Productie en optimalisatie van LTE, een van Leishmania tarentolae-afgeleid celvrij eiwitexpressiesysteem voor recombinante eiwitproductie

Samenvatting

Leishmania Translational Extract (LTE) is een eukaryotisch celvrij eiwitexpressiesysteem dat is afgeleid van de eencellige parasiet Leishmania tarentolae. Dit geoptimaliseerde protocol maakt LTE eenvoudig en kosteneffectief te produceren. Het is geschikt voor verschillende toepassingen die gericht zijn op de multiparallelle expressie en studie van complexe eukaryote eiwitten en hun interacties.

Samenvatting

Dit protocol schetst de productie en optimalisatie van een eukaryotisch Cell-Free Protein Expression System (CFPS) afgeleid van het eencellige flagellaat Leishmania tarentolae, aangeduid als Leishmania Translational Extract of LTE. Hoewel dit organisme oorspronkelijk is geëvolueerd als een parasiet van gekko's, kan het gemakkelijk en goedkoop worden gekweekt in kolven of bioreactoren. In tegenstelling tot Leishmania major is het niet-pathogeen voor mensen en vereist het geen speciale laboratoriumvoorzorgsmaatregelen. Een ander voordeel van het gebruik van Leishmania voor CFPS is dat de toevoeging van een enkel antisense-oligonucleotide aan de CFPS, gericht op een geconserveerde splice-leidersequentie aan het 5'-uiteinde van alle eiwitcoderende RNA's, de endogene eiwitexpressie kan onderdrukken. We bieden procedures voor celdisruptie en lysaatverwerking, die zijn vereenvoudigd en verbeterd in vergelijking met eerdere versies. Deze procedures beginnen met eenvoudige kolfculturen. Daarnaast leggen we uit hoe genetische informatie kan worden geïntroduceerd met behulp van vectoren die soortonafhankelijke translatie-initiatieplaatsen (SITS) bevatten en hoe u eenvoudige batchoptimalisatie en kwaliteitscontrole kunt uitvoeren om een consistente kwaliteit van eiwitexpressie te garanderen.

Inleiding

In de jaren 1960 speelden celvrije eiwitexpressiesystemen een cruciale rol bij het blootleggen van de genetische code¹. Prokaryote celvrije eiwitexpressiesystemen, voornamelijk gebaseerd op E. coli, domineren momenteel echter zowel laboratorium- als commerciële toepassingen. Hoewel op E. coli gebaseerde systemen voordelen bieden zoals kosteneffectiviteit, schaalbaarheid en hoge expressieopbrengsten, staan ze voor uitdagingen bij het produceren van multidomeineiwitten in hun actieve vormen en het vergemakkelijken van de assemblage van eiwitcomplexen ^2,3. Tegenwoordig omvatten veelgebruikte vormen van eukaryote celvrije eiwitsynthese (CFPS) tarwekiemextract (WGE), konijnenreticulocytlysaat (RRL) en insectcellysaat (ICL)^4,5,6. Dit werk introduceert een alternatief eukaryotisch celvrij systeem dat zowel eenvoudig als schaalbaar is, gebaseerd op de eencellige flagellaatparasiet Leishmania tarentolae.

Leishmania tarentolae kan gemakkelijk worden gekweekt in kolven met behulp van kosteneffectieve media en kan ook worden opgeschaald in bioreactoren om een hogere celdichtheid te bereiken. De aanwezigheid van endogene mRNA's in cellysaat, die anders zouden kunnen concurreren met geïntroduceerde berichten, kan worden geneutraliseerd met behulp van antisense-oligonucleotiden gericht op de geconserveerde Leishmania-mRNA-splice-leidersequentie⁷. In tegenstelling tot zijn naaste verwant Leishmania major, die ziekten bij de mens veroorzaakt, infecteert L. tarentolae de moorse gekko (Tarentolae mauritanica), waardoor hij geschikt is voor teelt in PC2-laboratoriumomgevingen zonder dat er speciale voorzorgsmaatregelen nodig zijn. Het is eerder gebruikt als een transgeen organisme voor in vivo eiwitexpressie⁸.

Om sjabloonpriming in celvrije systemen te vergemakkelijken, zijn universele sequenties ontworpen op basis van polymere RNA-structuren die de translationele initiatie verbeteren⁹. Deze soortonafhankelijke translatiesequenties (SITS) zijn toepasbaar op zowel prokaryote als eukaryote celvrije systemen en zijn geschikt voor het introduceren van genetische informatie in LTE. Hoewel dit protocol geen gedetailleerde uitleg geeft over de vectorconstructie voor LTE-celvrije eiwitexpressie, vereisen optimalisatie en kwaliteitscontrole geschikte vectoren die fluorofoorfusies bevatten van de gewenste eiwitten die van belang zijn stroomafwaarts van de SITS-site. Voor dit doel zijn geschikte LTE-vectoren gedeponeerd bij de Addgene-genrepository, zoals de pCellFree_G03-vector, die codeert voor een N-terminale eGFP-fusie naar het gewenste eiwit van belang met behulp van Gateway-kloonsites.

LTE heeft zijn waarde bewezen in een breed scala aan toepassingen die eiwitexpressie vereisen, waaronder de analyse van zelfassemblage van eiwitten^10,16, de productie van menselijke integrale membraaneiwitten¹⁷, onderzoek naar antivirale kandidaatgeneesmiddelen¹⁸, de ontwikkeling van biotechnologisch nuttige enzymen¹⁹, prototyping van eiwitbiosensoren^20,21 en de studie van biologische geneesmiddelen uit haakwormen²². LTE heeft ook een belangrijke rol gespeeld bij het in kaart brengen van eiwit-eiwitinteractienetwerken op het gebied van virologie en cellulaire structuren^21,32. LTE is gebenchmarkt om op dezelfde manier te presteren als andere eukaryote celvrije systemen bij het tot expressie brengen van volledige, monodispergeerde en niet-geaggregeerde eiwitten³³, terwijl het tegelijkertijd een kosteneffectievere en schaalbaardere productie biedt.

