Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Hyperglykemische klem en hypoglykemische klem bij bewuste muizen

2.6K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65581

⸱

26 januari 2024

 , 
1Department of Neuroscience for Metabolic Control, Graduate School of Medical Science, Kumamoto University

In dit artikel

Samenvatting

Een hyperglykemische klem wordt gebruikt voor het meten van de insulineafgifte bij een aangehouden hogere bloedglucoseconcentratie. Een hypoglykemische klem is voor het meten van de glucoseproductie die wordt geïnduceerd door tegenregulerende reacties. Beide methoden maken gebruik van dezelfde chirurgische ingreep. Hier presenteren we een klemtechniek om het systemische glucosemetabolisme te beoordelen.

Samenvatting

Diabetes mellitus (DM) wordt veroorzaakt door onvoldoende insulineafgifte uit de β-cellen van de alvleesklier (Type1 DM) en insulinegevoeligheid in spieren, lever en vetweefsel (Type2 DM). Insuline-injectie behandelt DM-patiënten, maar leidt tot hypoglykemie als bijwerking. Cortisol en catecholamines worden vrijgegeven om de glucoseproductie uit de lever te activeren om hypoglykemie te herstellen, de zogenaamde contraregulerende reacties (CRR). In DM-onderzoek met behulp van knaagdiermodellen worden glucosetolerantietests en 2-deoxy-glucose-injectie gebruikt om respectievelijk de insulineafgifte en CRR te meten. De bloedglucoseconcentraties veranderen echter voortdurend tijdens experimenten, waardoor het moeilijk wordt om de netto insulineafgifte en CRR te beoordelen. Dit artikel beschrijft een methode waarbij de bloedglucose bij bewuste muizen op 250 mg/dL of 50 mg/dL wordt gehouden om de afgifte van respectievelijk insuline- en CRR-hormonen te vergelijken.

Polyethyleen slangen worden geïmplanteerd in de halsslagader en halsader van de muizen en de muizen mogen herstellen van de operatie. De halsaderslang is verbonden met een Hamilton-spuit met een spuitpomp om insuline- of glucose-infusie met een constante en variabele snelheid mogelijk te maken. De slang van de halsslagader is bedoeld voor bloedafname. Voor de hyperglykemische klem wordt 30% glucose in de ader toegediend en worden de bloedglucosewaarden elke 5 minuten of 10 minuten gemeten uit het arteriële bloed. De infusiesnelheid van 30% glucose wordt verhoogd totdat de bloedglucosespiegel 250 mg/dL wordt. Er wordt bloed afgenomen om de insulineconcentraties te meten. Voor hypoglykemische klem wordt insuline van 10 mU/kg/min toegediend samen met 30% glucose, waarvan de infusiesnelheid variabel is om de bloedglucosespiegel van 50 mg/dL te behouden. Bloed wordt verzameld om tegenregulerende hormonen te meten wanneer zowel glucose-infusie als bloedglucose een stabiele toestand bereiken. Zowel hyperglykemische als hypoglykemische klemmen hebben dezelfde chirurgische ingreep en experimentele opstellingen. Deze methode is dus nuttig voor onderzoekers van systemisch glucosemetabolisme.

Inleiding

Glucose is een belangrijke energiebron voor cellen en een gebrek aan glucose kan leiden tot verschillende symptomen en complicaties. In het geval van een lage glucose (hypoglykemie, over het algemeen minder dan 70 mg/dL in nuchtere bloedglucosespiegel, maar mag niet worden bepaald door een enkele waarde1), zijn de meest voorkomende symptomen zwakte, verwardheid, zweten en hoofdpijn. Het kan ook de hersenfunctie verstoren en het risico op cardiovasculaire gebeurtenissen en mortaliteitverhogen2. Omgekeerd is hyperglykemie een medische aandoening waarbij de plasmaglucoseconcentratie de normale niveaus overschrijdt (over het algemeen > 126 mg/dL bij nuchtere bloedglucosespiegel3). Dit kan voorkomen bij personen met diabetes die een tekort hebben in de insulineproductie of -gebruik. Hyperglykemie kan leiden tot diabetische ketoacidose, die optreedt wanneer het lichaam glucose niet kan gebruiken voor energie, maar in plaats daarvan vetzuren afbreekt als brandstof. De hyperglykemische hyperosmolaire toestand verhoogt ook de mortaliteit4. Langdurige hyperglykemie kan schade aan bloedvaten, zenuwen en organen veroorzaken, wat leidt tot de ontwikkeling van verschillende chronische complicaties zoals hart- en vaatziekten, retinopathieën en nieraandoeningen. De bloedglucoseconcentratie moet dus binnen een strak bereik tussen 100 mg/dL en 120 mg/dL worden gehouden.

