Snelle installatie van weefselmicroarray en beeldvorming van betegelde gebieden op de multiplexed ion beam beeldvormingsmicroscoop met behulp van de Tile/SED/array-interface

Summary

Multiplexed ion beam imaging (MIBI) wordt vaak gebruikt om weefselmicroarrays en betegelde, aaneengesloten weefselgebieden in beeld te brengen, maar de huidige software voor het opzetten van deze experimenten is omslachtig. De tile/SED/array-interface is een intuïtieve, interactieve grafische tool die is ontwikkeld om de installatie van MIBI-runs drastisch te vereenvoudigen en te versnellen.

Abstract

Multiplexed ion beam imaging (MIBI) is een op massaspectrometrie gebaseerde microscopietechniek van de volgende generatie die 40+ plexbeelden van eiwitexpressie in histologische weefsels genereert, waardoor gedetailleerde dissectie van cellulaire fenotypes en histoarchitecturale organisatie mogelijk wordt. Een belangrijk knelpunt in de werking doet zich voor wanneer gebruikers de fysieke locaties op het weefsel selecteren voor beeldvorming. Naarmate de schaal en complexiteit van MIBI-experimenten zijn toegenomen, zijn de door de fabrikant geleverde interface en tools van derden steeds onhandelbaarder geworden voor het afbeelden van grote weefselmicroarrays en betegelde weefselgebieden. Daarom werd een webgebaseerde, interactieve, what-you-see-what-you-get (WYSIWYG) grafische interfacelaag - de tile/SED/array Interface (TSAI) - ontwikkeld voor gebruikers om beeldlocaties in te stellen met behulp van bekende en intuïtieve muisbewegingen zoals slepen en neerzetten, klikken en slepen en polygoontekenen. Het is geschreven volgens webstandaarden die al in moderne webbrowsers zijn ingebouwd en vereist geen installatie van externe programma's, extensies of compilers. Deze interface is interessant voor de honderden huidige MIBI-gebruikers en vereenvoudigt en versnelt het opzetten van grote, complexe MIBI-runs drastisch.

Introduction

Multiplexed ion beam imaging (MIBI) is een techniek om 40+ eiwitten tegelijkertijd af te beelden op histologische weefselsecties met een resolutie tot 250 nm ^1,2,3. Nadat een histologisch weefselgedeelte is gekleurd met behulp van antilichamen die zijn gelabeld met isotopisch zuivere elementaire metalen, voert het MIBI-instrument secundaire ionenmassaspectrometrie uit om tegelijkertijd alle isotopen - en dus de expressie van alle 40+ antigenen - op individuele plekken op het weefsel te kwantificeren. Uitgevoerd over rasters van miljoenen plekken, maken de resulterende 40+ plex-beelden van eiwitexpressie het mogelijk om celgrenzen af te bakenen en specifieke celtypen te identificeren met behoud van ruimtelijke context 1,2,3,4. Deze techniek is door honderden gebruikers op ongeveer 20 locaties gebruikt om de cellulaire samenstelling, metabolische profielen en/of architectuur van tientallen weefseltypen te bestuderen als onderdeel van het onderzoeken van de immuunrespons op tumoren, weefselontsteking veroorzaakt door infectieuze agentia, neuropathologie van dementie en immuuntolerantie tijdens de zwangerschap 5,6,7,8,9^{, 10,11}.

