Een eenvoudig, snel en gedeeltelijk geautomatiseerd protocol voor de isolatie van afzonderlijke kernen uit ingevroren zoogdierweefsels voor sequencing van één kern

Summary

De studie beschrijft een eenvoudig, snel en gedeeltelijk geautomatiseerd protocol om kernen van hoge kwaliteit te isoleren uit bevroren zoogdierweefsels voor stroomafwaartse RNA-sequencing met één kern.

Abstract

Single-cell en single-nucleus RNA-sequencing zijn veel voorkomende laboratoriumtoepassingen geworden vanwege de schat aan transcriptomische informatie die ze bieden. Met name single-nucleus RNA-sequencing is nuttig voor het onderzoeken van genexpressie in moeilijk te dissociëren weefsels. Bovendien is deze aanpak ook compatibel met bevroren (archief)materiaal. Hier beschrijven we een protocol om hoogwaardige single nuclei uit ingevroren zoogdierweefsels te isoleren voor downstream single nucleus RNA sequencing op een gedeeltelijk geautomatiseerde manier met behulp van in de handel verkrijgbare instrumenten en reagentia. In het bijzonder wordt een robotdissociator gebruikt om weefselhomogenisatie te automatiseren en te standaardiseren, gevolgd door een geoptimaliseerde chemische gradiënt om de kernen te filteren. Ten slotte tellen we nauwkeurig en automatisch de kernen met behulp van een geautomatiseerde fluorescerende cellenteller. De prestaties van dit protocol worden aangetoond op muizenhersenen, rattennieren en cynomolguslever- en miltweefsel. Dit protocol is eenvoudig, snel en gemakkelijk aan te passen aan verschillende zoogdierweefsels zonder uitgebreide optimalisatie en biedt kernen van goede kwaliteit voor stroomafwaartse RNA-sequencing met één kern.

Introduction

Single-cell (sc) en single-nucleus (sn) RNA-sequencing zijn veelgebruikte protocollen geworden in de moleculaire en cellulaire biologie vanwege de verhoogde resolutie van genexpressie in vergelijking met bulk-RNA-sequencing. De isolatie van eencellige en eenkernige preparaten van goede kwaliteit uit vaste weefsels blijft echter een uitdaging en is vaak de snelheidsbeperkende stap in sc/sn-RNAseq-experimenten. Er is inderdaad een overvloed aan protocollen ontwikkeld die verschillende chemische en mechanische procedures gebruiken om cel-/kernsuspensies^{te verkrijgen} 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 . Bovendien variëren strategieën om dergelijke preparaten te verwijderen van puin/klonten, enz., van stroomsortering tot filtratie tot wassen. Dergelijke protocollen zijn vaak handmatig (wat leidt tot gebruikersgerelateerde variabiliteit), kunnen tijdrovend zijn (wat leidt tot verminderde levensvatbaarheid van cellen/kernen) en/of vereisen mogelijk toegang tot een flowcytometer voor het sorteren van cellen/kernen. Deze studie richtte zich op het ontwikkelen van een eenvoudig, snel en gedeeltelijk geautomatiseerd isolatieprotocol met één kern uit bevroren zoogdierweefsels voor stroomafwaartse RNA-sequencingtoepassingen. We hebben ons specifiek gericht op kernisolatie in tegenstelling tot celisolatie, omdat dit compatibel is met het gebruik van ingevroren weefsels, waardoor het verzamelen/verwerken van monsters praktischer wordt en onbevooroordeelde batching van monsters mogelijk wordt, vooral in experimenten met een tijdsverloop. Bovendien, hoewel het nucleaire transcriptoom het cellulaire transcriptoom niet volledig weerspiegelt, hebben verschillende onderzoeken nu aangetoond dat RNA-sequencinggegevens met één kern vergelijkbaar zijn met single-cell RNA-sequencinggegevens voor identificatie van celtypen, ook al kunnen de verhoudingen van celtypen variëren 6,16,17,18,19.

Kernisolatie bestaat uit verschillende stappen: 1) mechanische of chemische verstoring van het weefsel om de kernen vrij te maken, 2) opruimen van puin en klonten, en 3) nauwkeurig tellen van kernen voor voorbereiding voor stroomafwaartse toepassingen. In een aantal protocollen wordt in stap 1 vaak een Dounce-homogenisator gebruikt om het weefsel te verstoren ^3,20. Als alternatief kunnen chemische methoden worden gebruikt, hoewel deze vaak moeten worden geoptimaliseerd voor verschillende weefsels ^2,5,6. We hebben ervaren dat een handmatige weefseldisruptieprocedure gevoelig is voor operator-geassocieerde variabiliteit, wat leidt tot variabele kwaliteit en opbrengst van kernen. Om de technische variabiliteit te minimaliseren en een consistenter en reproduceerbaarder protocol te hebben dat in verschillende weefsels werkt, werd een protocol ontwikkeld dat gebruik maakt van een in de handel verkrijgbare robotweefseldissociator²¹. Voor stap 2, hoewel bufferuitwisseling meestal de eenvoudigste manier is om kernen te wassen, hebben we het gebruik van een relatief korte centrifugatiestap met sucrosegradiënt aangenomen om het puin grondiger te verwijderen. Specifiek voor hersenweefsel gebruiken we een silica-colloïdgradiënt in plaats van een sucrose-gradiënt voor een effectievere myelineverwijdering. Ten slotte is het gebruik van een hemocytometer voor het tellen de gouden standaard voor het tellen en visueel inspecteren van de kernen. In ons protocol kan deze stap op betrouwbare wijze worden geautomatiseerd met behulp van een in de handel verkrijgbare geautomatiseerde fluorescentiecelteller²². Dit protocol is getest en is compatibel met verschillende ingevroren zoogdierweefsels, waaronder hersenen, nieren, milt en lever, van verschillende zoogdiersoorten (rat, muis en niet-menselijke primaat) en biedt kernen van goede kwaliteit voor stroomafwaartse RNA-sequencing met één kern met een op druppeltjes gebaseerd commercieel platform. Het protocol duurt ongeveer 75 minuten vanaf de weefselvoorbereiding tot het begin van de single-nuclei RNA-sequencing-workflow.