De bloedglucose wordt gereguleerd door de balans tussen de input en output van glucose in een model met één compartiment (Figuur 1A). Glucose-input omvat geabsorbeerde glucose uit voedsel en glucoseproductie uit de lever, nieren en dunne darm. De glucoseproductie omvat de opname van glucose in weefsels en de afvoer van glucose uit de nieren. Zowel de hoeveelheid glucose-input als -output worden gereguleerd door endocriene hormonen. Glucagon, corticosteron en catecholamines, bekend als tegenregulerende hormonen, komen bijvoorbeeld vrij wanneer de bloedglucosespiegelsdalen5. Ze stimuleren de afbraak van glycogeen en de synthese van glucose, voornamelijk uit de lever; Deze processen staan bekend als respectievelijk glycogenolyse en gluconeogenese. Hyperglykemie verhoogt de insulineafgifte uit β-cellen van de alvleesklier en stimuleert de opname van glucose in de spieren, vetweefsels en het hart 6,7,8,9. Lichaamsbeweging verhoogt de insuline-onafhankelijke glucoseopname10. Het sympathische zenuwstelsel verhoogt de opname van glucose in spieren en bruin vetweefsel 6,11. Om het vermogen om het glucosemetabolisme in perifere weefsels te reguleren te meten, gebruiken onderzoekers meestal de glucosetolerantietest (GTT) en de insulinetolerantietest (ITT) (Figuur 1B,C). Bij GTT moet rekening worden gehouden met twee factoren: insulineafgifte en insulinegevoeligheid (Figuur 1B). De glucoseconcentratiecurve tijdens de test van 120 minuten is echter bij elke muis anders, wat van invloed kan zijn op verschillende hoeveelheden hormoonafgifte. Bij ITT wordt de bloedglucose gereguleerd door zowel de insulinegevoeligheid als de afgifte van tegenregulerende hormonen. Daarom is het moeilijk om de precieze betekenis van glucosemetabolisme, insulineafgifte en insulinegevoeligheid in GTT en ITT te bepalen, in situaties waarin de bloedglucosespiegels niet constant zijn.

Om deze problemen op te lossen, is het wenselijk om de bloedglucose op een constant niveau te houden (of "klem"). Bij hyperglykemische klem wordt glucose in de bloedbaan toegediend om de bloedglucosespiegels tot een bepaald niveau te verhogen en vervolgens gedurende een bepaalde periode op dat niveau te houden. De hoeveelheid geïnfundeerde glucose wordt aangepast op basis van metingen van de bloedglucosespiegels om de 5-10 minuten om een stabiele toestand te behouden. Deze techniek is vooral nuttig voor het begrijpen van de parameters van insulinesecretie bij een geklemd glucosegehalte. Hypoglykemische klem is een methode om lage bloedglucosespiegels te handhaven door insuline toe te dienen. Glucose wordt met een variabele snelheid toegediend om een specifieke bloedglucosespiegel te behouden. Als de muis niet kan herstellen van hypoglykemie, moet meer glucose worden toegediend.

Hoewel er veel voordelen zijn aan het uitvoeren van hyperglykemische en hypoglykemische klemmen, worden de chirurgische en experimentele procedures als technisch moeilijk beschouwd. Er zijn dus maar weinig onderzoeksgroepen die ze hebben kunnen doen. We wilden deze methoden beschrijven voor onderzoekers met financiële en personeelsbeperkingen om deze experimenten met een lager budget te starten.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Alle procedures zijn goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Kumamoto.

