Methodenartikel

De novo lipiden traceren met behulp van stabiele isotopenetikettering LC-TIMS-TOF MS/MS

2.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65590

⸱

23 augustus 2024

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Deparment of Chemistry and Biochemistry, Florida International University, 2Bruker Daltonics Inc., 3Institute of Parasitology, Biology Centre CAS, 4Department of Biological Sciences, Florida International University, 5Department of Parasitology, University of South Bohemia, 6Biomolecular Sciences Institute, Florida International University

In dit artikel

Samenvatting

Hier wordt een methode gepresenteerd voor het screenen van lipidestructuren door middel van stabiele isotopenlabeling door gebruik te maken van hun retentietijd, mobiliteit en fragmentatie.

Samenvatting

Lipiden zijn zeer divers en kleine veranderingen in lipidestructuren en -samenstelling kunnen ingrijpende effecten hebben op kritieke biologische functies. Stabiele isotopenetikettering (SIL) biedt verschillende voordelen voor de studie van lipidedistributie, mobilisatie en metabolisme, evenals de novo lipidensynthese. De succesvolle implementatie van de SIL-techniek vereist het verwijderen van interferenties van endogene moleculen. In dit werk beschrijven we een high-throughput analytisch protocol voor de screening van SIL-lipiden uit biologische monsters; Er zullen voorbeelden worden getoond van lipide de novo identificatie tijdens de ontwikkeling van de eierstokken van muggen. Het gebruik van complementaire vloeistofchromatografie, spectrometrie van ingesloten ionenmobiliteit en massaspectrometrie maakt de scheiding en toewijzing van lipiden van een enkel monster in een enkele scan (<1 uur) mogelijk. De beschreven aanpak maakt gebruik van recente ontwikkelingen op het gebied van data-afhankelijke acquisitie en data-onafhankelijke acquisitie, waarbij gebruik wordt gemaakt van parallelle accumulatie in de mobiliteitsval, gevolgd door sequentiële fragmentatie en botsing-geïnduceerde dissociatie. De meting van SIL op het niveau van de vetzuurketen onthult veranderingen in de lipidendynamiek tijdens de eierstokontwikkeling van muggen. De lipiden de novo-structuren worden met vertrouwen toegewezen op basis van hun retentietijd, mobiliteit en fragmentatiepatroon.

Inleiding

Bij het analyseren van lipidegegevens is stabiele isotopenetikettering (SIL) een effectieve methode om metabole routes in levende organismen te beoordelen. Bij deze methode worden atomen in een analyt vervangen door stabiele isotopen die 13C of 2H bevatten. Deze isotopen worden verder opgenomen in voorlopers, die later worden ingebed in de vetzuren en de gebieden waarin ze zich bevinden labelen. Met deze isotopen is men in staat om de distributie en het metabolisme van lipiden te identificeren, omdat ze contrasteren met de niet-gelabelde achtergrond1. Gewone massaspectrometrieplatforms zijn niet in staat om het signaal te onderscheiden dat afkomstig is van endogene moleculen2. Het succes van SIL vereist het gebruik van analytische tools met ultrahoge resolutie. Vloeistofchromatografie gekoppeld aan hoge-resolutie ingesloten ionenmobiliteit spectrometrie-parallelle accumulatie, sequentiële fragmentatie-time-of-flight, tandem massaspectrometrie (LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS) maakt de scheiding mogelijk van gelabelde en niet-gelabelde soorten2. Het voordeel van LC-TIMS-PASEF-TOF-MS/MS-analyse is dat het MS-signaal kan worden gefilterd op basis van de retentietijd (RT) en mobiliteit, waardoor mogelijke interferenties van endogene moleculen worden verminderd, evenals kwantificering en scheiding van alle gewenste species2. Bij TIMS wordt een ion eerst stationair gehouden tegen een gasmobiele fase en vervolgens vrijgegeven op basis van zijn mobiliteit. Dit zorgt voor mobilogrammen met een hoge resolutie terwijl ze op een lagere spanning werken dan eerdere IMS-instrumentatie3. Mobilogrammen zijn grafieken van massa tot lading versus drifttijd die kunnen worden gebruikt om onderscheid te maken tussen verbindingen op basis van hun drifttijd en de mate van overlap4.

Door gebruik te maken van een extra PASEF-techniek wordt de sequencingsnelheid sterk verhoogd zonder dat dit ten koste gaat van de gevoeligheid5. De PASEF-theorie gaat uit van de accumulatie van ionen, gevolgd door hun opeenvolgende afgifte in de volgorde van hun mobiliteit. Dit wordt gedaan door ionen te accumuleren in parallelle uitlijning met hun mobiliteit. De accumulatie op deze manier voorkomt ionenverlies. Bovendien vindt de selectie van de voorloperionen gelijktijdig plaats met de accumulatie en afgifte van de ionen. Met deze methode selecteert PASEF tijdens elke TIMS-scan meerdere voorlopers in serie, in plaats van de individuele voorlopers per scan die typisch zijn voor een TIMS-instrument dat geen PASEF gebruikt. Wanneer de voorloperionen gelijktijdig worden geaccumuleerd en vrijgegeven in pieken van 2 ms binnen een TIMS-scan van ongeveer 100 ms per frame, wordt het signaal met meer dan één orde van grootte versterkt, waardoor de signaal-ruisverhouding3 toeneemt. De PASEF-toevoeging aan het TIMS verhoogt de efficiëntie van de MS/MS. Omdat de TIMS-PASEF gekoppeld is aan MS/MS, is een efficiëntere fragmentatie mogelijk. In tegenstelling tot conventionele MS/MS-detectie, wordt het voorlopersignaal gecomprimeerd van de TIMS-PASEF en worden de fragmentionen tegelijkertijd gedetecteerd naar de TIMS-elutietijd en ionenmobiliteitspositie van de voorloper3.

