Toepassing van flowcytometrische analyse voor het meten van meerdere mitochondriale parameters in 3D-hersenorganoïden

Summary

Dit protocol rapporteert een unieke methode voor het gebruik van een stromende cytometer en meerdere antilichamen voor gelijktijdige beoordeling van meerdere mitochondriale functionele parameters, waaronder veranderingen in mitochondriaal volume, hoeveelheden van de subeenheden van het mitochondriaal ademhalingsketen (MRC) complex en mitochondriaal DNA (mtDNA) replicatie.

Abstract

Mitochondriale disfunctie is een veel voorkomende primaire of secundaire oorzaak van vele soorten neurodegeneratie, en veranderingen in mitochondriale massa, mitochondriale ademhalingsketen (MRC) -complexen en mitochondriaal DNA (mtDNA) kopienummer komen vaak voor in deze processen. Menselijke hersenorganoïden afgeleid van humaan geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) recapituleren de driedimensionale (3D) cytoarchitecturale rangschikking van de hersenen en bieden de mogelijkheid om ziektemechanismen te bestuderen en nieuwe therapieën te screenen in een complex menselijk systeem. Hier rapporteren we een unieke op flowcytometrie gebaseerde benadering om meerdere mitochondriale parameters te meten in iPSC-afgeleide corticale organoïden. Dit rapport beschrijft een protocol voor het genereren van corticale hersenorganoïden uit iPSC's, eencellige dissociatie van gegenereerde organoïden, fixatie, kleuring en daaropvolgende flowcytometrische analyse om meerdere mitochondriale parameters te beoordelen. Dubbele kleuring met antilichamen tegen de MRC-complexsubeenheid NADH: ubiquinonoxidoreductase-subeenheid B10 (NDUFB10) of mitochondriale transcriptiefactor A (TFAM) samen met spanningsafhankelijk anionselectief kanaal 1 (VDAC 1) maakt het mogelijk om de hoeveelheid van deze eiwitten per mitochondrion te beoordelen. Aangezien de hoeveelheid TFAM overeenkomt met de hoeveelheid mtDNA, geeft het een indirecte schatting van het aantal mtDNA-kopieën per mitochondriale inhoud. Deze hele procedure kan binnen een tijdsbestek van 2-3 uur worden voltooid. Cruciaal is dat het de gelijktijdige kwantificering van meerdere mitochondriale parameters mogelijk maakt, inclusief zowel totale als specifieke niveaus ten opzichte van de mitochondriale massa.

Introduction

Mitochondriën zijn essentiële cellulaire organellen en de belangrijkste plaats van de productie van adenosinetrifosfaat (ATP). Naast het leveren van energie aan cellen, nemen mitochondriën ook deel aan meerdere cellulaire processen, waaronder de overdracht van celinformatie, celdifferentiatie en apoptose, en hebben ze het vermogen om celgroei en celcyclus te reguleren. Veranderingen in de mitochondriale functie zijn geïdentificeerd bij verschillende neurodegeneratieve ziekten, waaronder de ziekte van Parkinson (PD)^1,2, de ziekte van Alzheimer (AD)³ en amyotrofische laterale sclerose (ALS)⁴. Mitochondriale disfunctie speelt een rol in het verouderingsproces, waarbij somatische mtDNA-mutaties worden geaccumuleerd en de functie van de ademhalingsketen afneemt⁵.

Verschillende soorten mitochondriale disfunctie komen voor bij neurodegeneratie, en het vermogen om dergelijke veranderingen te meten is uiterst nuttig bij het bestuderen van ziektemechanismen en het testen van mogelijke behandelingen. Bovendien is het opzetten van geschikte in vitro modelsystemen die ziekten in menselijke hersencellen recapituleren van vitaal belang voor een beter begrip van ziektemechanismen en het ontwikkelen van nieuwe therapieën. iPSC's van patiënten met neurodegeneratieve ziekten zijn gebruikt om diverse hersencellen te genereren die mitochondriale schade vertonen 6,7,8,9. De ontwikkeling van 3D-hersenorganoïden afgeleid van iPSC's is een belangrijke stap in ziektemodellering. Deze iPSC-afgeleide hersenorganoïden zorgen voor complexiteit en bevatten de eigen genetische achtergrond van de patiënt, waardoor een ziektemodel ontstaat dat de pathologie in de hersenen van de patiënt nauwkeuriger weergeeft.

