Hier presenteren we een robuuste methode voor in situ perfusie van de muizenlever om de acute en directe regulatie van het levermetabolisme te bestuderen zonder de leverarchitectuur te verstoren, maar in afwezigheid van extra-hepatische factoren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Glucoseproductie in de lever, ureagenese en lipolyse gekwantificeerd met behulp van het geperfuseerde levermodel van muizen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De lever heeft tal van functies, waaronder het metabolisme van voedingsstoffen. In tegenstelling tot andere in vitro en in vivo modellen van leveronderzoek, maakt de geïsoleerde geperfuseerde lever de studie van de leverbiologie en het metabolisme in de hele lever mogelijk met een intacte leverarchitectuur, gescheiden van de invloed van extra-hepatische factoren. Leverperfusies zijn oorspronkelijk ontwikkeld voor ratten, maar de methode is ook aangepast aan muizen. Hier beschrijven we een protocol voor in situ perfusie van de muizenlever. De lever wordt antegrade geperfundeerd door de poortader met zuurstofrijke Krebs-Henseleit bicarbonaatbuffer, en de output wordt verzameld uit de suprahepatische inferieure vena cava met klemming van de infrahepatische inferieure vena cava om het circuit te sluiten. Met behulp van deze methode kunnen de directe levereffecten van een teststof worden geëvalueerd met een gedetailleerde tijdresolutie. De leverfunctie en levensvatbaarheid zijn stabiel gedurende ten minste 3 uur, waardoor interne controles in hetzelfde experiment kunnen worden opgenomen. De experimentele mogelijkheden met behulp van dit model zijn talrijk en kunnen inzicht geven in leverfysiologie en leverziekten.
Inleiding
De lever is een essentieel orgaan in de stofwisseling. Het speelt een sleutelrol bij de controle van de energiebalans van het hele lichaam door het glucose-, lipiden- en aminozuurmetabolisme te reguleren. De toename van leverziekten wereldwijd ontpopt zich als een grote wereldwijde gezondheidslast en er is meer kennis nodig over de pathofysiologie en de gevolgen daarvan voor de leverfuncties.
Er zijn verschillende in vitro modellen ontwikkeld voor onderzoek op de lever als aanvulling op in vivo studies. Geïsoleerde en gekweekte primaire hepatocyten van knaagdieren en mensen worden veel gebruikt. Niet-parenchymale cellen kunnen worden gescheiden van hepatocyten met behulp van differentiële en gradiëntcentrifugatie, en de co-cultuur van verschillende celtypen is nuttig voor het bestuderen van intercellulaire overspraak1. Hoewel primaire menselijke hepatocyten worden beschouwd als de gouden standaard voor het testen van de toxiciteit van geneesmiddelen, hebben verschillende onderzoeken aangetoond dat de hepatocyten snel dedifferentiëren in weefselkweek, wat resulteert in verlies van leverfuncties 2,3,4. Hepatocytenkweek in een 3D-sferoïde systeem verbetert de dedifferentiatie, is stabieler en lijkt de lever in vivo in hogere mate na te bootsen dan de traditionele 2D-kweeksystemen. Nauwkeurig gesneden leverplakken zijn een ander goed ingeburgerd in-vitromodel dat de weefselarchitectuur intact houdt en de niet-parenchymale cellen bevat die in de lever aanwezig zijn6. Meer geavanceerde in vitro modellen zijn onder meer lever-op-een-chip7 en leverorganoïden8. Bij al deze benaderingen is er echter een verlies van structurele integriteit en stromingsdynamiek, inclusief vectoriële portale leveraderstroom, wat waarschijnlijk van invloed is op de generaliseerbaarheid.