Protocol

Alle dierproeven werden uitgevoerd met de goedkeuring van de kantonnale veterinaire autoriteit van Basel-Stadt in strikte overeenstemming met de Zwitserse federale regelgeving inzake dierenbescherming of met de goedkeuring van de institutionele commissie voor dierenverzorging en -gebruik in overeenstemming met de Duitse dierenwelzijnswet.

1. Voorbereiding van weefsels en reagens/instrumenten

1. Reiniging en voorbereiding van het instrument
   1. Reinig werkbladen en pincetten met 70% ethanol en RNase-ontsmettingsoplossing. Koel de centrifuges voor tot 4 °C.
   2. Koel de nuclei isolatiepatronen voor in de koelkast op 4 °C gedurende ten minste 30 min.
   3. Start de robotdissociator en zet de koeling aan door de schuifregelaar rechtsboven in het scherm op koelen te zetten en door erop te klikken om te beginnen met koelen zodat de schuifregelaar oranje lijkt. Controleer of de bijgevoegde fles met nuclei storage reagens (NSR) en de fles met nuclei isolation buffer (NIB) voldoende vloeistof over hebben en goed zijn gekoeld.
   4. Zet een doos van polystyreenschuim gevuld met droogijs en koel petrischaaltjes en scalpelmesjes voor op droogijs.
2. Buffer voorbereiding
   1. Bereid de 1,5 M sucrosekussenoplossing (SCS) zoals weergegeven in tabel 1. Verdeel de SCS in aliquots van 500 μl in DNase/RNase-buisjes van 2 ml om vier SCS-aliquots van 500 μl per monster te verkrijgen. Bewaar de aliquots op ijs tot verder gebruik.
   2. In het geval van verwerking van hersenweefsel, bereid in plaats daarvan een 18% silica-colloïdoplossing zoals beschreven in tabel 2, door de silica-colloïdstockoplossing in NSR te verdunnen en RNaseremmer toe te voegen. Bereid 3 ml 18% silica-colloïdoplossing per monster en bewaar deze op ijs.

2. Weefselhomogenisatie en isolatie van kernen

1. Haal het monster uit de vriezer van -80 °C en plaats het onmiddellijk op droogijs.
2. Snijd het monster op een voorgekoelde petrischaal of metalen plaat op droogijs met een voorgekoelde scalpel in een stuk van 15-50 mg (als het nog niet de juiste maat heeft). Zorg ervoor dat u het monster in de juiste richting snijdt, zodat het monster nog steeds representatief is voor de orgaanstructuren van belang.
   OPMERKING: Met dit protocol is 15-50 mg de optimale steekproefomvang voor nucleaire extractie. Om na het opruimen een goede opbrengst te behalen, wordt een steekproefomvang van minimaal 25 mg aanbevolen. Voor kleinere monsters zijn speciale cartridges beschikbaar die zijn geoptimaliseerd voor het verwerken van kleine inputs met de robotdissociator. Kleine input nuclei isolatiecartridges werden gebruikt om weefselmonsters met een gewicht van slechts 4 mg te dissociëren met voldoende opbrengst voor stroomafwaartse RNA-sequencing van enkele kernen. Tabel 3 geeft een voorbeeld van de opbrengst van kernen met behulp van de cartridge met lage invoer uit leverweefsel van ratten.
3. Haal de nuclei-isolatiepatroon uit de koelkast, pak het uit, verwijder de molen en pipetteer 15 μL RNaseremmer (40 E/μL) op de bodem van het patroon.
   OPMERKING: Tijdens de extractie van de kernen voegt de robotdissociator NIB en NSR toe aan de cartridge tot een totaal volume van 3 ml (met het protocol voor het extraheren van kernen met een laag volume). Door voorafgaand aan de extractie 15 μL RNaseremmer (40 E/μL) aan de cartridge toe te voegen, heeft de suspensie de gewenste RNAse-remmerconcentratie van 0,2 E/μL.
4. Plaats het weefselmonster met een pincet op de bodem van de patroon. Plaats het monster niet precies in het midden van de cartridge om een optimale verstoringsefficiëntie te hebben.
5. Selecteer Een protocol uitvoeren op het instrument en klik op de optie Nuclei in de linkerbovenhoek.
   1. Selecteer in het menu het Low Volume Nuclei Isolation-protocol en controleer of de verstoringssnelheid is ingesteld op hoog door op Wijzigen te klikken. Laad de cartridge in het instrument door de deur te openen en het podium uit te schuiven door de rode knop op te tillen.
   2. Plaats de cartridge op de daarvoor bestemde plaats, draai aan de cartridgevergrendeling en schuif deze in de werktafel totdat de rode knop op zijn plaats klikt. Sluit de deur en start de kernextractie op het instrument door op Volgende te klikken. De run duurt ongeveer 7 min.
6. Zodra de run is voltooid, verwijdert u de cartridge uit het instrument door de rode knop op te tillen en de tafel eruit te trekken. Plaats de patroon onmiddellijk op ijs.
7. Ga voor alle weefsels behalve de hersenen verder met stap 3.1. Ga voor hersenmonsters direct door naar stap 3.2.