OPMERKING: Voor pijnverlichting werd ibuprofen gedurende 48 uur in drinkwater (0,11 mg/ml) gegeven en buprenorfine (0,05-0,1 mg/kg i.p.) werd 30 minuten voor de operatie gegeven. Steriele omstandigheden omvatten handschoenen, maskers en geautoclaveerde instrumenten die tussen dieren met ethyleenoxide zijn gesteriliseerd. De operatie werd uitgevoerd op een verwarmingskussen dat was ingesteld op 37 °C en voor elk dier werd bedekt met een nieuwe laboratoriummat. Vóór de operatie werd het operatiegebied gereinigd met een betadine-oplossing en alcohol. Alle chirurgische instrumenten werden gesteriliseerd met een autoclaaf (voor niet meer dan twee operaties). Voordat de incisie werd gemaakt, werden muizen gecontroleerd om er zeker van te zijn dat ze volledig verdoofd waren. De diepte van de anesthesie voor elke muis werd voorafgaand aan en tijdens de operatie beoordeeld door een teenknijp. De acclimatisatieperiode was niet meer dan 5 minuten per keer. Volg de instructies van de IACUC van de betreffende instelling.

1. Voorbereiding van slangen voor de halsader en halsslagader

  1. Steriliseer alle slangen, polypropyleen benodigdheden (bijv. pipetpunten) en hechtingen met een autoclaaf of ethyleenoxide. Verbind voor de halsader 8 cm slang1 (zie Materialen) en 3 cm slang2 met lijm (Figuur 2A). Plaats 2 mm slang1 op de bovenkant, omdat slang 2 (polyethyleen) te hard is en de bloedvaten kan beschadigen (slang1.1).
  2. Verlengbuis voor de halsader (Tubing1.2) om glucose en insuline toe te dienen
    1. Bereid twee buizen van 30 cm en een buis van 10 cm met slang2 voor (Figuur 2A). Knip het scherpe uiteinde van een pipetpunt van 20 μl af (of iets anders met een smal uiteinde met een buitendiameter < 0.5 mm om aan te sluiten op slang 1.1) en plaats er drie slangetjes2 (30 cm, 30 cm en 10 cm) samen in. Afdichten met lijm.
    2. Plaats 5 cm slang1 aan het andere uiteinde van slang2.
  3. Voor halsslagader (Tubing1.3): Rek de tubing2 uit om deze dunner te maken. Verbind 8 cm slang1 en 3 cm van de uitgerekte slang2 met lijm (Figuur 2A). Maak een markering op 9 mm van de punt.
  4. Naald met niet-scherp uiteinde dat de slang met de spuit verbindt: Maak een kras in de buurt van het scherpe uiteinde van de naald (23 G) met een metalen vijl, buig deze voorzichtig een paar keer heen en weer met een tang en breek deze. Maak dezelfde snede in het midden van de naald om een stuk metalen connector te maken (Figuur 2A).
  5. Verlengbuis voor de slagader om bloed af te nemen (slangset 1.4): Verbind 10 cm slang1 met de metalen connector en de niet-scherpe naald die in stap 1.4 is gemaakt.
    NOTITIE: Alle slangen en hechtingen worden gesteriliseerd met een autoclaaf of ethyleenoxide

