Dit artikel schetst een stapsgewijze procedure voor het opstellen van een muizenmodel met een oronasale fistel. De oronasale fistel werd gecreëerd door gebruik te maken van verwarmde oftalmologische cauterisatie om het middellijngedeelte van het harde gehemelte te beschadigen, wat resulteerde in de vorming van een opening tussen de mond- en neusholte.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Opstelling van een oronasale fistelmuizen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Deze studie presenteert een methode die gebruik maakt van verwarmde oftalmologische cauterisatie om een levensvatbaar model te ontwikkelen voor het onderzoeken van oronasale fistels. C57BL/6-muizen werden gebruikt om het oronasale fistelmodel (ONF) vast te stellen. Om de ONF te creëren, werden de muizen verdoofd, geïmmobiliseerd en werden hun harde gehemelte blootgesteld. Tijdens de chirurgische ingreep werd een slijmvliesbeschadiging van 2,0 x 1,5 mm over de volledige dikte geïnduceerd in de middellijn van het harde gehemelte met behulp van oftalmologische cauterisatie. Het was van cruciaal belang om de grootte van het ONF onder controle te houden en bloedingen tot een minimum te beperken om het succes van het experiment te garanderen. Verificatie van de effectiviteit van het ONF-model werd uitgevoerd op de 7e dag na de operatie, met zowel anatomische als functionele beoordelingen. De aanwezigheid van het neustussenschot in de mondholte en de uitstroom van steriel water uit de neusgaten bij injectie in de mondholte bevestigden de succesvolle oprichting van het ONF-model. Het model toonde een praktische en succesvolle oronasale fistel, gekenmerkt door een laag sterftecijfer, significante gewichtsveranderingen en minimale variatie in ONF-grootte. Toekomstige studies kunnen overwegen om deze methodologie toe te passen om de mechanismen van gehemeltewondgenezing op te helderen en nieuwe behandelingen voor oronasale fistels te onderzoeken.
Inleiding
Oronasale fistel (ONF), een abnormale opening tussen de mond- en neusholte, manifesteert zich klinisch als een defect in een structureel gebied van de processus alveolair naar de huig, dat vaak optreedt als een complicatie na herstel van het gespleten gehemelte. Patiënten met ONF ervaren voedselreflux, articulatiestoornissen en een verminderde velofaryngeale functie, wat een aanzienlijke invloed heeft op hun kwaliteit van leven 2,3,4. Het percentage postoperatieve ONF varieert van 2.4% tot 55% als gevolg van factoren zoals gespleten breedte, Veau-type en chirurgische methode 5,6,7,8. Bovendien is het recidiefpercentage na ONF-reparatie hoog, variërend van 0% tot 43%9.
Verschillende nieuwe behandelingen zijn onlangs veelbelovend gebleken op het gebied van ONF, waaronder verschillende materialen, medicijnen en nieuwe technieken 10,11,12,13,14,15,16,17. Nauwkeurige evaluatie van therapeutische effecten is essentieel omdat het de basis vormt voor het selecteren en verder ontwikkelen van ONF-behandelingen. Het is echter een uitdaging om op korte termijn een geldige beoordeling te krijgen voor andere therapeutische effecten dan chirurgie, aangezien de kenmerken van ONF's variëren tussen verschillende patiënten. Daarom is het opstellen van een ONF-ziektemodel noodzakelijk om de effectiviteit van deze behandelmethoden te verifiëren.
Al tientallen jaren hebben onderzoekers het oronasale fistelmodel (ONF) gegenereerd bij verschillende diersoorten, waaronder ratten18,19, biggen 20,21, minivarkens22 en honden 23, omdat deze soorten een aanzienlijk hard gehemelte hebben dat geschikt is voor chirurgische manipulatie. Muizen hebben echter een genetische sequentie en een volledig genoom dat vergelijkbaar is met dat van mensen, waardoor ze een belangrijk model zijn voor het onderzoeken en ontwikkelen van nieuwe medicijnen24,25,26. Bovendien bieden muizen weinig variatie van batch tot batch, waardoor ze een gunstige keuze zijn voor het vaststellen van het ONF-model12,13,27.