3. Opruimen van kernen

1. Sucrose gradiënt opruimen
   OPMERKING: Voor hersenweefsel slaat u deze stap over en gaat u direct naar stap 3.2. Alle opruimstappen worden uitgevoerd op ijs om de afbraak van RNA te minimaliseren. Buffers en buizen en de centrifuges moeten worden voorgekoeld. Alle hersuspensie- en mengstappen worden alleen uitgevoerd door zorgvuldig pipetteren, omdat vortexen de kwaliteit en integriteit van de kernen in gevaar kunnen brengen.
   1. Prik voorzichtig met een pipetpunt in de ronde folie op de dissociatorpatroon.
      OPMERKING: Na dissociatie heeft de resulterende kernsuspensie een volume van ongeveer 2 ml. Om het opruimen van de sucrosegradiënt te vergemakkelijken, verdeelt u de nuclei-suspensie in twee aliquots van 900 μL, wat resulteert in een totaal volume van 1,8 ml nuclei-suspensie dat tijdens het opruimen wordt gebruikt.
   2. Verwijder het eerste aliquot van 900 μl van de nucleisuspensie uit de patroon en voeg het toe aan een SCS-aliquot van 500 μl dat eerder in een buisje van 2 ml is bereid. Meng goed door te pipetteren tot het mengsel homogeen is.
   3. Verwijder het 1400 μl kernsuspensie - SCS-mengsel en breng het voorzichtig aan op een nieuw SCS-aliquot van 500 μl door de buis schuin te houden en het mengsel druppelsgewijs toe te voegen, zodat een duidelijk zichtbare fasescheiding ontstaat (zie figuur 1A).
   4. Sluit de buis voorzichtig en plaats deze terug op ijs zonder de fasescheiding te verstoren.
   5. Herhaal de stappen 3.1.2-3.1.4 met het tweede aliquot van 900 μl suspensie en een nieuw SCS-aliquot om twee buisjes van 2 ml per monster te hebben met een duidelijk zichtbare fasescheiding voor gradiëntcentrifugatie.
   6. Voeg de buisjes voorzichtig toe aan een voorgekoelde centrifuge en draai ze gedurende 15 minuten bij 4 °C op 13.000 x g .
   7. Bereid intussen de in tabel 4 beschreven NSR voor door de RNaseremmer toe te voegen aan een aliquotum van NSR. Bereid 1 ml NSR per monster.
      OPMERKING: Op dit punt kunnen de eencellige genexpressie-reagensgelkorrels uit de vriezer van -80 °C worden verwijderd, waardoor ze op kamertemperatuur (RT) kunnen worden gebracht, en de oligo van de sjabloonschakelaar kan opnieuw worden gesuspendeerd in een lage TE-buffer.
   8. Verwijder na het centrifugeren het supernatans uit beide buizen zonder de pellet te verstoren en resuspendeer de pellet voorzichtig in 50 μL ijskoude NSR volgens de aanbeveling van de fabrikant. Pool de twee pellets van hetzelfde monster in een nieuwe buis van 1,5 ml en voeg 900 μL ijskoude NSR toe tot een totaal volume van 1 ml. Goed mengen door te pipetteren.
   9. Centrifugeer het monster bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C met een rotorcentrifuge met zwenkbare emmer.
      OPMERKING: Het wordt ten zeerste aanbevolen om een rotor met zwenkbare emmer te gebruiken om het verlies van kernen te minimaliseren, vooral wanneer de opbrengst van de kernen naar verwachting laag zal zijn of wanneer u begint met kleine hoeveelheden weefsel.
   10. Bereid in de tussentijd 500 μL per monster van 1x PBS (zonder Ca2+ en Mg2+) met 0,04% runderserumalbumine (BSA) en 0,2 E/μL RNaseremmer zoals beschreven in tabel 5.
   11. Verwijder het supernatans voorzichtig zonder de pellet weg te gooien en resuspendeer de pellet in 100 μL PBS-oplossing zoals hierboven bereid (1x PBS + 0,04% BSA + RNaseremmer bij 0,2 E/μL).
       OPMERKING: Voor kleine weefselmonsters kan de kernconcentratie laag zijn en daarom wordt aanbevolen om de pellet te resuspenderen in slechts 50 μL PBS-oplossing om voldoende hoge concentraties te garanderen voor RNA-sequencing met één kern.
   12. Ga direct door naar stap 4.
2. Silica colloïde gradiënt opruimen
   OPMERKING: Voor hersenweefsel is een silica-colloïdgradiënt geschikter dan een sucrose-gradiënt om myeline en puin uit de kernsuspensie te verwijderen. Alle opruimstappen worden uitgevoerd op ijs om de afbraak van RNA te minimaliseren. Buffers en buizen, evenals de centrifuges, moeten worden voorgekoeld. Alle hersuspensie- en mengstappen worden alleen uitgevoerd door zorgvuldig pipetteren, omdat vortexen de kwaliteit en integriteit van de kernen in gevaar kunnen brengen.
   1. Prik voorzichtig met een pipetpunt in de ronde folie op de dissociatorpatroon.
   2. Verwijder de nuclei-suspensie uit de patroon en voeg deze toe aan een buisje van 5 ml.
   3. Centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C in een voorgekoelde centrifuge.
   4. Verwijder het supernatans voorzichtig zonder de pellet te verstoren en resuspendeer de pellet in 1 ml ijskoude 18% silica-colloïdoplossing.
   5. Voeg nog eens 2 ml 18% silicacolloïdoplossing toe tot een totaal volume van 3 ml en meng goed door te pipetteren.
   6. Centrifugeer het monster bij 700 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C in een rotor met zwenkbare emmer en de rem uitgeschakeld.
   7. Bereid in de tussentijd de in tabel 4 beschreven NSR voor door de RNaseremmer toe te voegen aan een aliquotum NSR. Bereid 1 ml NSR per monster.
      OPMERKING: Op dit punt kunnen de eencellige genexpressie-reagensgelkorrels uit de vriezer van -80 °C worden verwijderd, waardoor deze in evenwicht kan komen met RT en de sjabloonschakeloligo kan worden geresuspendeerd in een lage TE-buffer.
   8. Haal het monster voorzichtig uit de centrifuge zonder de myelinelaag die erop drijft te verstoren.
   9. Verwijder eerst de myelinelaag van de bovenkant en gooi deze weg; Verwijder vervolgens voorzichtig het hele supernatans zonder de pellet te verstoren.
      OPMERKING: De myelinelaag kan eenvoudig worden verwijderd door een steriel pluisvrij doekje om een pipetpunt van 1 ml te wikkelen om de myelinelaag samen met 1-2 ml van het supernatant op te zuigen.
   10. Resuspendeer de pellet in 1 ml ijskoude NSR volgens de aanbeveling van de fabrikant.
   11. Centrifugeer het monster bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C in een centrifuge met een rotor met een zwenkbare emmer.
       OPMERKING: Het wordt ten zeerste aanbevolen om een rotor met zwenkbare emmer te gebruiken om het verlies van kernen te minimaliseren, vooral wanneer de opbrengst van de kernen naar verwachting laag zal zijn of wanneer u begint met kleine hoeveelheden weefsel.
   12. Bereid in de tussentijd 500 μL per monster van 1x PBS (zonder Ca2+ en Mg2+) met 0,04% runderserumalbumine (BSA) en 0,2 E/μL RNaseremmer zoals beschreven in tabel 5.
   13. Verwijder het supernatans voorzichtig zonder de pellet te verstoren en resuspendeer het monster in 100 μL PBS-oplossing zoals hierboven bereid (1x PBS + 0,04% BSA + RNaseremmer bij 0,2 E/μL).
       OPMERKING: Voor kleine weefselmonsters kan de kernconcentratie laag zijn en daarom wordt aanbevolen om de pellet te resuspenderen in slechts 50 μL PBS-oplossing om voldoende hoge concentraties te garanderen voor RNA-sequencing met één kern.

