CATCH-UP: Een upstream-pijplijn met hoge doorvoer voor bulkgegevens ATAC-Seq en ChIP-Seq

Samenvatting

ATAC-seq en ChIP-seq maken gedetailleerd onderzoek van genregulatie mogelijk; Het verwerken van deze gegevenstypen is echter een uitdaging en vaak inconsistent tussen onderzoeksgroepen. We presenteren CATCH-UP: een gebruiksvriendelijke computationele pijplijn die gestandaardiseerde en reproduceerbare gegevensverwerking en analyse van nieuwe en gepubliceerde ATAC/ChIP-seq-datasets mogelijk maakt.

Samenvatting

Assay voor transposase-toegankelijk chromatine (ATAC) en chromatine-immunoprecipitatie (ChIP), in combinatie met next-generation sequencing (NGS), hebben een revolutie teweeggebracht in de studie van genregulatie. Een gebrek aan standaardisatie in de analyse van de hoogdimensionale datasets die door deze technieken worden gegenereerd, heeft de reproduceerbaarheid moeilijk gemaakt, wat heeft geleid tot discrepanties in de gepubliceerde, verwerkte gegevens. Een deel van dit probleem is te wijten aan de uiteenlopende bio-informatica-instrumenten die beschikbaar zijn voor de analyse van dit soort gegevens. Ten tweede zijn achtereenvolgens een aantal verschillende bio-informaticatools nodig om ruwe gegevens om te zetten in een volledig verwerkte en interpreteerbare output, en deze tools vereisen verschillende niveaus van rekenvaardigheden. Verder zijn er veel mogelijkheden voor kwaliteitscontrole die niet uniform worden toegepast tijdens de gegevensverwerking. We pakken deze problemen aan met een volledige test voor transposase-toegankelijke chromatine-sequencing (ATAC-seq) en chromatine-immunoprecipitatie-sequencing (ChIP-seq) upstream-pijplijn (CATCH-UP), een gebruiksvriendelijke, op Python gebaseerde pijplijn voor de analyse van bulk ChIP-seq- en ATAC-seq-datasets, van onbewerkte fastq-bestanden tot visualiseerbare bigwig-tracks en piekoproepen. Deze pijplijn is eenvoudig te installeren en uit te voeren en vereist minimale rekenkennis. De pijplijn is modulair, schaalbaar en parallelliseerbaar op verschillende computerinfrastructuren, waardoor eenvoudige rapportage van methodologie mogelijk is om reproduceerbare analyse van nieuwe of gepubliceerde datasets mogelijk te maken.

Inleiding

Genexpressie moet streng worden gereguleerd om cellen in staat te stellen hun juiste biologische functie vast te stellen en te behouden. Het is algemeen bekend dat afwijkende genexpressie ten grondslag ligt aan de pathogenese van veel ziekten, en daarom ligt veel onderzoeksinteresse in het begrijpen van de mechanismen van genregulatie¹. Genexpressie wordt vergemakkelijkt door regulerende elementen zoals promotors en enhancers. Binnen hun sequentie bevatten deze elementen transcriptiefactor (TF)-bindingsplaatsen, die, wanneer ze actief zijn, een platform bieden voor TF-binding. De binding van TF's op deze plaatsen resulteert in een verplaatsing van nucleosomen, wat resulteert in een toename van de toegankelijkheid van DNA en een daaropvolgende toename van de toelaatbaarheid voor de transcriptiemachinerie. Als gevolg van deze verhoogde toegankelijkheid zijn deze DNA-regio's gevoeliger voor nucleasen en transposasen zoals DNase en Tn5, een biochemische eigenschap die is benut door onderzoekers die transcriptieregulatie onderzoeken ^2,3.