Bij het verkrijgen van gegevens van een massaspectrometer zijn er opties in de gewenste scanmodus. Data-afhankelijke acquisitie (DDA) selecteert voorloperionen uit de MS1-scan op basis van hun overvloed, voordat ze worden gefragmenteerd en de MS2-scan wordt uitgevoerd. Deze scanmodus fragmenteert zoveel mogelijk voorlopers. De DDA-aanpak is doelgericht en de resultaten zullen afhangen van de ionenselectie3. DDA-PASEF heeft echter vaak problemen met de reproduceerbaarheid tussen replicaten. Hoewel DDA een geweldig hulpmiddel is in een gerichte analyse, hebben complexe mengsels meer moeite met het verzamelen van gegevens6. Dit komt omdat slechts een kleine hoeveelheid ionen tegelijkertijd kan worden gecontroleerd3. Gegevensonafhankelijke acquisitie (DIA) is een methode waarbij vooraf geselecteerde vensters van m/z onafhankelijk van hun intensiteit worden gefragmenteerd en allemaal worden gescand binnen het bereik7. Met deze scanmodus worden volledige ionenwolken verzonden van het IMS naar de massaspectrometer3. In proteomics-studies leidt dit ertoe dat grotere hoeveelheden eiwitten in een kortere tijdspanne worden gekwantificeerd in vergelijking met DDA. Daarnaast mist DIA minder m/z waarden in vergelijking met DDA. Daarom heeft dit alternatief grote verbeteringen laten zien in de reproduceerbaarheid van gegevens in signaal-ruisverhouding en een betere kwantificering dan DDA. In dit huidige werk is ons doel om DIA te implementeren volgens de methode gerapporteerd door Tose et al.2. We verbeterden de reproduceerbaarheid en intensiteit van signalen, wat meer en meer overtuigende informatie opleverde over de mobilisatie, distributie en het metabolisme van SIL-lipiden in biologische monsters door gebruik te maken van DDA- en DIA-acquisitie.

Protocol

1. Voorbereiding van het monster

  1. Dissectie van insecten
    1. Ontleed de eierstokken van Aedes aegypti-muggen als ze 7 dagen oud zijn in een met fosfaat gebufferde zoutoplossing met behulp van micronaalden.
    2. Verzamel acht eierstokken uit een met fosfaat gebufferde zoutoplossing met behulp van micronaalden en bewaar ze in microcentrifugebuisjes van 1,5 ml bij -80 °C.
    3. Verzamel eierstokken in biologische replicaten.
  2. Extractie van lipiden
    1. Voeg 10 μL interne standaard (ISTD) toe aan de acht verzamelde eierstokken in een concentratie van 1 ppm. De ISTD is een gelabeld lipidenmengsel met zeven deuterium van 1-pentadecanoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine-D7 (15:15:) 0-18:1 (D7) PC), lysofosfatidylcholine-D7 (18:1 (D7) Lyso PC), 1-pentadecanoyl-2-octadecenoyl-glycero-3-fosfoethanolamine-D7 (15:0-18:1 (D7) PE), 1-oleoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-D7 (18:1 (D7) Lyso PE), 1-pentadecanoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfoinositol-D7 (15:0-18:1 (D7) PI), 1-pentadecanoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfo-L-serine-D7 ( 15:0-18:1 (D7) PS), 1,2-dipentadecanoyl-3-octadecenoyl-sn-glycerol (15:0-18:1-15:0 (D7) TAG), 1-pentadecanoyl-2-octadecenoyl)-sn-glycerol-D7 (15:0-18:1 (D7) DAG), 2-octadecenoyl-sn-glycerol-D7 (18:1 MAG (D7)), cholesteryloleaat-D7 (18:1 (D7) chol ester).
    2. Wacht tot het droog is bij kamertemperatuur. Voeg 100 μl butanol/methanol en 3 μl butylhydroxytolueen toe. Homogeniseer handmatig gedurende 10 s met 1,5 ml polypropyleen stampers.
    3. Spoel de stamper af met 200 μL butanol/methanol en meng met de gehomogeniseerde oplossing.
    4. Sonificeer de microcentrifugebuis bij kamertemperatuur en gemiddeld vermogen gedurende 30 minuten.
    5. Centrifugebuisjes bij 1600 x g gedurende 10 minuten bij 20 °C. Breng het supernatans over in een injectieflacon met autosampler met 300 μl silanized glazen inzetstukken.