De geïsoleerde geperfuseerde rattenlever werd voor het eerst beschreven door Claude Bernard in 18559 en wordt nog steeds gebruikt op verschillende wetenschappelijke gebieden voor studies van leverbiologie, toxicologie en pathofysiologie. Voordelen van de geperfuseerde lever ten opzichte van de bovengenoemde in vitro modellen zijn onder meer het behoud van de leverarchitectuur, de vasculaire flow, de polariteit en zonering van de hepatocyten, en de interacties tussen hepatocyten en niet-parenchymale cellen. In vergelijking met in vivo studies maakt de geperfuseerde lever het mogelijk om het levermetabolisme op een geïsoleerde manier te bestuderen, waarbij extra-hepatische factoren die door het bloed worden gedragen, worden vermeden en met volledige controle over de experimentele omstandigheden. Er zijn in de loop der jaren verschillende wijzigingen aangebracht om het perfusiemodel van de lever van ratten te verbeteren10,11,12,13. Hoewel muizen zijn gebruikt voor geïsoleerde geperfuseerde leverstudies, is er minder literatuur beschikbaar. Hier presenteren we een methode voor in situ perfusie van de muizenlever door canulatie van de poortader en de suprahepatische vena cava inferior om de acute en directe metabole reacties op metabole substraten en hormonen te bestuderen zoals gemeten in het hepatische veneuze effluent van de muizenlever in real-time.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierproeven werden uitgevoerd met toestemming van de Deense inspectie voor dierproeven, het Ministerie van Milieu en Voedsel van Denemarken (vergunning 2018-15-0201-01397) en de lokale ethische commissie in overeenstemming met de EU-richtlijn 2010/63/EU, de National Institutes of Health (publicatie nr. 85-3) en volgens de richtlijnen van de Deense wetgeving inzake dierproeven (1987). Dit is een terminale procedure en de doodsoorzaak is verbloeding en perforatie van het middenrif onder diepe anesthesie.
1. Proefdieren
- Zorg voor muizen van de gewenste stam, leeftijd en geslacht. In deze studie werd gebruik gemaakt van mannelijke C57BL/6JRj-muizen in de leeftijd van 11-16 weken. Huisvest maximaal 5 mannelijke of 8 vrouwelijke muizen per kooi met ad libitum toegang tot voer en water en handhaaf een licht-donkercyclus van 12 uur/12 uur met lichten aan van 6 uur 's ochtends tot 6 uur 's avonds.
2. Preoperatieve voorbereidingen
- Maak een leverperfusiebuffer.
- Krebs-Henseleit Buffer. Meng en los 118 mmol/L NaCl, 4,7 mmol/L KCl, 1,2 mmol/L MgSO 4 en 1,2 mmol/LKH2 PO4 op in dH 2 O. Los 1,25 mmol/L CaCl2 op in een apart bekerglas en voeg de buffer toe.
- Los 25 mmol/L NaHCO3 op en voeg al roerend langzaam toe aan de buffer. Bewaar de buffer bij 4 graden. De buffer is minimaal 1 maand stabiel.
OPMERKING: Neerslag kan optreden als CaCl2 en NaHCO3 niet afzonderlijk worden opgelost voordat ze worden toegevoegd.
- Filtreer de perfusiebuffer door een filter van 2 μm en stel de pH in op 7,5 met HCl.
OPMERKING: Deze stap moet worden uitgevoerd op de experimentele dag, aangezien de pH in de loop van de tijd toeneemt, zelfs wanneer deze in gesloten kolven wordt bewaard. - Bereid testverbindingen in een hogere concentratie dan de gewenste eindconcentratie (bijv. 20x concentratie bij toediening met een snelheid van 0,175 ml/min via een zijarmpomp) in gefilterde en pH-aangepaste Krebs-Henseleit-perfusiebuffer. Verdun, indien relevant, de teststoffen in de perfusiebuffer van Krebs-Henseleit, waaraan 1% BSA als drager is toegevoegd (om hechting aan slangen en glaswerk te voorkomen, essentieel voor alle peptiden), gefilterd door een filter van geschikte grootte.
3. Werking en perfusie
OPMERKING: Een illustratie van de perfusie-opstelling die in dit onderzoek is gebruikt, wordt weergegeven in figuur 1.
- Vergas de perfusiebuffer (95% O 2, 5% CO2) gedurende ten minste 30 minuten om de lever van voldoende zuurstof te voorzien en om de juiste pH te handhaven vanaf het begin van de operatie (het bicarbonaatbuffersysteem bereikt een pH van 7,4 bij continue vergassing, zie aanvullende figuur 1).