4. Tellen

1. Verdun voor elk te tellen monster 10 μl kernsuspensie in 20 μl PBS-oplossing om een verdunning van 1:3 te verkrijgen.
2. Voeg voor het tellen 25 μL propidiumjodide (PI)-kleuroplossing toe aan een mengputje van de fluorescerende telplaat. Voeg 25 μl van de verdunde kernsuspensie toe en meng goed door te pipetteren. Breng het gekleurd monster van 50 μl over van de mengput naar de laadput.
3. Laad het telplaatje op de cellenteller en start de telling.
   OPMERKING: Het aantal kernen wordt genomen uit het rode fluorescerende kanaal met een belichtingstijd van 700 ms. Dit kanaal is geoptimaliseerd om een nauwkeurige telling van de kernen te krijgen door vergelijking met handmatige telling met een Neubauer-kamer en Trypan Blue-kleuring onder de microscoop. Bij hoge concentraties staan de kernen erg dicht bij elkaar, waardoor het voor de software moeilijk is om ze te scheiden. In dit geval wordt aanbevolen het monster in een geschikte verdunning te tellen. De integriteit van de kernen en de reinheid kunnen worden beoordeeld aan de hand van het heldere veldbeeld of onder een microscoop.
4. Verdun de monsters met PBS (1x PBS + 0,04% BSA + RNaseremmer bij 0,2 E/μL) tot de gewenste concentratie voor RNA-sequencing met één kern.
   OPMERKING: Concentraties tussen 700-1.200 nuclei/μL worden als optimaal beschouwd voor RNA-sequencing met één kern. Lagere celconcentraties, zoals 700 kernen/μL, kunnen leiden tot verminderde achtergrondbesmetting door omringend RNA.

5. Voorbereiding van de bibliotheek

1. Voer RNA-sequencing met één kern uit met de reagentia voor genexpressie van één cel met behulp van het protocol van de fabrikant dat gericht is op een kernherstel van 8000-10.000 kernen per monster.

6. Volgorde aanbrengen

1. Zet de volgorde van de bibliotheken met de gewenste sequentiediepte met paired-end, dubbele indexering en de volgende sequencing-lezingen: Read 1: 28 cycli, i7 Index: 10 cycli, i5 Index: 10 cycli en Read 2: 90 cycli.