Hoewel er enig onderzoek is gedaan naar mitochondriale studies met behulp van iPSC-afgeleide hersenorganoïden 10,11,12, blijven handige en betrouwbare technieken voor het bepalen van meerdere mitochondriale functionele parameters in iPSC-afgeleide hersenorganoïden beperkt. Flowcytometrie biedt een krachtig hulpmiddel om mitochondriale parameters op eencellig niveau te meten, zoals we eerder hebben aangetoond¹³. Deze studie biedt een gedetailleerd protocol voor het genereren van corticale organoïden uit iPSC's, gecombineerd met een nieuwe op flowcytometrie gebaseerde benadering om tegelijkertijd meerdere mitochondriale parameters te meten, waaronder mitochondriale massa, subeenheden van het ademhalingsketencomplex en het aantal mtDNA-kopieën (Figuur 1). Belangrijk is dat door mitochondriale massa als noemer te gebruiken, deze protocollen het mogelijk maken om zowel de totale als de specifieke niveaus per mitochondriale eenheid te meten.

Protocol

1. Differentiatie van iPSC's in corticale organoïden

1. Voorbereiding van matrix-gecoate platen
   1. Ontdooi de injectieflacon met in de handel verkrijgbare basaalmembraanmatrix een nacht op ijs. Verdun tot 1:100 in koude Advanced Dulbecco's Modified Eagle's Medium/Ham's F12 DMEM/F12 (1% eindconcentratie). Maak aliquots en bewaar ze bij -20 °C (zie materiaaltabel).
   2. Ontdooi de membraanmatrixoplossing bij 4 °C (houd deze koud) en bedek het vereiste aantal putjes (1 ml voor één putje in een plaat met 6 putjes). Incubeer gedurende 1 uur bij 37 °C.
   3. Neem de plaat uit de broedmachine en laat deze op kamertemperatuur (RT) komen (laat het een uur staan).
      NOTITIE: De platen zijn maximaal 2 weken houdbaar in de koelkast (vergeet niet om ze eruit te halen en de gecoate putjes die nodig zijn voor die dag bij RT op te warmen totdat ze niet meer koel aanvoelen voor gebruik). Het wordt aanbevolen om de platen binnen 3 dagen te gebruiken. Voeg voor langdurige opslag 1 ml Essential 8 Medium (zie materiaaltabel) toe aan de gecoate plaat om te voorkomen dat de gel uitdroogt.

2. Bereiding Essential 8 (E8) medium voor iPSC-cultuur

1. Bereid E8 Medium in een steriele omgeving door E8 basaal medium te combineren met E8-supplement (zie Materiaaltabel). Dit kan 2 weken bewaard worden bij 4 °C.
   OPMERKING: Ontdooi het ingevroren E8-supplement een nacht bij 4 °C voordat u het volledige medium bereidt. Het ontdooien van het bevroren supplement bij 37 °C wordt niet aanbevolen; gebruik E8 Medium gedurende 2 weken. Verwarm voor gebruik E8 Medium dat nodig is voor die dag bij RT totdat het niet meer koel aanvoelt.