- Verdoof een muis door ketamine (90 mg/kg) en xylazine (10 mg/kg) toe te dienen via intraperitoneale injectie.
- Plaats de muis op rugligging op een verwarmde operatietafel en bevestig het gebrek aan reflexen als reactie op de teenknijp. Spray met 70% ethanol om te voorkomen dat het haar aan de schaar blijft plakken. Door de muis op het warme oppervlak te bevestigen, wordt de stabiliteit voor de volgende procedures vergroot.
- Maak een incisie met een schaar aan de basis van de buik en knip aan beide kanten naar boven tot aan de ribbenkast om de buikholte bloot te leggen. Beweeg de darmen naar rechts met behulp van een wattenstaafje, waardoor de poortader bloot komt te liggen.
- Plaats twee ligaturen onder de poortader met behulp van een gebogen pincet en maak voor elke ligatuur een losse knoop.
- Breng een katheter van 0,7 mm in de poortader in. Verwijder bij perforatie de naald uit de katheter en leid de katheter door de ader totdat de punt van de katheter zich dicht bij de lever bevindt, zoals geïllustreerd in afbeelding 2. Er stroomt bloed in de katheter.
- Draai de ligaturen vast. Als de katheter niet met bloed is gevuld, vul deze dan met perfusiebuffer om te voorkomen dat er een luchtbel ontstaat.
- Bevestig de perfusiebuis en start de perfusie van de lever met Krebs-Henseleit bicarbonaatbuffer bij 37 °C door de rolpomp te starten met een perfusiedebiet van 0,8 ml/min. De lever wordt binnen enkele seconden bleek.
- Knip de ribbenkast en het middenrif af met een schaar. Op dit punt wordt het dier geëuthanaseerd. Plaats een ligatuur onder de suprahepatische inferieure vena cava met behulp van een fijne puntpincet. Plaats een pen, opgerold gaasje of een ander wegwerpartikel onder de achterkant van de muis om de ader toegankelijker te maken.
- Breng een katheter in de suprahepatische vena cava inferior in via het rechter atrium van het hart. Verwijder na perforatie de naald uit de katheter en leid de katheter door de ader totdat de punt van de katheter zich dicht bij de lever bevindt. Bloed- en perfusiebuffer raken onmiddellijk op.
- Draai de ligatuur vast en bevestig een buis voor het opvangen van perfusie-effluent. Zet alle buizen vast met waterdichte tape (gladde tape of iets dergelijks).
- Gebruik een vaatklemadapter om een vaatklem over de infrahepatische vena cava direct boven de rechter nierader te plaatsen om vermenging te voorkomen (Figuur 2).
- Verhoog het perfusiedebiet tot 3,5 ml/min en start een timer. Start de drukregistratie. Succesvolle perfusie resulteert meestal in een druk van ~10 mm/Hg.
- Bedek de lever met een steriel laken bevochtigd met zoutoplossing en voeg tijdens het experiment zoutoplossing toe om te voorkomen dat deze uitdroogt.
- Vang het perfusie-effluent gedurende 1 minuut op en meet het volume. Het volume moet ongeveer 3,5 ml/min zijn. Bijmenging van bloed wordt in dit stadium niet verwacht en het hart pompt niet meer.
- Wacht op een evenwichtsperiode van 30 minuten voordat u met het experiment begint.
