Methodenartikel

Meten van de mitochondriale functie van naïeve en effector CD8 T-cellen

1.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65642

⸱

28 maart 2025

 ,  , 
1Department of Immunology and Microbiology, University of Colorado School of Medicine, Anschutz Medical Campus, 2Medical Scientist Training Program, University of Colorado School of Medicine, Anschutz Medical Campus, 3Division of Surgical Oncology, Department of Surgery, University of Colorado School of Medicine, Anschutz Medical Campus

In dit artikel

Samenvatting

De bio-energetica van CD8 T-cellen kan worden ondervraagd met behulp van de Mito-stresstest. Deze methodologie kan worden gebruikt om acute en chronische metabole programmering te bestuderen. Dit protocol beschrijft benaderingen om de relaties tussen T-celreceptorbiologie en bio-energetische analyse te onderzoeken.

Samenvatting

Begrijpen hoe immunometabolisme de functie, differentiatie en het lot van lymfocyten beïnvloedt, heeft veel belangstelling en aandacht getrokken. De biologie van lymfocyten is onderzocht met behulp van bio-energetische analyse en is nu een cruciaal belangrijk hulpmiddel in het veld geworden. Daarom probeerden we een bio-energetische analysetest te optimaliseren die kan worden aangepast met voorbehandelingen en acute injectie voor receptorstimulaties. Hier evalueerden we het ex vivo metabolisme van CD8 T-cellen met behulp van de Cell Mito-stresstest om de snelheid van zuurstofverbruik en extracellulaire verzuring in naïeve en effector CD8 T-cellen te beoordelen. Antigeenspecifieke effector CD8 T-cellen werden afgeleid via ex vivo stimulatie en naïeve CD8 T-cellen werden geoogst uit splenocyten en geïsoleerd met magnetische kralenkolomscheiding.

Voorbehandelingen worden uitgevoerd in microplaten en we beschrijven hoe sensorcartridges moeten worden voorbereid. We laten zien hoe injectiepoorten kunnen worden geladen met medicijnen om indirect metabole capaciteiten te meten en met metabole modulatoren kan dit protocol worden gebruikt om specifieke enzymactiviteit te bestuderen. T-celreceptorstimulaties kunnen in realtime worden bestudeerd met acute injectie en stimulatie met anti-CD3/CD28 met behulp van de injectiepoorten. Instrumentanalysatoren worden gebruikt voor metingen en gegevensverzameling en gegevensvisualisatie wordt gedaan met softwareprogramma's om het cellulaire metabolisme te interpreteren. Deze strategie levert een uitgebreide hoeveelheid gegevens op over de biologie van immuuncellen en mitochondriale bio-energetica, waardoor onderzoekers het protocol op tal van manieren kunnen aanpassen om het metabolisme van CD8 T-cellen te onderzoeken.

Inleiding

Het lot en de functionaliteit van immuuncellen worden aanzienlijk beïnvloed door metabolisme, oxidatieve consumptie en anaërobe ademhaling 1,2,3,4. Onlangs is er een groeiende belangstelling voor het richten op metabole modulatie als een strategie om het lot en de effectorfunctie van CD8 T-cellen te herprogrammeren of nieuw leven in te blazen en de virale klaring te verbeteren of de endogene antitumorimmuniteit te verbeteren 5,6,7,8,9. Met name antigeenreceptorsignalering via de T-celreceptor (TCR) is een belangrijke vereiste voor CD8 T-celdifferentiatie, wat resulteert in stroomafwaartse signalering en activering 10,11,12 (Figuur 1). Langdurige blootstelling aan immunologische beledigingen veroorzaakt aanhoudende antigeenspecifieke stimulatie op de TCR, wat uiteindelijk leidt tot chronisch ontstoken toestanden, T-celvermoeidheid, een hermodellering van de immuunmicro-omgeving en immuunontsnapping 11,13,14,15,16,17,18,19.

