Dit artikel beschrijft hoe je fototunable hydrogels in 3D bioprint om extracellulaire matrixverstijving en fibroblastactivering te bestuderen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
3D-bioprinting Phototunable Hydrogels om de activering van fibroblasten te bestuderen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Fototeerbare hydrogels kunnen ruimtelijk en tijdelijk transformeren als reactie op blootstelling aan licht. Door dit soort biomaterialen op te nemen in celkweekplatforms en dynamisch veranderingen teweeg te brengen, zoals toenemende stijfheid van het micro-milieu, kunnen onderzoekers veranderingen in de extracellulaire matrix (ECM) modelleren die optreden tijdens fibrotische ziekteprogressie. Hierin wordt een methode gepresenteerd voor het 3D-bioprinten van een fototunable hydrogel-biomateriaal dat in staat is tot twee opeenvolgende polymerisatiereacties in een gelatine-ondersteuningsbad. De techniek van Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogels (FRESH) bioprinting werd aangepast door de pH van het steunbad aan te passen om een Michael-additiereactie te vergemakkelijken. Eerst werd de bioink met poly(ethyleenglycol)-alfamethacrylaat (PEGαMA) off-stoichiometrie gereageerd met een celafbreekbare crosslinker om zachte hydrogels te vormen. Deze zachte hydrogels werden later blootgesteld aan foto-initator en licht om de homopolymerisatie van niet-gereageerde groepen te induceren en de hydrogel te verstijven. Dit protocol omvat hydrogelsynthese, 3D-bioprinten, fotoverstijving en eindpuntkarakteriseringen om de activering van fibroblasten binnen 3D-structuren te beoordelen. De hier gepresenteerde methode stelt onderzoekers in staat om een verscheidenheid aan materialen te 3D-bioprinten die pH-gekatalyseerde polymerisatiereacties ondergaan en kunnen worden geïmplementeerd om verschillende modellen van weefselhomeostase, ziekte en herstel te ontwikkelen.
Inleiding
3D-bioprinten is een transformatieve technologie die onderzoekers in staat stelt om cellen en biomaterialen nauwkeurig in 3D-volumes te deponeren en de complexe hiërarchische structuur van biologische weefsels na te bootsen. In het afgelopen decennium heeft de vooruitgang op het gebied van 3D-bioprinten geleid tot kloppend menselijk hartweefsel1, functionele modellen van nierweefsel2, modellen van gasuitwisseling in de long3 en tumormodellen voor kankeronderzoek4. De uitvinding van ingebedde 3D-bioprinttechnieken, zoals Freeform Reversible Embedding of Suspended Hydrogel (F....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. PEGαMA synthese en karakterisering
OPMERKING: De synthese van poly(ethyleenglycol)-alfamethacrylaat (PEGαMA) is aangepast aan Hewawasam et al . en uitgevoerd onder vochtvrije omstandigheden9.
- Weeg de reactanten.
OPMERKING: Weeg bijvoorbeeld 5 g 10 kg/mol 8-armig PEG-hydroxyl (PEG-OH) en 0,38 g natriumhydride (NaH) af (zie materiaaltabel). - Voeg een roerstaaf toe aan de Schlenk-kolf van 250 ml en spoel met argon.
- Los de PEG-OH op in het laagste volume watervrij tetrahydrofuraan (THF) dat nodig is voor het oplossen in de Schlenk-kolf.
OPME....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Dit protocol beschrijft hoe fotoafstembare hydrogels in een steunbad in 3D bioprint om constructies te creëren die in staat zijn tot dynamische en temporele verstijving voor het bestuderen van fibroblastactivering in geometrieën die menselijke weefsels nabootsen. Ten eerste legde het protocol uit hoe PEGαMA, de ruggengraat van dit fototafbare polymeersysteem, kon worden gesynthetiseerd. Metingen van nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie toonden een succesvolle PEGαMA-functionalisatie bij 96,5% (
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Tweetraps polymerisatiereacties als reactie op gecontroleerde blootstelling aan licht kunnen biomaterialen verstijven met ruimtelijke en temporele controle. Verschillende studies hebben deze techniek gebruikt om cel-matrixinteracties in verschillende platforms te evalueren 5,8,9,10,11,21,22,23.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken. Delen van dit manuscript zijn gereproduceerd met toestemming van © IOP Publishing https://doi.org/10.1088/1758-5090/aca8cf. 5 Alle rechten voorbehouden.