DNase-seq en ATAC-seq stellen onderzoekers in staat om regio's van open chromatine, TF-bindingsplaatsen en nucleosomale positionering in het genoom in kaart te brengen. Van deze twee technieken is ATAC-seq de afgelopen tien jaar in populariteit gegroeid dankzij het eenvoudige tweestapsprotocol en een laag aantal cellen (50.000 cellen vergeleken met 1 miljoen per replicaat voor DNase-seq). Hoewel ATAC-seq een overzicht geeft van het algemene chromatinelandschap in een populatie van cellen, is het grotendeels agnostisch aan welke specifieke eiwitten aan het genoom^{binden 4,5}. Om de locaties te identificeren waar een specifiek eiwit interageert met het genoom, is de gouden standaardtechniek Chromatine Immunoprecipitation (ChIP)-seq. ChIP-seq omvat het chemisch fixeren van eiwit-DNA-interacties in een cel, gevolgd door immunoprecipitatie ("pull-down") met behulp van een antilichaam dat specifiek is voor het eiwit van belang om te selecteren op DNA-fragmenten die zijn gebonden door het eiwit van belang (POI). Deze DNA-fragmenten kunnen worden gesequenced om de genomische bindingslocaties van specifieke eiwitten zoals TF's of plaatsen met specifieke histonmodificaties te onthullen¹. Door ATAC-seq en ChIP-seq datasets te combineren, kan een gedetailleerd beeld van het regelgevingslandschap voor een populatie cellen worden afgeleid.

De basisworkflow die nodig is voor de analyse is als volgt: ruwe sequencing-lezingen moeten op kwaliteit worden gecontroleerd voordat ze worden uitgelijnd met een referentiegenoom ("mapping"). De succesvol in kaart gebrachte lezingen kunnen vervolgens worden gefilterd om zowel lezingen van lage kwaliteit als PCR-duplicaten te verwijderen. Om deze in kaart gebrachte en gefilterde lezingen te visualiseren, is het noodzakelijk om de "dekking" van deze lezingen over het hele genoom te berekenen. Dit genereert een bestand dat kan worden geüpload naar een genoombrowser zoals multi-locus view (MLV) of de UCSC-genoombrowser als een "track"^6,7. Piekidentificatie, of "piekoproep" van deze dekkingssporen wordt meestal bereikt met behulp van tools zoals LanceOtron of MACS2 ^8,9. Ten slotte kunnen door de analyse van pieklocatie, vorm en grootte vergelijkingen worden gemaakt tussen monsters of biologische omstandigheden. De analyse en integratie van deze datasets is een complex proces dat uit meerdere stappen bestaat waarin verschillende combinaties van bio-informaticatools kunnen worden geïmplementeerd. Verschillende versies van de tools kunnen incompatibel zijn met elkaar en kunnen de output van de gegevensverwerking veranderen. Er is ook een grote verscheidenheid in de rekenkracht en gebruikersvaardigheid die nodig zijn om verschillende delen van de gegevensverwerking te implementeren, zoals weergegeven in nf-core¹⁰, panpipes¹¹, genpipes¹², PEPATAC¹³ of ChIP-AP¹⁴ pijpleidingen.

Over het algemeen heeft dit geleid tot inconsistenties in zowel de analyse als de rapportage van de analyse, wat op zijn beurt heeft geleid tot slechte reproduceerbaarheid, toegankelijkheid en gemak voor iedereen met beperkte kennis van bio-informatica. We pakken al deze problemen aan met CATCH-UP (complete ATAC-seq en ChIP-seq upstream pipeline), een gebruiksvriendelijke, flexibele en modulaire pipeline voor het verwerken van ChIP-seq en ATAC/DNase-seq data. De implementatie van CATCH-UP vereist minimale bio-informatica-ervaring; Het kan op verschillende computerinfrastructuren worden uitgevoerd en maakt reproduceerbare gegevensanalyse mogelijk binnen en tussen onderzoeksgroepen.

CATCH-UP is een op Python gebaseerde Snakemake-pijplijn die is gebouwd om de analyse van ChIP-seq- en ATAC-seq-gegevens te standaardiseren. Het neemt ruwe sequentiegegevens (fastq.gz bestanden) als invoer en genereert een uitvoer in de vorm van piekbestanden (.bed) die de respectieve uitkomst voor elke stap leveren. We bieden een configuratiebestand in yaml-formaat (config.yaml), waarin de gebruiker de parameters van elke analysestap kan bewerken. Het beheersysteem dat binnen Snakemake is geïmplementeerd, maakt het mogelijk om verschillende computerinfrastructuren te gebruiken (zoals servers, clusters, cloudsystemen of pc's) en parallel als de gebruiker een grote hoeveelheid gegevens verstrekt.