Dit protocol biedt technieken voor het kweken en verstoren van het gastheerorganisme, het bereiden van lysaat en het aanvullen van een voedingsoplossing (FS) voor gekoppelde transcriptie/translatie-eiwitexpressie. Daarnaast bevat het een protocol voor het optimaliseren van productiebatches. In de eerste versie van het Leishmania-celvrije systeem werd ongewenste variatie van batch tot batch waargenomen in expressieniveaus, de fractie van eiwitten van volledige lengte en de aanwezigheid van eiwitaggregaten, wat leidde tot de verwijdering van batches³⁴. Latere protocolverbeteringen werden aangebracht om dit probleem aan te pakken²⁵. Het huidige protocol bouwt voort op deze verbeteringen, waardoor individuele batches kunnen worden geoptimaliseerd voor piekeiwitexpressie en -grootte. Het bereikt dit door de belasting van de celverstoorder (gemeten als optische dichtheid bij 600 nm; OD_{600 nm}) en het normaliseren van de resulterende lysaatoutput met behulp van absorptie bij 280 nm (Abs_{280 nm}). Bovendien bevat het een methode om het lysaat tijdens de productie gedeeltelijk aan te vullen met rNTP en magnesium, met daaropvolgende optimalisatie van deze componenten van de voedingsoplossing tijdens testexpressies. Hoewel deze optimalisatie als een optie in het protocol wordt gepresenteerd, wordt het sterk aanbevolen door de auteurs.

Protocol

Dit protocol omvat gedetailleerde mediarecepten en stappen die betrekking hebben op kweken, centrifugeren, het meten van GFP-fluorescentie met behulp van een multimode plaatlezer, het meten van cultuur OD_600nm en het beoordelen van lysaat Abs_280nm. Het behandelt ook de installatie en beeldvorming van SDS-PAGE-eiwitgels. De materialen die nodig zijn of worden voorgesteld voor dit protocol worden vermeld in de spreadsheet Materialen. Het is belangrijk op te merken dat typische laboratoriumbronnen zoals mediacomponenten, centrifuges, buizen, spectrofotometers en gelelektroforese-opstellingen waarschijnlijk door elkaar kunnen worden gebruikt, tenzij anders aangegeven. Figuur 1 geeft een overzicht van het LTE-productieproces.

Figuur 1: Overzicht van het LTE-productieprotocol. Deze cartoon geeft een beknopte samenvatting van het LTE-productieprotocol. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. Groei van Leishmania tarentolae-culturen

1. Bereid ten minste 3 l TBGG-groeimedia voor (bactotrypton 12 g/l, gistextract 24 g/l, glycerol 8 ml/l, glucose 1 g/l, KH₂PO₄ 2,3 g/l, K₂HPO₄ 2,5 g/l, zie materiaaltabel). Steriliseer de media met behulp van een filter van 0,22 μm onder vacuüm of een vergelijkbare opstelling.
2. Bewaar de media bij kamertemperatuur (RT), waarbij de laatste toevoegingen (Hemin, Antibiotica) net voor de inoculatie met L. tarentolae worden toegevoegd. Hemin (0,25% v/v in 50% triethanolamine) wordt toegevoegd in een dosis van 0,2% v/v, penicilline (10.000 eenheden/ml) plus streptomycine (10.000 μg/ml) mix in een mix van 0,5% v/v.
   OPMERKING: Het uitgangspunt van dit protocol is een onderhouden cultuur van 2 x 10 ml van het wildtype L. tarentolae. Onderhoudsculturen worden gekweekt bij 27 °C in standaard weefselkweekkolven van 50 ml met weinig schudden (75 tpm). Dergelijke culturen van 10 ml kunnen voor onbepaalde tijd worden gehandhaafd met ~1/20 verdunningen in steriel (TBGG + hemin, penicilline, streptomycine) om de 2-3 dagen. Een standaard bioveiligheidskast in een PC2-laboratorium wordt aanbevolen; bacteriële besmettingen worden echter meestal voorkomen door de toegevoegde antibiotica, terwijl schimmelinfecties over het algemeen worden ontgroeid door L. tarentolae.
3. Breid gedurende twee dagen de onderhoudsculturen van L. tarentolae uit tot 200 ml (dag 1) en vervolgens tot 2 l (dag 2) via verdunningen van 1:10 met elke dag een toenemend volume TBGG + hemine/antibiotica. Voer beide verdunningen uit in autoclaaf-gesteriliseerde glazen kolven van 5 L (gevuld tot maximaal 1 L). De tweede verdunning moet 's middags tussen 15-18 uur plaatsvinden, met de bedoeling om de volgende dag tussen 8-11 uur met de lysaatproductie te beginnen.
   OPMERKING: Dit protocol gebruikt het minimale startvolume voor LTE-productie (2 x 1 L culturen). Het is ook mogelijk om de cultuur uit te breiden tot 10 L voor LTE-productie door een extra expansiestap op te nemen (bijv. Dag 1: 100 ml; Dag 2: 1 L; Dag 3: 10 L). Hoewel dit protocol gebruik maakt van verbijsterde kolven (zie Tabel met materialen) om L. tarentolae te laten groeien, kunnen optioneel conventionele bioreactoren worden gebruikt die zijn ontworpen voor bacteriegroei met Rushton-waaiers, op voorwaarde dat de roersnelheid onder de 100 tpm wordt gehouden. Verbeterde beluchting en pH-regeling in bioreactoren verlengen over het algemeen de groei in de logfase van de L. tartolae-culturen , waardoor een hogere oogst-OD van_{600 nm} van 10 kan worden gebruikt in stap 1.4.
4. Registreer de OD_{600 nm} van de cultuur in drievoud via een verdunning van 1:10 in TBGG rechtstreeks in de cuvet van de spectrofotometer. Een geschikt startbereik voor het maken van lysaat is OD_600nm = 4.0-8.0.
5. Zorg voor extra incubatietijd als OD_600nm < 4.0. Een cultuur met OD_600nm > 8 is bruikbaar en zal resulteren in een groter volume celvrij expressielysaat, maar met een lagere kwaliteit vanwege het begin van de groeifase van de late log. Plaats de kweekkolven op het ijs in afwachting van de volgende stappen.
   OPMERKING: Nauwkeurige meting van de uiteindelijke cultuur OD_600nm is van cruciaal belang, omdat deze wordt gebruikt om het uiteindelijke volume voor geconcentreerde cellen te berekenen voorafgaand aan de verstoring. Om het protocol te vereenvoudigen, vervangt deze berekening een pelletweegmethode die in eerdere versies van LTE-fabricage werd gebruikt om de celconcentratie te kalibreren voorafgaand aan verstoring³⁴. Zorg ervoor dat u verdunt in TBGG voor OD_600nm-meting , omdat anders osmotische shock de celvorm verandert, waardoor een meetfout ontstaat. Pipetmeng de 1:10 verdunning voor OD_600nm meting (direct in de cuvet) seconden voordat de spectrofotometrische meting wordt uitgevoerd, aangezien L. tarentolae-cellen snel bezinken en een kenmerkend troebel uiterlijk hebben. Als het uiteindelijke volume van de expressiecultuur als bij benadering wordt beschouwd, wordt ook aanbevolen om de kolven bij de oogst te wegen (met geschikte lege kolf tarra) om een beter geschat volume te krijgen (bij 1 g = 1 ml). De maximale OD_600nm die mogelijk is van de groei van L. tarentolae in verbijsterde kolven is 15-20, hoewel dit niet geschikt is voor de productie van lysaat vanwege het bereiken van de stationaire fase.

