan elk putje toe.
    4. Meng de reagentia A en B in een verhouding van 50:1 en breng 200 μL over naar elk putje.
    5. Incubeer de plaat gedurende 30 minuten in een waterbad van 37 °C.
    6. Meet de extinctiewaarde met behulp van een microplaatlezer, bereken de eiwitconcentratie (μg/μL) en bepaal het eiwitgehalte (μg) van de monsters op basis van de standaardcurve (x: optische dichtheid; y: eiwitconcentratie) die wordt gegenereerd op basis van de waarden van de standaardoplossingen die in stap 8.2.2 zijn verdund.
  3. Karakteriseer de BEV-fracties die zijn gedefinieerd in stap 8.1.4 met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) om de aanwezigheid van BEV's te verifiëren. Alle onderstaande procedures moeten op ijs worden uitgevoerd.
    1. Breng 10 μl van elke geïsoleerde F4-F9-fractie uit stap 7.8 en de monsters die overblijven na UC gedefinieerd in stap 6.2.9 gedurende 20 minuten aan op Formvar/Carbon-ondersteunde koperroosters en dep af met filtreerpapier.
    2. Spoel de monsters driemaal gedurende 1 minuut met 100 μL PBS en dep ze af met filtreerpapier.
    3. Fixeer de monsters met 100 μL 1% (g/v) glutaaraldehyde gedurende 5 minuten en dep ze af met filtreerpapier.
    4. Was de roosters met 100 μL PBS tien keer gedurende 2 minuten en dep ze af met filtreerpapier.
    5. Kleur de roosters gedurende 10 minuten met 50 μl 1,5% (m/v) uranylacetaat en dep ze af met filtreerpapier.
      LET OP: Uranylacetaat is radioactief en uiterst giftig bij contact met de huid of bij inademing. Hanteer oplossingen met uranylacetaat in een zuurkast en volg de juiste veiligheidsmaatregelen.
    6. Leg de roosters gedurende 5 minuten op een druppel methylcellulose van 1% (m/v) en dep ze af met filtreerpapier.
    7. Bewaar de aan de lucht gedroogde roosters tot observatie in een donkere, stofvrije omgeving.
    8. Leg beelden vast en analyseer ze met behulp van een TEM.
  4. Karakteriseer de BEV-fracties die in stap 8.1.4 zijn gedefinieerd met behulp van nanodeeltjesvolganalyse (NTA) om het aantal deeltjes te tellen.
    1. Kalibreer het systeem met polystyreendeeltjes van 110 nm.
    2. Was het monsterbad met PBS.
    3. Verdun de monsters van verschillende fracties die in stap 7.8 zijn verkregen en de monsters die overblijven na de in stap 6.2.9 gedefinieerde CU tot een concentratie in het bereik van 105-10 9 deeltjes/ml, met een geoptimaliseerde concentratie van 107 deeltjes/ml.
    4. Registreer en analyseer op 11 posities met drie replicaties, waarbij de temperatuur rond de 23-30 °C wordt gehouden.
  5. Analyseer het eiwitgehalte van de monsters door middel van coomassie briljante blauwe kleuring (CBBS) en western blotting (WB).
    1. Verdun de BEV-monsters van verschillende fracties die in stap 7.8 zijn verkregen en de monsters die overblijven na de in stap 6.2.9 gedefinieerde CU met behulp van PBS en 5 × laadbuffer tot een eindconcentratie van 0,5 of 1 μg/μl, indien kwantificering nodig is, en zorg ervoor dat de monsterbelasting in stap 8.5.2 voldoende 20 μl (10 μg of 20 μg) van elk putje bedraagt. Kook de monsters gedurende 10 minuten op 95 °C.
    2. Monteer de geprefabriceerde polyacrylamidegel in de elektroforesetank en breng de monsters over naar de putten.
    3. Voer verticale elektroforese uit met de volgende parameters: 160 V gedurende 50 min.
    4. Kleur de gel gedurende 1 uur in Coomassie briljantblauwe oplossing, spoel af in gedeïoniseerd water totdat de blauwe achtergrond lichter wordt en leg foto's vast met een camera.
    5. Voer eiwitblotting-procedures uit voor andere gels met de volgende parameters: 400 mA gedurende 20 min.
    6. Blokkeer de deblottingmembranen met een 5% (w/v) BSA-oplossing gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    7. Was de membranen in TBST-buffer drie keer gedurende 5 minuten.