3. Subcultuur van iPSC's

1. Verwarm matrixgecoate platen in RT of incubator gedurende 20-30 minuten bij 37 °C. Verwarm de hoeveelheid E8 Medium die nodig is voor bij RT.
2. Zuig het kweekmedium op met een pipet.
3. Spoel iPSC's (zie materiaaltabel) af met Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (Ca²⁺/Mg²⁺ vrij) (DPBS-/-) (4 ml voor één putje in een plaat met 6 putjes).
4. Voeg ethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) (0,5 mM) toe (1 ml voor één putje in een plaat met 6 putjes). Incubeer bij 37 °C totdat de randen van de kolonies beginnen los te komen van de plaat (meestal 3-5 minuten).
5. Zuig de dissociatieoplossing op.
6. Voeg voorverwarmd E8 Medium toe (4 ml voor één putje in een plaat met 6 putjes) en gebruik hoge druk om iPSC-kolonies los te maken.
7. Breng over in twee verschillende putjes in een matrix gecoate plaat met 6 putjes (2 ml voor één putje in een plaat met 6 putjes) en incubeer bij 37 °C.
   NOTITIE: Schud voorzichtig voordat u de plaat in de broedmachine plaatst. De splitsingsverhouding kan 1:2-1:4 zijn.
8. Wissel dagelijks media uit totdat de koloniën 80% samenvloeiing krijgen met een goede grootte en verbindingen.
   OPMERKING: Controleer op kolonies van een geschikte grootte, meestal gekenmerkt door een goed gedefinieerde, ronde vorm en een diameter variërend van 0,5 tot 1 mm. De kolonies moeten dichte, compacte structuren vertonen met duidelijk afgebakende, gladde randen.

4. Vorming van embryoïde lichaam (EB) en neurale inductie

1. Bereid neuraal inductiemedium (NIM) voor door de componenten te combineren die worden vermeld in de materiaaltabel.
2. Zuig het medium op en spoel de cellen af met DPBS -/- (4 ml per putje in een plaat met 6 putjes).
3. Voeg voorverwarmde Accutase (1 ml per putje in een plaat met 6 putjes) (zie materiaaltabel) toe aan het putje en incubeer gedurende 10 minuten bij 37 °C.
4. Piteer de oplossing 3 tot 4 keer voorzichtig op en neer met behulp van een pipetpunt van 1000 μL.
5. Neutraliseer met 2 ml DMEM met 10% foetaal runderserum (FBS) en centrifugeer de 15 ml conische buis met de cellen op 600 x g gedurende 5 minuten bij RT. Zuig de supernatant op.
6. Resuspendeer de celpellets door voorzichtig op en neer te pipetteren tot pallets met één cel.
7. Tel en bereken de concentratie van levende cellen met behulp van trypanblauw¹⁴ in een geautomatiseerde cellenteller.
8. Bereken de verdunningsverhouding en verdun cellen in NIM om de uiteindelijke celconcentratie van 60.000 levende cellen/ml te maken.
9. Voeg Rho-geassocieerde proteïnekinase (ROCK)-remmer Y-27632 (eindconcentratie 50 μM) (zie materiaaltabel) toe aan de celsuspensie en meng voorzichtig.
10. Voeg 150 μL eencellige suspensie toe aan elk putje met ultralage bevestiging van 96 putjes (zie materiaaltabel) en plaats deze in de incubator. Instellen als dag 0.
11. Controleer op dag 1 de cellen en EB-vormen in elk putje.
    OPMERKING: Evalueer succesvolle EB-vorming op basis van hun heldere, bolvormige en doorschijnende uiterlijk onder een microscoop, hun vermogen om vrij zwevend en gescheiden te blijven, en de afwezigheid van dode cellen, die verschijnen als donkere vlekken.
12. Verwijder op dag 2 voorzichtig 75 μL medium uit elk putje en voeg 150 μL NIM samen met 50 μM Y-27632 toe aan elk putje.
13. Verwijder op dag 4, 6 en 8 100 μL medium uit elk putje en voeg 150 μL NIM toe aan elk putje.

5. Genereren van corticale organoïden

1. Bereid neuraal differentiatiemedium minus vitamine A (NDM-) voor door de componenten in de materiaaltabel te combineren.
2. Breng op dag 10 EB's over van de ultralage bevestiging 96-gaats plaat naar de ultra-lage bevestiging 6-gaats plaat met behulp van een 5 ml pipet. Breng voorzichtig acht EB's over naar elke put (Figuur 2). Voeg 5 ml NDM- toe aan elk putje.
3. Plaats de plaat op de orbitale schudder in de broedmachine en begin te draaien met 80 tpm.
4. Vervang op dag 12, 14 en 16 de NDM- door 4 ml na het opzuigen van 3 ml oud medium.