2. Concentratie van L. tarentolae-culturen

1. De Leishmania-cellen moeten ongeveer 60x worden gewassen en geconcentreerd voordat ze worden verstoord. Bereken het doelvolume voor de celconcentratie op basis van OD_600nm = 300 voor het uiteindelijke concentraat. De vergelijking is V = oogstvolume (ml) x (oogst-OD_600nm/300). Als u bijvoorbeeld een cultuur van 2 L gebruikt met een oogst-OD₆₀₀ = 5, is het doelvolume 33 ml.
   OPMERKING: Het OD_600nm-doel van 300 kan worden gewijzigd; eerdere LTE-productie heeft waarden gebruikt in het bereik van 150-350. Hogere concentraties van cellen die in ontwrichting gaan, zullen de neiging hebben om uiteindelijke celvrije expressiereacties op te leveren met hogere eiwitopbrengsten, maar met een verhoogde neiging van kwetsbare eiwitten om te aggregeren. OD_600nm = 300 vertegenwoordigt een geschikt standaarddoel voor LTE-productie.
2. Breng de geoogste culturen over in geschikte centrifugeflessen en draai ze 10 minuten op 2500 x g bij 4 °C. Decanteer het supernatans voorzichtig in het cultuurafval.
   OPMERKING: Het is belangrijk om het verlies van cellen in het afgedankte supernatant tot een minimum te beperken, omdat dit van invloed is op de berekening van de verstoringsbelasting. In eerdere LTE-productieprotocollen werd de concentratie van L. tarentolae-cellen voor disruptie gekalibreerd door het celconcentraat in een testmicrocentrifugebuis te draaien en het pelletgewicht te meten ten opzichte van het totale gewicht³⁴. Dit vereenvoudigde protocol gebruikt in plaats daarvan een theoretisch OD_600nm-doel voor het concentraat, gebaseerd op de gemeten oogst-OD_600nm, en gaat uit van een laag celverlies tijdens de celconcentratie en het wassen.
3. Was de celpellet in SEB-buffer (45 mM HEPES-KOH pH 7,6, 250 mM sucrose, 100 mM KOAc, 3 mM Mg(OAc)₂, bewaard op ijs) driemaal, telkens centrifugerend bij 2500 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C. Resuspendeer voor de eerste wasbeurt elke 1 L gepelleteerde cultuur in 100 ml SEB-buffer en combineer ze vervolgens in een enkele centrifugekolf. Gebruik voor de tweede wasbeurt ook 100 ml SEB voor elke 1 L van de oorspronkelijke cultuur.
   OPMERKING: Voeg voor de uiteindelijke resuspensie van de pellet de SEB-buffer toe tot 50% van het uiteindelijke doelresuspensievolume (stap 2.1). Hierdoor kan het gepoolde concentraat zorgvuldig worden bijgevuld tot precies het uiteindelijke doelvolume in stap 2.4. Elke resuspensie moet zo voorzichtig mogelijk zijn om voortijdige lysis van L. tarentolae te voorkomen, bijvoorbeeld door de toegevoegde SEB voorzichtig rond de gedecanteerde pellet te draaien of door SEB te pipetteren over de pellet die aan de wand van de centrifugebuis kleeft. Het kan handiger zijn om supernatanten over te brengen naar kleinere centrifugebuisjes voor de laatste stap.
4. Giet het geresuspendeerde concentraat in een geschikte volumetrische cilinder van gewassen glas, vul het volume aan tot het doelvolume (stap 2.1) met extra koude SEB en meng voorzichtig.