    8. Incubeer de membranen met primaire antilichamen (BEV-markers: LPS, OmpA, LTA; EEV-markers: CD63, CD9, TSG-101, Syntenine, Integrine β1; Andere contaminatiemarkers: flagelline, calnexine) gedurende 8-12 uur bij 4 °C.
    9. Was de membranen in TBST-buffer drie keer gedurende 10 minuten.
    10. Incubeer de membranen met secundaire antilichamen gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    11. Voer stap 8.5.9 uit.
    12. Ontwikkel het blotting met behulp van een chemiluminescentieapparaat.
    13. Vervang PBS/BEV-oplossing (stap 6.1.1 en stap 6.2.2) door BEV's van Escherichia coli om een positieve controle tot stand te brengen (zie de materiaaltabel voor de procedure voor het isoleren van ruwe E. coli-BEV's) en voer alle bovengenoemde experimenten uit voor de karakterisering van BEV's.
      PAUZEPUNT: Bepaal F6-F8 als de verdeling van BEV-verrijkte fracties op basis van de resultaten van de hierboven beschreven karakterisering voor fecale BEV's, en gebruik dit vernauwde bereik voor latere analyse.
  6. Bereken de terugwinningspercentages in termen van deeltjes en eiwitten om de efficiëntie van de twee DGC-modi te beoordelen. Onderstaande resultaten worden weergegeven in percentages.
    1. Bereken de terugwinningspercentages van deeltjes in de top-downmodus: totaal aantal deeltjes in F6-F8/deeltjes na UC gedefinieerd in stap 6.2.9.
    2. Bereken de terugwinningspercentages van deeltjes in de bottom-upmodus: totale hoeveelheid deeltjes in F6-F8/deeltjes na UC gedefinieerd in stap 6.2.9.
    3. Bereken de terugwinningspercentages van eiwitten in de top-downmodus: totaal eiwitgehalte in F6-F8 (μg)/eiwitgehalte na CU gedefinieerd in stap 6.2.9 (μg).
    4. Bereken de terugwinningspercentages van eiwitten in de bottom-upmodus: totaal eiwitgehalte in F6-F8 (μg)/eiwitgehalte na CU gedefinieerd in stap 6.2.9 (μg).
  7. Bereken de verhouding tussen deeltjes en eiwitten om de zuiverheid te beoordelen die traditioneel wordt gedefinieerd van UC en de twee DGC-modi, en de onderstaande resultaten werden allemaal gepresenteerd als percentages.