Figuur 1: Een illustratie van de perfusie-opstelling. (A)De operatietafel wordt op een statief geplaatst en verwarmd tot 37 °C. De perfusiebuffer wordt vergast (95% O 2, 5 % CO2 ), verpompt via een peristaltische rolpomp en verwarmd in de warmtewisselaar met een ingebouwde bellenvanger. Het systeem bestaat verder uit een manometer en spindelpomp voor het instellen van de perfusiedruk. De perfusiedruk wordt continu geregistreerd en gevisualiseerd via een transducer op een pc, een drukregistratieprogramma. (B) Het rode vak vangt de aansluitingen van driewegafsluitkranen op. De eerste driewegkraan is open voor de infusie van een teststof via een spuitpomp, en de tweede is gesloten. De derde staat open voor continue drukmetingen. De vierde kraan kan worden gebruikt om inputmonsters te verzamelen, bijvoorbeeld voor gasanalyse over de geperfuseerde lever. De connectoren kunnen naar behoefte worden aangepast voor specifieke experimenten waarvoor meer of minder infuusleidingen nodig zijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Foto's van de buikholte van de muis voor en tijdens de leverperfusie. (A)De groene stip geeft de locatie aan van de punt van de poortaderkatheter. Het is belangrijk dat de punt van de katheter zich net onder het vertakkingspunt van de poortader in de linker en rechter portale aders van de lever bevindt, maar boven de pancreato-twaalfvingerige darmtak om lekkage te voorkomen. De gele stip geeft de juiste locatie aan van de vaatklem op de infrahepatische inferieure vena cava tussen de rechter nierader en de lever om terugstroming van bloed in de geperfuseerde lever te voorkomen. (B, C) Een geperfuseerde muizenlever met de twee katheters ingebracht in de poortader (B) en suprahepatische inferieure vena cava (C) en de vaatklem op de infrahepatische inferieure vena cava (B). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
4. Experimenteer
- Start het experiment door aan het einde van de evenwichtsperiode de eerste basismonsters te verzamelen met behulp van een fractiecollector. Verzamel monsters met het gewenste tijdsinterval en plaats ze onmiddellijk op ijs.
- Controleer de bellenvanger regelmatig en vul deze opnieuw met perfusiebuffer als deze bijna leeg is.
- Verzamel een monster van de buffer via een driewegkraan onmiddellijk voordat deze het orgaan binnenkomt en van de opvangkatheter die in de inferieure vena cava is ingebracht (nadat deze door de lever is geperfuseerd).
- Meet de monsters met een bloedgasanalysator om te bevestigen dat het orgaan metabolisch actief is (aangegeven door een toename van de partiële druk van CO2 en een verlaging van de pH).
- Herhaal stap 4.3-4.4 aan het einde van het experiment om de levensvatbaarheid gedurende het hele experiment te beoordelen (aanvullende figuur 2).
OPMERKING: De afname van de partiële zuurstofdruk biedt geen betrouwbare maatstaf voor de ademhaling vanwege het verlies van zuurstof uit slangen, het orgaan enz. - Start na 15 minuten basislijnperfusie de eerste stimulatie door een teststof via een driewegkraan toe te dienen met het gewenste debiet met behulp van een spuitpomp (bijv. 20x de concentratie van de teststof bij toediening met een snelheid van 0,175 ml/min via een zijarmpomp). U kunt ook de basisbuffer vervangen door een nieuwe (zuurstofrijke en verwarmde) buffer die de teststof in de eindconcentratie bevat.
- Stop de stimulatie en verzamel basislijnmonsters gedurende 20-30 minuten voordat u met de tweede stimulatie begint.
- Aan het einde van het experiment gedurende 5-10 minuten een geschikte positieve controle toedienen.
- Snijd na het experiment de geperfuseerde lever weg en weeg deze om de output te normaliseren tot levergewicht. Vries de lever snel in vloeibare stikstof in voor mogelijke meting van het eiwitgehalte om de output naar eiwitgehalte te normaliseren.
5. Biochemische metingen
- Kwantificeer de concentratie van het betreffende molecuul met behulp van tests die geschikt zijn voor metingen in perfusiebuffer (interne of in de handel verkrijgbare colorimetrische of ELISA-tests). De buffer is compatibel met de meeste op omics gebaseerde technieken zoals metabolomics en proteomics.
OPMERKING: In deze studie werd ureum gemeten op basis van een colorimetrische test die eerder is beschreven14. Glucose en niet-veresterde vetzuren werden gekwantificeerd met behulp van in de handel verkrijgbare kits.