3. Lysis van L. tarentolae concentraat

1. Breng het celconcentraat over in het stikstofcavitatie-apparaat (zie Materiaaltabel) dat is voorgekoeld tot 4 °C, breng het onder druk tot 70 bar stikstof en incubeer gedurende 45 minuten op ijs.
   OPMERKING: Hoewel stikstofcavitatieverstoorders geen gebruikelijke laboratoriumartikelen zijn, worden ze wel aanbevolen voor LTE-productie. Alternatieve methoden zoals cellulaire vries-dooi en verstoorders van het type Franse pers zijn uitgeprobeerd; De activiteit van de eiwitexpressie was echter <50% in vergelijking met het gebruik van de stikstofcavitatiemethode. Het stikstofcavitatie-apparaat moet voor gebruik en tussen de runs grondig worden gereinigd, net als alle hergebruikte vaten die vanaf deze stap in contact komen met het cellysaat (zoals de opvangkolf). Een geschikt reinigingsregime omvat wassen met laboratoriumreinigingsmiddelen, gevolgd door grondig spoelen met gedeïoniseerd water.
2. Open de ontluchting op het stikstofcavitatie-apparaat en verdrijf het resulterende lysaat in een voldoende robuuste container, zoals een vacuümopvangkolf op ijs. Kantel de opvangkolf om ervoor te zorgen dat al het resulterende lysaat bezinkt en in een verse centrifugebuis of een soortgelijk vat kan worden gepipetteerd.
   LET OP: Stikstofcavitatieverstoorders vertrouwen op de abrupte overgang van het celconcentraat van 70 bar stikstof naar de omgevingsdruk, bereikt door een sterke stroom van eerst vloeistof en vervolgens stikstof door de uitlaatklep van het apparaat. Het ventileren moet gebeuren met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) in een chemische veiligheidskap. Het risico bestaat dat het bestemmingsvat breekt en het lysaat verloren gaat, daarom gebruiken we een stevige vacuümontvanger in plaats van een generieke kolf. Als de uitlaatklep van het apparaat een slang is, plaats de slang dan niet direct in de ontvanger om overmatige drukopbouw op het ontluchtingspunt te voorkomen.

4. Centrifugatie van cellysaat

1. Breng het lysaat over in geschikte centrifugebuisjes met een g-sterkte en centrifugeer gedurende 15 minuten bij 4 °C bij 10.000 x g . Verwijder het supernatans in verse, soortgelijke centrifugebuisjes.
2. Centrifugeer het lysaat bij 30.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C en verwijder vervolgens het laatste supernatans in een verse centrifugebuis of een soortgelijke container die op ijs is geplaatst. Maak een schatting van het totale volume.

5. Gelfiltratie van cellysaat

OPMERKING: Gelfiltratie wordt gebruikt om sucrose in de SEB-buffer te verwijderen. Hoewel sucrose helpt bij het stabiliseren van de cellulaire machinerie tijdens celdisruptie, vermindert het de opbrengst als het wordt vastgehouden in eiwitexpressiereacties.

1. Plaats een voldoende aantal PD-10 door zwaartekracht gevoede gelfiltratiekolommen (zie Materiaaltabel) in een rekformaat zodat ze in een opvangbak of een soortgelijke container eronder kunnen druppelen, zodat ze het volledige lysaatvolume kunnen filteren met 2.5 ml per kolom. Breng de kolommen vooraf in evenwicht door er vooraf 10 ml EB-buffer van 4 °C (45 mM HEPES-KOH pH 7,6, 100 mM KOAc, 3 mM Mg(OAc)₂) doorheen te halen.
   OPMERKING: Alle stappen vanaf dit punt hebben baat bij het uitvoeren in een koude ruimte van 4 °C. Het is echter ook geschikt om alle lysaten en reagentia op een ijsbak op een tafelmodel te bewaren. Een uitzondering is de stap van de gelfiltratie, waarbij de auteurs een rek met kolommen in een koelkast van 4 °C plaatsen terwijl ze opnieuw bufferen. In de oorspronkelijke versies van dit protocol werden nieuwe gelfiltratiekolommen 'geblokkeerd' door het lysaat in eerste instantie te bufferen en de eerste output weg te gooien. Hoewel dit niet nodig wordt geacht, moeten kolommen worden gespoeld met EB-buffer en tussen lysaatbatches bij 4 °C worden opgeslagen. Het eerste outputlysaat kan een lagere eiwitexpressieactiviteit hebben dan de daaropvolgende outputs als gevolg van enige achtergrondretentie van lysaatcomponenten op de nieuwe kolom.
2. Voeg 2,5 ml lysaat toe aan elke kolom en wacht tot het in de kolom terechtkomt. Voeg een extra 0,5 ml EB toe om het lysaat in de kolom te laten bezinken terwijl u het eluaat weggooit.
3. Elueer het met gel gefilterde lysaat door een extra 2,5 ml EB aan elke kolom toe te voegen en de output op te vangen door een vers, schoon bakje of een andere bak onder de kolommen te plaatsen.

6. Suppletie van cellysaat

1. Gebruik de nanodruppelspectrofotometer (zie Materiaaltabel) om Abs_280nm van het gelgefilterde lysaat te meten. Als het hoger is dan 60, verdun het dan om Abs_280nm = 60 te bereiken met behulp van een extra EB-buffer van 4 °C.
   OPMERKING: Hoewel het beheersen van de invoer van de celdichtheid in verstoring met behulp van OD_600nm ongeveer de lysaatuitgangssterkte bepaalt, verbetert het normaliseren van de Abs_280nm na lysaatverstoring en verwerking de batchconsistentie van lysaatprestaties verder. Lysate Abs_280nm kan naar boven en naar beneden worden aangepast, met gevolgen voor de opbrengst en aggregatie van eiwitexpressie (zie sectie Discussie). Als het niet-aangevuld lysaat een Abs_280nm < 60 aangeeft, kan het nodig zijn om meer Leishmania-biomassa op te nemen in de verstoringsstap, d.w.z. de celverstoorderbelasting te verhogen tot OD_600nm > 300 in stap 2.1.
2. Voeg 5x Feeding Solution (5x FS, Tabel 1) toe aan het lysaat in een verhouding van 2:5 en wervel goed door. Doe het in geschikte recipiënten (bijv. 1,5 ml microfuge-buisjes) en vries het snel in vloeibare stikstof in. Als men de optionele stappen 7.1-7.3 voor LTE-expressie-optimalisatie hieronder volgt, gebruik dan de verminderde rNTP.Mg 5x FS uit Tabel 1 in plaats van de standaard 5x FS. Voeg 5 aliquots van 100 μl toe voor invriezen voor gebruik in de optimalisatie-experimenten.
   OPMERKING: Invriezen met de standaard 5x FS in een verhouding van 2:5 creëert expressieklare aanvullende LTE, gebruikt bij 7 μL/10 μL expressie (vandaar dat de 5x FS 1x FS wordt in de uiteindelijke reactie). De auteurs raden echter aan om de verdere optionele stappen te volgen waarbij 0,6x de standaardhoeveelheid rNTP's en magnesium wordt verstrekt in de 5x FS. Dit wordt gevolgd door een optimalisatiestap waarbij een equimolaire mix van de twee (aangeduid als rNTP.Mg) wordt toegevoegd om de testreacties aan te vullen tot een geoptimaliseerde waarde. De gedeeltelijke 5x FS bevat ook een oligonucleotide dat de endogene mRNA-expressie uitschakelt (zie de inleiding). De sequentie van het oligonucleotide is CAATAAAGTACAGAAACTGATACTTATATAGCGTT.