Hieronder geven we een gedetailleerde beschrijving van elke stap van de workflow (zie Figuur 1 voor de workflowillustratie). Deze uitleg is essentieel om de stap-voor-stap in het protocolgedeelte te kunnen volgen:

Fastq verplaatsen: de eerste stap van de pijplijn is het kopiëren van de onbewerkte fastq-bestanden naar de benoemde analysemap. Dit laat de originele gegevens onaangeroerd om te voorkomen dat de onbewerkte gegevensbestanden worden beschadigd of gewijzigd.

Aaneengeschakeld: als onbewerkte sequentiegegevens meerdere banen bevatten, is deze stap vereist om de banen samen te voegen voorafgaand aan de analyse. Standaard verwerkt de pijplijn alle fastq-bestanden als afzonderlijke voorbeelden. Deze aaneenschakelingsstap moet worden gedefinieerd in het configuratiebestand.

Bijsnijden: optionele stap voor het opschonen van gegevens. Dit maakt het mogelijk om lezingen van lage kwaliteit of adaptersequenties bij te snijden met behulp van trimmomatic¹⁵. De gebruiker kan aangepaste fasta-bestanden van adaptersequenties aanleveren; Een voorbeeld vindt u in de map Adapter. Aanvullende trimparameters kunnen worden gedefinieerd in het configuratiebestand. Standaard slaat de werkstroom deze regel over.

Aligner: voor uitlijning wordt Bowtie2¹⁶ standaard toegepast; Alternatieve uitlijngereedschappen zoals BWA-MEM2¹⁷ kunnen ook worden gespecificeerd. De Bowtie2-uitlijningstool is standaard geselecteerd omdat deze bijzonder bedreven is in het afstemmen van relatief korte lezingen op relatief grote genomen en daarom zeer geschikt is voor de uitlijning van ChIP-seq- en ATAC-seq-gegevens op het genoom van zoogdieren. Om tussenliggende bestanden te voorkomen, wordt de aligner naar de samtools-weergave geleid om het bam-bestand in de uitvoer op te slaan. Voor deze regel moet de gebruiker de voorkeursgenoombuild specificeren waarop de lezingen in kaart moeten worden gebracht, bijv. hg19/hg38 (mens), mm10/mm39 (muis).

Filteren: goed toegewezen lezingen blijven behouden en lezingen met een lage kwaliteit worden uitgefilterd. Standaardinstelling: samtools-weergave, met parameters: -bShuF 4 -f 3 -q 30.

Sorteren: uitgelijnde lezingen worden gesorteerd op volgorde van de meest linkse coördinaat. Standaard: samtools sort (snakemake wrapper), met parameter: -m 4G.

Markeer duplicaten: alle dubbele leesbewerkingen worden geïdentificeerd en gemarkeerd. De gebruiker kan besluiten deze te verwijderen door de parameter van het configuratiebestand te wijzigen. Standaardinstelling: Picard MarkDuplicates (snakemake wrapper), met de parameter: --REMOVE_DUPLICATES False om duplicaten te markeren en te behouden.

Bam samenvoegen: Als de sequentiegegevens zijn samengesteld uit replicaten of samples, wil de gebruiker mogelijk samenvoegen tot één bam. In dit geval kan de gebruiker ervoor kiezen om de bams samen te voegen of bam-bestanden gescheiden te houden tijdens de analyse. Als de gebruiker ervoor kiest om bams samen te voegen (met behulp van samtools merge), moet een gemeenschappelijk voorvoegsel worden opgegeven voor de samengevoegde bams.

Index: deze stap indexeert de gesorteerde coördinaten. Standaardinstelling: samtools-index (snakemake wrapper), met behulp van standaardparameters die zijn gespecificeerd door samtools.

BamCoverage: deze regel maakt een bigwig coverage track van uitgelijnde reads. De bamCoverage-tool van deepTools wordt toegepast en de dekking wordt berekend als het aantal leesbewerkingen per opslaglocatie, waarbij de opslaglocatie een venster van een opgegeven grootte vertegenwoordigt. In deze pijplijn wordt bamCoverage toegepast met de volgende parameters die als standaard zijn ingesteld: -bs 1 -normalizeUsing RPKM -extendReads.