6. Data-analyse
- Presenteer de gegevens in XY-grafieken die de secretoire output in de loop van de tijd laten zien.
OPMERKING: Het is een van de voordelen van het in-vitroperfusiesysteem dat het mogelijk is om gegevens uit te drukken als de werkelijke output (concentratie × stroomsnelheid, bijv. μmol/min) in plaats van de gemeten concentratie in de output (mmol/L) zoals in in vivo studies. Overweeg om de output te normaliseren naar het levergewicht bij het vergelijken van verschillende muismodellen of naar het totale eiwitgehalte (gemeten door BCA) bij het vergelijken van controlemuizen met muismodellen met obesitas of leverziekten waarbij een toename van het levergewicht te wijten kan zijn aan een verhoogd vetgehalte. - Presenteer samenvattende gegevens als individuele stippen per dier die de gemiddelde of totale output vertegenwoordigen tijdens de uitgangswaarde en gedurende een stimulatieperiode (meestal 15-30 min) of incrementele output met behulp van de voorgaande basislijn voor elke stimulatieperiode, afhankelijk van de onderzoeksopzet.
- Analyseer de gegevens met behulp van een gepaarde t-test (twee groepen) of eenrichtings-ANOVA met herhaalde stimulaties (meer dan twee groepen) met een geschikte post-hoctest voor meervoudige tests.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een stabiele basislijn is nodig om te bepalen of een stimulus of substraat leidt tot het vrijkomen van het betreffende molecuul. Figuur 3A toont een voorbeeld van een succesvol experiment. De productie van ureum in de geperfuseerde lever wordt gemeten met tussenpozen van 2 minuten en weergegeven als gemiddelde ± SEM. De basisperioden voorafgaand aan elk van de twee stimulatieperioden zijn stabiel. De gemiddelde ureumproductie tijdens de twee stimulatieperiode...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De geïsoleerde geperfuseerde muizenlever is een sterk onderzoeksinstrument voor studies van de dynamiek en moleculaire mechanismen van het levermetabolisme. De mogelijkheid om monsters van minuut tot minuut te nemen, biedt een gedetailleerde evaluatie van het directe effect van een teststof op de lever. In vergelijking met in vivo studies stelt de geperfuseerde lever ons in staat om het levermetabolisme op een geïsoleerde manier te bestuderen, waarbij extra-hepatische factoren die door het bloed worden gedragen ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren geen belangenconflicten die relevant zijn voor dit artikel.
Dankbetuigingen
De studies en Nicolai J. Wewer Albrechtsen werden ondersteund door Novo Nordisk Foundation Excellence Emerging Investigator Grant - Endocrinology and Metabolism (Application No. NNF19OC0055001), European Foundation for the Study of Diabetes Future Leader Award (NNF21SA0072746) en Independent Research Fund Denmark, Sapere Aude (1052-00003B). Novo Nordisk Foundation Center for Protein Research wordt financieel ondersteund door de Novo Nordisk Foundation (Grant agreement NNF14CC0001). Figuur 1B is gemaakt met biorender.com. We danken Dr. Rune E. Kuhre (Novo Nordisk A/S) voor vruchtbare discussies over de geperfuseerde muizenlever.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 3-weg stopkraan | BD | 394601 | |
| Altromin fokkersvoer | Altromin Spezialfutter | 1319 | |
| Calciumchloridedihydraat (CaCl2·2H2O) | Sigma | C8106 | |
| Katheters (0,7 mm) | BD | 381812 | |
| Filterpapier (porengrootte 2,0 µm) | Millipore | AP2029325 | |
| Glucosekit | QuantiChromTM | DIGL-100 | Laag concentratie protocol |
| Ketamine | MSD Animal Health | 511485 | 90 mg/kg |
| Ligatuur (zwarte steriele zijde) | Agnthos | 14739 | |
| Magnesiumsulfaat (MgSO4) | Sigma | 230391 | |