6. Rijping en langdurige kweek van corticale organoïden

1. Bereid neuraal differentiatiemedium voor met vitamine A (NDM+) en van de hersenen afgeleide neurotrofe factor (BDNF). Zie Materiaaltabel voor meer informatie.
2. Verwijder op dag 18 de 3 ml medium en voeg 4 ml NDM+ toe.
3. Breng het bord terug naar de spincultuur.
4. Voer elke 4 dagen en onderhoud de gedifferentieerde corticale organoïden in NDM+ tot gebruik. Voor de stroomafwaartse analyse werden corticale organoïden van 25-40 dagen oud gebruikt.
   LET OP: De corticale organoïden kunnen langer worden onderhouden (tot 3-4 maanden); Maar de levensvatbaarheid van cellen zal afnemen vanwege het gebrek aan voedingsuitwisseling.

7. Celkarakterisering door immunocytochemie en immunofluorescentiekleuring

1. Gebruik een pipet van 1000 μL om de organoïde voorzichtig uit het medium te halen en plaats deze voorzichtig op een medium met minimaal medium op een standaard microscoopglaasje.
2. Laat het volledig drogen bij RT. Voeg 4% paraformaldehyde (PFA) (300 μL per monster) toe gedurende 30 min. Verwijder PFA en spoel vervolgens twee keer met PBS.
   OPMERKING: PFA is giftig en wordt ervan verdacht kankerverwekkend te zijn. Vermijd contact met huid en ogen en hanteer het onder een chemische zuurkast.
3. Voeg 30% sacharoseoplossing (300 μl per monster) toe aan de objectglaasjes en incubeer een nacht bij 4 °C.
4. Blokkeer en permeabiliseer de organoïden met blokkeerbuffer (BB) (300 μL per monster) met PBS (met Ca²⁺/Mg²⁺), 0,3% Triton X-100 en 10% normaal geitenserum gedurende 2 uur bij RT (of 's nachts bij 4 °C). Omlijn de organoïden met een hydrofobe barrièrepen om de buffer op de dia te houden.
5. Bedek monsters met primair antilichaam in blokkeerbuffer (300 μL per monster), anti-SRY (geslachtsbepalende regio Y)-box 2 (SOX2, 1:100) en anti-neurale marker tuberine bèta III (Tuj1, 1:1000), en incubeer 's nachts bij 4 °C in het donker (zie Materiaaltabel).
6. Was in PBS gedurende 3 uur met twee tot drie bufferwissels op een zacht schommelend platform.
7. Incubeer met secundair antilichaam (300 μL per monster), anti-Alexa Flour 488 (1:800) en anti-Alexa Flour 594 (1:800), 's nachts bij 4 °C in een bevochtigde donkere kamer. Voeg tegelijkertijd Hoechst 33342 (1:5000) nucleaire beits toe (zie Materiaaltabel).
8. Zuig het antilichaam op en spoel snel met PBS, voeg vervolgens PBS met 0,01% NaAzide toe gedurende 1-2 dagen bij 4 °C om besmetting te voorkomen.
9. Zuig de PBS op en verwijder de overtollige oplossing. Monteer de organoïden met montagemedium (zie Materiaaltabel) en voeg vervolgens een dekglaasje toe. Vermijd de vorming van luchtbellen en plaats deze gedurende ten minste 12 uur in een donkere kamer bij RT om de montage volledig te laten polymeriseren.
   OPMERKING: Het monster is nu klaar om onder een fluorescentiemicroscoop te worden voorgesteld.