    1. Verhouding deeltje/eiwit na CU gedefinieerd in stap 6.2.9: deeltjes na CU/eiwitgehalte na CU (μg).
    2. Deeltjes/eiwitverhouding in de Top-down-modus: totaal aantal deeltjes in F6-F8/eiwitgehalte in F6-F8 (μg).
    3. Deeltje/eiwitverhouding in de bottom-upmodus: totaal aantal deeltjes in F6-F8/eiwitgehalte in F6-F8 (μg).
  8. Selecteer de meest geschikte centrifugatiemodus (Top-down modus werd geselecteerd in het protocol) voor fecale BEV-zuivering en toekomstige analyse.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bepaal de verdeling van BEV-verrijkte fracties
Om de verdeling van met bacteriële extracellulaire vesikels (BEV's) verrijkte fracties te bepalen, werd een blancocontrole ingesteld om de absorptiewaarden bij OD 340 nm te meten, en de dichtheid van elke fractie werd berekend op basis van de metingen en jodixanolrichtlijnen (stap 8.1). Tabel 2 geeft de dichtheidsresultaten weer, waaruit blijkt dat de fracties F4 tot en met F9 dichtheden vertoonden binnen het bereik dat doorgaans wordt ge...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bacteriële extracellulaire blaasjes (BEV's) zijn lipide-dubbellaagse nanodeeltjes die door bacteriën worden uitgescheiden en een schat aan eiwitten, lipiden, nucleïnezuren en andere bioactieve moleculen bevatten, die bijdragen aan het mediëren van de functionele effecten van bacteriën20. Van BEV's afkomstig van de darm is geverifieerd dat ze betrokken zijn bij de ontwikkeling van ziekten, zoals inflammatoire darmaandoeningen, de ziekte van Crohn en colorectale kanker, en ook het algemene metabolis...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door het National Science Fund for Distinguished Young Scholars (82025024); het Key-project van de National Natural Science Foundation of China (82230080); het National Key R&D-programma van China (2021YFA1300604); de National Natural Science Foundation of China (81871735, 82272438 en 82002245); Guangdong Natural Science Fund for Distinguished Young Scholars (2023B1515020058); de Natural Science Foundation van de provincie Guangdong (2021A1515011639); het Major State Basic Research Development Program van de Natural Science Foundation van de provincie Shandong in China (ZR2020ZD11); de Stichting Postdoctorale Wetenschappen (2022M720059); het Outstanding Youths Development Scheme van het Nanfang Hospital, Southern Medical University (2022J001).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1 % (w/v) glutaraldehyde (prepared from 2.5 % stock solution in deionized water)ACMECAP1126Morfologische observatie voor BEV's met behulp van TEM bij Stap 8.3.3
1 % (w/v) methylcellulose (prepared from original powder in deionized water)Sigma-AldrichM7027Morfologische observatie voor BEV's met behulp van TEM bij Stap 8.3.6
1.5 % (w/v) uranyl acetate (prepared from original powder in deionized water)Polysciences21447-25Morfologische observatie voor BEV's met behulp van TEM bij Stap 8.3.5
1000 μL, 200 μL, 10 μL PipetteKIRGENKG1313, KG1212, KG1011De oplossing overbrengen
5 % (w/v) bovine serum albumin oplossing (prepared from the original powder in TBST buffer)Fdbio scienceFD0030Gebruikt in western blotting voor blocking bij Stap 8.5.6
5 × laadbufferFdbio scienceFD006Gebruikt in western blotting en Coomassie brilliant blue stain bij Stap 8.5.1
75 % (v/v) alcoholLIRCONLIRCON-500 mLOppervlaktedesinfectie
96-well plateRarA8096De absorptiewaarden meten 
Anti-Calnexin antilichaamAbcamab92573Western blotting (Primair Antilichaam)
Anti-CD63 antilichaamAbcamab134045Western blotting (Primair Antilichaam)
Anti-CD9 antilichaamAbcamab236630Western blotting (Primair Antilichaam)
Anti-Flagellin antilichaamSino Biological40067-MM06Western blotting (Primair Antilichaam)
Anti-Integrin beta 1 antilichaamAbcamab30394Western blotting (Primair Antilichaam)
Anti-LPS antilichaamThermo FisherMA1-83152Western blotting (Primair Antilichaam)
Anti-LTA antilichaamThermo Fisher MA1-7402Western blotting (Primair Antilichaam)
Anti-OmpA antilichaamCUSABIOCSB-PA359226ZA01EOD, https://www.cusabio.com/Western blotting (Primair Antilichaam)
Anti-Syntenin antilichaamAbcamab133267Western blotting (Primair Antilichaam)
Anti-TSG101 antilichaamAbcamab125011Western blotting (Primair Antilichaam)
AutoclaafZEALWAYGR110DPSteriliseren voor benodigdheden en media die in het experiment worden gebruikt
BalansMettler ToledoAL104De tube met PBS-beladen monster balanceren
Bicinchoninic acid assay Fdbio scienceFD2001Eiwitgehalte van BEV's meten bij Stap 8.2
BioRenderBioRenderhttps://app.biorender.comMaak het schematische werkstroom van BEV's isolatie en zuivering getoond in Figuur 1
BioveiligheidskastHaierHR1200- II B2De procedures over feces monsterbehandeling uitvoeren
Centrifuge 5810 R; Rotor F-34-6-38Eppendorf5805000092; 5804727002, adapter: 5804774000Voorbereiding voor BEV's (Stap 3)
Chemiluminescentie apparaatBIO-OIOI600SE-MFGebruikt in western blotting voor signaaldetectie bij Stap 8.5.12
Cytation 5BioTekF01Microplate detector voor het meten van de absorptie (Stap 8.1) en fluorescentie (Figuur 6) waarden 
Dil-labeled lagedichtheids-lipoproteïneACMECAC12038Definieer de verdeling van storende componenten 
ElektroforeseapparatuurBio-rad1658033Gebruikt in western blotting voor eiwitscheiding en overdracht bij Stap 8.5.2, 8.5.3, 8.5.5
Enhanced Chemiluminescence kit HRP Fdbio scienceFD8020Gebruikt in western blotting voor signaaldetectie bij Stap 8.5.12
Escherichia coli American Type Culture CollectionATCC8739Isoleer BEV's als positieve controle. Protocol: Los 25 g van de LB-poeder op in 1 L gedeïoniseerd water en autoclaveer. Breng de 800 μL van de bewaarde Escherichia coli over in het medium. Kweek bij 37 °C in de incubator shaker. Centrifugeer vervolgens 3, 000 × g gedurende 20 min bij 4 °C, 12, 000 × g gedurende 30 min bij 4 °C, filter de supernatant door een 0.22 μm membraan en voer ultra-snel centrifugeren uit bij 160, 000 × g gedurende 70 min bij 4 °C. Pellet gedefinieerd als ruwe BEV's uit Escherichia coli werd opgehangen in 1.2 mL PBS (Stap 3, 4).    