De gedetailleerde stappen voor het creëren van ONF werden echter niet beschreven en er werd geen rekening gehouden met de stabiliteit van de ONF-omvang. Bovendien was de verificatie van de vorming van ONF uitsluitend gebaseerd op observatie28, zonder directe communicatie tussen de mond- en neusholten te waarborgen. Het werd niet aangetoond met andere middelen, zoals het verlies van lichaamsgewicht van de muis als gevolg van eetproblemen veroorzaakt door het ONF. Bovendien werd geen rekening gehouden met normale variatie in wondgrootte, wat cruciaal is voor onderzoeken naar geneesmiddelen of materialen die wondgenezing bevorderen of remmen. Daarom is er een sterke behoefte aan een stabiel en gevalideerd ONF-model.
Het doel van deze studie was om een praktisch ONF-model te ontwikkelen dat de bovengenoemde problemen aanpakt, in de hoop dat dit protocol als basis zal dienen voor toekomstig onderzoek naar de mechanismen van palatinale wondgenezing en nieuwe behandelingen voor ONF.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierproeven in deze studie werden beoordeeld en goedgekeurd door de ethische commissie van de West China School of Stomatology, Sichuan University. Volwassen C57BL/6 muizen (vrouwtjes) werden gebruikt voor de huidige studie.
1. Chirurgische voorbereiding
- Verzamel de benodigde chirurgische instrumenten voor de procedure: kiemer, oftalmologische cauterisatie, microchirurgische schaar, microchirurgisch pincet, spuiten en naalden (26 g x 0.63 inch) (Figuur 1A,B) (zie Materiaaltabel).
OPMERKING: Voorafgaand aan de chirurgische ingreep autoclaveren van de chirurgische instrumenten, inclusief de oftalmologische cauterisatie, het microchirurgische pincet en de microchirurgische schaar, bij 102,9 kPa (1,05 kg/cm2) en 121 °C gedurende 20 minuten. - Verzamel de benodigde chirurgische benodigdheden: operatielakens, latex handschoenen, steriel katoen, steriele lakens, steriele metaalfolie, foamboard als chirurgisch platform, elastiekjes (die kunnen worden verkregen door een medische latexhandschoen te scheuren) en tape (Figuur 1C) (zie Materiaaltabel).
OPMERKING: Gebruik voor elke muis een aparte set benodigdheden, inclusief spuiten en steriele vellen voor het chirurgische veld. - Reinig het operatiegebied en het apparaat (lichtbron, schuimplaat en apparaat voor temperatuurbehoud, zie Materiaaltabel) met alcoholdoekjes. Bedek de knoppen en handgrepen van instrumenten die tijdens de procedure nodig kunnen zijn met steriele metaalfolie.
- Open de afzonderlijke instrumenten aseptisch en plaats ze voorzichtig in het operatiegebied. Activeer de kiemmachine (zie Materiaaltabel) en de lampen voor gebruik tijdens de procedure. Plaats de oftalmologische cauterisatie in de kiemer en verwarm deze gedurende 20 minuten tot 250 °C.
2. Chirurgische ingreep
- Voer fixatie van de muis uit en open de mondholte door de onderstaande stappen te volgen.
- Kies een vrouwelijke C57BL/6J-muis met een gewicht van 20-25 g en een leeftijd van 8-12 weken. Huisvest de muis 7 dagen voordat u procedures uitvoert.
- Verdoof de muis door intraperitoneale injectie van Zoletil50 (80 mg/kg) en Xylazine (5 mg/kg) (zie Materiaaltabel). Breng oogzalf aan op het oog van de muis. Wacht tot er geen teenknijpreactie is.
NOTITIE: De muis is klaar voor de procedure wanneer deze niet zelfstandig kan omdraaien. - Bevestig de muis op een foamboard bekleed met steriele vellen. Gebruik tape om de muis in rugligging aan het chirurgische platform vast te binden (Figuur 2A).
- Open de mondholte van de muis. Plaats twee naalden (26 g x 0.63 inch) voor het orbitale oorvlak en nog twee erachter. Plaats een elastiekje om de naalden en kruis de snijtanden om de mond open te houden. Gebruik een microchirurgisch pincet om de mondhoeken open te houden (Figuur 2B).