7. QC en optimalisatie van de uiteindelijke aangevulde LTE

OPMERKING: De minimaal noodzakelijke stappen om de juiste 'top-up' toevoeging van rNTP.Mg aan het verminderde rNTP en magnesium-aangevuld lysaat te bepalen, omvatten het tot expressie brengen van eGFP of een vergelijkbare fluorofoor (bijv. sfGFP) zonder een fusiepartner. Toenemende concentraties van rNTP.Mg worden aan de reacties toegevoegd om het punt te bepalen waarop het expressieniveau (gemeten als eGFP RFU via een multimode plaatlezer) wordt geoptimaliseerd. Voortijdige beëindigingen van eGFP, die niet fluorescerend zijn, worden duidelijk door het verlagen van de eGFP RFU bij te hoge rNTP.Mg concentraties. Korte-productstoringen van LTE komen echter vaker voor in eiwitten met een grotere expressie (>50 kDa). Daarom is het mogelijk om deze optimalisatie uit te voeren met behulp van een grotere sjabloon dan eGFP, vooral als er een beschikbaar is in een geschikte expressievector, die een fluorofoorfusie oplevert die door LTE voor een bepaalde toepassing of studie moet worden geproduceerd (zie de sectie Representatieve resultaten).

1. Ontdooi een aliquot van 100 μl en zet zes expressiereacties van 10 μl op, elk bestaande uit 7 μl gedeeltelijk gesupplementeerd lysaat uit stap 6.2, 1 μl bijvuloplossing volgens tabel 2 en 2 μl ultrapuur water met voldoende DNA-controlesjabloon om een eindconcentratie van 50 ng/μl in de reactie te bereiken.
2. Incubeer de reacties gedurende 2 uur bij 25 °C en bewaak de toename van de GFP-fluorescentie met behulp van een multimode plaatlezer.
   OPMERKING: Geschikte configuratiewaarden voor GFP zijn excitatie bij 485 nm (bandbreedte 5 nm), emissie bij 516 nm (bandbreedte 5 nm), met een leesinterval van 1 minuut gedurende 2 uur.
3. Rangschik de uiteindelijke expressiewaarden om de rNTP.Mg concentratie te bepalen die overeenkomt met de hoogste eGFP-RFU. Als er kinetische gegevens beschikbaar zijn, wordt een overmaat aan rNTP.Mg ook aangegeven door een bifasische toename van de eGFP RFU gedurende de expressieperiode van 2 uur (zie de sectie Representatieve resultaten).
4. Zodra de geoptimaliseerde top-up rNTP.Mg concentratie is bepaald, voegt u deze toe aan alle verdere eiwitexpressies met behulp van de batch LTE die in de vorige stappen gedeeltelijk is aangevuld.
   OPMERKING: Als de aliquotatie in stap 6.2 zorgvuldig wordt uitgevoerd met vaste volumes, kan de aanvulling achteraf aan elke aliquot worden toegevoegd zonder te ontdooien, bijvoorbeeld door de aliquots op droogijs te plaatsen. Deze aliquots zijn nu volledig aangevuld, omdat de juiste rNTP.Mg aanvulling door elk wordt gemengd wanneer ze worden ontdooid en gemengd voor gebruik.

Resultaten

Het doel van celvrije eiwitexpressie is om eiwitten van volledige lengte te produceren in een gevouwen, actieve vorm die geschikt is voor een breed scala aan toepassingen. LTE (Leishmania tarentolae-extract ) is eerder vergeleken met andere prokaryote en eukaryote celvrije expressiesystemen, en toont een hoog vermogen aan om afkapping en aggregatie te voorkomen wanneer het optimaal werkt, vooral in vergelijking met op E. coli gebaseerde celvrije expressie³³. Dit ging voorheen echter gepaard met een aanzienlijke variatie van batch tot batch in de outputkwaliteit. De huidige methode bevat verdere verbeteringen om een consistente outputkwaliteit te garanderen, voornamelijk door gedeeltelijke aanvulling van de benodigde voedingsoplossing voordat de LTE in aliquots voor het eerst wordt ingevroren. Dit wordt gevolgd door de optimalisatie van de transcriptionele invoer rNTP.Mg in een top-up oplossing die aan elke volgende reactie kan worden toegevoegd of kan worden gebruikt om de bevroren aliquots direct te voltooien. Het is opmerkelijk dat de optimalisatiereacties ook een typisch gebruik van LTE vertegenwoordigen om eiwitten praktisch tot expressie te brengen, met reacties die gedurende 2 uur bij 25 °C worden uitgevoerd.