2. Instrument instellen

  1. Voorbereiding van de mobiele fase
    1. Bereid de mobiele fase voor met een samenstelling van 30:40:30 (mobiele fase A) en 10:5:85 (mobiele fase B) met acetonitril, water en isopropanol als respectievelijke verhouding. Voeg in beide mobiele fasen 10 mmol/L ammoniumformiaat toe in water en 0,1% mierenzuur om een buffertoestand te creëren.
    2. Weeg 3,15 g ammoniumformiaat af in 10 ml water. Voeg 500 μL van deze oplossing toe aan 12,5 ml water. Doe achtereenvolgens in een maatkolf van 250 ml en vul met isopropanol tot ongeveer 2/3 van de kolf. Meng door te wervelen.
    3. Voeg 250 μL mierenzuur (85%) toe, vul met 25 ml acetonitril en isopropanol aan de vullijn van 250 ml en meng.
  2. In het MS-systeem, aan de linkerkant van het scherm bij MS-instellingen, bepaalt u het massabereik door 50 als minimum en 1850 als maximale scaninstelling te selecteren.
    1. Selecteer Polariteit als positieve ionenmodus. Selecteer de scanmodus als DIA-PASEF. Selecteer hiervoor Tune and open analysis method van een eerdere DDA-methode met de volgende LC-parameters.
      1. Voor gradiëntscheiding:
        Monsterinjectie: 0% B, houdtijd 1 min.
        Verhoog tot 55% B, houd vast tot 6,4 min.
        Verhoog tot 65% B, houd vast tot 24 min.
        Verhoog tot 88% B, houd vast tot 40,8 min.
        Verhoog tot 95% B, houd vast tot 48,1 min.
        Verlaag tot 35% B, houd vast tot 56 min.
        Verlaag tot 0% B, houd vast tot 60 min.
      2. Voor HPLC-omstandigheden:
        Injectievolume: 5 μL
        Snelheid oplosmiddel: 0,25 ml/min
        Totale looptijd: 60 min, waarin 5 min de kolom moet worden voorgeconditioneerd.
      3. Bereid de vloeistofchromatograaf voor door de kolom in de vloeistofchromatograaf te plaatsen. Voer een blanco uit om de kolom schoon te maken en te testen op lekken. Dit is te zien aan het feit dat het instrument geen druk of stroming vasthoudt.
  3. Als u een nieuwe methode wilt maken, voert u de onderstaande stappen uit (Figuur 1 en Figuur 2).
    1. Open de software en klik op Alle instrumenten verbinden. Als de verbinding tot stand is gebracht, piept het LC-systeem één keer en wordt HyStar op het bedieningsscherm zonder foutmeldingen in het statusvak weergegeven.
    2. Klik op het tabblad Acquisitie . Zoek in de Sample Table Navigator het vervolgkeuzemenu tag en selecteer een eerdere methode.
    3. Verdubbel de nieuwste voorbeeldtabel. Klik op Opslaan als... en sla een nieuwe voorbeeldlijst op met het formaat: YYYYMMDD_LIP_C30_(XXXX) waarbij (XXXX) een korte descriptor van de analyse is.
    4. Klik met de rechtermuisknop op de scheidingsmethode en klik op Methode bewerken. Klik op Modulemethode bewerken.
    5. Klik op Downloaden. Als dit is gelukt, verschijnt Downloaden geslaagd. Sluit het scherm zonder opslagmethode.
    6. Ga onder MS-instellingen naar TIMS-instellingen, selecteer de 1/k0 start bij 0.70 en 1/k0 eindigt bij 1.85. Stel de aanlooptijd in op 150 ms. Hiermee worden de inschakelduur en aanloopsnelheid automatisch aangepast.
    7. Selecteer in het onderste venster het tabblad Bron . Selecteer het brontype als ESI en stel de offset van de eindplaat in op 800 V en het capillair op 4500 V. Controleer de doos van de vernevelaar en stel de druk in op 4.0 bar. Stel het droge gas in op 4,0 l/min en de droge temperatuur op 250 °C.
    8. Selecteer rechts van het tabblad Bron het tabblad Afstemmen. Klik op het tabblad Algemene sub en zorg onder het kopje overdracht voor de volgende parameters:
      Doorbuiging 1 delta: 70 V
      Trechter 1 RF: 250 vpp
      isCID-energie: 0 eV
      Trechter 2 RF: 250 vpp
      Meerpolige RF: 500 vpp.
      1. Zorg onder de kop van de botsingscel voor de volgende parameters:
        Botsingsenergie: 6,0 eV
        Botsing RF: 1200 vpp.
      2. Zorg onder de rubriek quadrupool voor de volgende parameters:
        Ionenenergie: 6 eV
        Lage massa: 250 m/z.
      3. Zorg onder het tabblad focus pre-TOF voor de volgende parameters:
        Overdrachtstijd: 45 μs
        Opslag vóór de puls: 5,0 μs.
    9. Klik op het tabblad Verwerkingssub . Onder massaspectra zorgt piekdetectie voor de volgende parameters:
      Absolute drempel: 667
      Absolute drempel (per 100 ms AccuTime): 445.
      1. Let bij detectie van mobiliteitspieken op de volgende parameters:
        Absolute drempel: 30,00.
    10. Klik op het subtabblad TIMS . Zorg onder het tabblad Compensaties voor de volgende parameters:
      Δt1: -20 V
      Δt2: -150 V
      Δt3: 70 V
      Δt4: 150 V
      Δt5: 0 V
      Δt6: 150 V
      Botsingscel: 300 V.
    11. Klik rechts van het tabblad Tune op het tabblad MS/MS . Zorg onder het tabblad voorloperionen voor de volgende parameters:
      Aantal PASEF-hellingen: 8
      Minimale kosten: 1
      Laad maximaal op:1.
      1. Klik onder het tabblad planning op Geavanceerd en zorg voor de volgende parameters:
        Intensiteiten: 0,1500, 5000, 10000
        Herhaling: 1, 10, 5, 1
        Intensiteit drempel: 1500.
      2. Zorg onder het tabblad actieve uitsluiting voor de volgende parameters:
        Actief uitsluitingsvinkje
        Loslaten na: 0,4 min.
      3. Bij botsingsenergie-instellingen zorgen ze voor de volgende parameters:
        K0 (V-s/cm3): 0,70, 1,60
        Botsingsenergie (eV): 20.00, 35.00 uur.
      4. Bij de afzondering zorgen de breedte-instellingen voor de volgende parameters:
        Massa (m/z): 622, 1222
        Breedte (m/z): 1.00 2.50.
    12. DIA -PASEF instellen: Selecteer DIA-PASEF in de scanmodus voor MS-instellingen aan de linkerkant. Selecteer op het tabblad MS/MS de optie Venstereditor. Zorg hier voor de volgende parameters (Figuur 3):
      Vensterinstellingen: Massabreedte: 50 Da; Massa overlapping: 0,0 Da; Berekenen op basis van veelhoek: massastappen; Aantal mobiliteitsvensters: 1.