NOTITIE: Zorg ervoor dat het harde gehemelte duidelijk zichtbaar is. Bevestig de tong onder het elastiekje om belemmering van het gezichtsveld en verbranding tijdens volgende experimenten te voorkomen.
- Maak de oronasale fistel (ONF) op het harde gehemelte (Figuur 3A-F).
- Haal de oftalmologische cauterisatie op, die gedurende 20 minuten tot 250 °C is verwarmd. Plaats de cauterisatiepunt op 1 mm afstand van het snijpunt van de middellijn van het gehemelte en de lijn van de eerste premolaar, waardoor een slijmvliesbeschadiging over de volledige dikte van het harde gehemelte in de middellijn ontstaat.
NOTITIE: Voorkom dat u de tong van de muis verbrandt. - Verwijder na enkele seconden de oftalmologische cauterisatie wanneer het slijmvlies rond de cauterisatiepunt wit wordt.
- Plaats de oftalmologische cauterisatie in de kiemer en blijf deze gedurende 10 minuten verwarmen tot 250 °C. Herhaal de vorige stap om de wond langs de randen te vergroten tot een lengte van 2,0 mm en een breedte van 1,5 mm.
NOTITIE: Elke verlenging moet de rand van de laatste verwonding volgen. Gebruik een schuifmaat om de lengte en breedte van de verwonding te meten. De verwonding moet 10% van het gehemelte bedekken. - Gebruik een microchirurgische schaar om overtollig gedenatureerd zacht weefsel rond de wond te verwijderen. Gebruik steriel katoen om het bloeden te stoppen en verstikking door inademing van de muis te voorkomen. Meet de wond om er zeker van te zijn dat deze een slijmvliesbeschadiging van de volledige dikte van het harde gehemelte vormt van 2,0 x 1,5 mm in de middellijn.
- Haal de oftalmologische cauterisatie op, die gedurende 20 minuten tot 250 °C is verwarmd. Plaats de cauterisatiepunt op 1 mm afstand van het snijpunt van de middellijn van het gehemelte en de lijn van de eerste premolaar, waardoor een slijmvliesbeschadiging over de volledige dikte van het harde gehemelte in de middellijn ontstaat.
3. Postoperatieve zorg
- Toedienen van Meloxicam aan de muis op het moment van postoperatief ontwaken, in een dosis van 5 mg/kg/dag gedurende 3 dagen, subcutaan29.
- Plaats de muis op een temperatuurbehoudapparaat totdat deze weer volledig bij bewustzijn is.
NOTITIE: Zorg ervoor dat de muis zo is geplaatst dat de ademhaling wordt vergemakkelijkt. Draai de muizen elke 10-15 minuten om bloedophoping of instorting van longkwabben te voorkomen. Zodra de muis is opgewarmd, plaatst u hem terug in zijn kooi. Zorg voor steriele gelei en bestraald voer op de bodem van de kooi zodat de muizen het kunnen consumeren.
4. Verificatie van de creatie van de oronasale fistel
OPMERKING: Het succes van het ontstaan van de oronasale fistel (ONF) wordt beoordeeld op de 7e dag na de chirurgische ingreep.
- Bereid de benodigde chirurgische benodigdheden voor: elastiek, tape, spuiten, operatiedoeken, latex handschoenen, steriele vellen, steriele metaalfolie en foamboard.
- Draag chirurgische lakens en steriele handschoenen om aseptische omstandigheden te behouden. Desinfecteer het schuimbord, de lichtbron en het temperatuurbehoudapparaat met alcohol.
- Induceer algemene anesthesie door intraperitoneale injectie van Zoletil50 (80 mg/kg). Wacht tot er geen teenknijpreactie is. Gebruik dezelfde methode als beschreven in stap 2.1.3 en 2.1.4 om de muis te immobiliseren en het harde gehemelte bloot te leggen.
- Voer anatomische structurele verificatie uit door ervoor te zorgen dat het septum nog steeds zichtbaar is op de plaats van de wond, wat wijst op een succesvolle ONF-creatie (Figuur 4A,B).
- Voer functionele verificatie uit: sluit de mondholte van de muis en injecteer steriel water in de mondholte met behulp van een steriele spuit. De succesvolle creatie van ONF wordt bevestigd wanneer vloeistof uit de neusgaten van de muis stroomt.