Gegevens van het optimaliseren van de concentratie van rNTP.Mg in celvrije reacties leveren een representatieve dataset op. Expressieniveaus nemen doorgaans toe naarmate de transcriptionele invoer (rNTP.Mg) stijgt, wat wijst op een succesvolle expressie. Er wordt echter een drempel bereikt waarbij het systeem neigt naar niet-productieve expressie van afgekapte producten, vooral in het geval van grotere eiwitten (>50 kDa). Deze suboptimale expressie leidt tot een verlies van fluorescentiesignaal met toenemende rNTP.Mg, vooral duidelijk bij C-terminale fluorofoorfusies, waarbij de translatie van het polypeptide de fluorofoor zelf niet bereikt. Voor N-terminale fusies geldt dat, hoewel een vermindering van de totale RFU (Relative Fluorescence Units) niet noodzakelijkerwijs optreedt bij een teveel aan rNTP.Mg, een mislukte expressie zichtbaar is op SDS-PAGE-gels als meerdere fluorescerende producten van afnemende afmetingen. Deze aanpak maakt gebruik van het vermogen van GFP (Green Fluorescent Protein) om de fluorescentie te behouden, zelfs wanneer het wordt gevisualiseerd op een conventionele SDS-PAGE-gel, op voorwaarde dat de monsters na het mengen niet worden verwarmd. In plaats daarvan worden ze gemengd met de gellaadbuffer en rechtstreeks op de gel geladen. Hoewel SDS-PAGE-gelmaterialen en -apparatuur over het algemeen uitwisselbaar zijn, moet de gelimager in staat zijn om GFP-fluorescentie te visualiseren. Een typische configuratie voor GFP-visualisatie is voorzien van excitatie bij 485 nm (bandbreedte 5 nm), emissie bij 516 nm (bandbreedte 5 nm) en een leesinterval van 1 minuut gedurende 2 uur.

Het is mogelijk om het systeem te optimaliseren met alleen de expressie van eGFP. Figuur 2A,B (inzet) toont typische expressie-outputs van optimalisatiereacties voor twee LTE-batches, waarbij eGFP RFU toeneemt met stijgende rNTP.Mg concentraties, waarbij een optimaal niveau wordt bereikt van +0,6x rNTP.Mg (Figuur 2A) en +0,3x rNTP.Mg (Figuur 2B) voor maximale RFU. De gereduceerde rNTP-feedoplossing bevat 0,6x rNTP.Mg, wat resulteert in totale rNTP.Mg niveaus van 1,2x en 0,9x de standaardhoeveelheid voor deze LTE-batches. Figuur 2C illustreert de kinetiek van de RFU-toename tijdens de reactie voor de LTE-batch in Figuur 2B, waarbij een bifasische reactie met twee discrete fasen gedurende de duur van de reactie wordt aangetoond.

Figuur 2: Optimalisatie van rNTP.Mg top-up additie in LTE met verminderde rNTP 5x FS. (A) Expressieniveaus van eGFP na 140 minuten expressie van een controleplasmide op variërende rNTP.Mg top-up niveaus in de celvrije expressiereactie (n = 3, gemiddelde ± SD uitgezet). (B) Optimalisatie van een andere LTE-productiebatch, die een verminderde expressie vertoont boven een bepaalde drempel van rNTP.Mg. (C) Kinetiek van eGFP-accumulatie in dezelfde reacties als (B), met toenemende rNTP.Mg topup. Deze gegevens vertegenwoordigen ook de typische kinetiek van eiwitaccumulatie in LTE-batchexpressie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Er moet echter worden opgemerkt dat eGFP, een klein eiwit (27 kDa) dat gemakkelijk te vouwen is, waarschijnlijk tot expressie wordt gebracht, gevouwen en gerijpt, ongeacht het gebruikte celvrije expressiesysteem. Falen van het systeem is waarschijnlijker bij het tot expressie brengen van grotere eiwitten die van belang zijn, waarbij afgekapte producten duidelijker worden bij invoereiwitgroottes groter dan 70 kDa³³. Daarom is het optimaliseren van het systeem met het eiwit of de eiwitten bedoeld voor daadwerkelijk gebruik superieur, met eGFP nog steeds aanwezig voor kwantificering, maar als een N-terminale fusie met het eiwit van belang.

Figuur 3 geeft een typische optimalisatie weer van het rNTP.Mg bijvulniveau bij gebruik van een groter eiwitsjabloon dat vatbaar is voor het leveren van afgekapte producten (eGFP-Sox18). Met behulp van een semi-native gel SDS-PAGE-formaat (d.w.z. zonder verwarmingsmonsters) is het mogelijk om het progressieve falen van expressie te visualiseren. Optimale rNTP.Mg additie bij +0,1x (gecombineerd met de 0,6x rNTP.Mg in de gedeeltelijke voedingsoplossing, in totaal 0,7x) vermindert duidelijk de fractie van de eiwitband over de volledige lengte als onderdeel van totale fluorescerende expressieproducten, wat betekent dat het systeem faalt met een teveel aan rNTP.Mg toevoeging.

Zoals vermeld in het protocol, is het mogelijk om de rNTP.Mg optimalisatiestap over te slaan en direct de volledige hoeveelheid rNTP.Mg in de "standaard" voedingsoplossing toe te voegen tijdens de suppletie direct na gelfiltratie in stap 6.2. Door dit te doen, keert het protocol in wezen terug naar de oorspronkelijk gepubliceerde methoden voor het maken van LTE³⁴. De auteurs zijn echter van mening dat het afstemmen van het systeem op optimale prestaties, zoals aangetoond in figuur 3 (Lane D naar Lane E), opweegt tegen de extra complexiteit van het protocol en de waarde van LTE als hulpmiddel voor eiwitexpressie verhoogt.