Results

De prestaties en veelzijdigheid van dit protocol worden gedemonstreerd door het uitvoeren van RNA-sequencing met één kern op vers ingevroren occipitale cortexweefsel in de hersenen van drie B6-muizen, vers ingevroren transversaal gesneden nierweefsel van drie Wistar-ratten, gearchiveerd (11-jarige) lever- en miltweefsel van drie Mauritiaanse Cynomolgus-makaken. Alle dieren waren niet doorbloed.

Zoals te zien is in figuren 1B,C, werden kernen van goede kwaliteit verkregen die vrij waren van tekenen van blebbing, puin en klontering. De filtratie op basis van sucrosegradiënt werd geoptimaliseerd om het grootste deel van het puin te verwijderen door verschillende dichtheden, spinsnelheden en tijden te testen, en de nucleaire zuiverheid/integriteit onder een microscoop te beoordelen, evenals de verdeling en opbrengst van de kerngrootte te beoordelen (Figuur 1D). Hierdoor konden we kiezen voor een sucrosegradiëntdichtheid van 1,5 M en een korte centrifugetijd van 15 minuten gebruiken. Om de kwaliteit van de kernen verder te beoordelen, werden de gegevens vervolgens voorbewerkt met behulp van 10X Cell Ranger en werd verdere stroomafwaartse gegevensanalyse uitgevoerd met behulp van Besca²³. Kernen met >5% procent mitochondriale inhoud (omdat deze de neiging hebben om beschadigde/gestreste kernen te zijn) werden uitgefilterd en kernen met 500-7.000 genen (om lege druppeltjes en veelvouden te minimaliseren) werden behouden. We hebben alleen genen opgenomen die in ten minste 30 kernen aanwezig waren. We richtten ons op 8.000 kernen per hersenschorsmonster en 10.000 kernen per nier-, lever- en miltmonster. Na filtratie werden 10.644 hoogwaardige kernen uit de drie hersenmonsters, 14.960 hoogwaardige kernen uit de drie niermonsters, 18.795 hoogwaardige kernen uit de drie levermonsters en 13.882 hoogwaardige kernen uit de drie miltmonsters verkregen. Figuur 2A,D,G,J toont vioolplots die de verdeling van UMI-tellingen, gentellingen en mitochondriale inhoud in elk monster weergeven. Het mediane aantal tellingen over alle hersenmonsters was 7.563 UMI/kern en 3.208 genen/kern. Het mediane aantal tellingen over alle niermonsters was 3.841 UMI/kern en 1.915 genen/kern. Het mediane aantal tellingen over alle levermonsters was 2.649 UMI/kernen en 1.676 genen/kernen. Het mediane aantal tellingen over alle miltmonsters was 1.609 UMI/kernen en 1.138 genen/kernen. Vervolgens genereerden we clusters met behulp van zeer variabele genen en annoteerden ze met behulp van bekende markergenen 17,24,25,26. Zoals te zien is in figuur 2B,E,H,K, waren we in staat om de verwachte celtypen van elk weefsel te identificeren. Bovendien, zoals te zien is in figuur 2B,E,H,K, droegen alle dieren bij aan alle clusters, wat wijst op een algehele lage technische variabiliteit die door het protocol wordt geïntroduceerd. Bovendien waren de cellulaire verhoudingen in alle drie de monsters per weefseltype vergelijkbaar, evenals de UMI en het aantal genen (figuur 2A, C, D, F, G, I, J, L). Een opmerkelijke uitzondering is de lever, waar de hepatocytenpopulaties tussen de drie levermonsters verschillend waren in verhoudingen en profiel. Dit is hoogstwaarschijnlijk te wijten aan biologische verschillen tussen de dieren (geslacht, leeftijd, metabole status).

Figuur 1: Beoordeling van de kwaliteit van de kernen en optimalisatie van de sucrosegradiënt. (A) De verwachte fasescheiding tijdens het centrifugeren van de sucrosegradiënt wordt weergegeven met een pijl. (B) Representatieve fluorescerende beelden van met propidiumjodide gekleurd rattennier (boven) en cynomolgusmilt (onder) verkregen met het protocol. (C) Representatieve helderveldmicroscopiebeelden van kernen geïsoleerd uit muizenlever (boven) en muizenhersenen (onder), schaalbalk 500 μm. Let op het regelmatige gladde oppervlak van kernen dat wijst op een goede nucleaire kwaliteit. (D) Optimalisatie van de sucrosegradiënt. Verschillende sucrosedichtheden, centrifugesnelheden en centrifugetijden werden getest. Helderveldmicroscopiebeelden van kernen, kerngrootteverdeling en kernopbrengst worden voor elke aandoening weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Representatieve gegevens van snRNAseq over de occipitale cortex van muizen, de nier van ratten (cortex en medulla) en de lever en milt van cynomolgus-makaak. (A) Vioolgrafieken die de verdeling van genen/kern, UMI's/kern en percentage mitochondriale inhoud per hersenmonster laten zien. (B) Linkerpaneel: UMAP-grafiek met de bijdrage van elk monster aan de clusters die in de hersenen zijn geïdentificeerd. Rechterpaneel: UMAP met de identiteiten van de clusters geannoteerd op basis van markergenen in hersenweefsel. (C) Cellulaire verhoudingen waargenomen in de 3 hersenmonsters. (D) Vioolgrafieken met de verdeling van genen/kern, UMI's/kern en procentuele mitochondriale inhoud per niermonster. (E) Linkerpaneel: UMAP-grafiek met de bijdrage van elk monster aan de in de nier geïdentificeerde clusters. Rechterpaneel: UMAP met de identiteiten van de clusters geannoteerd op basis van markergenen in nierweefsel. (F) Cellulaire verhoudingen waargenomen in de 3 niermonsters. (G) Vioolgrafieken met de verdeling van genen/kern, UMI's/kern en procentuele mitochondriale inhoud per levermonster. (H) Linkerpaneel: UMAP-grafiek met de bijdrage van elk monster aan de clusters die in de lever zijn geïdentificeerd. Rechterpaneel: UMAP met de identiteiten van de clusters geannoteerd op basis van markergenen in leverweefsel. (I) Cellulaire verhoudingen waargenomen in de 3 levermonsters. (J) Vioolgrafieken met de verdeling van genen/kern, UMI's/kern en procentuele mitochondriale inhoud per miltmonster. (K) Linkerpaneel: UMAP-grafiek met de bijdrage van elk monster aan de clusters die in de milt zijn geïdentificeerd. Rechterpaneel: UMAP met de identiteiten van de clusters geannoteerd op basis van markergenen in miltweefsel. (L) Cellulaire verhoudingen waargenomen in de 3 miltmonsters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Onderdelen	Concentratie van de voorraad	Volume per monster	Uiteindelijke concentratie
Sucrose Kussen Oplossing	2 M boven NN	1500 μL	1,5 m boven zeeniveau
Sucrose Kussen Buffer	-	500 μL	-
Dithiothreitol (DTT)	1 M boven NN	2 μL	1 mM
RNAse-remmer	40 E/μL	10 μL	0,2 E/μL