Een belangrijk knelpunt bij de werking van MIBI-instrumenten is het instellen van gezichtsvelden (FOV's) - 200 x 200 μm² tot 800 x 800 μm² delen van het weefsel - voor beeldvorming. De MIBI beeldt één gezichtsveld tegelijk af, tot 800 x 800 μm², waardoor het voor het afbeelden van grotere gebieden vereist is dat meerdere gezichtsvelden aan elkaar worden gehecht. Het afbeelden van een weefselmicroarray (bijv. acht cirkelvormige weefsels in figuur 1A) omvat het plaatsen van meerdere FOV's op afstand van elkaar. Om FOV's in te stellen, biedt de interface van de fabrikant 1) een optisch camerabeeld van de dia met een dradenkruis dat ongeveer overeenkomt met de gespecificeerde beeldcoördinaat (Figuur 1A) en 2) een beeld van de secundaire elektronendetector (SED) dat het exacte gebied op de coördinaat laat zien, naar verluidt nauwkeurig tot op 0,1 μm (Figuur 1B). Eerst positioneert de gebruiker ruwweg een enkel gezichtsveld met behulp van het optische beeld. Omdat de beeldresolutie slechts ongeveer 60 μm per pixel is, zal een standaard gezichtsveld van 400 μm 30% afwijken als de plaatsing twee pixels afwijkt (2 pixels x 60 μm per pixel). De gebruiker moet dus de SED-afbeelding gebruiken om de positie te verfijnen - een vervelende opeenvolging van een dozijn stappen met meerdere pop-upvensters, het typen van coördinaten in tekstvakken, het langzaam duwen van de SED met richtingsbedieningsknoppen en vaak zelfs het opschrijven van coördinaten op papier (aanvullende figuur 1). Dit proces moet worden herhaald voor elke plek van een 100+ kernweefselmicroarray (TMA). Sommige tools van derden kunnen helpen bij de eerste ruwe positionering¹². Ze vereisen echter nog steeds enige programmeerkennis en de uiteindelijke positionering gebeurt nog steeds via het proces van tientallen stappen. Het is ook zeer lastig om rasters van aangrenzende FOV's te plaatsen, die later aan elkaar worden genaaid tot een betegeld panoramisch beeld.

Daarom is de tile/SED/array-interface (TSAI) ontwikkeld met als doel gebruikers in staat te stellen snel grote aantallen FOV's te positioneren met behulp van een intuïtieve, interactieve grafische interface. TSAI bestaat uit twee hoofdcomponenten: 1) Een webgebaseerde grafische gebruikersinterface (web-UI) voor het snel plaatsen van TMA-punten en weefseltegels, en 2) Integraties in de MIBI-gebruikersbedieningsinterface voor het genereren van een betegeld SED-beeld en het aanpassen van FOV-posities. Als u alleen het optische beeld gebruikt, kunnen veel FOV's ruwweg worden gepositioneerd en vervolgens snel worden aangepast met behulp van de FOV-navigatie-/aanpassingstools (Figuur 2, TSAI, linkertak). Als de SED-tegeling echter wordt uitgevoerd, kunnen FOV's nauwkeurig op de betegelde SED-afbeelding worden gepositioneerd zonder dat er verdere aanpassingen in de SED-modus nodig zijn (Afbeelding 2, TSAI, rechtertak). Deze tools zijn van algemeen belang voor honderden huidige MIBI-gebruikers en maken tegel- en TMA-positionering zeer eenvoudig, zelfs voor beginners, en verminderen complexe MIBI-run-opstellingen van enkele uren tot enkele tientallen minuten.

Protocol

1. Laden van TSAI

1. Voer TSAI uit door https://tsai.stanford.edu/research/mibi_tsai te openen in de webbrowser van de MIBI-gebruikersbesturingscomputer.
   1. Dit exemplaar van TSAI bevat aangepaste presets die niet van toepassing zijn op alle instrumenten. Wanneer u het gebruikt, bouw dan alleen tegels op basis van sjabloon-FOV('s) zoals hieronder gegenereerd in stap 2.6. TSAI wordt lokaal in de webbrowser uitgevoerd en er worden geen afbeeldings-, .json- of bestandsnaamgegevens naar de server verzonden of op de server opgeslagen.
2. U kunt ook TSAI instellen op elke website met aangepaste presets voor elk instrument.
   1. Ga naar https://github.com/ag-tsai/mibi_tsai en download de mibi_tsai_standalone directory. U kunt ook het aanvullende coderingsbestand 1 .zip bestand downloaden en de inhoud uitpakken in een map met de naam mibi_tsai_standalone.
   2. Open mibi_tsai_standalone/_resources/index.js in een tekstverwerker.
   3. Bewerk indien nodig de FOV-grootte, de keuze van de verblijftijd/timing, de rastergrootte, FOV-JSON en de aanbevolen vooraf ingestelde instellingen in index.js zodat deze overeenkomen met de instellingen van het instrument. Dit is voornamelijk van toepassing op op maat gemaakte instrumenten, maar dwell time/timing keuzeparen moeten hoe dan ook worden gecontroleerd. Bespaar index.js.
   4. Upload mibi_tsai_standalone naar een webserver die toegankelijk is via internet, bijvoorbeeld een laboratoriumwebsite of een door de universiteit gehoste website.
   5. Open mibi_tsai_standalone/index.html in de webbrowser van de MIBI-gebruikersbesturingscomputer.