Het metabolisme van uitgeputte CD8 T-cellen verschilt fundamenteel van dat van functionele effector CD8 T-cellen 2,3,14,15,18,20. T-celdifferentiatie, interferon γ (IFNγ) secretie en terugroepcapaciteit worden gedeeltelijk bepaald door de mitochondriale functie en β-oxidatie-afbraakproducten. IFNγ+ CD8 T-cellen zijn cruciale componenten van zowel antitumor- als antivirale immuunresponsen 21,22,23. Specifieke metabole flux via glycolyse en de elektronentransportketen is belangrijk voor de activering van CD8 T-cellen, cytokinesecretie en geheugenresponsen 4,11,13,15,18,24,25,26,27,28 . Optimale responsen, waaronder T-celactivering en effectordifferentiatie, vereisen een gecoördineerde en specifieke mitochondriale respons, terwijl mitochondriale defecten en overmatige reactieve zuurstofsoorten (ROS) uitgeputte of disfunctionele T-cellen kenmerken 9,29. Onlangs bevordert aanhoudende TCR-stimulatie van CD8 T-cellen in vitro de uitputtende differentiatie van CD8 T-cellen, deels door oxidatieve stress te induceren en het oxidatieve metabolisme en de metabolische capaciteiten die nodig zijn voor de proliferatie van T-cellen te herprogrammeren 1,2,13,20,24,29 . Al met al zijn metabole controle-assen cruciale componenten bij het sturen van CD8 T-celdifferentiatie en hun progressie naar effector-, geheugen- of uitgeputte/disfunctionele fenotypes.

Metabolische verbindingen sturen ook de respons van immuuncellen door te functioneren als autocriene of paracriene signaalmoleculen 9,30,31,32,33,34,35. Sphingosine-1-fosfaat (S1P) en lysofosfatidinezuur (LPA) zijn bioactieve en inflammatoire lipiden die via G-proteïne gekoppelde receptoren (GPCR's) signaleren om de uittreding van lymfocyten en cytotoxiciteit door CD8 T-cellen te moduleren36. LPA-signalering via GPCR LPA-receptoren op CD8 T-cellen herprogrammeert het metabolisme om lipolyse, vetzuuroxidatie en protonlekkage te verhogen9. Al met al worden de bio-energetica en het metabolisme van CD8 T-cellen grotendeels bepaald door de beschikbaarheid van substraat, omgevingsfactoren en energetische vereisten.

Methodologieën om het metabolisme van CD8 T-cellen te ondervragen zijn steeds belangrijker geworden. De Cell Mito Stress Test biedt een uitgebreide evaluatie van bio-energetica en wordt nu erkend als een kenmerkende techniek op het gebied van immunometabolisme en CD8 T-celenergetica 9,37. Adherente cellen werden in het verleden gebruikt voor de Mito-stresstesttest38; er is echter steeds meer belangstelling voor het toepassen van dit protocol op cellen die in suspensie zijn gekweekt en specifiek voor het gebruik van immuuncellen voor de Cell Mito Stress Test-testtest. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol om de metabole activiteit van CD8 T-cellen te meten op basis van onze recente publicatie9. We geven een gedetailleerde uitleg over de expansie van CD8 T-cellen, naïeve CD8 T-celisolatie, testvoorbereiding en behandeling met protocollen voor zowel voorbehandelingen als acute injecties in de Cell Mito Stress Test-test. Belangrijk is dat we meerdere methoden voor TCR-stimulatie en CD8 T-celactivering vergelijken en contrasteren, waaronder polyklonale en antigeenspecifieke TCR-stimulatie.