- Plaats de muis op het temperatuurbehoudapparaat (37 °C) totdat deze weer volledig bij bewustzijn is. Draai de muizen elke 10-15 minuten om bloedophoping of instorting van longkwabben te voorkomen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Om de haalbaarheid en stabiliteit van deze experimentele methode te beoordelen, werd dezelfde procedure uitgevoerd op tien muizen en werden observaties gedaan met betrekking tot mortaliteit, veranderingen in wondgrootte, lichaamsgewicht en histologische analyse. De muizen werden op dag 7 geëuthanaseerd.
De procedure vertoonde een laag sterftecijfer. De oftalmologische cauterisatie en kiemer, afgebeeld in figuur 1A-C, waren de bela...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Onderzoekers hebben verschillende materialen, medicijnen en nieuwe technieken onderzocht voor de behandeling van ONF 10,11,12,13,14,15,16,17. Met de vooruitgang in chirurgische ingrepen zijn de incidentie en herhaling van ONF verminderd. Vanwege de unieke k...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door het onderzoeks- en ontwikkelingsprogramma, het West China Hospital of Stomatology, Sichuan University (RD-02-202107), het Sichuan Province Science and Technology Support Program (2022NSFSC0743) en de Sichuan Postdoctoral Science Foundation (TB2022005) subsidie aan H. Huang.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Germinator | Electron Microscopy Sciences | 66118-20 | Verwarmings- en desinfectieapparatuur |
| Latex handschoenen | Allmed | of soortgelijk | |
| Lichten | Olympus | A1813 | |
| Meloxicam | MedChemExpress | HY-B0261 | gemalen; 5 mg/kg |
| Microchirurgische instrumenten (schaar en pincet) | Jiangsu Tonghui Medical Devices Co. | M-Y-0087 | Chirurgisch instrument |
| Oogheelkundig cauterisatie | Suqian Wenchong Medical Equipment Co. | 1.00234E+13 | Chirurgisch instrument |
| Steriele katoen, | Yancheng Begu Technology Co. | of soortgelijk | |
| Steriele metaalfolie | Biosharp | of soortgelijk | |
| Steriele lakens | 3M | XH003801129 | of soortgelijk |
| Chirurgische schermen | Yancheng Begu Technology Co. | of soortgelijk | |
| Spuiten | Yancheng Begu Technology Co. | S-015301 | of soortgelijk |
| Tape | Bkmamlab | of soortgelijk | |
| Temperatuurbehoudapparaat | Harvard Apparatus | LE-13-2104 | |
| Zoletil50 | Virbac | 80 mg/kg |
Referenties
- Alonso, V., et al. Three-layered repair with a collagen membrane and a mucosal rotational flap reinforced with fibrine for palatal fistula closure in children. International Journal of Pediatric Otorhinolaryngology. 127, 109679(2019).
- Garg, R., Shah, S., Uppal, S., Mittal, R. K. A statistical analysis of incidence, etiology, and management of palatal fistula. National Journal of Maxillofacial Surgery. 10 (1), 43-46 (2019).
- Mahajan, R. K., Kaur, A., Singh, S. M., Kumar, P. A retrospective analysis of incidence and management of palatal fistula. Indian Journal of Plastic Surgery. 51 (3), 298-305 (2018).
- Huang, H., et al. Validation of the Chinese Velopharyngeal Insufficiency Effects on Life Outcomes Instrument. Laryngoscope. 129 (11), E395-E401 (2019).
- Sakran, K. A., et al. Evaluation of Postoperative Outcomes in Two Cleft Palate Repair Techniques without Relaxing Incisions. Plastic and Reconstructive Surgery. , (2023).
- Sakran, K. A., et al. Evaluation of late cleft palate repair by a modified technique without relaxing incisions. Journal of Stomatology, Oral and Maxillofacial Surgery. 124 (4), 101403(2023).
- Sakran, K. A., et al. The Sommerlad-Furlow modified palatoplasty technique: postoperative complications and implicating factors. Laryngoscope. 133 (4), 822-829 (2023).
- Sakran, K. A., et al. Early cleft palate repair by a modified technique without relaxing incisions. The Cleft Palate-Craniofacial Journal. , (2022).