Tabel 1: Bereiding van 1,5 M sucrosekussenoplossing (SCS). Deze oplossing wordt gebruikt voor het centrifugeren van de sucrosegradiënt tijdens het opruimen in stap 3.1 en moet elke keer vers worden bereid voordat het protocol wordt gestart. Houd de SCS altijd op ijs tijdens het protocol. Naar de oplossingen die in deze tabel worden genoemd, wordt verwezen in de materiaaltabel.

Onderdelen	Concentratie van de voorraad	Volume per monster	Uiteindelijke concentratie
Silica colloïde voorraadoplossing	90%	600 μL	18%
Reagens voor opslag van kernen (S2 Genomics)	-	2400 μL	-
RNAse-remmer	40 E/μL	15 μL	0,2 E/μL

Tabel 2: Bereiding van 18% silicacolloïdoplossing. Deze oplossing wordt gebruikt voor het centrifugeren van de silicacolloïdgradiënt tijdens het opruimen in stap 3.2 en moet elke keer vers worden bereid voordat het protocol wordt gestart. Bewaar de 18% silica colloïd oplossing altijd op ijs tijdens het protocol.

Weefsel	Gewicht van de steekproef	Patroon	Opbrengst
Rattenlever	25 mg	Nuclei Isolatie Cartridge	65.000 kernen per mg weefsel
Rattenlever	4 mg	Isolatiecartridge voor kleine invoerkernen	32.000 kernen per mg weefsel

Tabel 3: Kernopbrengst van de isolatiecartridge met lage input van kernen versus de kernisolatiecartridge na het opschonen van de sucrosegradiënt.

Onderdelen	Concentratie van de voorraad	Volume per monster	Uiteindelijke concentratie
Het Reagens van de Opslag van Kernen	-	1000 μL	-
RNAse-remmer	40 E/μL	5 μL	0,2 E/μL

Tabel 4: Bereiding van nuclei storage reagens (NSR). Deze oplossing wordt gebruikt tijdens de Nuclei Isolation in stap 3-5 en tijdens de clean-up in stap 3.1.8. Het kan maximaal 4 maanden bij 4 °C worden bewaard. Bereid een vers aliquot met RNaseremmer tijdens de centrifugatiestap in de opruimstap 6. Naar de oplossingen die in deze tabel worden genoemd, wordt verwezen in de materiaaltabel.

1x PBS + 0,04% BSA-voorraadoplossing
Onderdelen	Concentratie van de voorraad	Volume voor voorraad	Uiteindelijke concentratie
PBS (geen Ca 2+, geen Mg2+)	1x	30 ml	-
Runderserumalbumine (BSA)	30%	40 μL	0.04%
1x PBS + 0,04% BSA + 0,2 E/μL RNAse-remmer
Onderdelen	Concentratie van de voorraad	Volume per monster	Uiteindelijke concentratie
1x PBS + 0,04% BSA-voorraadoplossing	-	500 μL	-
RNAse-remmer	40 E/μL	2,5 μL	0,2 E/μL

Tabel 5: Bereiding van PBS + 0,04% BSA. Deze oplossing wordt gebruikt aan het einde van de clean-up in stap 3.1.10 en na het tellen om de nuclei suspensie te verdunnen tot de gewenste concentratie voor 10X single nuclei RNA sequencing (telstap 4.4). De voorraadoplossing kan maximaal 1 maand bij 4 °C worden bewaard. Bereid een vers aliquot met RNaseremmer tijdens de centrifugatiestap in de opruimstap 6.

Discussion

We hebben een veelzijdig en gedeeltelijk geautomatiseerd protocol ontwikkeld om hoogwaardige enkelvoudige kernen te verkrijgen uit ingevroren zoogdierweefsels en hebben het protocol gedemonstreerd op muizenhersenen, rattennieren en cynomolguslever- en miltweefsel.