Falcon tubes 50 mLKIRGENKG2811Voorbereiding voor BEV's (Stap 3)
Feto Protein Staining BufferAbsciab.001.50Coomassie brilliant blue staining bij Stap 8.5.4
FilterpapierBiosharpBS-TFP-070BMorfologische observatie voor BEV's met behulp van TEM bij Stap 8.3 (De oplossing blotten)
Formvar/Carbon ondersteunde koper roosters Sigma-AldrichTEM-FCF200CU50Morfologische observatie voor BEV's met behulp van TEM bij Stap 8.3
HEPES poederMeilunbioMB6078Iodixanol buffers met verschillende concentraties voor dichtheidsgradiëntcentrifugatie voorbereiden
HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)Fdbio scienceFDM007Western blotting (Secundair Antilichaam)
HRP Affini

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Costello, E. K., et al. Bacterial community variation in human body habitats across space and time. Science. 326 (5960), 1694-1697 (2009).
  2. Greenhalgh, K., Meyer, K. M., Aagaard, K. M., Wilmes, P. The human gut microbiome in health: establishment and resilience of microbiota over a lifetime. Environmental Microbiology. 18 (7), 2103-2116 (2016).
  3. de Vos, W. M., Tilg, H., Van Hul, M., Cani, P. D. Gut microbiome and health: mechanistic insights. Gut. 71 (5), 1020-1032 (2022).
  4. Zhou, P., Yang, D., Sun, D., Zhou, Y. Gut microbiome: New biomarkers in early screening of colorectal cancer. Journal of Clinical Laboratory Analysis. 36 (5), 24359(2022).
  5. Paik, D., et al. Human gut bacteria produce Τ(Η)17-modulating bile acid metabolites. Nature. 603 (7903), 907-912 (2022).
  6. Parada Venegas, D., et al. Short chain fatty acids (SCFAs)-mediated gut epithelial and immune regulation and its relevance for inflammatory bowel diseases. Frontiers in Immunology. 10, 277(2019).
  7. Jiang, C., Li, G., Huang, P., Liu, Z., Zhao, B. The Gut microbiota and Alzheimer's disease. Journal of Alzheimer's Disease. 58 (1), 1-15 (2017).
  8. Morais, L. H., Schreiber, H. L. t, Mazmanian, S. K. The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders. Nature Reviews Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).
  9. Kim, J. H., Lee, J., Park, J., Gho, Y. S. Gram-negative and Gram-positive bacterial extracellular vesicles. Seminars in Cell and Developmental Biology. 40, 97-104 (2015).
  10. Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. Types and origins of bacterial membrane vesicles. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).
  11. Xie, J., Li, Q., Haesebrouck, F., Van Hoecke, L., Vandenbroucke, R. E. The tremendous biomedical potential of bacterial extracellular vesicles. Trends in Biotechnology. 40 (10), 1173-1194 (2022).
  12. Coumans, F. A. W., et al. Methodological guidelines to study extracellular vesicles. Circulation Research. 120 (10), 1632-1648 (2017).
  13. Northrop-Albrecht, E. J., Taylor, W. R., Huang, B. Q., Kisiel, J. B., Lucien, F. Assessment of extracellular vesicle isolation methods from human stool supernatant. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (4), 12208(2022).
  14. Park, Y. E., et al. Microbial changes in stool, saliva, serum, and urine before and after anti-TNF-α therapy in patients with inflammatory bowel diseases. Scientific Reports. 12 (1), 6359(2022).