Dit protocol beschrijft antigeenspecifieke stimulatie met behulp van OT-I transgene muizen (een klassiek transgeen muismodel) waarvoor alle T-cellen van muizen dezelfde Vα2 - en Vβ5-genen tot expressie brengen39. De OT-I CD8 T-cellen van muizen herbergen allemaal dezelfde TCR die specifiek is tegen ovalbumine-octapeptide (OVA257-264 , ook geschreven als de aminozuursequentie SIINFEKL of N4, een veel bestudeerd epitoop dat, na presentatie door major histocompatibility complex (MHC) klasse I, cytotoxische CD8 T-cellen activeert39 (Figuur 1A). Over het algemeen wordt het OT-I transgene muismodel veel gebruikt door immunologen om TCR-signalering en antigeenspecifieke T-celeffectorfunctie te bestuderen. In tegenstelling tot monoklonale activering met het OT-I-muismodel, kunnen polyklonale CD8 T-cellen worden gegenereerd met anti-CD3/CD28-antilichamen tegen TCR CD3-subeenheden en CD28 co-stimulerend molecuul40 (Figuur 1B). Anti-CD3/CD28-antilichamen omzeilen de antigeenspecifieke component van TCR-signalering om een polyklonale populatie van T-cellen40 te activeren. Uiteindelijk vergelijken de resultaten die in dit rapport worden beschreven meerdere methoden voor het gebruik van de Cell Mito Stress Test om de dynamische metabole flux in CD8 T-cellen te kwantificeren.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Muizen werden gehouden in een pathogeenvrije omgeving en gehouden volgens de normen en voorschriften van de Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Aanmaak en uitbreiding van CD8 T-cellen via antigeenspecifieke stimulatie