2. Chirurgie

  1. Verdoof een muis met isofluraan (1,5-2,0%) of ketamine/xylazine (ketamine 10 mg/ml, xylazine 1 mg/ml in 0,9% steriele zoutoplossing, 0,1 ml/10 g lichaamsgewicht (LG) via intraperitoneale [ip]-injectie). Houd de muis op de warme pad (37 °C) om fysieke belasting te verminderen. Wacht 5-10 minuten op diepe anesthesie. Bevestig de diepte van de anesthesie door pedaalreflex, ademhaling en hartslag, en reactie op stimuli door teen te knijpen. Tijdens de operatie moet chirurgische tape worden gebruikt om de neuskap aan de operatietafel te bevestigen voor continue inhalatie van anesthesie. Breng oogzalf aan op de ogen om uitdroging onder narcose te voorkomen.
  2. Vul gehepariniseerde zoutoplossing (100 E/ml) in de slang 1.1 en 1.3 en verbind ze met een spuit van 1 ml met een niet-scherpe naald (Figuur 2B). Sluit het uiteinde van de slang3 (zie Materiaaltabel) door deze te smelten met een soldeerbout, die zal worden gebruikt als doppen voor slang1.1 en slang1.3.
  3. Scheer en veeg het eerste (interscapulier op de rug) en tweede (nek aan de voorkant) incisiegebied af met drie cycli van 10% betadine, gevolgd door een preoperatieve bereiding met steriele 70% alcohol. Maak een kleine verticale incisie in de middellijn van 5 mm kopel van het borstbeen, ontleed de weefsels stomp en leg de slagader bloot. Scheid de nervus vagus van de slagader. Dit vermindert de negatieve effecten van het verwijderen van de nervus vagus op het glucosemetabolisme.
    NOTITIE: De stap van de ventrale incisie naar de stap waar de katheter in de ader wordt ingebracht en vastgezet met zijden hechtingen, wordt uitgevoerd onder een microscoop.
  4. Plaats twee zijden hechtingen onder de slagader. Stop de bloedstroom door de ene hechting stevig aan de schedelzijde vast te binden (Figuur 2C-1) en de andere losjes aan de staartzijde (Figuur 2C-2), wat voldoende is om de bloedstroom te stoppen, maar voldoende om later weer te openen. Plaats nog een hechting onder de slagader (Figuur 2C-3).
  5. Knip de slagader bij figuur 2C-1 door met een veerschaar en plaats slang 1.3 in de slagader. Maak een losse band op zowel de slagader als de slang (Figuur 2C-3, niet stevig vastbinden. De slang wordt dieper in de slagader ingebracht). Open de knoop aan de staartzijde (Figuur 2C-2) om de buis in te brengen totdat de 9 mm-markering de knoop in het midden bereikt (Figuur 2C-3). Bind alle ligaturen stevig vast en spoel ze met gehepariniseerde steriele zoutoplossing.
  6. Leg de rechter halsader bloot vanuit dezelfde incisie als de rechter halsslagader voor de halsslagader. Isoleer het craniale uiteinde en maak het vast met zijden hechtdraad (Figuur 2D-1, Tabel met materialen). Plaats nog een stuk hechtdraad aan het caudale uiteinde van de blootliggende ader (Figuur 2D-2). Knip de ader bij de markering Figuur 2D-1 af met een veerschaar.
  7. Breng de katheter in (niet te diep om penetratie van bloedvaten te voorkomen), bind hem vast en bevestig visueel dat hij bloed afmonstert. Spoel met gehepariniseerde steriele zoutoplossing (0,2 ml) en bevestig visueel dat er geen bloed in de katheter achterblijft.
  8. Plaats de muis op het nieuwe steriele chirurgische laken om infectie van de eerste wond te voorkomen. Draai de muis om, veeg af met drie cycli betadine gevolgd door een preoperatieve bereiding met steriele alcohol en maak een kleine incisie tussen de schouderbladen.
  9. Steek een naaldhouder onder de huid van de incisie aan de achterkant naar de ventrale zijde. Klem de katheters vast met de naaldhouder, breng ze onder de huid en breng ze terug. Reinig de incisieplaats en sluit de ventrale incisies af met een synthetische hechting (diameter 0,15-0,2 mm). Klem de veneuze katheter met micro serrefine op de incisieplaats tussen de schouderbladen.
  10. Snijd de katheter 1 cm boven de klem door, spoel deze door met gehepariniseerde zoutoplossing en sluit deze af met een dop (stap 2.4). Volg dezelfde procedure voor de arteriële katheter. Sluit de dorsale incisie met een synthetische hechting (diameter 0,15-0,2 mm).
  11. Plaats de muis in een warme, schone kooi (Figuur 2E). Voer dagelijks postoperatieve zorg uit.