| Non-esterified vetzuurkit | Fujifilm Wako Chemicals | NEFA-HR(2) | |
| Operatietafel, verwarmd op statief, type 873 | Harvard Bioscience, Inc. | 733776 | |
| Kaliumchloride (KCl) | Sigma | P9541 | |
| Kaliumdihydrogeenfosfaat(KH2PO4) | Merck | 1.04877 | |
| Rollerpomp, met vier kanalen | Harvard Bioscience, Inc. | 730100 | |
| Sleek tape | Mediq danmark | 4001910 | |
| Natriumbicarbonaat (NaHCO3) | Sigma | S5761 | |
| Natriumchloride (NaCl) | Sigma | S1679 | |
| Thermostatische circulator | Harvard Bioscience, Inc. | 730125 | Badvolume 3 L, 230 V/50 Hz |
| Slang | Tygon | E3603 | Binnendiameter 1,59 mm, buitendiameter 3,18 mm |
| Universeel perfusiesysteem | Harvard Bioscience, Inc. | 732316 | Basiseenheid uniper UP-100, type 834 |
| Vamin | Fresenius Kabi | B05ABA01 | Gemengde aminozuren |
| Vatklemadapter | Deutsche Biomedical | DBC1002 | |
| Vatklemmetjes | Deutsche Biomedical | DBC1005 | |
| Windkessel | Harvard Bioscience, Inc. | 732068 | |
| Xylazin | Rompun Vet | 530701 | 10 mg/kg |
Referenties
- Bale, S. S., Geerts, S., Jindal, R., Yarmush, M. L. Isolation and co-culture of rat parenchymal and non-parenchymal liver cells to evaluate cellular interactions and response. Scientific Reports. 6, 25329(2016).
- Lauschke, V. M., et al. Massive rearrangements of cellular MicroRNA signatures are key drivers of hepatocyte dedifferentiation. Hepatology. 64 (5), 1743-1756 (2016).
- Seirup, M., et al. Rapid changes in chromatin structure during dedifferentiation of primary hepatocytes in vitro. Genomics. 114 (3), 110330(2022).
- Gupta, R., et al. Comparing in vitro human liver models to in vivo human liver using RNA-Seq. Archive of Toxicology. 95 (2), 573-589 (2021).
- Bell, C. C., et al. Characterization of primary human hepatocyte spheroids as a model system for drug-induced liver injury, liver function, and disease. Scientific Reports. 6, 25187(2016).
- Dewyse, L., Reynaert, H., van Grunsven, L. A. Best practices and progress in precision-cut liver slice cultures. International Journal of Molecular Sciences. 22 (13), 7137(2021).
- Li, X., George, S. M., Vernetti, L., Gough, A. H., Taylor, D. L. A glass-based, continuously zonated and vascularized human liver acinus microphysiological system (vLAMPS) designed for experimental modeling of diseases and ADME/TOX. Lab on a Chip. 18 (17), 2614-2631 (2018).
- Broutier, L., et al. Culture and establishment of self-renewing human and mouse adult liver and pancreas 3D organoids and their genetic manipulation. Nature Protocols. 11 (9), 1724-1743 (2016).
- Bartošek, I., Guaitani, A., Miller, L. L. Isolated Liver Perfusion and its Applications. , Raven Press. New York. (1973).
- Gores, G. J., Kost, L. J., LaRusso, N. F. The isolated perfused rat liver: conceptual and practical considerations. Hepatology. 6 (3), 511-517 (1986).
- Mischinger, H. J., et al. An improved technique for isolated perfusion of rat livers and an evaluation of perfusates. Journal of Surgical Research. 53 (2), 158-165 (1992).
- Vairetti, M., et al. Correlation between the liver temperature employed during machine perfusion and reperfusion damage: role of Ca2. Liver Transplantation. 14 (4), 494-503 (2008).
- Ferrigno, A., Richelmi, P., Vairetti, M. Troubleshooting and improving the mouse and rat isolated perfused liver preparation. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 107-114 (2013).
- Zawada, R. J. X., Kwan, P., Olszewski, K. L., Llinas, M., Huang, S. -G. Quantitative determination of urea concentrations in cell culture medium. Biochemistry and Cell Biology. 87 (3), 541-544 (2009).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