Piekaanroeping: LanceOtron⁸ is geselecteerd als de standaard peakcaller voor deze pijplijn. In tegenstelling tot traditionele piekbellers, die meestal statistisch op tests zijn gebaseerd, is LanceOtron een op deep learning gebaseerde piekbeller, die genomische verrijkingsmetingen en statistische tests omvat en waarvan is aangetoond dat deze beter presteert dan de industriestandaard piekbeller, MACS2⁹. Om bigwigs compatibel te maken met LanceOtron, moet de dekking per basenpaar worden berekend en moet RPKM worden genormaliseerd; dit wordt weerspiegeld in de standaardinstellingen voor de stap BamCoverage. MACS2 kan worden geselecteerd als alternatieve piekbeller. De vrijlating van nieuwe piekbellers zal worden gemonitord en indien van toepassing worden opgenomen om de prestaties van deze analysepijplijn te behouden en te optimaliseren.

TrackDb: dit creëert een key-value pair-associatie van bigwig-bestanden om ze te laden en te visualiseren in tools zoals MLV⁶ of UCSC Genome Browser^18-platforms .

Naast de uitvoergegevens voert elke stap van de pijplijn een logbestand uit en worden de juiste kwaliteitscontroles uitgevoerd, zodat de gebruiker de voortgang van de analyse kan volgen. FastQC¹⁹ wordt toegepast op onbewerkte en bijgesneden (indien geselecteerde) sequentiegegevens (stappen 1 - Fastq verplaatsen en 2 - Bijsnijden). Samtools-statistieken plus MultiQC²⁰ worden gebruikt om kwaliteitscontrolerapporten over bam-bestanden in uitvoer te verzamelen, te produceren en te visualiseren in stap 3 - Aligner, 6 - Duplicaten markeren en 7 - Bam samenvoegen. Zie tabel 1 voor meer informatie over elk van de instrumenten die in de bovenstaande stappen zijn toegepast.