Dankbetuigingen
De auteurs willen graag Dr. Adam Feinberg (Carnegie Mellon University) en degenen die de 3D Bioprinting Open-Source Workshop organiseerden, erkennen. Deze personen maakten het mogelijk om de technieken van FRESH bioprinting te leren en de 3D-bioprinter te bouwen die voor deze studies werd gebruikt. Daarnaast willen de auteurs Biorender.com erkennen, die in dit manuscript is gebruikt om cijfers te produceren. Dit werk werd ondersteund door meerdere groepen of financieringsbronnen, waaronder de Rose Community Foundation (DDH en CMM), een Colorado Pulmonary Vascular Disease Research Award (DDH en CMM), de National Science Foundation onder Award 1941401 (CMM), het Departm....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| AccuMax Radiometer/Photometer Kit | Spectronics Corporation | XPR-3000 | Om lichtintensiteit te meten, gebruikt voor fotoverstijving |
| Azijnzuur | Fisher Scientific | BP2401-500 | Gebruikt tijdens PEGaMA-synthese |
| Aceton | Fisher Scientific | A184 | Gebruikt met de cryosecties |
| ActinGreen 488 ReadyProbes | Fisher Scientific | R37110 | Gebruikt voor kleuring |
| Aluminiumfolie | Reynolds | F28028 | |
| Watervrij tetrahydrofuraan (THF) | Sigma-Aldrich | 401757-1L | Gebruikt tijdens PEGaMA-synthese |
| Argon geperst gas | Airgas | AR R300 | Gebruikt tijdens PEGaMA-synthese |
| 8 Arm Poly(ethyleenglycol)-hydroxyl (PEG-OH) | JenKem Technology | 8ARM-PEG-10K | Gebruikt tijdens PEGaMA-synthese |
| 365 nm bandpassfilter | Edmund Optics | 65-191 | Gebruikt voor fotoverstijving |
| Rund Serum Albumine (BSA) | Fisher Scientific | BP9700-100 | Gebruikt tijdens kleuringsproces |
| Buchner trechter | Quark Glass | QFN-8-14 | Gebruikt tijdens PEGaMA-synthese |
| Calcein AM | Invitrogen | 65-0853-39 | Gebruikt tijdens kleuringsproces |
| Celite 545 (filtratiehulpmiddel) | EMD Millipore | CX0574-1 | Gebruikt tijdens PEGaMA-synthese |
| Gelaaide microscoopglazen | Globe Scientific | 1358W | |
| Chloroform-d | Sigma-Aldrich | 151823-10X0.75ML | Gebruikt om PEGaMA te karakteriseren |
| Click-iT Plus EdU Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C10637 | Gebruikt voor kleuring |
| 50 mL conische buisjes | CELLTREAT | 667050B | |
| Cryogeen veiligheidskit | Cole-Parmer | EW-25000-85 | |
| Cryostat | Leica | CM 1850-3-1 | |
| Dialysebuis | Repligen | 132105 | |
| 4’,6-Diamidino-2-Phylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542-1MG | Gebruikt voor kleuring |
| Diethylether | Fisher Scientific | E1384 | Gebruikt tijdens PEGaMA-synthese |
| 1,4-Dithiothreitol (DTT) | Sigma-Aldrich | 10197777001 | Bioink component |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | Cytiva | SH30271.FS | |
| Filtpapier | Whatman | 1001-090 | Gebruikt tijdens PEGaMA-synthese |
| Freezone 2.5L Freeze Dry System | Labconco | LA-2.5LR | Lyofilisator |
| Fusion 360 | Autodesk | N/A | Software download |
| 2,5 mL gasdichte spuit | Hamilton | 81420 | Gebruikt voor bioprinting |
| 15 Gauge 1,5" IT Serie tip | Jensen Global | JG15-1.5X | Gebruikt voor bioprinting |
| 30 Gauge 0,5" HP Serie tip | Jensen Global | JG30-0.5HPX | Gebruikt voor bioprinting |
| Geit Anti-Muis Alexa Fluor 555 Antilichaam | Fisher Scientific | A21422 | Gebruikt voor kleuring |
| Glycine | Fisher Scientific | C2H5NO2 | Gebruikt tijdens kleuringsproces |
| Hemocytometer | Fisher Scientific | 1461 | |
| Hoechst | Thermo Scientific | 62249 | Gebruikt tijdens kleuringsproces |
| Human Pulmonary Artery Adventitial Fibroblasts (HPAAFs) | AcceGen | ABC-TC3773 | Van een 2-jarige mannelijke patiënt |
| Zoutzuur (HCl) | Fisher Scientific | A144-500 | Gebruikt om pH van oplossingen aan te passen |
| ImageJ | National Institutes of Health (NIH) | N/A | Gratis software download |
| ImmEdge® Pen | Vector Laboratories | H-4000 | Gebruikt tijdens kleuringsproces |
| Incubator | VWR | VWR51014991 | |
| LifeSupport Gelatine Microparticle Slurry (Gelatine Slurry) | Advanced Biomatrix | 5244-10GM | Gebruikt voor bioprinting |
| Lichtmicroscoop | Olympus | CKX53 | Omgekeerde lichtmicroscoop |
| Lithium Fenyl-2,4,6-Trimethylbenzoylfosfinaat (LAP) | Sigma-Aldrich | 900889-5G | Foto-initiator gebruikt voor fotoverstijving |
| Vloeibare stikstof | N/A | N/A | |
| LulzBot Mini 2 | LulzBot | N/A | Bioprinter aangepast |
| Methacryloxiethyl Thiocarbamoyl Rhodamine B | Polysciences Inc. | 669775-30-8 | |
| 2-Methylbutaan | Sigma-Aldrich | M32631-4L | |
| Microman capillaire zuigers CP1000 | VWR | 76178-166 | Positieve verplaatsing pipetpunten |
| MMP2 Afbreekbare kruisverbinding (KCGGPQGIWGQGCK) | GL Biochem | N/A | Bioink component |
| Muis Anti-Mens & alpha;SMA Monoklonaal Antilichaam | Fisher Scientific | MA5-11547 | Gebruikt voor kleuring |
| OmniCure Series 2000 | Lumen Dynamics | S2000-XLA | UV lichtbron gebruikt voor fotoverstijving |
| Paraformaldehyde (PFA) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Gebruikt om monsters te fixeren |
| pH Meter | Mettler Toledo | FP20 | |
| pH Strips | Cytiva | 10362010 | |
| Fosfaat Buffered Saline (PBS) | Hyclone Laboratories, Inc. | Cytiva SH30256.FS | |
| Pipetset | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
| 10 µL Pipetpunten |
Referenties
- Ahrens, J. H., et al. Programming cellular alignment in engineered cardiac tissue via bioprinting anisotropic organ building blocks. Advanced Materials. 34 (26), e2200217(2022).
- Lin, N. Y. C., et al.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