  1. Oogst op de eerste dag splenocyten afkomstig van OT-I-muizen; Bereid ze vervolgens voor en activeer ze in vitro met het SIINFEKL (4) peptide.
    1. Maak de kapruimte schoon, bereid reagentia voor en verzamel het muismedium. Verwarm de muismedia in een water- of kralenbroedmachine.
      1. Doe op een plaat met 6 putjes 7 ml muismedium in het ene putje en vervolgens nog eens 3 ml muismedium in een ander putje. Plaats daarna een zeef in het putje met 7 ml media.
    2. Breng een muis vanuit het vivarium in een transferkooi naar het laboratorium. Breng de muis over naar een lege nieuwe kooi en plaats de CO2 -adapter op de bovenkant. Euthanaseer de muis met CO2 tot een stroomniveau van 2,75.
      1. Let goed op de muis en observeer of er tekenen van angst zijn. Let na de laatste ademhaling minstens 1 minuut op tekenen van ademhaling en leven. Schakel de CO2 uit en voer cervicale dislocatie uit als secundaire methode van euthanasie. Maak vervolgens het werkblad, de kooi en de rest van het werkgebied schoon en draag de muis naar de dissectiekap.
    3. Ontleed de milt uit de muis.
      1. Gebruik 70% ethanol om de dissectieapparatuur te steriliseren en plaats de muis met de linkerkant naar beneden, spuit de linkerkant van de muis om te desinfecteren.
      2. Gebruik schone instrumenten om de huid te verwijderen en het buikvlies te identificeren. Maak een kleine incisie door het buikvlies om de milt te vinden en snijd vervolgens de milt weg. Leg de milt in de 6-gaats plaat bovenop de zeef.
      3. Maak het gebied schoon, doe het muizenkarkas in een afvalzak en plaats de zak vervolgens in een vriezer voor verwijdering.
      4. Zorg ervoor dat het hele gebied schoon is en verplaats de plaat met 6 putjes in de weefselkweekkap voor de volgende stappen.
    4. Homogeniseer in de weefselkweekkap de milt en suspendeer de cellen in een eencellige suspensie zonder klonten.
      1. Duw de milt door de zeef in het putje met 7 ml media met de zuiger van een spuit van 5 ml.
      2. Spoel de zeef en eventueel achtergebleven weefsel af met 3 ml medium in het extra putje.
      3. Breng de celsuspensie met een serologische pipet over in een nieuwe conische buis van 10 ml.
      4. Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 500 × g en zuig het bovenstaande op met behulp van een glazen pipet.
    5. Lyse rode bloedcellen.
      1. Begin het proces voor een lysis van rode bloedcellen met behulp van 1 ml ACK-lysisbuffer door de cellen opnieuw te suspenderen in de ACK-lysisbuffer en gedurende 1-5 minuten bij kamertemperatuur te incuberen.
        OPMERKING: De incubatietijd moet worden geoptimaliseerd voor de specifieke batch ACK-lysisbuffer om maximale lysis van rode bloedcellen te bereiken met minimale sterfte van splenocyten.
      2. Voeg 10 ml medium toe aan de conische buis voor neutralisatie en centrifugeer gedurende 5 minuten bij 500 × g.
      3. Resuspendeer de cellen in 50 ml medium en breng ze over in een T75-kolf.
    6. Stimuleer de cellen met SIINFEKL (N4) peptide.
      1. Breng het SIINFEKL-peptide in de weefselkweekkap. Bewaar het SIINFEKL peptide bij -20 °C.