3. Herstel

  1. Zet de muis in één huis, want een andere muis kan in de katheter in de groepshuisvesting bijten.
    1. Om stress door sociaal isolement te verminderen, houdt u muizen met omgevingsverrijkingen (bijv. schuilplaatsen). Voer dagelijks postoperatieve zorg uit. Om pijn, angst en ongemak te verlichten, biedt u postoperatieve zorg, waaronder analgesie (ibuprofen in drinkwater (0,11 mg/ml).
    2. Observeer muizen op tekenen van infectie, zoals etteren, lethargie of pijn op de incisieplaats. De meeste gezonde muizen beginnen ongeveer 2 uur na de operatie te lopen en te eten. Een voorovergebogen houding, een gegolfde vacht en een verminderde voedselinname kunnen wijzen op pijn. Als deze tekenen worden waargenomen, euthanaseer de muizen dan onmiddellijk door ze te onthoofden onder diepe verdoving of verstikking door kooldioxide.
  2. Bloed komt de katheter in de slagader binnen en vormt een stolsel. Om de katheterlijnen te onderhouden, verwijdert u het stolsel dagelijks door stap 3-6 te volgen.
  3. Vul een injectiespuit van 1 ml en een naald van 23 g (niet-scherp uiteinde) met gehepariniseerde zoutoplossing (100 E/ml). Gebruik een inductiekamer om de muis licht te verdoven met isofluraan (1,0%-1,5%). Haal vervolgens de muis uit de kamer en voer stolselverwijdering uit onder isofluraan-anesthesie met een neuskap.
  4. Klem de slang voor de slagader op de achterkant van de muis met micro serrefine, verwijder de dop en verwijder het bloed en de stolsels. Spoel de katheter met gehepariniseerde zoutoplossing met een andere spuit van 1 ml met een naald van 23 G (niet-scherp uiteinde) en sluit deze opnieuw af. Reinig de veneuze lijn zoals de arteriële lijn in het geval van ernstige stolling.
  5. Voer dezelfde procedure uit om de katheter gedurende 3-5 dagen eenmaal per dag schoon te maken.
  6. Controleer het lichaamsgewicht van de muis. Als het lichaamsgewicht vanaf de dag van de operatie met meer dan 10% afneemt, pas dan ondersteunende zorg toe en probeer de normale lichaamsconditiescore te verbeteren en gebruik de muis voor een ander experiment.
    OPMERKING: Het gewichtsverlies van dieren was minder dan 10% in de experimenten in deze studie. Gewichtsverlies heeft een sterke invloed op het systemische glucosemetabolisme. Het wordt dus aanbevolen om te wachten op het herstel van het lichaamsgewicht of om het klemexperiment te verwijderen.

4. Stel het pompsysteem in (voor hypoglykemische klem)

  1. Bereid 1 E/ml insuline in 0,1% BSA-zoutoplossing, 30% glucose in zoutoplossing en gehepariniseerde zoutoplossing.
  2. Meet het lichaamsgewicht van de muis. Bereken het volume voor 1 E/ml insuline om de insuline te laten infuseren (10 mU/kg/min). Injecteer 1,7 μL/min insulineoplossing in de muizen in het klemexperiment. Om 300 μL insuline te laten infuuseren, is het benodigde volume voor 1 E/ml insuline (μL) 2.647 (μL/g) x lichaamsgewicht (g). Een volume van 300 μL insuline-infusaat is voldoende om het klemexperiment op 1 muis af te ronden. Tabel 1 toont een voorbeeld van het toedienen van insuline.
  3. Vul insuline-infusaat en 30% glucose in elke Hamilton-spuit, sluit ze aan op slang 1.2 en plaats de spuit op de spuitpomp (Figuur 3A). Vul elke oplossing in slang 1.2. Vul zoutoplossing in een spuit en slangenset van 1 ml 1.4 (Figuur 2A).
  4. Verdoof de muis met isofluraan (1,0%-1,5%) en sluit slang1.2 aan op de veneuze katheter en slangset1.4 op de arteriële katheter (Figuur 3A). Gebruik cellofaantape om de buisjes bij elkaar te houden.
  5. Plaats de muis in een leeg bekerglas van 500 ml.
    OPMERKING: Gebruik voor hyperglykemische klem zoutoplossing in plaats van 1 E/ml insuline.