2. Het laden van de MIBI-dia en het maken van een sjabloonbestand

1. Meld u aan bij de MIBI-experimenttracker (door de fabrikant geleverde webinterface voor het beheren van scangerelateerde metagegevens) in de webbrowser.
2. Voeg op het tabblad Dia's een nieuwe dia toe en voeg een nieuwe sectie toe (aanvullende afbeelding 2A-B). Selecteer of maak op het tabblad Resources een markeringspaneel (aanvullende afbeelding 2C).
3. Voeg op het tabblad Secties de nieuwe sectie toe aan het paneel (aanvullende afbeelding 2D).
4. Log in op de MIBI-gebruikersbedieningsinterface in de webbrowser. Laad de MIBI-dia door op Voorbeeld uitwisselen te klikken en de nieuwe dia te selecteren (aanvullende afbeelding 3A).
5. Maak een sjabloon-FOV door te klikken op FOV toevoegen (aanvullende afbeelding 3B) en de frameafmetingen, FOV-grootte, verblijftijd, beeldvormingsmodus en sectie-ID in te stellen.
6. Exporteer (download) de FOV-lijst naar een .json bestand (aanvullende afbeelding 3C). Download de optische afbeelding als een .png bestand (aanvullende afbeelding 3D).

3. Coregistratie van de motor in het optische beeldstadium

1. Open de TSAI-webinterface in de webbrowser. Als er nog niet eerder coregistratie is uitgevoerd, moet het optische coregistratiemenu automatisch worden geopend. Als het is uitgevoerd en adequaat is, herhaal deze stappen dan niet.
2. Open het menu Optische coregistratie . Klik op Kopieer automatische coregistratiecode naar klembord (aanvullende figuur 4A).
3. Open de MIBI-gebruikersbedieningsinterface in de webbrowser. Druk op Ctrl+Shift+J om de browserconsole te openen, of klik met de rechtermuisknop op de pagina en klik op Inspecteren en open vervolgens het tabblad Console (aanvullende afbeelding 4B).
4. Plak de code in de console en druk op Enter. Klik op de link die in de console is gegenereerd (aanvullende afbeelding 4C). Hierdoor wordt de co-registratie in de TSAI-webinterface geladen en als een cookie opgeslagen, zodat deze blijft bestaan en niet hoeft te worden herhaald, tenzij er een wijziging in de instrumenthardware is.