Wanneer we de prestaties van dit protocol vergelijken met die van andere gepubliceerde protocollen voor single nucleus RNA-sequencing in hersen-, nier-, milt- en leverweefsel 6,7,20,24,25,26^, zien we dat we in staat zijn om een vergelijkbaar aantal genen en UMI-tellingen per kern te detecteren en in staat zijn om de verwachte celtypen te herstellen. In vergelijking met bestaande methoden zijn er verschillende voordelen aan dit protocol. Ten eerste automatiseert het protocol in deze studie weefselhomogenisatie en isolatie van afzonderlijke kernen. Dit wordt bereikt met behulp van een robotische weefselverstoorder²¹. In de meeste protocollen wordt weefsel gehomogeniseerd met een Dounce-homogenisator om enkele kernen ^3,20 vrij te maken. We hebben echter gemerkt dat deze handmatige stap kan leiden tot experimentele variabiliteit in de opbrengst en integriteit van de kernen, afhankelijk van de hoeveelheid kracht die wordt uitgeoefend tijdens homogenisatie, waardoor de reproduceerbaarheid van de experimenten in gevaar komt. Hier, door gebruik te maken van een geautomatiseerde weefselmolen met vaste instellingen, werden een goede kernkwaliteit en opbrengst met een grotere consistentie verkregen in alle experimenten. Bovendien verkort het automatiseren van deze stap ook de hands-on tijd van het protocol (de weefseldisruptiestap duurt ongeveer 7 minuten), waardoor de gebruiker zich kan voorbereiden op de volgende stappen. Ten tweede is het protocol dat in deze studie wordt beschreven veelzijdig, d.w.z. het is compatibel met verschillende weefsels van verschillende soorten. Dit stelt ons in staat om langdurige protocoloptimalisatie te vermijden, bijvoorbeeld om homogenisatiebuffers/detergenten voor verschillende weefsels te identificeren ^2,5,6. Ten derde is dit protocol niet afhankelijk van toegang tot een flowsorter om schone kernen te verkrijgen, waardoor het toegankelijker wordt voor laboratoria die niet over de vereiste apparatuur/expertise voor flowsorting beschikken. In plaats daarvan hebben we de filtratie op basis van sucrosegradiënt geoptimaliseerd om het meeste vuil te verwijderen. Met name voor hersenweefsel wordt echter aanbevolen om een silica-colloïdgradiënt te gebruiken in plaats van een sucrosegradiënt voor een efficiëntere verwijdering van myeline. We hebben ook ontdekt dat het gebruik van een zwenkbare emmerrotor aan het einde van de centrifugatiestap met sucrose/silica colloïdegradiënt het verlies van kernen minimaliseert. Daarom wordt het gebruik van een dergelijke rotor ten zeerste aanbevolen. Ten vierde, na het testen van meerdere methoden om kernen te tellen (handmatig tellen onder de microscoop, gebruik van verschillende geautomatiseerde tellers), wordt het gebruik van een geautomatiseerde fluorescerende celteller²² aanbevolen. Het gebruik van een DNA-intercalerende kleurstof, zoals propidiumjodide, verhoogt de nauwkeurigheid van het tellen van de kernen. Ten vijfde duurt dit protocol ongeveer 75 minuten vanaf het begin tot het laden van de microfluïdische chip. Dit helpt ervoor te zorgen dat de integriteit van de kernen hoog blijft bij het verwerken van meerdere monsters. Ten slotte hebben we geconstateerd dat het protocol ook compatibel is met in optimale snijtemperatuur (OCT) ingebed weefsel. Als dergelijk materiaal wordt gebruikt, kan het weefsel vóór homogenisatie met een scalpel uit het OCT-blok worden verwijderd.

Een veel voorkomende uitdaging in datasets voor de sequentiebepaling van RNA met één kern is de aanwezigheid van omringend RNA, dat zowel niet-nucleair (bijv. mitochondriaal) als nucleair afgeleid kan zijn^27,28. In ons protocol is mitochondriaal RNA (een proxy voor niet-nucleair omgevings-RNA) laag, zelfs vóór het filteren (0,1-1,6% voor de getoonde weefsels). Net als bij andere protocollen en datasets is er echter nog steeds omringende RNA-besmetting van genen met een hoge expressie in de kernen van overvloedige celtypen (zoals hepatocyten in de lever, neuronen in de hersenen, enz.)²⁷. Er bestaan verschillende bio-informaticatools, zoals CellBender, SoupX, enz., die dergelijke omringende RNA-besmetting kunnen verwijderen voorafgaand aan nuclei-annotatie 29,30,31. Een andere beperking van dit protocol is dat, hoewel de stappen voor weefselverstoring en isolatie van kernen geautomatiseerd zijn, de doorvoer van deze stap nog steeds beperkt is omdat er slechts één monster tegelijk kan worden verwerkt. Aangezien deze stap echter slechts ongeveer 7 minuten per stuk weefsel in beslag neemt, kunnen er nog steeds meerdere monsters in een batch worden verwerkt. We verwerken doorgaans vier monsters per batch, maar hebben tot zes monsters per batch gedaan met goede resultaten. Recente verbeteringen in de robotdissociator om de parallelle verwerking van twee monsters tegelijk mogelijk te maken, zullen de verwerking van 8-12 monsters per batch mogelijk maken, wat compatibel is met de doorvoer van de microfluïdische chip die wordt gebruikt voor het inkapselen van afzonderlijke kernen.