5. Hypoglykemische klem

  1. Meet de bloedglucosewaarden elke 5-10 minuten, zoals weergegeven in figuur 3B, en verzamel bloedmonsters voor hormoonmetingen bij -15 min, 10 min, 20 min, 40 min, 60 min, 80 min, 100 min en 120 min. Volg stap 5.2 om de bloedglucose te meten.
    OPMERKING: Het is niet nodig om de bloedglucose op alle tijdstippen te meten, maar het wordt aanbevolen om deze ten minste elke 10 minuten te meten. Meet de bloedglucose elke 5 minuten wanneer het niveau en de glucose-infusiesnelheid niet stabiel zijn.
  2. Klem het bovenste uiteinde van de slangset1.4 vast en sluit een nieuwe spuit aan, zuig 50 μL bloed af en plaats deze in een slang van 1.5 ml om te wassen. Meet de bloedglucosespiegel.
    OPMERKING: Dit is het bloed dat wordt verdund door de zoutoplossing in de buis als gevolg van het wassen van de katheter na de vorige bemonstering. Een volume van 50 μL is voldoende om verdund bloed te vervangen door zuiver bloed.
  3. Bewaar het verdunde bloed (rode bloedcellen). Was het opgehoopte bloed (~500 μL) met zoutoplossing (zie stappen 5.11-5.12) en keer terug naar het lichaam om hypoxie te voorkomen.
  4. De katheter is aangesloten op de slagader met hoge bloeddruk, dus wanneer de klem wordt losgemaakt, stroomt het bloed naar buiten en wordt het gebruikt om glucose te meten met een handige glucosemeter. Laat 50 μL zoutoplossing trekken om voldoende bloedvocht vast te houden.
  5. Voor bloedafname neemt u nog eens 50 μl bloed af en plaatst u dit in een buisje van 1,5 ml op ijs. Voeg 100 μl (50 μl vervanging + 50 μl bemonstering) zoutoplossing toe.
  6. Start na 0 minuten bloedglucosemeting de insulinespuitpomp. Injecteer eerst 30 mU/kg/min in een bolus gedurende 2 minuten (5,1 μl/min) en vervolgens 10 mU/kg/min (1,7 μl/min) infusie voor de rest van de duur.
  7. Meet de bloedglucosespiegel en verander de glucose-infusiesnelheid elke 5-10 minuten gedurende 120 minuten.
  8. Creëer een stabiele toestand waarin de glucose-infusiesnelheid niet verandert en de bloedglucosespiegel 50 mg/dL is.
  9. Na het verzamelen van het bloedmonster bij t = 120 min, inbrengen van een euthanasiemiddel in de halsader en weefsels verzamelen voor RNA- of eiwitanalyse.
  10. Centrifugeer bloed op 1000 x g gedurende 5 minuten en meet de hormoonconcentratie zoals insuline of c-peptide met behulp van een ELISA-kit volgens het protocol van de fabrikant.
  11. Voor het wassen van bloed, centrifugeer het bloed op 1000 x g gedurende 3 minuten. Verwijder het supernatant, voeg 500 μL gehepariniseerde zoutoplossing toe en pipetter.
  12. Herhaal de wasbeurt opnieuw en plaats de gewassen rode bloedcellen in een spuit van 1 ml voor de slagader. De bloedcellen worden automatisch opnieuw geïnfundeerd wanneer 50 of 100 μL zoutoplossing wordt toegediend in stap 5.2 en 5.3. Houd de hematocriet zorgvuldig in de gaten om hypoxie te voorkomen.
    OPMERKING: Voor het meten van de bloedglucose werd een in de handel verkrijgbare handige glucosemeter gebruikt.

6. Hyperglycemische klem

  1. Volg de stappen als de hypoglykemische klemtechniek, maar zonder insuline-infusie en met een bloedglucose aangepast aan 250-300 mg/dL. Meet de bloedglucosewaarden elke 5-10 minuten, zoals weergegeven in figuur 3B, en verzamel bloedmonsters voor hormoonmetingen bij -15 min, 10 min, 20 min, 40 min, 60 min, 80 min, 100 min en 120 min.
  2. Sluit een nieuwe spuit aan op de slangenset1.4, neem 50 μl bloed af en plaats deze in een slang van 1,5 ml om te wassen.
  3. Voor bloedafname neemt u nog eens 50 μl bloed af en plaatst u dit in een buisje van 1,5 ml op ijs. Voeg 100 μl (50 μl vervanging + 50 μl bemonstering) zoutoplossing toe.
  4. Start na 0 minuten bloedglucosemeting de glucosespuitpomp. Injecteer eerst 30 g/kg/min in de bolus gedurende 2 minuten (5,1 μl/min) en vervolgens 10 g/kg/min (1,7 μl/min) gedurende de rest van de duur.
  5. Meet de bloedglucosespiegel en verander de glucose-infusiesnelheid elke 5 -10 minuten gedurende 120 minuten. Creëer een stabiele toestand waarin de glucose-infusiesnelheid niet verandert en de bloedglucosespiegel 250-300 mg/dL is, een geklemde hyperglykemische toestand.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De hypoglykemische klemstudie werd uitgevoerd bij mannelijke C57BL/6N-muizen (8 weken oud, meer dan 25 g lichaamsgewicht) 3 uur nuchter aan het begin van het experiment (Figuur 4A,B). De aanvankelijke bloedglucosespiegel was 136 mg/dl (t = -15 min). Als het minder dan 90 mg/dL is, kan het zijn dat de operatie niet goed is verlopen, of dat de arteriële katheter te diep is ingebracht of dat er bloedstolsels in de bloedstroom zijn terechtgekomen. De conditie van de muis na de o...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De hier beschreven methode is een eenvoudige methode die kan worden uitgevoerd met pipetpunten, spuiten en andere items die in gewone laboratoria worden aangetroffen. Hoewel onderzoekers mogelijk extra slangen en pompen moeten aanschaffen, is dure apparatuur niet nodig. Dit protocol van katheterisatie en klemming is dus gemakkelijker te starten in vergelijking met eerdere rapporten 12,13,14.