4. Betegelde SED-scan

1. Laad de optische afbeelding .png en .json bestanden uit stap 2.6 door ze naar de TSAI-webinterface te slepen en neer te zetten.
2. Open het menu SED Tiler en klik op een tekstvak in de bovenste rij (aanvullende afbeelding 5A).
3. Klik (± slepen) op de optische afbeelding om de linkerbovenhoek voor de SED-scan te selecteren (aanvullende afbeelding 5B).
4. Druk op de D-toets of klik op een tekstvak in de tweede rij in het menu SED Tiler.
5. Klik (± slepen) op de optische afbeelding om de rechterbenedenhoek voor de SED-scan te selecteren.
6. Klik in het menu SED-tegelzetter op Kopieer SED-scan en verschuif de correctiecode naar het klembord (aanvullende afbeelding 5C).
7. Open de MIBI-gebruikersbedieningsinterface in de webbrowser. Plak de code in de console en druk op Enter (aanvullende afbeelding 5D).
8. Zet de MIBI in de SED-modus op de QC - 300 μm-instelling, ga naar een gebied dat niet zal worden verkregen en pas de versterking, focus en stigmatie aan.
   1. Pas de helderheid en het contrast van het SED-beeld aan zonder de versterking te wijzigen. Druk op B om de helderheid te verhogen of op Shift+B om deze te verlagen. Druk op C om het contrast te verhogen of op Shift+C om het te verlagen. Druk op Shift+V om zowel de helderheid als het contrast te resetten.
9. Druk op Shift+T om de betegelde SED-scan te starten.
10. Als u klaar bent, zou het automatisch een nieuw .png-bestand van de betegelde SED-afbeelding moeten opslaan (Afbeelding 3). Tekens mogen aan het begin van de bestandsnaam worden toegevoegd, maar wijzigen geen enkel ander deel van de bestandsnaam.
11. Als specifieke tegels onscherp zijn of op een andere manier niet goed zijn gescand, scant u ze opnieuw.
    1. Druk op Shift+R om een tegel toe te voegen aan de wachtrij voor opnieuw scannen. Er wordt een dialoogvenster geopend waarin de gebruiker wordt gevraagd de rij en kolom van de tegel in te voeren. De nummers zijn nul-geïndexeerd, waardoor 8,0 wachtrijen worden ingevoerd in de negende rij, de eerste kolom.
    2. Nadat u alle relevante tegels aan de wachtrij hebt toegevoegd, drukt u op Shift+T om opnieuw te scannen. Als u klaar bent, wordt automatisch een nieuw .png-bestand van de tegel-ED-afbeelding opgeslagen.
12. Kritieke stap: Inspecteer de betegelde SED-scan op grote afwijkingen in de uitlijning (Figuur 3C-D). Indien aanwezig, neem dan contact op met de ondersteuning van de fabrikant om de motor- en beeldstraal aan te passen of probeer handmatige softwarecorrectie uit te voeren met behulp van de toetsenbordbedieningen in stap 4.12.1 tot 4.12.9 (aanvullende afbeelding 6A).
    1. Om de uitlijning van de motor in de SED-fase te controleren, gaat u naar een gebied van het objectglaasje zonder tissue. Druk op Shift+5 om vijf gezichtsveldbeelden van 400 μm in een dambordpatroon te branden (aanvullende afbeelding 6B-C) of op Shift+9 om een 3 x 3-patroon van 400 μm gezichtsveldfilters te verbranden (aanvullende afbeelding 6D-E).
    2. Als de FOV-kolommen te ver uit elkaar liggen, drukt u op 1 en stelt u de x f(x)-waarde in op een negatieve decimaal, meestal tussen -0.0025 en -0.1.
    3. Als de gezichtspunten van de derde rij naar links zijn verschoven ten opzichte van de gezichtspunten van de eerste rij, drukt u op 2 en stelt u de waarde x f(y) in op een positieve decimaal, meestal tussen 0,0025 en 0,1.
    4. Als de FOV's van de derde kolom naar beneden zijn verschoven ten opzichte van de FOV's van de eerste kolom, drukt u op 3 en stelt u de y f(x)-waarde in op een negatieve decimaal, meestal tussen -0.0025 en -0.1.
    5. Als de FOV-rijen te ver uit elkaar liggen, drukt u op 4 en stelt u de y f(y)-waarde in op een negatieve decimaal, meestal tussen -0.0025 en -0.1.
    6. Herhaal iteratief de stappen 4.12.1 tot en met 4.12.5 totdat het dambord en 3 x 3 patronen een ruwweg recht raster vormen (aanvullende figuur 6C, E).
    7. Druk op S om een .png afbeelding van het patroon met de correctiewaarden in de bestandsnaam op te slaan.
    8. Sleep dit .png bestand naar de TSAI-webinterface om de waarden te laden en op te slaan in de browsercookie.
    9. Voer betegelde SED-scans uit om de coëfficiënten te controleren. Op basis van dezelfde principes als in de stappen 4.12.2 tot en met 4.12.5 moet u de coëfficiënten verder aanpassen om eventuele verkeerde uitlijningen in de betegelde SED-afbeeldingen te corrigeren.
13. Als de betegelde SED voldoende is, drukt u op Escape. Keer terug naar de TSAI-webinterface.
14. Sleep het betegelde SED .png-bestand naar de TSAI-webinterface (aanvullende afbeelding 5E).
15. Klik op het tabblad SED en pas de zoom aan (aanvullende afbeelding 5F).
16. Als u de helderheid en het contrast van de afbeelding en/of tekenopties zoals lijndikte en cursorgrootte wilt aanpassen, gebruikt u het menu met dia-opties boven de SED-afbeelding.
17. Sneltoetsen zijn beschikbaar en worden het meest weergegeven naast de afbeeldingsbedieningselementen: Druk op Z om in te zoomen en op Shift+Z om uit te zoomen. Druk op B om de helderheid te verhogen of op Shift+B om deze te verlagen. Druk op C om het contrast te verhogen of op Shift+C om het te verlagen. Druk op Shift+V om zowel de helderheid als het contrast te resetten. Druk op L om de labels boven de tegels te schakelen. Druk op O om cirkels met een straal van 5 mm rond scherpstelpunten te schakelen.