Figuur 3: Effect van toenemende rNTP.Mg top-up op eGFP-Sox18-expressie in gedeeltelijk gesupplementeerde LTE. Semi-native SDS-PAGE-gel die de impact weergeeft van het verhogen van rNTP.Mg opwaarderen op de eGFP-Sox18-expressie. Baan A: +0,1x (rNTP.Mg) opwaarderen, Baan B: +0,2x (rNTP.Mg), Baan C: +0,3x (rNTP.Mg), Baan D: +0,4x (rNTP.Mg). De N-terminale eGFP-fusie wordt gevisualiseerd door fluorescentiescanning van de gel. De primaire band in baan A vertegenwoordigt eGFP-Sox18 over de volledige lengte. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Bestanddeel	Concentratie van de voorraad	5x Feed Oplossing	μL voorraad/ml 5x Feed Oplossing
		Standaard (verlaagde rNTP)	Standaard (verlaagde rNTP)
Spermidine	100 mM	1,25 mM	12
DTT	500 mM	10 mM	20
Creatine Fosfaat	1000 mM	200 mM	200
HEPES-KOH pH7.6	2500 mM	100 mM	40
PEG3000	0,5 V/V	0,05 V/V	100
Proteaseremmer cocktail	120x	5 keer	43
Aminozuren	3,6 mM (ea)	0,68 mM (ea)	190
ATP	100 mM	8,5 (5,1) mM	85 (51)
GTP	100 mM	3,2 (1,9) mM	32 (19)
UTP	100 mM	2,5 (1,5) mM	25 (15)
CTP	100 mM	2,5 (1,5) mM	25 (15)
Mg(OAc)2	1 miljoen	16,7 (10) mM	16.7 (10)
Anti-splitsing leider oligo	1mM	0,05 mM	50
T7 RNA-polymerase	5 mg/ml	0,5 mg/ml	100
Creatine fosfokinase	5 eenheden/μL	0,2 eenheden/μL	42
Ultrapuur water			19 (93)

Tabel 1: Samenstelling van 5x Feed Solution (5x FS) voor LTE. 1 ml 5x FS is vereist voor elke 2,5 ml niet-aangevuld lysaat na gelfiltratie. Door aan te vullen met de standaard 5x FS ontstaat een expressieklare LTE voor gebruik in expressiereacties in een verhouding van 7 μL/10 μL. Het recept voor gereduceerde rNTP.Mg (hoeveelheden cursief) wordt aanbevolen voor optimalisatie van LTE-expressie en bevat 0,6 keer de standaardniveaus van rNTP's en magnesium. Deze kunnen in het daaropvolgende optimalisatie-experiment op variabele niveaus (0,6 tot 1,1 keer) worden aangepast met behulp van de toevoegingen die in tabel 2 worden beschreven.

rNTP opwaarderen	ATP (100 mM)	GTP (100 mM)	UTP (100 mM)	CTP (100 mM)	MgOAc (1 miljoen)	Ultrapuur water
(1 μL/10 μL rxn)	μL/200 μL	μL/200 μL	μL/200 μL	μL/200 μL	μL/200 μL
+0x	0	0	0	0	0	200
+0,1 keer	3.4	1.3	1	1	0.7	193
+0,2 keer	6.8	2.5	2	2	1.3	185
+0,3 keer	10.2	3.8	3	3	2	178
+0,4 keer	13.6	5.1	4	4	2.7	171
+0,5 keer	17	6.4	5	5	3.3	163

Tabel 2: Samenstelling van (rNTP.Mg) top-up oplossingen voor LTE optimalisatie. Deze oplossingen worden gebruikt om LTE te optimaliseren door 1 μL bijvuloplossing toe te voegen per 10 μL eiwitexpressiereactie. Zodra een top-upniveau is bepaald in het optimalisatie-experiment, kan het consistent worden toegevoegd aan alle volgende eiwitexpressiereacties met behulp van dezelfde LTE-batchaliquots. Als alternatief kan het rechtstreeks aan de aliquots zelf worden toegevoegd met een toevoeging van 1 μL per 7 μL (zonder te ontdooien). Na ontdooien en mengen worden deze lysaten gebruikt bij 8 μL LTE per 10 μL eiwitexpressie, waarbij het rNTP.Mg topup-niveau dat tijdens de optimalisatie is vastgesteld, behouden blijft.

Discussie

Protocollen voor het creëren van LTE zijn de afgelopen tien jaar gepubliceerd⁷ en hebben periodieke updates ondergaan^25,34. Nieuwkomers in de techniek stuiten echter vaak op een steile leercurve, wat resulteert in vertragingen bij het bereiken van hoogwaardige eiwitexpressie met een hoge opbrengst. Soortgelijke uitdagingen zijn gemeld door andere onderzoeksgroepen die met LTE³⁵ werken, met name met betrekking tot aanzienlijke batch-tot-batch-variaties. Het op video gebaseerde protocolformaat kan mogelijk aanvullende, minder voor de hand liggende installatiekennis bieden die potentiële gebruikers ten goede komt³⁴. Er zijn wijzigingen in het protocol aangebracht, met als doel de kans op succes te vergroten, de procedure te vereenvoudigen, tijd te besparen en fouten in verband met complexiteit te minimaliseren.

Bij celdisruptie is nauwkeurige controle over het laden van cellen in de stikstofcavitatiecelverstoorder van cruciaal belang³⁴. Het bereiken hiervan kan een uitdaging zijn vanwege de hoge celdichtheid na celconcentratie en wassen. In de oorspronkelijke protocollen werden verschillende methoden gebruikt, zoals het afspinnen van een klein volume van de uiteindelijke geconcentreerde cultuur en het kwantificeren van de fractionele celpellet. In dit protocol wordt echter gekozen voor een eenvoudigere aanpak. Het oogstvolume van de cultuur en de OD_{600 nm} worden gemeten, en deze metingen worden gebruikt om een doelvolume voor het celconcentraat in milliliter te berekenen, waarbij wordt gestreefd naar een gewenste uiteindelijke OD_{600 nm} van 300. Deze berekening gaat ervan uit dat er geen significant celverlies optreedt tijdens het wassen. Als er een vermoeden van celverlies bestaat, wordt een alternatieve methode gebruikt met drievoudige seriële 1/10 verdunningen van de geconcentreerde cellen na het wassen, wat uiteindelijk resulteert in een verdunning van 1/1000. Dit maakt het mogelijk om de OD_{600 nm} van het werkelijke concentraat te meten, zodat het de beoogde OD_{600 nm} = 300 bereikt voordat het in de disrupter wordt geladen.