De klemte...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat er geen tegenstrijdige belangen zijn.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door het Leading Initiative for Excellent Young Researchers (van MEXT); een subsidie voor wetenschappelijk onderzoek (B) (subsidienummer JP21H02352); Japans Agentschap voor Medisch Onderzoek en Ontwikkeling (AMED-RPIME, subsidienummer JP21gm6510009h0001, JP22gm6510009h9901); de Uehara Memorial Foundation; Astellas Stichting voor Onderzoek naar Stofwisselingsziekten; Suzuken Memorial Foundation, Akiyama Life Science Foundation en Narishige Neuroscience Research Foundation. We danken ook Nur Farehan Asgar, Ph.D, voor het redigeren van een concept van dit manuscript.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Kleverige lijmHenkel AG & Co. KGaALOCTITE 454
ELISA kit (C-peptide)Morinaga Institute of Bilogical Science IncM1304Mouse C-peptide ELISA Kit
ELISA kit (insuline)FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation633-03411LBIS Mouse Insulin ELISA Kit (U-type)
Handige glucosemeterNipro Co.11-777Free Style Freedom Lite
Insuline (100U/ml)Eli Lilly & Co.428021014Humulin R (100U/ml)
MuisJapan SLC Inc.C57BL/6NCrSlcC57BL
HechtdraadNatsume seisakushoC-23S-560 No.2Gesteriliseerd
SpuitpompPump Systems Inc.NE-1000
Kunststof hechtdraadVÖMELHR-17
Slang1AS ONE Corporation9-869-01LABORAN(R) Siliconenbuis
Slang2Fisher Scientific427400BD Intramedic PE-buis
Slang3IGARASHI IKA KOGYO CO., LTD.size5Polyethyleen buis size5