5. Weefsel microarray (TMA)

1. Als u FOV's instelt voor een raster van TMA-spots, stelt u eerst het patroon in van FOV's die moeten worden gerepliceerd. Pas in de relevante tegel van de tegelkolom de kolommen en rijen aan (Figuur 4A) en vink de vakjes op de kaart aan of uit (Figuur 4B), en pas indien nodig andere FOV-instellingen aan.
2. Klik in de betreffende tegel op TMA om het TMA-optiemenu te openen (Figuur 4C). Stel het aantal rijen en kolommen met TMA-spots in (Figuur 4D). Voeg indien nodig een naamgevingsvoorvoegsel toe (Figuur 4E) en bewerk de startrij en kolomnummering (Figuur 4F).
3. Klik op de dia-afbeelding op de vier hoeken van de TMA (Figuur 4G-J). Klik en sleep de omcirkelde hoeken om de positionering van het dradenkruis aan te passen zodat ze het beste overeenkomen met de TMA-vlekken.
4. Klik op TMA bouwen in het TMA-optiemenu (Afbeelding 4K).
5. Plaats de muisaanwijzer op elke tegel in de tegelkolom om de positie te controleren. Om aan te passen, klikt u op Verplaatsen (Figuur 4L). Klik en sleep vervolgens op de dia-afbeelding of druk op de pijltjestoetsen op het toetsenbord.
   1. Houd de Shift-toets ingedrukt terwijl u op de pijltoetsen drukt om een grotere afstand te verplaatsen. Houd de Alt-toets (Windows) of Optie (Mac) ingedrukt terwijl u de pijltoetsen ingedrukt houdt om een kortere afstand af te leggen.
   2. Wanneer verplaatsen is geselecteerd, drukt u op T om het selectievakje naast de naam van de tegel uit te schakelen, de tegel uit de weergave te verwijderen en weg te laten uit alle bestanden die vervolgens .json worden gegenereerd. U kunt het selectievakje ook rechtstreeks met de muis uitschakelen (Figuur 4M) of het volledig verwijderen door op Verwijderen te klikken.
   3. Wanneer verplaatsen is geselecteerd, drukt u op 2, 4 of 8 om de FOV-grootte in te stellen op respectievelijk 200 μm, 400 μm of 800 μm, en de rasterafmetingen worden proportioneel geschaald, zodat de beeldresolutie ongewijzigd blijft.
   4. Wanneer verplaatsen is geselecteerd, drukt u op A om naar de vorige tegel te gaan of op D om naar de volgende tegel te gaan.
   5. Als u andere tegelinstellingen wilt aanpassen, klikt u op de knop ≡ om het instellingenmenu uit te vouwen als dit niet zichtbaar is.