Protocol

1. Lopende CATCH-UP pijplijn

1. Kloon de UpStreamPipeline-opslagplaats vanuit https://github.com/Genome-Function-Initiative-Oxford/UpStreamPipeline:
   Navigeer naar de gekozen werkmap, kopieer de volgende code en voer uit op de opdrachtregel:
   git kloon git@github.com:Genome-Function-Initiative-Oxford/UpStreamPipeline.git
2. Navigeer in de gedownloade map UpStreamPipeline met de opdracht: cd UpStreamPipeline
3. Installeer de anaconda-distributie (indien nodig):
   1. Controleer of anaconda al op het systeem is geïnstalleerd met behulp van de opdracht welke conda. Als de opdracht geen pad naar een conda-distributie toont, download dan mambaforge van https://github.com/conda-forge/miniforge#mambaforge en selecteer de juiste distributie en versie voor het systeem. Gebruik bijvoorbeeld voor linux-gebruikers wget-https://github.com/conda-forge/miniforge/releases/latest/download/Mambaforge-Linux-x86_64.sh. Bezoek deze webpagina voor verschillende besturingssystemen: https://github.com/conda-forge/miniforge/.
   2. Voer het installatieprogramma uit met behulp van sh Mambaforge-Linux-x86_64.sh en initialiseer conda in het systeem door conda init uit te voeren.
4. Installeer en activeer de upstream conda omgeving (de vereisten van de upstream conda omgeving worden vermeld in tabel 2):
   1. Installeer de omgeving met behulp van het commando mamba env create - file=envs/upstream.yml.
   2. Activeer de omgeving met behulp van de opdracht conda stroomopwaarts activeren.
5. Zodra de upstream conda omgeving met succes is geïnstalleerd, activeert u de omgeving met behulp van de opdracht conda activeren upstream en navigeert u naar de CATCH-UP map met behulp van cd genetics/CATCH-UP.
6. Bewerk het configuratiebestand, dat te vinden is in de configuratiemap met behulp van de opdracht cd /config/analysis.yaml, en wijzig het dienovereenkomstig met de analysespecificatie met behulp van een teksteditor. Volg de regel-voor-regel instructies om elke parameter in het bestand zelf te bewerken. Dit bestand wordt na de analyse bewaard en dient om de run-parameters te documenteren om de reproduceerbaarheid te bevorderen.
7. Open en bewerk de volgende drie bestanden in een teksteditor (bijvoorbeeld TextEdit voor Mac of Kladblok voor Windows):
   1. Bewerk 1_fastqfile_home_dir.txt bestand om een lijst te bevatten van alle fastq-bestanden die moeten worden geanalyseerd.
      OPMERKING: Leesnummers en extensies (bijv. _R1/_R2 en .fastq.gz) moeten worden uitgesloten. Als een project bijvoorbeeld deze lijst met fastq-bestanden bevat:
      Sample1_conditionA_L001_R1 . FASTQ . GZ
      Sample1_conditionA_L001_R2 . FASTQ . GZ
      Sample1_conditionA_L002_R1 . FASTQ . GZ
      Sample1_conditionA_L002_R2 . FASTQ . GZ
      Sample1_conditionB_L001_R1 . FASTQ . GZ
      Sample1_conditionB_L001_R2 . FASTQ . GZ
      Sample1_conditionB_L002_R1 . FASTQ . GZ
      Sample1_conditionB_L002_R2 . FASTQ . GZ
      Sample2_conditionA_L001_R1 . FASTQ . GZ
      Sample2_conditionA_L001_R2 . FASTQ . GZ
      Sample2_conditionA_L002_R1 . FASTQ . GZ
      Sample2_conditionA_L002_R2 . FASTQ . GZ
      Sample2_conditionB_L001_R1 . FASTQ . GZ
      Sample2_conditionB_L001_R2 . FASTQ . GZ
      Sample2_conditionB_L002_R1 . FASTQ . GZ
      Sample2_conditionB_L002_R2 . FASTQ . GZ
      In dit geval is de 1_fastqfile_home_dir.txt als volgt:
      Sample1_conditionA_L001
      Sample1_conditionA_L002
      Sample1_conditionB_L001
      Sample1_conditionB_L002
      Sample2_conditionA_L001
      Sample2_conditionA_L002
      Sample2_conditionB_L001
      Sample2_conditionB_L002
   2. Als onbewerkte gegevens sequentierijstroken bevatten die moeten worden aaneengeschakeld, bewerkt u 2_fastqbestandle_concat.txt om het voorvoegsel van de bestandsnamen die moeten worden samengevoegd te definiëren. Als er geen aaneengeschakelde rijstroken zijn, bewerk dan niet 2_fastqfile_concat.txt. Zorg ervoor dat elke regel van 2_fastqfile_concat.txt één voorbeeldvoorvoegsel bevat, als volgt:
      Sample1_conditionA
      Sample1_conditionB
      Sample2_conditionA
      Sample2_conditionB
   3. Als het samenvoegen van de gegevens van verschillende voorbeelden nodig is, bewerkt u 3_merge_bams.txt bestand met het voorvoegsel van de bestandsnamen die u wilt samenvoegen. Zorg ervoor dat elke regel één voorbeeldvoorvoegsel bevat, als volgt:
      Voorbeeld 1
      Voorbeeld 2
      Figuur 2 geeft een samenvatting van hoe deze drie bestanden kunnen worden samengevat. Het protocol kan worden toegepast op single- of paired-end sequencinggegevens. De pijplijn is standaard ingesteld op analyse met gepaarde einden, tenzij anders aangegeven; Dit kan worden gewijzigd in het configuratiebestand (zie stap 1.6).
8. Zodra alle vereiste bestanden zijn bewerkt, gebruik je snakemake om CATCH-UP als volgt uit te voeren: snakemake --configfile=config/analysis_name.yaml all --cores 4.
   OPMERKING: Zie voor meer gedetailleerde instructies en documentatie de map CATCH-UP in de UpStreamPipeline GitHub-opslagplaats, die hier beschikbaar is. Dit omvat gedetailleerde documentatie over het correct wijzigen van het configuratiebestand, van het wijzigen van paden voor het sequencen van gegevensbestanden en het opslaan van resultaten tot het bewerken van parameters voor elke stap.