Referenties

  1. Seaquist, E. R., et al. Hypoglycemia and diabetes: A report of a workgroup of the american diabetes association and the endocrine society. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 98 (5), 1845-1859 (2013).
  2. Amiel, S. A., et al. Hypoglycaemia, cardiovascular disease, and mortality in diabetes: epidemiology, pathogenesis, and management. The Lancet Diabetes and Endocrinology. 7 (5), 385-396 (2019).
  3. Leanne Riley Mean fasting blood glucose. , World Health Organisation. https://www.who.int/data/gho/indicator-metadata-registry/imr-details/2380 (2022).
  4. Umpierrez, G., Korytkowski, M. Diabetic emergencies-ketoacidosis, hyperglycaemic hyperosmolar state and hypoglycaemia. Nature Reviews Endocrinology. 12 (4), 222-232 (2016).
  5. Sprague, J. E., Arbeláez, A. M. Glucose counterregulatory responses to hypoglycemia. Pediatric Endocrinology Reviews. 9 (1), 463-473 (2011).
  6. Toda, C., et al. Distinct effects of leptin and a melanocortin receptor agonist injected into medial hypothalamic nuclei on glucose uptake in peripheral tissues. Diabetes. 58 (12), 2757-2765 (2009).
  7. Toda, C., et al. Extracellular signal-regulated kinase in the ventromedial hypothalamus mediates leptin-Induced glucose uptake in red-type skeletal muscle. Diabetes. 62 (7), 2295-2307 (2013).
  8. Toda, C., Kim, J. D., Impellizzeri, D., Cuzzocrea, S., Liu, Z. -W., Diano, S. UCP2 regulates mitochondrial fission and ventromedial nucleus control of glucose responsiveness. Cell. 164 (5), 872-883 (2016).
  9. Lee, M. L., et al. Prostaglandin in the ventromedial hypothalamus regulates peripheral glucose metabolism. Nature Communications. 12 (1), 2330(2021).
  10. Jessen, N., Goodyear, L. J. Contraction signaling to glucose transport in skeletal muscle. Journal of Applied Physiology. 99 (1), 330-337 (2005).
  11. Shiuchi, T., et al. Induction of glucose uptake in skeletal muscle by central leptin is mediated by muscle β2-adrenergic receptor but not by AMPK. Scientific Reports. 7 (1), 15141(2017).
  12. Ayala, J. E., et al. Hyperinsulinemic-euglycemic clamps in conscious, unrestrained mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 57, e3188(2011).
  13. Hughey, C. C., Hittel, D. S., Johnsen, V. L., Shearer, J. Hyperinsulinemic-euglycemic clamp in the conscious rat. Journal of Visualized Experiments: JoVE. 48, e2432(2010).
  14. Ayala, J. E., Bracy, D. P., McGuinness, O. P., Wasserman, D. H. Considerations in the design of hyperinsulinemic-euglycemic clamps in the conscious mouse. Diabetes. 55 (2), 390-397 (2006).
  15. DeFronzo, R. A., Soman, V., Sherwin, R. S., Hendler, R., Felig, P. Insulin binding to monocytes and insulin action in human obesity, starvation, and refeeding. Journal of Clinical Investigation. 62 (1), 204-213 (1978).
  16. Czech, M. P. Insulin action and resistance in obesity and type 2 diabetes. Nature Medicine. 23 (7), 804-814 (2017).
  17. Saisho, Y. β-cell dysfunction: Its critical role in prevention and management of type 2 diabetes. World Journal of Diabetes. 6 (1), 109(2015).
  18. Mittendorfer, B., Patterson, B. W., Smith, G. I., Yoshino, M., Klein, S. β Cell function and plasma insulin clearance in people with obesity and different glycemic status. Journal of Clinical Investigation. 132 (3), 154068(2022).
  19. Nchienzia, H., et al. Hedgehog interacting protein (Hhip) regulates insulin secretion in mice fed high fat diets. Scientific reports. 9 (1), 11183(2019).
  20. Tomita, T., Doull, V., Pollock, H. G., Krizsan, D. Pancreatic islets of obese hyperglycemic mice (ob/ob). Pancreas. 7 (3), 367-375 (1992).
  21. Uchida, K., et al. Lack of TRPM2 impaired insulin secretion and glucose metabolisms in mice. Diabetes. 60 (1), 119-126 (2011).
  22. Zhu, Y. X., Zhou, Y. C., Zhang, Y., Sun, P., Chang, X. A., Han, X. Protocol for in vivo and ex vivo assessments of glucose-stimulated insulin secretion in mouse islet β cells. STAR Protocols. 2 (3), 100728(2021).
  23. Moullé, V. S. Autonomic control of pancreatic beta cells: What is known on the regulation of insulin secretion and beta-cell proliferation in rodents and humans. Peptides. 148, 170709(2022).
  24. Honzawa, N., Fujimoto, K., Kitamura, T. Cell autonomous dysfunction and insulin resistance in pancreatic α cells. International Journal of Molecular Sciences. 20 (15), 3699(2019).
  25. Siddiqui, A., Madhu, S. V., Sharma, S. B., Desai, N. G. Endocrine stress responses and risk of type 2 diabetes mellitus. Stress. 18 (5), 498-506 (2015).
  26. Chan, O., Sherwin, R. Influence of VMH fuel sensing on hypoglycemic responses. Trends in Endocrinology & Metabolism. 24 (12), 616-624 (2013).
  27. Donovan, C. M., Watts, A. G. Peripheral and central glucose sensing in hypoglycemic detection. Physiology. 29 (5), 314-324 (2014).
  28. TeSlaa, T., et al. The source of glycolytic intermediates in mammalian tissues. Cell Metabolism. 33 (2), 367-378.e5 (2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Bloedglucose-regulatieinsulinegevoeligheidtegenregulatieve responsenglucose-infusiejugulaire venecatheterarteria carotis-catheterglucosemetabolisme
Hyperglykemische klem en hypoglykemische klem bij bewuste muizen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.