Zelfs met zorgvuldige controle van de belasting van celverstoorders, kan een aanzienlijke variabiliteit in het lysaateiwitgehalte na verstoring optreden, zoals aangegeven door de Abs_280nm van het gelgefilterde niet-aangevuld lysaat³⁴. Daarom wordt een meting van Abs_280nm vóór lysaatsuppletie geïntroduceerd en wordt het lysaat verdund om een Abs_280nm = 60 te bereiken. Aangezien eiwitexpressiereacties uiteindelijk 0,5 v/v lysaat omvatten, resulteert dit in een gestandaardiseerde reactielysaat met Abs_280nm = 30. Lysaatprestaties geconfigureerd met een lager dan Abs_280nm = 30 hebben de neiging om langdurige reacties met een lage expressie op te leveren, terwijl waarden groter dan Abs_280nm = 30 de neiging hebben om een hogere expressie op te leveren, maar een verhoogde neiging tot aggregatie van outputeiwitten.

Optimalisatie van de lysaatprestaties omvat het aanpassen van de transcriptionele invoer in de voedingsoplossing die het lysaat aanvult, met name rNTP's en magnesium, in optionele reactiestappen 7.0-7.3. Het is belangrijk op te merken dat rNTP's en magnesium complexe en meervoudige rollen hebben in een gekoppeld transcriptie-vertaalsysteem zoals LTE²⁵. Het is echter aangetoond dat LTE een geschatte magnesiumexpressie optimaal heeft bij rNTP (mM) + 1,5. Aangezien het lysaat zelf 1,5 mM Mg bijdraagt aan het uiteindelijke reactiemengsel, biedt dit een eenvoudige manier om rNTP-input te variëren en te optimaliseren zonder Mg te co-optimaliseren door equimolaire rNTP.Mg te variëren.

De prestaties van lysaat vertonen aanzienlijke variatie bij het verhogen van de rNTP.Mg, waarbij de eiwitexpressie over het algemeen toeneemt tot een drempel waar de optimalisatie omkeert, wat resulteert in expressiestoringen in de vorm van korte producten in plaats van eiwitten van volledige lengte²⁵. Daarom is het nuttig om het systeem uiteindelijk te optimaliseren om deze drempel te identificeren. Het oorspronkelijke LTE-protocol maakte gebruik van een vast recept voor voedingsoplossingen, met enige Mg-optimalisatie voorgesteld³⁴. Deze aanpak werd later aangepast met een uitgebreidere rNTP-optimalisatie. Deze methode vereiste echter het snel invriezen van het lysaat in niet-aangevulde vorm om optimalisatie op een aliquot mogelijk te maken, wat de neiging had om de uiteindelijke lysaatexpressieniveaus te verlagen. Deze vermindering werd toegeschreven aan het verlies van de cryoprotectieve eigenschappen van de voedingsoplossing bij het snel invriezen van onaangevuld lysaat onmiddellijk na de stap van de gelfiltratie. Het huidige protocol zorgt voor een evenwicht door aan te vullen met een voedingsoplossing met verminderde rNTP.Mg voor het invriezen, die op het moment van afkolven kan worden bijgevuld tot het geoptimaliseerde niveau.

Verwacht wordt dat deze protocolverbeteringen de bruikbaarheid van het LTE-systeem voor beginnende gebruikers zullen vergroten door de primaire bronnen van variatie te verminderen en de consistentie van de eiwitexpressie-output te verbeteren.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
PD-10 SuperDex 25 Columns	Cytiva	17085101	Gel filtratie kolommen
Nitrogen Cavitation cell disrupter	Parr Industries	4635 of 4639	Celdisruptor
Bovine derived Hemin	Sigma-Aldrich	H5533	Kweekadditief
Penicillin/Streptomycin 10000U/ml	Thermo-Fisher	15140122	Antibioticummix
Optiplate 384	Perkin-Elmer	6007290	Multiwellplaat voor 10ul expressies
Oligonucleotide	IDT synthese		Oligo met sequentie CAATAAAGTACAGAAACTGATAC TTATATAGCGTT
Creatine Phosfokinase	Sigma-Aldrich	9001-15-4	Enzym
Tecan Spark	Tecan		of vergelijkbare multimode platereader
Chemidoc MP Imager	Biorad		of vergelijkbare SDS-PAGE gel imager
4-12% Bis-Tris Gels	Invitrogen	NW04125	SDS-PAGE gels
Biophotometer	Eppendorf		of vergelijkbare cuvetspectrofotometer
Nanodrop One	Thermofisher		Nanodrop spectrofotometer
Avanti JXN-26 centrifuge	Beckman Coulter		of vergelijkbare centrifuge, met rotors/buizen beoordeeld op 10K en 50K g
5424R microcentrifuge	Eppendorf		of vergelijkbare microcentrifuge, met 1,5 ml microcentrifugebuizen
Flask Incubator Inova S44i	Eppendorf		of vergelijkbare flach incubatieschudmachine geschikt voor 5L Flessen
5L glazen kweekflessen			Baffled glazen flessen voor kweekgroei
Bactotryptone	BD	211705	Groeimedium
Yeast Extract	Merck	VM930053	Groeimedium
Glycerol			Elke analytische graad
Glucose			Elke analytische graad
KH2PO4			Elke analytische graad
K2HPO4			Elke analytische graad
UltraPure water	Invitrogen	10977-015	Of output van elke MilliQ-type waterdispenser