- Chen, J., Yang, R., Shi, B., Xu, Y., Huang, H. Obturator manufacturing for oronasal fistula after cleft palate repair: a review from handicraft to the application of digital techniques. Journal of Functional Biomaterials. 13 (4), 251(2022).
- Yussif, N., Wagih, R., Selim, K. Propylene mesh versus acrylic resin stent for palatal wound protection following free gingival graft harvesting: a short-term pilot randomized clinical trial. BMC Oral Health. 21 (1), 208(2021).
- Miron, R. J., et al. Platelet-rich fibrin and soft tissue wound healing: a systematic review. Tissue Engineering Part B: Reviews. 23 (1), 83-99 (2017).
- Ballestas, S. A., et al. Improving hard palate wound healing using immune modulatory autotherapies. Acta Biomaterialia. 91, 209-219 (2019).
- Ferreira, C. L., et al. Electrical stimulation enhances early palatal wound healing in mice. Archives of Oral Biology. 122, 105028(2021).
- Lindley, L. E., Stojadinovic, O., Pastar, I., Tomic-Canic, M. Biology and Biomarkers for Wound Healing. Plastic and Reconstructive Surgery. 138 (3 Suppl), 18s-28s (2016).
- Xu, Y., et al. Rapid Additive Manufacturing of a Superlight Obturator for Large Oronasal Fistula in Pediatric Patient. Laryngoscope. 133 (6), 1507-1512 (2022).
- Leenstra, T. S., Kuijpers-Jagtman, A. M., Maltha, J. C. The healing process of palatal tissues after palatal surgery with and without implantation of membranes: an experimental study in dogs. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 9 (5), 249-255 (1998).
- In de Braekt, M. M., van Alphen, F. A., Kuijpers-Jagtman, A. M., Maltha, J. C. Wound healing and wound contraction after palatal surgery and implantation of poly-(L-lactic) acid membranes in beagle dogs. Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 50 (4), 359-365 (1992).
- Suragimath, G., Krishnaprasad, K. R., Moogla, S., Sridhara, S. U., Raju, S. Effect of carbonated drink on excisional palatal wound healing: A study on Wistar rats. Indian Journal of Dental Research. 21 (3), 330-333 (2010).
- Zhu, T., Park, H. C., Son, K. M., Yang, H. -C. Effects of dimethyloxalylglycine on wound healing of palatal mucosa in a rat model. BMC Oral Health. 15 (1), 60(2015).
- Kirschner, R. E., et al. Repair of oronasal fistulae with acellular dermal matrices. Plastic and Reconstructive Surgery. 118 (6), 1431-1440 (2006).
- Rohleder, N. H., et al. Repair of oronasal fistulae by interposition of multilayered amniotic membrane allograft. Plastic and Reconstructive Surgery. 132 (1), 172-181 (2013).
- Kesting, M. R., et al. Repair of oronasal fistulas with human amniotic membrane in minipigs. British Journal of Oral and Maxillofacial Surgery. 48 (2), 131-135 (2010).
- Ayvazyan, A., et al. Collagen-gelatin scaffold impregnated with bFGF accelerates palatal wound healing of palatal mucosa in dogs. Journal of Surgical Research. 171 (2), e247-e257 (2011).
- Takao, K., Miyakawa, T. Genomic responses in mouse models greatly mimic human inflammatory diseases. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (4), 1167-1172 (2015).
- Rongvaux, A., et al. Development and function of human innate immune cells in a humanized mouse model. Nature Biotechnology. 32 (4), 364-372 (2014).
- Shan, L., Flavell, R. A., Herndler-Brandstetter, D. Development of humanized mouse models for studying human NK cells in health and disease. Methods in Molecular Biology. 2463, 53-66 (2022).
- Keswani, S. G., et al. Role of salivary vascular endothelial growth factor (VEGF) in palatal mucosal wound healing. Wound Repair and Regeneration. 21 (4), 554-562 (2013).
- Amanso, A. M., et al. Local delivery of FTY720 induces neutrophil activation through chemokine signaling in an oronasal fistula model. Regenerative Engineering and Translational Medicine. 7 (2), 160-174 (2021).
- Antiorio, A. T. F. B., et al. Administration of meloxicam to improve the welfare of mice in research: a systematic review (2000 - 2020). Veterinary Research Communications. 46 (1), 1-8 (2022).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