      2. Voeg SIINFEKL rechtstreeks aan de media toe om een uiteindelijke concentratie van 2 μg/ml te bereiken. Voeg 50 μL SIINFEKL (2 mg/ml) toe aan 50 ml medium om een uiteindelijke concentratie van 2 μg/ml te bereiken.
    7. Incubeer de cellen gedurende 72 uur bij 37 °C.
    8. Ontsmet de weefselkweekkap met 70% ethanol.
  2. Was op de vierde dag de cellen om het peptide te verwijderen. Breng de cellen opnieuw in suspensie met vers bereide media aangevuld met IL-2 en plaats de kolf terug in de broedmachine.
    1. Verzamel de cellen uit de T75 weefselkweekkolf in een conische buis van 50 ml. Centrifugeer en pellet OT-I CD8 T-cellen en verwijder vervolgens alle overtollige media met aspiratie. Voeg 50 ml nieuwe muismedia toe die 1.000 E/ml IL-2 bevatten en breng de cellen opnieuw over naar een nieuwe T75-kolf.
    2. Bewaar voor opslag aliquots van de IL-2-voorraad in een vriezer bij -80 °C. Opslag bij -80 °C minimaliseert de afbraak van peptiden.
  3. Bereid geëxpandeerde antigeenspecifieke cytotoxische CD8 T-cellen voor de mitochondriale functietest
    1. Op de zevende dag wordt de mitochondriale functietest uitgevoerd. Bereid de antigeenspecifieke OT-I CD8 T-cel voor op de test.
    2. Verzamel live CD8 T-cellen.
      1. Breng de cellen van de T-75 weefselkweekkolf over in een nieuwe conische buis van 50 ml. Centrifugeer vervolgens de conische buis gedurende 5 minuten bij 500 × g.
      2. Pipetteer in een nieuwe conische buis van 50 ml 20 ml van een dichtheidsgradiëntmedium (dichtheid = 1,077 g/ml) terwijl de cellen draaien.
      3. Zodra het centrifugeren is voltooid, neemt u de conische buis en gebruikt u 10 ml medium om de cellen opnieuw te suspenderen. Pipetter vervolgens heel langzaam en leg de geresuspendeerde cellen bovenop de dichtheidsgradiënt. Zonder de helling te verstoren, centrifugeert u de conische buis bij 1.300 × g gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur met de instelling ingesteld op maximale acceleratie en minimale vertraging zonder rem.
      4. Wanneer het centrifugeren is voltooid, gebruikt u een P1000-pipet om de middelste laag T-cellen te verzamelen. Visualiseer de cellulaire laag en zorg ervoor dat de pipet erboven blijft en de laag niet verstoort. Breng de verzamelde cellen over in een verse conische buis van 50 ml met 30 ml volledig muismedium. Centrifugeer vervolgens de conische buis van 50 ml gedurende 5 minuten bij 500 × g . Wanneer de centrifugatie is voltooid, zuigt u het overtollige supernatans op van de OT-I CD8 T-cellen. Met 20 ml vers muizenmedium, suspendeer de cellen.
    3. Tel met behulp van een hemocytometer het totale aantal levensvatbare cellen. Kleur een klein aantal cellen met trypanblauw in een verdunning van 1:4 om dode cellen te identificeren.
      OPMERKING: Van één OT-I-muis kunnen ongeveer 40-60 × 106-cellen worden verwacht.
    4. Was met een extra centrifugatiestap de resterende cellen met een extra 20 ml vers muismedium. Vervolgens pipetteren cellen met behulp van een microtiteren 200.000 cellen/putje in volledig muismedium.