3. Kalibratie

  1. Kalibratie van het instrument (Figuur 4)
    1. Klik onder het subtabblad Kalibratie op m/z, selecteer Tuning Mix in de vervolgkeuzelijst en klik op Kalibreren in de rechterbenedenhoek.
    2. Blijf op Kalibreren klikken totdat een score van 100% is bereikt.
    3. Selecteer nu het tabblad Mobiliteit en volg dezelfde stappen als hierboven totdat de kalibratiescore van 100% is bereikt.
  2. Kalibratiekromme
    1. Spike lipide intern standaardmengsel met 10 μL gedeutereerd intern standaardmengsel.
      Gebruik zeven kalibratiepunten van 0,1-500 ng/ml standaardmengsel met 10 μl van het gedeutereerde interne standaardmengsel.
    2. Handmatig annoteren van de vetzuurketens op basis van de PASEF MS/MS-patronen die al zijn beschreven in2.
  3. Efficiëntie van SIL-etikettering
    1. Bereken de verhouding tussen de oppervlakte van de SIL-bevattende isotopen en de oppervlakte van de niet-SIL-bevattende isotopen.
    2. Bereken het theoretische patroon door de kans te bepalen dat een gelabeld atoom op een willekeurige plaats wordt gevonden.
    3. Bereken de SIL-verrijking door de experimentele isotopenprofielen aan te passen aan het theoretische patroon dat is gesimuleerd met behulp van gegevensanalysesoftware.
  4. Starten van de run
    1. Activeer kolomoven door op de knop Thermometer te klikken. Activeer pompen door op de Valve-knop te klikken.
    2. Stel de MS-methode in op de eerder opgeslagen methode. Controleer of het injectievolume 5 μl is en of lijn 1 zich richt op injectieflacon 20:1.
    3. Zorg ervoor dat de injectieflacon 20:1 50% IPA/ACN bevat. Voorbeeldlijst opslaan.
    4. Start de sequentie en controleer of de injectie is geslaagd (dit wordt bevestigd door een bericht dat op het systeem wordt weergegeven met de melding dat de injectie is uitgevoerd).
    5. Kopieer regel 1 en plak hieronder om een nieuwe regel te genereren. Vul lijn 2 met monsters, afhankelijk van het huidige experiment. Zorg ervoor dat de juiste positie in de autosampler wordt gebruikt.
    6. Als de mobiele fase vers is, voer dan eerst een piekvormtest uit door de lipidenmengselstandaarden van de fabrikant te injecteren. Vergelijk met eerdere resultaten. 2 De standaarden zijn een lipidenmengsel van 1-pentadecanoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (15:0-18:1 PC), lysofosfatidylcholine (18:1 Lyso PC), 1-pentadecanoyl-2-octadecenoyl-glycero-3-fosfoethanolamine (15:0-18:1 PE), 1-oleoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-fosfoethanolamine (18:1 Lyso PE), 1-pentadecanoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfoinositol (15:0-18:1 PI), 1-pentadecanoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfo-L-serine (15:0-18:1 PS), 1,2- dipentadecanoyl-3-octadecenoyl-sn-glycerol (15:0-18:1-15:0 TAG), 1-pentadecanoyl-2-octadecenoyl)-sn-glycerol (15:0-18:1 DAG), 2-octadecenoyl-sn-glycerol (18:1 MAG), cholesteryloleaat (18:1 Chol Ester).
    7. Zorg ervoor dat nieuwe lijnen de juiste scheidingsmethode hebben en niet de preconditioneringsmethode die in lijn 1 wordt gebruikt. Zorg ervoor dat de MS-methode correct is (de methode van de huidige dag).
    8. Controleer of de juiste verwerkingsmethode is geladen en of het geautomatiseerde proces uitvoeren is ingeschakeld.
    9. Sla de voorbeeldlijst op om ervoor te zorgen dat voorbeelden worden geanalyseerd nadat de huidige uitvoering is voltooid.