Resultaten

De CATCH-UP-pijplijn produceert voor elke stap een resultaat, logboek en kwaliteitscontrole (QC). Binnen het configuratiebestand kan de gebruiker ervoor kiezen om uitvoerbestanden te behouden of te verwijderen om het benodigde opslaggeheugen te verminderen. Alle outputs worden als volgt toegelicht:

00. fastq_home_dir: configuratiebestand, fastqfile_home_dir.txt en merge_bams.txt worden naar deze map gekopieerd voor referentie en reproduceerbaarheid.
01. Leest: FastQ-bestanden worden naar deze map gekopieerd om wijzigingen van de originele onbewerkte gegevens tijdens het workflowproces te voorkomen, lanes kunnen worden samengevoegd indien opgegeven.
02. Bijsnijden: FastQ-bestanden met lezen en adapters bijgesneden indien opgegeven.
03. Aligner: uitlijning met het geselecteerde genoom.
04. Afwerking: Filtering voor kwaliteitscontrole.
05. Gesorteerd: sorteren van BAM-bestanden.
06. Duplicaten: Duplicaten markeren.
07. Samenvoegen: BAM-bestanden samenvoegen als dit is gespecificeerd in config.yaml.
08. bam_coverages: Bigwig bestand van de dekking.
09. peak_calling: een bedbestand van LanceOtron piekaanroepende output.
10. track: produceert een geformatteerd tekstbestand dat klaar is om indien nodig in de Genome Browser te worden gebruikt.

Voor uitvoer van 01, 02, 03, 06 en 07 worden QC-metrische gegevens en HTML-bestanden verstrekt. Daarnaast geven we in Figuur 3 een voorbeeld van verwerkte gegevens met behulp van CATCH-UP, waarbij de uiteindelijke output wordt gevisualiseerd via het MLV-platform.

Figuur 1: Workflow van CATCH-UP. Aan de hand van een lijst met fastq-bestanden verwerkt CATCH-UP alle samples parallel door alle upstream-stappen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Illustratieve weergave waarin wordt uitgelegd hoe 1_fastqfile_home_dir.txt, 2_fastqfile_concat.txt en 3_merge_bams.txt correct moeten worden gewijzigdom CATCH-UP uit te voeren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Voorbeeld van output uit de CATCH-UP-pijplijn. Ruwe sequencing-gegevens (fastq-bestanden) werden gedownload van ENCODE²¹. De CATCH-UP-pijplijn werd gebruikt om de fastq-bestanden voor DNase-seq en 5 soorten ChIP-seq (H3K4me1, H3K4me3, H3K27ac, CTCF en POLR2A) te verwerken. Bigwig-uitvoerbestanden werden geüpload naar Multi Locus View voor visualisatie en identificatie van genomische regulerende elementen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Documentatiebronnen. Deze tabel toont de tools die betrokken zijn bij de CATCH-UP-workflow, de link voor hun documentatie en de respectievelijke referenties. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Lijst van kanaal- en afhankelijkheidsvereisten voor upstream conda-omgeving. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 3: Besturingssystemen die worden gebruikt om CATCH-UP te testen. Ubuntu werd getest op een high-performance cluster en een lokale machine. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Discussie

De toegenomen acceptatie en het gebruik van NGS-technieken om genomische gegevens te genereren, ging gepaard met een toename van de ontwikkeling van bio-informaticatools voor de analyse van deze gegevens. Er zijn meerdere tools die kunnen worden toegepast voor elke stap van de gegevensanalyse, evenals veel verschillende parameters die binnen elke tool kunnen worden gespecificeerd 6,8,9,15,16,17,18,19,20,22,23,24 . Dit zorgt voor een zeer diverse combinatie van analysestrategieën die kunnen worden toegepast, die elk variaties in de uitkomst kunnen veroorzaken. Om experimenten nauwkeurig te kunnen vergelijken, is standaardisatie van bio-informaticaanalyse essentieel. Historisch gezien worden NGS-gegevens gegenereerd door wetenschappers van natte laboratoria en worden de gegevens geanalyseerd door bio-informatici.