8. Dissociatie van corticale organoïden

1. Voeg 30 ml DPBS -/- toe in een centrifugebuis van 50 ml.
2. Verzamel voorzichtig de hersenorganoïden in het buisje met behulp van een pipet van 10 ml. Voor één kleuring worden ten minste 3 organoïden gebruikt, en deze moeten meer dan 25 dagen maar minder dan 40 dagen oud zijn.
3. Sediment organoïden gedurende ongeveer 5 min. Niet centrifugeren.
4. Zuig DPBS aan en voeg 2 ml voorverwarmde Accutase toe aan de buis. Incubeer het monster gedurende 5 minuten in het waterbad bij 37 °C.
5. Trituleer 15 keer voorzichtig met behulp van een pipetpunt van 1000 μL zonder belletjes te genereren. Incubeer het monster nog 5 minuten bij 37 °C in een waterbad.
6. Voorzichtig gedissocieerd met behulp van 15 keer pipetpunten van 1000 μl zonder belletjes te genereren (Figuur 3A).
   OPMERKING: Als er nog enkele niet-gedissocieerde cellen zijn, breng de niet-gedissocieerde cellen dan over in een nieuwe centrifugebuis van 50 ml en incubeer vervolgens nog eens 5 minuten bij een waterbad van 37 °C. Dissocieer vervolgens voorzichtig door 20 keer 1000 μL pipetpunten te gebruiken.
7. Neutraliseer met 4 ml DMEM met 10% FBS en centrifugeer de 15 ml conische buis met de cellen bij 600 x g gedurende 5 minuten bij RT.
8. Zuig supernatans aan en resusinfecteer met 200 μL DPBS met behulp van 1000 μL pipetpunten 10 keer zonder bellen te genereren.
9. Voeg 200 μL DPBS toe om een totaal volume van 400 μL celsuspensies in DPBS te maken.
10. Filter met het filter of de filterbuis (gebruik filters van 35 of 40 μm en spoel het filter af met DPBS voordat u het filter gebruikt).
11. Scheid de helft van de oplossing in een buisje en gebruik het als ongekleurd monster.

9. Flowcytometrie meting van MRC-complex subeenheden en TFAM in vaste cellen

1. Voeg levende en dode (L/D) kleurstof (1: 1000) toe (zie materiaaltabel) (met verrood of nabij-infrarood, afhankelijk van de opstelling van de markeringen voor flowcytometrie).
   OPMERKING: Als een nieuwe injectieflacon voor L/D-kleurstof wordt geopend, voeg dan 50 μL DMSO toe om te reconstitueren en maak een hoeveelheid van 10 μL om deze bij -20 °C te bewaren.
2. Houd 30 minuten in RT en donker. Voeg 40 ml DPBS -/- toe. Centrifugeer op 600 x g gedurende 5 min.
3. Resuspendeer in eencellige suspensie na het weggooien van de supernatant.
4. Fixeer en permeabiliseer de cellen met 1 ml ijskoude 90% methanol bij -20 °C gedurende 20 min.
5. Blokkeer de monsters in een blokbuffer van 1 ml met 0,3 M glycine, 5% geitenserum en 1% runderserumalbumine (BSA) in PBS (met Ca²⁺/Mg²⁺).
6. Was één of twee keer met 20 ml stroombuffer met PBS (met Ca²⁺/Mg²⁺) met 0,2% BSA.
7. Voeg de primaire antilichamen anti-NDUFB10 geconjugeerd met Alexa Fluor 405 (1:100), anti-VDAC 1 geconjugeerd met Alexa Fluor PE (1:100) en anti-TFAM-antilichaam geconjugeerd met Alexa Fluor 488 (1:200) gedurende 30 minuten toe (zie materiaaltabel).
8. Wassen met een debietbuffer van 20 ml.
9. Zuig ongeveer 100 μl op en reconstitueer de celpellets tot een stroombuffer van 300 μl.
10. Breng de cellen over naar stroombuizen van 1,5 ml. Houd in het donker en ijs.
11. Analyseer op de flowcytometer (zie Materiaaltabel). Signalen werden gedetecteerd voor Anti NDUFB10-Alexa 405 met behulp van een 450/50 banddoorlaatfilter, TFAM-Alexa 488 met behulp van 530/30 banddoorlaatfilter, VDAC 1-Alexa 647 met behulp van 670/14 banddoorlaatfilter en L/D-kleurstof in 780/60 banddoorlaatfilter (Afbeelding 3B).