4. Gegevensanalyse

  1. Software voor open data-analyse (Figuur 5). Klik in de linkerbovenhoek op de knop Bestand en selecteer Openen...
  2. Selecteer de bestanden naar keuze. Klik met de rechtermuisknop op de bestandsnaam en selecteer Eigenschappen.
    1. Selecteer Kalibratiestatus (Afbeelding 6). Selecteer in de vervolgkeuzelijst de optie Eerste kalibratie voor de massaspectrometer. Zorg ervoor dat alle fouten kleiner zijn dan 1 ppm.
    2. Selecteer vervolgens Initial Mobility Calibration (Initiële mobiliteitskalibratie ) en bevestig dat de fout minder dan 1 ppm is.
    3. Klik met de rechtermuisknop op Chromatogram en selecteer Chromatogram bewerken (Figuur 6C). Klik bij Type op de vervolgkeuzelijst en selecteer Geëxtraheerde ionenchromatogram (Afbeelding 6D). Selecteer onder filter de optie Alle MS en selecteer in de scanmodus Alles. Dit is om de pieken voor het molecuul van belang te bekijken in plaats van alleen de fragmenten.
      1. Daaronder zijn er twee filteropties voor molecuulselectie: Massa's of Formule. Als Massa's is geselecteerd, kan men de theoretische m/z van de moleculen van belang kiezen. Selecteer in dit geval 829,7985 m/z. Als Formule is geselecteerd, kan men de formule voor het molecuul kiezen, evenals de ionenvormen die van belang zijn voor het chromatogram. Selecteer in dit geval ammonium [M+NH4]. Dit komt door de ammoniumbuffer in de mobiele fase die ionisatie in deze ionenvorm bevordert (Figuur 7).
      2. Selecteer bij breedte ±1. Zorg er voor polariteit voor dat deze de positieve modus behoudt. Selecteer onder Mobiliteit de optie 1.455-1.465. Dit wordt gedaan om moleculen die niet binnen deze waarden vallen eruit te filteren en het betreffende molecuul te isoleren.
  3. Zodra de parameters zijn geselecteerd, klikt u rechtsboven op Toevoegen > OK . Na korte tijd zal de software de selecties verwerken en een chromatogram uitvoeren.
  4. Klik met de rechtermuisknop op de basislijn aan het begin van de piek van interesse en sleep terwijl u deze vasthoudt tot het einde van de piek. Deze handmatige integratie zorgt voor een live massaspectrum van fragmenten binnen die retentietijd.
  5. Mobilogram
    1. Klik met de rechtermuisknop aan de linkerkant van het scherm op Mobilogram en selecteer Mobilogram bewerken (Figuur 8). Er verschijnt een venster met de naam Mobilogramsporen bewerken. Volg dezelfde stappen C.e.i.1 tot en met C.e.i.5 (Figuur 9).
    2. Voer bij Retentietijd de retentietijd van de piek van interesse in. In dit geval 37,45-37,55 min.
    3. Nadat de parameters zijn geselecteerd, klikt u rechtsboven op Toevoegen > OK . Na korte tijd zal de software de selecties verwerken en een chromatogram uitvoeren.
  6. Voor geëxtraheerde ionen wordt de stappen 4.2.3.1-4.3.2.2 herhaald totdat een lijst met ionen is gevormd.
  7. Selecteer onder aan het MS-venster de optie Profile MS en Fragment MS. Dit maakt een spectrumweergave van ionen van volledige scan en PASEF mogelijk.
    1. Klik in de spectrumweergave met de rechtermuisknop en selecteer Samengestelde spectra kopiëren. Met de spectrumgegevens die aan de rechterkant verschijnen, kan men meer informatie vinden over iemands verbinding, zoals resolutieoplossend vermogen, intensiteit en signaal-ruisverhouding (S/N; Figuur 10).
  8. Verwerking
    1. Om de gegevens te verwerken, integreert u handmatig het chromatogram en de mobiliteitspieken om waardevolle informatie over het betreffende molecuul te verkrijgen (Figuur 10).
    2. Klik met de rechtermuisknop op Zoeken en selecteer Alleen chromatogram of mobilogram integreren (Afbeelding 11). Klik met de linkermuisknop en markeer de gewenste piek. Deze informatie omvat retentietijd, gebied, S/N en mobiliteit.

Resultaten

De stabiele isotoopetikettering vergemakkelijkt de visualisatie van triglyceriden in lipidedynamiekstudies van eierstokken van vrouwelijke muggen. In het 2D-mobiliteitsdomein wordt het triglyceride 48:1 weergegeven in een gebied met een specifieke retentietijd ten opzichte van mobiliteit 1/K0. De intensiteit van de triglyceriden kan worden gevisualiseerd door een donkerdere blauwe lijn. Andere vlekken vertegenwoordigen extra triglyceriden die in de eierstok worden aangetroffen. De retentietijden en mobiliteit variëren als gevolg van de verschillen in massa's en structuren, en verschijnen daarom in verschillende delen van de grafiek. Deze verschillen zijn essentieel bij het onderscheiden van triglyceriden in een monster (Figuur 12A,B). De versterkte massaspectrumprojectie van het gebied vertoont een triglyceridenion van 48:1 gekoppeld aan een ammoniumion bij 822 m/z. Andere triglyceriden, zoals 50:2 en 52:3, worden ook gevisualiseerd, maar in hogere m/z-gebieden vanwege de verschillen in structuur, grootte en fragmentatie (Figuur 12C,D). In dit voorbeeld waren we geïnteresseerd in het analyseren van de met deuterium gelabelde isotopen. Het gebied voor TG 48:1 werd verder versterkt om de isotopisch gelabelde ionen te visualiseren. Naarmate de hoeveelheid deuterium op het ion toeneemt, neemt de intensiteit van de piek af. Dit gebeurt omdat er minder vaak veel deuterium-gelabelde ionen voorkomen. De m/z-verhouding neemt licht toe bij elke toevoeging van deuterium als gevolg van massatoename. Deze intensiteiten zullen verder de hoeveelheid van elke isotoop bepalen die in het monster aanwezig is.