NGS-gegevensanalyse kan worden onderverdeeld in "upstream" en "downstream" pijplijnen, waarbij upstream de nodige stappen omvat om van de uitvoer van onbewerkte gegevens van een sequencingmachine naar een formaat te gaan dat visueel interpreteerbaar is voor een onderzoeker. Downstream-analyse omvat aanvullende stappen die zijn afgestemd op de onderzoeksvraag en het experimentele ontwerp. Upstream-pijpleidingen zijn daarom generaliseerbaar en vatbaar voor standaardisatie voor een betere wetenschappelijke reproduceerbaarheid. Downstream-pijpleidingen daarentegen zijn op maat gemaakt, afhankelijk van de biologische vraag, en vereisen inzicht van de onderzoeker, waardoor ze minder geschikt zijn voor standaardisatie. We hebben een gebruiksvriendelijke upstream-pijplijn gecreëerd waarmee wet-lab wetenschappers hun eigen gegevens reproduceerbaar kunnen analyseren zonder enige voorkennis van bio-informatica. Hier presenteren we CATCH-UP, een pijplijn die is gebouwd met behulp van het snakemake-framework en is ontworpen om zowel gebruiksvriendelijk te zijn als om het probleem van reproduceerbaarheid in ChIP-seq- en ATAC-seq-gegevensanalyse te bestrijden. Deze pijplijn is gebouwd om ChIP-seq- of ATAC-seq-gegevens te verwerken. Nadat de gebruiker CATCH-UP heeft gedownload, moeten de analyseparameters en de naamgeving van het voorbeeld eerst worden gedefinieerd voordat de pijplijn op de opdrachtregel wordt uitgevoerd met behulp van één regel code. Eenvoudige stapsgewijze instructies voor het aanpassen van de analyseparameters voor ChIP-seq- of ATAC-seq-analyse worden verstrekt in het configuratiebestand zelf en in onze stapsgewijze handleiding in de CATCH-UP GitHub-repository.

Er zijn bestaande analysepijplijnen voor ChIP-seq- of ATAC-seq-gegevens, zoals PEPATAC en ChIP-AP. Hoewel deze pijplijnen voordelen hebben, zoals de integratie van zowel upstream- als downstream-analyses in een enkele workflow of het gebruik van een grafische gebruikersinterface (GUI), zijn deze tools gericht op bio-informatici en wetenschappers met een gemiddeld niveau van computationele training^13,14. CATCH-UP is ontworpen om twee problemen op te lossen: natte laboratoriumwetenschappers zonder bio-informaticatraining in staat stellen hun eigen stroomopwaartse analyse uit te voeren en standaardisatie van stroomopwaartse analyse mogelijk maken door eenvoudige rapportage en exacte reproduceerbaarheid in laboratoria mogelijk te maken. CATCH-UP is opzettelijk beperkt tot upstream-analyse, maar de output is compatibel met downstream-analyse-instrumenten zoals die worden gebruikt om datasets statistisch te vergelijken of transcriptiefactorbinding af te leiden ^25,26.

Alle kritieke stappen die nodig zijn om een reproduceerbare upstream-analyse uit te voeren, zijn vooraf gedefinieerd binnen de CATCH-UP-pijplijn om robuustheid te garanderen. Door de uitgebreide aard van deze pijplijn kan de gebruiker de uitvoer van de pijplijn stap voor stap volgen, wat handig is voor zowel het oplossen van problemen als het mogelijk maken van de analytische werkstroom om te worden gerepliceerd. Gezien de snel evoluerende aard van NGS-technieken, is het modulaire karakter van deze pijplijn gunstig omdat het de mogelijkheid biedt om gemakkelijk te worden aangepast om zowel de release van toolversie-updates als de implementatie van nieuwe tools op te nemen. CATCH-UP is met succes getest voor de volgende besturingssystemen: Ubuntu, CentOS, macOS (Intel CPU) en Windows (Tabel 3). De pijplijn is gebouwd om grote experimenten met tientallen monsters te verwerken door de workflow te parallelliseren, waardoor deze kan worden aangepast aan verschillende experimentele ontwerpen. Over het algemeen maakt de implementatie van CATCH-UP in de analyse van ChIP-seq- en ATAC-seq-gegevens een gebruiksvriendelijke, reproduceerbare en zeer aanpasbare analyseworkflow mogelijk.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
CATCH-UP	GitHub		https://github.com/Genome-Function-Initiative-Oxford/UpStreamPipeline/tree/main/genetics/CATCH-UP
CentOS	Linux	Versie 7	Elk van de hier vermelde besturingssystemen kan worden gebruikt
macOS	Apple	Versie 13 Ventura	Elk van de hier vermelde besturingssystemen kan worden gebruikt
Ubuntu	Ubuntu	Versie 22.04 LTS	Elk van de hier vermelde besturingssystemen kan worden gebruikt
Windows	Microsoft	Versie 11	Elk van de hier vermelde besturingssystemen kan worden gebruikt