10. Acquisitie en analyse van flowcytometrie

1. Gebruik ongekleurde en enkelvoudig gekleurde monsters van de controleorganoïde om de spanning van de cytometerinstellingen in te stellen.
2. Gebruik de niet-gekleurde controlebuis om de spreidingsdiagrammen voor het voorwaartse verstrooiingsgebied (FSC-A) en het zijverstrooiingsgebied (SSC-A) in te stellen op basis van de grootte en granulariteit van de celpopulatie (Afbeelding 4A).
3. Sluit puin af om levende cellen uit FSC-A- en SSC-A-percelen te selecteren. Poort doubletten uit met behulp van zijverstrooiingshoogte (SSC-H) vs. SSC-A-grafiek (Figuur 4B).
4. Selecteer de levende cellen op basis van de kleuring van L/D-kleurstof door over te schakelen naar APC-cy7 vs. FSC-A-perceel (figuur 4C).
5. Teken met behulp van de ongekleurde monsters van elke lijn een poort boven de hoofdpopulatie van de gebeurtenissen in FSC-A vs. fluorochrome kanalen (FITC, APC, BV 421) plots.
6. De opstelling compenseert de flowcytometer¹⁵.
7. Gebruik isotyperegeling voor negatieve controle om achtergrondkleuring waar te nemen.
8. Gegevensverzameling uitvoeren.
   1. Selecteer de levende cellen op basis van de kleuring van L/D-kleurstof door over te schakelen naar APC-cy7 vs. de FSC-A-grafiek (figuur 4C).
   2. Gebruik het onbevlekte als negatieve controle. Vervolgens, tijdens het onderzoeken van de FSC-A vs. fluorochrome kanalen (FITC, APC, BV 421) plots, vormen een poort boven de hoofdpopulatie van eencellige gebeurtenissen (Figuur 4D-F).
9. Voer data-analyse uit met behulp van FlowJo-software (zie Materiaaltabel).
   1. Dupliceer de posities van de poorten op de gekleurde celmonsters. Documenteer het aantal cellen dat positieve kleuring vertoont.
   2. Beoordeel voor elke doelpopulatie de mediane fluorescentie-intensiteit (MFI) van verschillende kanalen (FITC, APC, BV 421) uitgezet op de x-as van een histogram om het mitochondriale signaal te identificeren. Specifieke waarden voor de complex I-subeenheid NDUFB10 en TFAM kunnen worden bepaald door de MFI van de complexe expressie of TFAM te delen door de mitochondriale massa-indicator, VDAC 1.

Results

Figuur 1 geeft een schematische weergave van het differentiatieproces en de strategieën die worden gebruikt voor flowcytometrische analyse. Menselijke iPSC's werden gekweekt in niet-hechtende platen met 96 putjes om EB's te vormen en vervolgens overgebracht naar niet-hechtende platen met 6 putjes om volgroeide corticale organoïden te verkrijgen. De cellulaire samenstelling van organoïden werd gevalideerd met behulp van confocale microscopie na immunokleuring...