Bij het beoordelen van de intensiteiten van de fragmenten in het massaspectrum moet men de niet-gelabelde isotopen vergelijken met die gelabeld met 2H (Figuur 12E). In blauw is de niet-gelabelde intensiteit met de gestippelde zwarte lijnen als theoretische intensiteiten. In rood worden de met isotoop gelabelde resultaten waargenomen. Ze vertonen grotere intensiteiten dan zowel de niet-gelabelde als de theoretische intensiteiten. De verrijking van de soorten met isotopische etikettering levert een grotere intensiteit op dan de niet-gelabelde theoretische soorten. De grotere intensiteiten maken het mogelijk om de triglyceriden te visualiseren als gevolg van de districtsverschillen. De fragmentatie speelt ook een sleutelrol bij de identificatie van lipiden, aangezien de PASEF een verhoogde fragmentatie zal veroorzaken in vergelijking met de volledige scan MS/MS. Dit komt omdat de vetzuren in de lipideketens in verschillende patronen kunnen fragmenteren, daarom geven de lijnen in de spectra de intensiteit van de fragmenten weer op basis van het fragmentatieproces van de triglyceriden (Figuur 12F). Dit geeft structurele informatie over het vetzuur en helpt om vast te stellen welke isomeer van een soort aanwezig is. Bij het analyseren van gegevens van de DIA-methode zal het aantal fragmenten toenemen, wat resulteert in een betere MS/MS-scan en superieure identificatie dan bij een typische DDA-methode.

figure-results-1
Afbeelding 1: Typisch startscherm van de software. Het startscherm maakt het mogelijk om de methode aan te maken en het instrument te starten. (A) Softwarescherm met TIMS- en MS/MS-besturingsinstellingen. Onderaan het scherm bevindt zich het tabblad bron om die bedieningselementen op het instrument te bewerken. (B) Softwarescherm met het tabblad Tune geopend. (C) Hier kan men het instrument voorbereiden op de algemene stemming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Afbeelding 2: Softwarescherm met het tabblad Tune geopend. Hier kan men de parameters van de verwerkingsafstemming bewerken. (A) Softwarescherm met het tabblad Tune geopend. Hier kan men de stemparameters voor het TIMS-gedeelte van het instrument bewerken. (B) Softwarescherm met het tabblad MS/MS geselecteerd onder aan het scherm. (C) Hier kan men parameters voor de tandem massaspectrometer bewerken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Afbeelding 3: Scherm voor het selecteren van DIA-PASEF-vensterbreedtes. Hier kan men de kleuren bewerken voor overvloed en de grootte van de vensters bewerken voor gegevensverzameling. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Kalibratie van de massaspectrometer op basis van de verhouding tussen massa en lading (m/z). Voor de kalibratie wordt de referentielijst geselecteerd. (A) Rechtsonder wordt op de knop Kalibreren geklikt totdat een acceptabele waarde verschijnt. Kalibratie van de ionenmobiliteitsspectrometer door mobiliteit. Voor de kalibratie wordt de referentielijst geselecteerd. (B) Rechtsonder wordt op de knop Kalibreren geklikt totdat een acceptabele waarde verschijnt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5: Typisch startscherm voor de data-analysesoftware. Om een bestand te openen, wordt op de knop Bestand linksboven geklikt om de vervolgkeuzelijst met opties te laten verschijnen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6: Software voor data-analyse. Het softwarescherm bevestigt een succesvolle kalibratie met (A) hoe kalibratieresultaten moeten worden geselecteerd en (B) het selecteren van de kalibratiecategorie. (C) Het selecteren van een chromatogram om te analyseren en (D) het selecteren van een geëxtraheerd ionenchromatogram. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-7
Figuur 7: Pop-up scherm. Pop-up voor het selecteren en extraheren van ionenchromatogram door (A) massafilter en (B) formulefilter. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-8
Figuur 8: Software voor gegevensanalyse. Het scherm van de software waar aan de linkerkant een mobilogram is geselecteerd voor analyse. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-9
Figuur 9: Pop-up scherm voor mobilogram. Pop-up voor het selecteren van een geëxtraheerde ionenmobilogram door (A) massafilter en (B) formulefilter. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-10
Figuur 10: Scherm voor gegevensanalyse. (A) Het softwarescherm; Aan de linkerkant gemarkeerd kan men een geëxtraheerde ionenlijst vormen. (B) Data-analysescherm waarbij onderaan een samengesteld spectrum van de geëxtraheerde ionen wordt bereid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-11
Figuur 11: Scherm voor data-analyse. Het softwarescherm toont de resultaten van een handmatige integratie van samengestelde spectra. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-12
Figuur 12: LC-TIMS MS Resultaat. (A) Het LC-TIMS MS 4 dagen na het voeren van 2H-gelabeld sucrosedieet en de eierstokken van insecten zijn te zien in het 2D-mobiliteitsdomein. (B) Typische MS-projecties voor het signaal dat overeenkomt met TG 48:1, TG 50:2 en TG 52:3 van het gelabelde monster. (C) Versterkt MS-gebied 822 - 827 m/z voor het gelabelde TGs-profiel. (D) Besteed bijzondere aandacht aan MS, pieken in rood worden versterkt in het isotopenprofiel. (E-F) Het 2H-gelabelde isotopenprofiel is rood gemarkeerd; Het onderstaande niet-gelabelde isotopenprofiel is blauw gemarkeerd. De theoretische isotopenprofielen worden aangeduid als streepjes (13C in zwart; Arabisch cijferH in groen). Rechtsboven wordt ook een potentiaalstructuur voor triglyceriden 48:3 weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