6. Gebied/veelhoekige tegel

1. Als u FOV's instelt om een aaneengesloten gebied van weefsel te bedekken, past u eerst de FOV-instellingen indien nodig aan in de relevante tegel van de kolom Tegels.
2. Klik in de betreffende tegel op Polygoon (Figuur 5A). Klik op de dia-afbeelding om de hoekpunten/hoeken van het te betegelen gebied in te stellen (Figuur 5B-C). Dubbelklik om de veelhoek te sluiten en het gebied te bedekken met gezichtsvelden (Figuur 5D).
3. Scrol naar de onderkant van de kolom Tegels en klik op de knop ≡ (^ indien uitgevouwen, Figuur 5E) in de nieuwe polygoontegel om de tegelkaart te zien.
4. Schakel afzonderlijke tegels AAN of UIT door op de tegelkaart te klikken (Afbeelding 5F) of door op Clicker te klikken (Afbeelding 5G) en op de tegelvormige FOV's in de dia-afbeelding te klikken.
5. Als u meerdere gezichtsveldfoto's wilt uitschakelen, klikt u op Gum en klikt en sleept u vervolgens op de betegelde gezichtsveldafdrukken in de diaafbeelding (Afbeelding 5H).
6. Als u meerdere gezichtsveldfoto's wilt inschakelen, klikt u op Clicker (Afbeelding 5G) en klikt en sleept u vervolgens op de lege gebieden in de diaafbeelding die door de tegelkaart wordt bedekt.
7. Om de bovenstaande rijen in te voegen, klikt u op de knop ▲ (Figuur 5I). Om kolommen aan de linkerkant in te voegen, klikt u op de knop ◄ (Figuur 5J).
8. Als u de positie van de tegels wilt aanpassen, klikt u op Verplaatsen (Afbeelding 5K). Klik en sleep vervolgens op de dia-afbeelding, druk op de pijltjestoetsen op het toetsenbord of gebruik andere besturingselementen die worden beschreven in stappen 5.5.1 tot en met 5.5.5.

7. FOV-navigatie en aanpassing

1. Als SED-tegels niet goed zijn uitgelijnd of als het dradenkruis van het optische beeld niet de werkelijke positie van de fasemotor weergeeft, past u de FOV-posities in de SED-modus aan in de MIBI-gebruikersbedieningsinterface met behulp van de onderstaande toetsenbordbedieningen.
2. Open het FOV-navigatie-/aanpassingsmenu onder de diaafbeelding (optisch of SED). Klik op FOV-navigatiecode kopiëren naar klembord.
3. Open de MIBI-gebruikersbedieningsinterface in de webbrowser. Zet de MIBI in de SED-modus en pas de versterking, focus en stigmatie aan.
4. Druk op Ctrl+Shift+J om de browserconsole te openen of klik met de rechtermuisknop op de pagina en klik op Inspecteren en open vervolgens het tabblad Console.
5. Plak de code in de console en druk op Enter. De code navigeert automatisch naar het eerste gezichtsveld en de exacte gezichtsveldpositionering die wordt weergegeven in de SED-afbeelding van de MIBI-gebruikersbedieningsinterface.
6. Pas de helderheid en het contrast van het SED-beeld aan zonder de versterking te wijzigen. Druk op B om de helderheid te verhogen of op Shift+B om deze te verlagen. Druk op C om het contrast te verhogen of op Shift+C om het te verlagen. Druk op Shift+V om zowel de helderheid als het contrast te resetten.
7. Om de SED-vergroting aan te passen, drukt u op de toetsen M (200 μm), , ( 400 μm), . (800 μm) of / (maximum).
8. Als u het gezichtsveld wilt verplaatsen, drukt u op de pijltjestoetsen op het toetsenbord. Sla de positie op door op W te drukken. Houd de Shift-toets ingedrukt terwijl u op de pijltoetsen drukt om een grotere afstand te verplaatsen. Houd de Alt-toets (Windows) of Optie (Mac) ingedrukt terwijl u de pijltoetsen ingedrukt houdt om een kortere afstand af te leggen. Merk op dat alleen R1C1 van een bepaalde tegel kan worden verplaatst.
9. Om een gezichtsveld AAN of UIT te zetten, drukt u op T. Als u de grootte van het gezichtsveld wilt wijzigen, drukt u op 2 (200 μm), 4 (400 μm) of 8 (800 μm). De rasterafmetingen worden proportioneel geschaald, zodat de beeldresolutie hetzelfde blijft.
10. Om een afbeeldingsbestand van de SED-afbeelding en het overlappende dradenkruis op te slaan, drukt u op S. Als u een concept van de aanpassingen in een .txt bestand wilt opslaan, drukt u op X.
11. Als u tevreden bent, drukt u op D om naar het volgende gezichtsveld te gaan, of op A om terug te gaan naar het vorige gezichtsveld. Herhaal stap 7.6 tot en met 7.11 voor alle FOV's.
12. Als u klaar bent met alle gezichtsveldcamera's, drukt u op X of Escape. Aanpassingen worden opgeslagen in een .txt bestand en naar het klembord gekopieerd.
13. Keer terug naar de TSAI-webinterface. Sleep het .txt bestand naar de TSAI-webinterface of plak de aanpassingen in het tekstvak in het FOV-navigatie-/aanpassingsmenu.
14. Klik op Aanpassen om aanpassingen toe te passen op de tegels in de kolom Tegels.