Discussion

Er wordt een protocol gepresenteerd voor het genereren van corticale hersenorganoïden uit menselijke iPSC's en voor het uitvoeren van de flowcytometrische analyse van mitochondriale parameters in afzonderlijke cellen geïsoleerd uit deze organoïden. De cellulaire samenstelling van de organoïden werd geverifieerd door middel van confocale microscopie met immunohistochemische kleuring voor neuronale en gliacelmarkers. Het is aangetoond dat de op flowcytometrie gebaseerde strategie die co-kl...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antilichamen gebruikt in flowcytometrie
anti-DUFB10 Alexa Fluor 405	NOVUS biologicals	NBP2-72915AF405
anti-VDAC1 Alexa Fluor 647	Santa cruz technology	sc-390996
anti-TFAM Alexa Fluor 488	Abcam	ab198308
L/D fixable near-IR dead cell stain kit	Life technologies	L10119
Antilichamen gebruikt bij immunofluorescentie kleuring
anti-Tuj1	Abcam	ab78078
anti-SOX2	Abcam	ab97959
anti-Alexa Flour 488	Thermo Fisher Scientific	A28175
anti-Alexa Flour 594	Thermo Fisher Scientific	A-21442
Commerciële cellen
AG05836 (RRID:CVCL_2B58)			Verstrekt door Gareth John Sullivan van het Institute of Basic Medical Sciences aan de Universiteit van Oslo, Noorwegen
Essential 8 Medium (iPSC-kweekmedium)
Essential 8 Basal Medium	Thermo Fisher Scientific	A1516901
Essential 8 Supplement (50x) 2% (v/v)	Thermo Fisher Scientific	A1517101
Bewaar bij 4 °C en warm op tot RT voor gebruik.
Instrumenten
Heracell 150i CO2 Incubators	Fisher Scientific, USA
Orbitale schudders - SSM1, SSL1	Stuart Equipment, UK
CCD Microscoopcamera Leica DFC3000 G	Leica Microsystems, Germany
Water Bath Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant Instruments	Grant Instruments, USA
Vloeistof aspiratie systeem BVC control	Vacuubrand, Germany
Leica TCS SP8 STED confocale microscoop	Leica Microsystems, Germany
50 mL falcon buis	Sigma-Aldrich	CLS430828
BD LSR Fortessa	BD Biosciences, USA
Flowjo Sampler Analysis	FlowJo LLC, USA
10 mL pipette	Sigma-Aldrich	SIAL1100
1, 10, 100, 1000 mL pipette	Sigma-Aldrich
40 µm Cell stariner	Sigma-Aldrich	CLS431750
ultra-low attachment 96-well plaat	S-BIO	MS-9096UZ
Countess II geautomatiseerde celteller	Thermo Fisher Scientific
Neural differentiatie medium  (NDM+)
DMEM/F12	Life technologies	11330032
Neurobasal medium	Life technologies	2110349
Glutamax supplement 1% (v/v)	Life technologies	35050
N2 supplement 0.5% (v/v)	Life technologies	17502-048
B27 supplement 1% (v/v)	Life technologies	17504-044
β-Mercaptoethanol 50 µM	Sigma-aldrich	M3148
BDNF 20 ng/mL	Peprotech	450-02
Ascorbinezuur 200 µM	Sigma-Aldrich	A92902
Bewaar bij 4° C voor maximaal 2 weken
Neural differentiatie medium minus viatmin A (NDM-)
DMEM/F12	Life technologies	11330032
Neurobasal medium	Life technologies	2110349
Glutamax supplement 1% (v/v)	Life technologies	35050
N2 supplement 0.5% (v/v)	Life technologies	17502-048
B27 supplement W/O vit. A 1% (v/v)	Life technologies	12587010
β-Mercaptoethanol 50 µM	Sigma-aldrich	M3148
Bewaar bij 4° C voor maximaal 8 dagen
Neural Inductie Medium (NIM)
DMEM/F12	Life technologies	11330032
Knockout serum replacement 15% (v/v)	Life technologies	10828028
Glutamax supplement 1% (v/v)	Life technologies	35050
β-Mercaptoethanol 100 µM	Sigma-Aldrich	M3148
LDN-193189 100 nM	Stemgent/Reprocell	04-0074
SB431542 10 µM	Tocris	1614
XAV939 2 µM	Sigma-Aldrich	X3004
Bewaar bij 4° C voor maximaal 10 dagen
Neutralisatie medium
IMDM	Life technologies	21980032
FBS 10%	Sigma-Aldrich	12103C
Overige reagentia
DPBS (Ca2+/Mg2+ vrij)	Thermo Fisher Scientific	14190250
Bovine Serum Albumine	Europa Bioproducts	EQBAH62-1000
Accutase	Life technologies	A11105-01
Geltrex	Life technologies	A1413302
EDTA	Life technologies	15575038
Advanced DMEM / F12	Life technologies	12634010
Neural weefsel dissociatie kit	Miltenyi biotec	130-092-628
Y-27632 dihydrochloride Rock Inhibitor	Biotechne Tocris	1254