Dit protocol beschrijft methoden om perifere, volwassen en nucleaire ooglensvezelcellen voor te bereiden op immunofluorescentiekleuring om complexe cel-tot-cel-interdigitaties en de membraanarchitectuur te bestuderen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Voorbereiding en immunofluorescentiekleuring van bundels en enkelvoudige vezelcellen uit de cortex en de kern van de ooglens
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
De lens is een transparant en ellipsoïde orgaan in de voorste oogkamer dat van vorm verandert om het licht fijn op het netvlies te richten om een helder beeld te vormen. Het grootste deel van dit weefsel bestaat uit gespecialiseerde, gedifferentieerde vezelcellen die een zeshoekige doorsnede hebben en zich uitstrekken van de voorste tot de achterste polen van de lens. Deze lange en dunne cellen staan sterk tegenover naburige cellen en hebben complexe interdigitaties over de lengte van de cel. De gespecialiseerde in elkaar grijpende structuren zijn vereist voor normale biomechanische eigenschappen van de lens en zijn uitgebreid beschreven met behulp van elektronenmicroscopietechnieken. Dit protocol demonstreert de eerste methode om enkelvoud en bundels van muizenlensvezelcellen te behouden en te immunokleuren om de gedetailleerde lokalisatie van eiwitten in deze complex gevormde cellen mogelijk te maken. De representatieve gegevens tonen kleuring van de perifere, differentiërende, rijpe en nucleaire vezelcellen in alle regio's van de lens. Deze methode kan mogelijk worden gebruikt op vezelcellen die zijn geïsoleerd uit lenzen van andere soorten.
Inleiding
De lens is een helder en eivormig weefsel in de voorste oogkamer dat bestaat uit twee celtypen, epitheel- en vezelcellen 1 (Figuur 1). Er is een monolaag van epitheelcellen die de voorste hemisfeer van de lens bedekt. Vezelcellen worden onderscheiden van epitheelcellen en vormen het grootste deel van de lens. De zeer gespecialiseerde vezelcellen ondergaan een verlenging, differentiatie en rijpingsprogrammering, gekenmerkt door duidelijke veranderingen in de morfologie van het celmembraan van de lensperiferie naar het lenscentrum 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Muizen zijn verzorgd op basis van een dierprotocol dat is goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Indiana University Bloomington. De muizen die werden gebruikt om representatieve gegevens te genereren, waren controledieren (wildtype) met een C57BL6/J-achtergrond, vrouwelijk en 8-12 weken oud. Zowel mannelijke als vrouwelijke muizen kunnen voor dit experiment worden gebruikt, omdat het zeer onwaarschijnlijk is dat het geslacht van de muizen de uitkomst van het experiment beïnvloedt.
1. Lensdissectie en decapsulatie
- Euthanaseer muizen volgens de "Guide for the Care and Use of Laborator....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Lensvezelcellen worden bereid uit de lenscortex (differentiërende vezels en rijpe vezels) en de kern, en de cellen worden gekleurd met falloïdine voor F-actine en WGA voor het celmembraan. Een mengsel van bundels cellen of enkelvoudige lensvezels (Figuur 3) wordt waargenomen en in beeld gebracht. Vanuit de lenscortex worden twee soorten cellen gevonden (Figuur 3A). Differentiërende vezelcellen in de periferie van de lens zijn recht, met zeer kleine uitsteeksels .......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dit protocol heeft de fixatie-, conserverings- en immunokleuringsmethoden gedemonstreerd die de 3D-membraanmorfologie van bundels of enkelvoudige lensvezelcellen van verschillende diepten in de lens getrouw behouden. De gekleurde lensvezels worden vergeleken met SEM-preparaten die al lang worden gebruikt om de morfologie van lensvezelcellen te bestuderen. De resultaten laten vergelijkbare membraanstructuren zien tussen beide preparaten. EM blijft de gouden standaard voor het bestuderen van celmorfologie, maar immunolabel.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door subsidie R01 EY032056 (aan CC) van het National Eye Institute. De auteurs bedanken Dr. Theresa Fassel en Kimberly Vanderpool van de Scripps Research Core Microscopy Facility voor hun hulp bij de elektronenmicroscoopbeelden.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 100% Triton X-100 | FisherScientific | BP151-500 | |
| 60mm plate | FisherScientific | FB0875713A | |
| 16% paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| 10X fosfaat gebufferd zoutoplossing | ThermoFisher | 70011-044 | |
| 1X fosfaat gebufferd zoutoplossing | ThermoFisher | 14190136 | |
| 48-well plate | CytoOne | CC7672-7548 | |
| Dekglasjes (22 x 40 mm) | FisherScientific | 12-553-467 | |
| Gebogen pincet | World Precision Instruments | 501981 | |
| Dissectiemicroscoop | Carl Zeiss | Stereo Discovery V8 | |
| Pincet met fijne punt | Electron Microscopy Sciences | 72707-01 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscoopglazen | FisherScientific | 12-550-15 | |
| LSM 800 confocale microscoop met Airyscan (63X) en Zen 3.5 Software | Carl Zeiss | ||
| Nagellak | |||
| Normaal ezelsserum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Phalloidin (rhodamine) | ThermoFisher | R415 | |
| Primair antilichaam | |||
| Scalpel Feather Wegwerp, steriel, Nr. 11 | VWR | 76241-186 | |
| Secundair antilichaam | |||
| Rechte pincet | World Precision Instruments | 11252-40 | |
| Thermo Scientific Nunc MicroWell MiniTrays (dissectielade) | FisherScientific | 12-565-154 | |
| Ultrafijne schaar | World Precision Instruments | 501778 | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium met DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Wei-kiem agglutinine (fluoresceine) | Vector Laboratories | FL-1021-5 |
Referenties
- Lovicu, F. J., McAvoy, J. W. Growth factor regulation of lens development. Developmental Biology. 280 (1), 1-14 (2005).
- Kuszak, J., Alcala, J., Maisel, H. The surface morphology of embryonic and adult chick lens-fiber cells. The American Journal of Anatomy.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