8. JSON het genereren en importeren van bestanden

1. Controleer onder de kolom Tegels, onder Uitvoer, de lijst met tegels en de geschatte looptijd (aanvullende afbeelding 7A).
2. Selecteer onder Groep een optie voor FOV-groepering (aanvullende afbeelding 7B). Het groeperen heeft geen invloed op de sequentieel geordende .json bestand.
   1. Voor het bestand met gerandomiseerde .json zal het groeperen van FOV's op tegel FOV's zo ordenen dat alle FOV's binnen een bepaalde tegel bij elkaar blijven, ook al staan de tegels in willekeurige volgorde.
   2. Voor het bestand met gerandomiseerde .json zullen FOV's niet worden gegroepeerd, FOV's willekeurig worden gerangschikt zodat FOV's van verschillende tegels door elkaar worden gemengd.
   3. Als autofocus tijdens het hardlopen is opgegeven, worden FOV's automatisch gegroepeerd op de dichtstbijzijnde autofocuslocatie.
3. Selecteer onder splitsen een optie voor het splitsen in meerdere .json bestanden (aanvullende afbeelding 7C).
   1. Niet splitsen houdt alle FOV's in slechts één .json bestand.
   2. Splitsen door elke # FOV's zal FOV's splitsen over meerdere .json bestanden, waarbij elk bestand het opgegeven aantal FOV's bevat.
   3. Gesplitst door elke # uur # minuten worden FOV's verdeeld over meerdere .json bestanden, waarbij de geschatte looptijd van elk bestand ongeveer de opgegeven hoeveelheid tijd is.
4. Bekijk en herschik de volgorde van FOV's in de .json bestanden door het menu Herschikken te openen (aanvullende afbeelding 7D). Als u een gezichtsveld wilt verplaatsen, klikt u erop en sleept u het naar de gewenste positie. De andere FOV's zullen zich interactief herschikken rond de gesleepte FOV.
5. Om de .json bestand(en) op te slaan, klikt u op de FOV-knop (en) onder het herschikmenu. De sequentiële .json zet FOV's op volgorde per tegel, dan rij en dan kolom (aanvullende figuur 7E). De willekeurige .json randomiseert FOV's binnen de groepen zoals geselecteerd in stap 8.2 (aanvullende figuur 7F).
6. Als u een afbeelding van het weefsel met de gezichtsveldfoto's en toegepaste weergaveopties (tegellabels, helderheid, contrast, enz.) wilt opslaan, klikt u op Betegelde afbeelding opslaan (aanvullende afbeelding 7G). Dit is vaak handig voor het bijhouden en delen met medewerkers.
7. Keer terug naar de MIBI-gebruikersbedieningsinterface. Klik op FOV's importeren en selecteer het gegenereerde .json-bestand. Pas de focus, stigmatisering en stroom indien nodig aan en klik op Uitvoeren starten.

Results

TSAI biedt twee methoden voor het instellen van FOV's (Figuur 2). Men gebruikt alleen het optische beeld (Figuur 2, TSAI, linkertak), vergelijkbaar met andere bestaande methoden. De tweede methode - het genereren van een betegelde SED-afbeelding - is uniek voor TSAI (Figuur 2, TSAI, rechtertak). TSAI tekent FOV's nauwkeurig op dit beeld, waardoor het niet nodig is om urenlang FOV's op hun plaats te ...

Discussion

Multiplexed ion beam imaging (MIBI) is een krachtige techniek voor het ontleden van gedetailleerde cellulaire fenotypes en weefselhistoarchitectuur 5,6,7,8,9,10,11. De rekeninspanningen rond MIBI zijn grotendeels gericht op het verwerken van de gegevens na b...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
MIBI computer	Ionpath
MIBIcontrol (software)	Ionpath
MIBIscope	Ionpath		Multiplexed Ion Beam Imaging (MIBI) microscope
MIBIslide	Ionpath	567001	Conductive slide voor MIBI
Tile/SED/Array Interface (TSAI) (software)		https://github.com/ag-tsai/mibi_tsai/