2. Aanmaak en uitbreiding van polyspecifieke CD8 T-cellen via anti-CD3/anti-CD28 stimulatie

  1. Smeer op dag 0 een plaat met 24 putjes in CD3. Voeg 1 ml anti-CD3-biotine in een concentratie van 5 μg/ml, verdund in PBS, toe aan elk putje van een plaat met 24 putjes. Plaats de plaat een nacht in een bevochtigde couveuse met 5% CO2 -.
  2. Oogst de volgende dag een muis en verzamel splenocyten. Activeer splenocyten in vitro met anti-CD3/anti-CD28 door de stappen 1.1.1-1.1.5.3 te volgen.
  3. Gebruik het protocol voor het scheiden van magnetische kralen om CD8 T-cellen te isoleren.
    OPMERKING: Zorg ervoor dat de cellen koud worden gehouden. Werk snel onder voorgekoelde omstandigheden.
    1. Gebruik 40 μL MACS-buffer om de cellen te resuspenderen met 10.000.000 cellen per 40 μL MACS-buffer. Meng tot de oplossing grondig 10 μl biotine-antilichaamcocktail door de celoplossing en incubeer vervolgens gedurende 5 minuten bij 4 °C.
    2. Terwijl u wacht tot de cel in de koelkast is uitgebroed, bereidt u een kolom voor positieve selectie voor. Gebruik 3 ml buffer om de kolom te wassen en gooi vervolgens de afvalstroom weg.
    3. Haal na 5 minuten de cel-antilichaamoplossing uit de koelkast en voeg 30 μL MACS-buffer per 10.000.000 cellen toe, 20 μL anti-biotine en incubeer vervolgens nog eens 10 minuten bij 4 °C.
    4. Bereid een nieuwe opvangbuis voor onder een positieve selectiekolom met behulp van een verse conische buis van 15 ml. Zodra de incubatie van 10 minuten is voltooid, brengt u de celsuspensie over naar de positieve selectiekolom. Vang in een verse conische buis van 15 ml de doorstroming op. Was met 3 ml MACS-buffer de kolom om resterende cellen te verzamelen.
      NOTITIE: Zorg ervoor dat de celsuspensie een minimaal volume van 0.5 ml heeft.
    5. Plaats de positief geselecteerde CD8 T-cellen opnieuw in de plaat met 24 putjes voor anti-CD3/anti-CD28-stimulatie.
      1. Centrifugeer de doorstroming bij 500 × g gedurende 5 minuten bij 4 °C. Zuig het overtollige bovenstaande middel op en pipileer de cellen om ze in oplossing opnieuw te suspenderen. Tel met behulp van een hemacytometer en trypan blue de cellen.
        OPMERKING: Verwacht dat ~8-10 × 106 levende cellen per muizenmilt worden geteld.
      2. Na het tellen van de cellen, suspendeer de CD8 T-cellen met 500.000 cellen per ml. Zuig vervolgens voorzichtig 1 ml PBS op van de plaat met 24 putjes, herplaat de getelde cellen in de plaat met 24 putjes en voeg 106 cellen per putje toe.
      3. Om de cellen te stimuleren, spuit u anti-CD28 in de plaat met 24 putjes, zodat de uiteindelijke concentratie anti-CD28 2 μg/ml is. Om de cellen te mengen, tik je voorzichtig op de plaat. Houd de cellen de volgende 72 uur op 37 °C.
  4. Gebruik 70% ethanol om de weefselkweekkap schoon te maken.
  5. Verwijder op dag 4 (72 uur later) de cellen uit de anti-CD3/anti-CD28-stimulatie. Was de cellen door polyklonale CD8 T-cellen te centrifugeren. Verwijder het overtollige supernatans door aspiratie en suspendeer de cellen vervolgens opnieuw met vers muismedium met 1.000 eenheden/ml IL-2 met 10 ml media. Breng de geresuspendeerde cellen over in een nieuwe plaat met 6 putjes en plaats deze in de incubator.
    OPMERKING: 1.2.2. Voor opslag kunnen aliquots van de IL-2 voorraad worden bewaard in een vriezer bij -80 °C. Opslag bij -80 °C minimaliseert de afbraak van peptiden.
  6. Bereid de geëxpandeerde polyklonale effector CD8 T-cellen voor op de mitochondriale functietest.
    1. Maak op de zevende dag de polyklonale CD8 T-cellen klaar en verwerk ze voor de test.
    2. Verzamel live CD8 T-cellen.
      1. Breng de cellen met behulp van een pipet over van de plaat met 6 putjes naar een schone conische buis en centrifugeer de cellen vervolgens gedurende 5 minuten bij 500 × g.
      2. Volg stap 1.3.3.2-1.3.4.
        OPMERKING: Ongeveer 10-30 miljoen live CD8 T-cellen kunnen worden verwacht van een enkele C57BL/6-muis.
      3. Bewaar een hoeveelheid cellen voor flowcytometrie om de zuiverheid van CD8 te beoordelen. Voor flowcytometrie kleurt u de cellen gedurende 20 minuten op ijs met een levensvatbaarheidskleurstof naar keuze9.