  15. Tulkens, J., De Wever, O., Hendrix, A. Analyzing bacterial extracellular vesicles in human body fluids by orthogonal biophysical separation and biochemical characterization. Nature Protocols. 15 (1), 40-67 (2020).
  16. Tulkens, J., et al. Increased levels of systemic LPS-positive bacterial extracellular vesicles in patients with intestinal barrier dysfunction. Gut. 69 (1), 191-193 (2020).
  17. Kang, C. S., et al. Extracellular vesicles derived from gut microbiota, especially Akkermansia muciniphila, protect the progression of dextran sulfate sodium-induced colitis. PloS one. 8 (10), 76520(2013).
  18. Simonsen, J. B. What are we looking at? Extracellular vesicles, lipoproteins, or both. Circulation Research. 121 (8), 920-922 (2017).
  19. Correll, V. L., et al. Optimization of small extracellular vesicle isolation from expressed prostatic secretions in urine for in-depth proteomic analysis. Journal of Extracellular Vesicles. 11 (2), 12184(2022).
  20. Liang, X., et al. Gut bacterial extracellular vesicles: important players in regulating intestinal microenvironment. Gut Microbes. 14 (1), 2134689(2022).
  21. Alberti, G., et al. Extracellular vesicles derived from gut microbiota in inflammatory bowel disease and colorectal cancer. Biomedical papers of the Medical Faculty of the University Palacky, Olomouc, Czech Republic. 165 (3), 233-240 (2021).
  22. Díez-Sainz, E., Milagro, F. I., Riezu-Boj, J. I., Lorente-Cebrián, S. Effects of gut microbiota-derived extracellular vesicles on obesity and diabetes and their potential modulation through diet. Journal of Physiology and Biochemistry. 78 (2), 485-499 (2022).
  23. Lajqi, T., et al. Gut microbiota-derived small extracellular vesicles endorse memory-like inflammatory responses in murine neutrophils. Biomedicines. 10 (2), 442(2022).
  24. Lee, K. E., et al. The extracellular vesicle of gut microbial Paenalcaligenes hominis is a risk factor for vagus nerve-mediated cognitive impairment. Microbiome. 8 (1), 107(2020).
  25. Villard, A., Boursier, J., Andriantsitohaina, R. Bacterial and eukaryotic extracellular vesicles and nonalcoholic fatty liver disease: new players in the gut-liver axis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 320 (4), G485-G495 (2021).
  26. Wei, S., et al. Outer membrane vesicles enhance tau phosphorylation and contribute to cognitive impairment. Journal of Cellular Physiology. 235 (5), 4843-4855 (2020).
  27. Bitto, N. J., Kaparakis-Liaskos, M. Methods of bacterial membrane vesicle production, purification, quantification, and examination of their immunogenic functions. Methods in Molecular Biology. 2523, 43-61 (2022).
  28. Stentz, R., Miquel-Clopés, A., Carding, S. R. Production, isolation, and characterization of bioengineered bacterial extracellular membrane vesicles derived from Bacteroides thetaiotaomicron and their use in vaccine development. Methods in Molecular Biology. 2414, 171-190 (2022).
  29. Zhang, Q., Jeppesen, D. K., Higginbotham, J. N., Franklin, J. L., Coffey, R. J. Comprehensive isolation of extracellular vesicles and nanoparticles. Nature Protocols. 18 (5), 1462-1487 (2023).
  30. Iwai, K., Minamisawa, T., Suga, K., Yajima, Y., Shiba, K. Isolation of human salivary extracellular vesicles by iodixanol density gradient ultracentrifugation and their characterizations. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 30829(2016).
  31. Vandeputte, D., et al. Stool consistency is strongly associated with gut microbiota richness and composition, enterotypes and bacterial growth rates. Gut. 65 (1), 57-62 (2016).
  32. Wen, M., et al. Bacterial extracellular vesicles: A position paper by the Microbial Vesicles Task Force of the Chinese Society of Extracellular Vesicles. Interdisciplinary Medicine. 1, 12046(2023).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Isolatie van fecale BEVvesikels van de darmmicrobiotaBEV purificatieultracentrifugatieiodixanolgradi ntherstel van deeltjesanalyse van eiwitgehaltemenselijke fecesmonsters

Gerelateerde artikelen