Bij het beoordelen van het gebruik van dit protocol is het essentieel om ervoor te zorgen dat de parameters DIA-PASEF en MS/MS van toepassing zijn op de triglyceriden in kwestie. In het bijzonder moeten mobiliteitsvensters en vensterbreedte het patroon van de triglyceriden volgen. Dit kan worden bepaald met een eerdere run met behulp van de DDA-methode. Bij het volgen van de triglyceriden in de interne standaard, moeten de vensters voor de DIA-opstelling alle vooraf geïdentificeerde moleculen van belang omvatten. De vensters moeten allemaal even groot zijn en de bereiken vallen binnen de m/z en 1/k0 van de gewenste verbindingen (Figuur 7). Bij een verkeerde dimensionering van de vensters worden de te fragmenteren ionen overgeslagen en zouden de opbrengstspectra een lagere reproduceerbaarheid hebben. In wezen zullen DIA-resultaten zonder de juiste optimalisatie van een vensterbereik in lipidomics de DDA-gegevens niet verbeteren. De vensters moeten een stapsgewijze vorm vertegenwoordigen voor het gegevensverzamelingsproces. Als dit niet het geval is, moeten de parameters van het DIA-PASEF-venster worden gewijzigd om representatief te zijn voor het volledige lipidenprofiel. Zonder deze stap worden kritieke vetzuren weggelaten uit de verkregen gegevens.

Instrumentele beperkingen omvatten meestal die welke gepaard gaan met LC-MS-methoden. Dit omvat multiplexing-beperkingen in piekbreedte. Daarom moet er een optimalisatie zijn in piekelutie voor een geschikte kwantificering, waardoor selectiviteit tijdens de gegevensverzameling wordt bevorderd. Meestal is dit met geselecteerde precursoren zoals met DDA. Bij DIA worden echter geen precursoren geselecteerd, waardoor het risico bestaat dat de instrumentele selectiviteit beperkt wordt8. Hoewel DIA-methoden voor meer fragmentatie zorgen, zijn er nog steeds beperkingen. De meest in het oog springende beperking is de vermindering van de selectiviteit van de voorlopers. De vensters voor een DIA-methode zijn 5 tot 10 keer breder dan een typische DDA-methode. Bijgevolg, terwijl het een grotere fragmentatie mogelijk maakt, zou het de inschakelduur en seriële acquisitie kunnen verminderen. Dit kan worden waargenomen in massaspectrometers die gebruik maken van een getrapte quadrupool. Omdat er geen selectie is van precursoren en welke ionen moeten worden gefragmenteerd, worden statische isolatievensters achtereenvolgens doorlopen om het m/z-venster te bedekken. Omdat het venster veel groter is dan bij een typische DDA-methode, moet men een groter bereik gebruiken om te proberen gevoeligheid te verkrijgen9. Het probleem in de seriële acquisitie vermindert daarom de gevoeligheid. Een tweede beperking heeft te maken met het genereren van bibliotheken. Het is tijdrovend en vereist grote hoeveelheden monsters om te formuleren. Hoewel externe bibliotheken kunnen worden gebruikt, kunnen de fragmentatiepatronen verschillen tussen experimentele omstandigheden en instrumentatie10.

Bij het analyseren van lipidegegevens met behulp van stabiele isotopenetikettering is het noodzakelijk om interferentie van andere moleculen die in het organisme worden aangetroffen tot een minimum te beperken. Dit wordt gedaan door gebruik te maken van analysetools met een hoge resolutie, zoals de LC-TIMS-TOF-MS/MS2. Momenteel is het gebruik van deze instrumenten met hoge resolutie om de gelabelde isotopen te scheiden van de achtergrondruis nog steeds erg nieuw in vergelijking met traditionele methoden. Traditionele instrumentele overwegingen implementeren scheiding door gaschromatografie gevolgd door chemische of elektronenionisatie. Dit maakt chemische afleiding met pentafluorbenzylbromide of fragmentatie van elektronenionisatie mogelijk. Het is meer recentelijk waar LC-MS wordt gebruikt in isotopenstudies. Het gebruik van massaspectrometers met hoge resolutie zorgt voor een hoge massanauwkeurigheid en de mogelijkheid om multi-tracer onderzoek uit te voeren door meerdere isotopenlabels te gebruiken in plaats van een enkele isotoop. Zonder de hoge resolutie van het instrument zou men geen onderscheid kunnen maken tussen verschillende etiketteringsgraden zoals 13C, 2 en 13C. Dit zorgt voor meer informatie uit een enkele run in vergelijking met traditionele instrumentatie met een lagere resolutie10.