Hoewel we de kernen die door dit protocol zijn geïsoleerd niet hebben gebruikt voor andere stroomafwaartse toepassingen zoals ATAC-seq of snRNAseq met behulp van andere platforms, zijn we op basis van de kwaliteit van de gegevens die zijn verkregen met de genexpressiereagentia die hier worden gebruikt, van mening dat ons protocol compatibel moet zijn met aanvullende stroomafwaartse toepassingen. Toekomstig werk zal echter inhouden dat dit protocol wordt getest met andere downstream-toepassingen, zoals ATAC-seq.

Concluderend hebben we een snel, eenvoudig en gedeeltelijk geautomatiseerd nuclei-isolatieprotocol ontwikkeld voor stroomafwaartse single nucleus RNA-sequencing waarvan is aangetoond dat het compatibel is met verschillende soorten ingevroren zoogdierweefsels.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M DTT	Thermo Fisher Scientific	P2325
10% Tween 20	Bio-Rad	1662404
10x Magnetic Separator	10x genomics	PN-120250
10x Vortex Adapter	10x genomics	PN-120251
1x DPBS (10x), no calcium, no magnesium	Thermo Fisher Scientific	14190144	opgeslagen bij 4°C
30% Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A9576_50ML
400 mM Tris-HCl, pH 8.0	Thermo Fisher Scientific	15568025
40U/μl RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor	Thermo Fisher Scientific	10777019	Opgeslagen bij -20 °C
Agilent High Sensitivity DNA Kit	Agilent	5067-4626
Cellaca MX High-throughput Automated Cell Counter	Nexcelom Bioscience	CELMXSYSF2	Automatische fluorescente celteller
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns	10x genomics	PN-1000127	Single cell genexpressiereagens, opgeslagen bij kamertemperatuur
Chromium Next GEM Secondary Holder	10x genomics	PN-1000195
Chromium Next GEM Single Cell 3' Gel Bead Kit v3.1, 4 rxns	10x genomics	PN-1000129	Single cell genexpressiereagens, opgeslagen bij -80 °C
Chromium Next GEM Single Cell 3' GEM, Library & Gel Bead Kit v3.1, 4 rxns	10x genomics	PN-1000128	Single cell genexpressiereagens
Chromium Next GEM Single Cell 3' Library Kit v3.1 4 rxns	10x genomics	PN-1000158	Single cell genexpressiereagens, opgeslagen bij -20 °C
Chromium Next GEM Single Cell 3'GEM Kit v3.1 4 rxns	10x genomics	PN-1000130	Single cell genexpressiereagens, opgeslagen bij -20 °C
Divided Polystyrene Reservoirs	VWR	41428-958
DNA LoBind Tubes 1.5ml Eppendorf	Sigma-Aldrich	EP0030108051
DNA LoBind Tubes 2ml Eppendorf	Sigma-Aldrich	EP0030108078
Dry ice	-	-
Dynabeads MyOne SILANE	10x genomics	PN-2000048	Single cell genexpressiereagens, opgeslagen bij 4 °C
Ethanol Pure	Sigma-Aldrich	E7023
Glycerin (Glycerol), 50% (v/v)	Ricca Chemical Company	3290-16
Heatblock
High-Throughput Nexcelom Counting Plates	Nexcelom Bioscience	CHM24-A100-001	Tellplaat voor celteller
Low TE Buffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.1 mM EDTA)	Thermo Fisher Scientific	12090015
Mini Centrifuge	-	-
NovaSeq 6000 SP Reagent Kit v1.5 (100 cycles)	Illumina	2002840
Nuclei Isolation Buffer	S2 Genomics	100-063-396	Opgeslagen bij 4 °C
Nuclei Isolation Cartridge	S2 Genomics	100-063-287	Voorgekoeld op 4 °C voor gebruik
Nuclei PURE 2 M Sucrose Cushion Solution	Sigma-Aldrich	NUC201-1KT	Sucrose kussenoplossing
Nuclei PURE Sucrose Cushion Buffer	Sigma-Aldrich	NUC201-1KT
Nuclei Storage Reagent	S2 Genomics	100-063-405	Opgeslagen bij 4 °C
PCR Tubes 0.2 ml 8-tube strips	Eppendorf	30124359
Percoll	GE Healthcare	17-0891-02	Silica colloïdoplossing
PhiX Control v3	Illumina	FC-110-3001
Qiagen Buffer EB	Qiagen	19086
Qubit dsDNA HS Assay Kit	Thermo Fisher Scientific	Q32854
Refrigerated Centrifuge (Eppendorf 5804R)	Eppendorf	5805000010
Refrigerated Centrifuge with Swinging-Bucket Rotor (Eppendorf 5810R)	Eppendorf	5811000015
RNAseZap	Ambion	AM9780	RNAse decontaminatieoplossing
Round cell culture petri dish	SPL	330005
Scalpel disposable	Aesculap AG	BA210	Voorgekoeld op droogijs voor gebruik
Single Index Kit T Set A, 96 rxns	10x genomics	PN-1000213	Single cell genexpressiereagens, opgeslagen bij -20 °C
Singulator 100 System	S2 Genomics	-	Commercieel verkrijgbare robotische weefseldissocieerder
Sodium Hydroxide 1M	Sigma-Aldrich	72068
SPRIselect Reagent Kit	Beckman Coulter	b23318
Sterile tweezers	-	-
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water	Thermo Fisher Scientific	10977049
ViaStain PI Staining Solution	Nexcelom Bioscience	CS1-0109-5mL	Propidiumjodide kleuroplossing
Vortex Mixer+A2:D44	VWR	-