Hoewel DIA een betere reproduceerbaarheid heeft dan DDA, kunnen andere opkomende methoden voor gegevensverzameling hiermee worden vergeleken. Hybride DIA-DDA-strategieën zoals p-SMART zijn in staat om de sterke punten van elke methode te combineren om een geweldige detectie en kwantificering te behouden, terwijl het hoge niveau van gerichte kwalitatieve analyses behouden blijft. Bij deze methode kan het gebruik van één gematcht production de DIA-gevoeligheid en selectiviteit verhogen, omdat het de DIA-vensters zal verkleinen in vergelijking met een brede ongerichte benadering8. In de lipidomica kan de structuur van een triglyceriden variëren met de isomere structuur. PASEF maakt het mogelijk om verschillende fragmentatiepatronen te visualiseren, waardoor de identificatie van soorten wordt verbeterd2. Met het gebruik van DIA-PASEF levert de verhoogde fragmentatie informatie op over isomeren als veel fragmenten op dezelfde manier als andere, die normaal gesproken niet kunnen worden opgelost vanwege de beperkingen van de DDA-methode. Deze informatie levert bewijs over welke vetzuren aanwezig zijn in de eierstokken van muggen. Deze methode kan worden toegepast op andere de novo lipidenstudies in diverse organismen.

Openbaarmakingen

Matthew Willetts en Melvin A. Park zijn werknemers van Bruker Daltonics Inc, de fabrikant van het commerciële instrument timsOTOF. De auteurs verklaren geen concurrerend financieel belang te hebben.

Dankbetuigingen

De auteurs willen graag de bijdragen van Dr. Cesar Ramirez erkennen tijdens de eerste ontwikkelingen van de methode. Dit onderzoek werd gefinancierd door de NIAID-subsidies R21AI167849 aan FGN, project 22-21244S van de Czech Science Foundation, Tsjechië aan MN.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Accucore C30 columThermo Fisher Scientific27826-252130
Bruker Compass Data AnalysisBruker Daltonics Inc2363525870Versie 5.2
d-Glucose-13C6Sigma-Aldrich 389374
eppendorf tubesFisher Scientific14-282-300
EquiSplash LipidomixAvanti Polar Lipids330731-1EA
glass vialsThermo Fisher Scientific11-417-236
heavy water (2H2O)Sigma-Aldrich 1.13366
polypropylene pestlesFisher ScientificBAF199230001
Prominence LC-20 CE ultrafast liquid chromatographShimadzuL20234651907
silanized glass insertsThermo Fisher Scientific03-251-826
Sucrose-13C12Sigma-Aldrich 605417
timsTOFBruker Daltonics Inc1.84443E+11
Tuning Mix Calibration StandardAgilent Technologies36

Referenties

  1. Stokvis, E., Rosing, H., Beijnen, J. H. Stable isotopically labeled internal standards in quantitative bioanalysis using liquid chromatography/mass spectrometry: Necessity or not. Rapid Commun Mass Spectrom. 19 (3), 401-407 (2005).
  2. Tose, L. V., et al. Coupling stable isotope labeling and liquid chromatography-trapped ion mobility spectrometry-time-of-flight-tandem mass spectrometry for de novo mosquito ovarian lipid studies. Anal Chem. 94 (16), 6139-6145 (2022).
  3. Meier, F., Park, M. A., Mann, M. Trapped ion mobility spectrometry and parallel accumulation-serial fragmentation in proteomics. Mol Cell Proteomics. 20, 100138(2021).
  4. Basit, A., Pontis, S., Piomelli, D., Armirotti, A. Ion mobility mass spectrometry enhances low-abundance species detection in untargeted lipidomics. Metabolomics. 12 (3), 50(2016).
  5. Meier, F., et al. Online parallel accumulation-serial fragmentation (PASEF) with a novel trapped ion mobility mass spectrometer. Mol Cell Proteomics. 17 (12), 2534-2545 (2018).
  6. Koopmans, F., Ho, J. T. C., Smit, A. B., Li, K. W. Comparative analyses of data independent acquisition mass spectrometric approaches: DIA, WiSIM-DIA, and untargeted DIA. Proteomics. 18 (1), 1700304(2018).
  7. Fernández-Costa, C., et al. Impact of the identification strategy on the reproducibility of the DDA and DIA results. J Proteome Res. 19 (8), 3153-3161 (2020).
  8. Prakash, A., et al. Hybrid data acquisition and processing strategies with increased throughput and selectivity: PSMART analysis for global qualitative and quantitative analysis. J Proteome Res. 13 (12), 5415-5430 (2014).
  9. Tsou, C. C., et al. DIA-umpire: Comprehensive computational framework for data-independent acquisition proteomics. Nat Methods. 12 (3), 258-264 (2015).
  10. Triebl, A., Wenk, M. R. Analytical considerations of stable isotope labelling in lipidomics. Biomolecules. 8 (4), 151(2018).

Herprints en machtigingen

Tags

De novo lipidensyntheselipidenmetabolismelipidomicsdata-afhankelijke acquisitiedata-onafhankelijke acquisitievetzuurketensontwikkeling van muggeneierenchromatogramintegratie
De novo lipiden traceren met behulp van stabiele isotopenetikettering LC-TIMS-TOF MS/MS
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.