3. Oogst naïeve CD8 T-cellen

  1. Oogst op de zevende dag splenocyten van een muis door de stappen 1.1.1-1.1.5.3 te volgen.
  2. Voer CD8 T-celisolatie uit met behulp van het protocol op basis van magnetische kralen dat wordt beschreven in de stappen 2.3-2.3.5.1.
  3. Plaat CD8 T-cellen in de microtiterplaat op 200.000 cellen/per putje in volledig medium.

4. Voer de mitochondriale functietest uit

  1. Bereid materialen voor op de dag voordat u de mitochondriale functietest uitvoert.
    1. Hydrateer de sensorcartridge.
      1. Pipetteer 200 μL gedestilleerd water in elke put van de nutsplaat. Plaats de sensorcartridge op de gereedschapsplaat. Controleer of de uiteinden van de sensorcartridge zijn ondergedompeld om een goede hydratatie te garanderen. Plaats zowel de sensorcartridge als de gereedschapsplaat in een CO2 -vrije broedstoof bij 37 °C gedurende minimaal 10 uur.
      2. Bereid een conische buis van 50 ml voor met 50 ml Calbrant en plaats deze in een CO2 -vrije incubator en broed een nacht uit.
      3. Bereid de dag voor de test het volledige verse medium voor ter voorbereiding op de test. Bereid in totaal 50 ml een oplossing van 1 mM pyruvaat, 2 mM glutamine en 10 mM glucose in analysemedium.
  2. Voer de mitochondriale functietest de volgende dag uit.
    1. Verwijder gedestilleerd water van de elektriciteitsplaat door deze eraf te vegen. Rehydrateer met 200 μL Calibrant. Gebruik de Calibrant die 's nachts in de CO2 -vrije incubator is bewaard. Na het terugplaatsen van de sensorcartridge bovenop de gereedschapsplaat. Plaats de gereedschapsplaat met de sensorcartridge terug in de CO2 -vrije couveuse.
      OPMERKING: Om de plaat om te draaien, keert u de plaat snel en snel in één vloeiende beweging om over de gootsteen, zodat het gedestilleerde water snel uit de plaat valt.
  3. Bereid CD8 T-cellen voor zoals hierboven beschreven in secties 1-3.
    1. Gebruik een meerkanaals pipet om 200.000 cellen per putje te plateren door 10 × 106 cellen opnieuw te suspenderen in 4,5 ml volledig medium en 90 μl per putje te plateren. Voeg vervolgens tijdens de voorbehandeling nog eens 90 μL aangewezen media per putje toe.
      OPMERKING: Als er geen voorbehandelingen zijn, leg de cellen dan op een plaat van 180 μL per putje met een eindconcentratie van 200.000 cellen per putje. Bewaar de plaat vanaf dit punt in het protocol op kamertemperatuur of in de CO2 -vrije incubator. De plaat mag niet in een 5% CO2 -incubator worden geplaatst. Merk op dat het uiteindelijke volume van de microtiterplaat 180 μL zal zijn.
  4. Bereid voorbehandelingen voor (inclusief suppletie met lipiden of een andere metaboliet).
    1. Bereid de voorbehandeling van lipiden voor door gevriesdroogd lipide uit de vriezer te draaien met behulp van een snel draaiende minicentrifuge. Bepaal de gewenste concentraties voor de voorbehandeling en bereid de lipidenvoorbehandeling voor op deze concentraties. Sonificeer de verdunde lipide gedurende 30 minuten direct voor gebruik.
    2. Bereid lipidencocktails voor.
      1. Bepaal de gewenste lipideconcentratie die moet worden gebruikt in de mitochondriale functietest.
      2. Bereid de lipiden voor in een concentratie die 2x de gewenste concentratie is. Voeg vervolgens de lipideoplossing toe aan het bestaande volume in de microplaat om een verdunning van 1:2 te bereiken. Voltooi dit door 90 μL van de lipidenoplossing rechtstreeks toe te voegen aan de reeds bestaande 90 μL. Het uiteindelijke volume is 180 μl (1:2 verdunning) per putje.
        OPMERKING: Tabel 1 geeft een voorbeelddiagram van een mogelijke plaatopstelling en -ontwerp. We stellen voor om de test uit te voeren met 5-6 technische replicaten, waarin zowel naïeve als antigeenspecifieke effector CD8 T-cellen worden opgenomen met en zonder lipide-additieven. Dit protocol is met name ontworpen om centrifugatie te voorkomen om cellulaire verstoring te minimaliseren. Aangezien de mitochondriale functietest zeer gevoelig is voor celaantallen, is het verminderen van celverlies van cruciaal belang. In plaats van centrifugeren worden cellen behandeld door te tikken om hun integriteit te behouden.
      3. Pineert 180 μl volledig medium in elke hoek van de plaat. Plaats de microtiterplaat met CD8 T-cellen in een CO2 -vrije incubator.
        OPMERKING: De incubatietijd is afhankelijk van de gewenste duur van de voorbehandeling. Om celdood tot een minimum te beperken, hebben we aanbevolen om CD8 T-cellen maximaal 4 uur voor te behandelen. Te lang duren van de voorbehandelingstijd kan overmatige celdood veroorzaken, wat de nauwkeurigheid van de resultaten beïnvloedt.
  5. Bereid vergiften en oplossingen voor acute injecties voor.
    1. Bereid met behulp van voorraadoplossingen een verdunde vorm van oligomycine. Maak een verdunning van oligomycine in 3 ml volledig medium. Bereid in conische buizen van 15 ml voorzichtig gifstoffen en acute injecties voor. Omdat de vergiften lichtgevoelig zijn, moet u deze oplossingen bereiden met behulp van buizen die in aluminiumfolie zijn gewikkeld om te beschermen tegen blootstelling aan licht.
      1. Verdun oligomycine in een conische buis van 15 ml, gewikkeld in aluminiumfolie, in 3 ml volledig medium, zodat de uiteindelijke concentratie 2,5 μM na injectie is.
      2. Verdun FCCP in een tweede conische buis van 15 ml, gewikkeld in aluminiumfolie, in 3 ml volledig medium, zodat de uiteindelijke concentratie na injectie 2,0 μM is.
      3. Maak in een derde conische buis van 15 ml, gewikkeld in aluminiumfolie, oplossingen van rotenon en antimycine A in 3 ml volledig medium om concentraties van 0,5 μM voor beide toxinen na injectie te bereiken.
      4. Als de test wordt uitgevoerd met aanvullende metabole modulatoren, geneesmiddelen of stimulaties, verdun deze middelen dan in het volledige medium. Als u van plan bent etomoxir of andere metabole modulatoren en geneesmiddelen te gebruiken, voer dan eerst een test uit om de titratiecurve te testen en de optimale concentratie voor gebruik te bepalen. Als een TCR-stimulatie via acute injectie wordt uitgevoerd, kan de test worden uitgevoerd met behulp van anti-CD3/anti-CD28 magnetische kralen of een combinatie van plaatgebonden anti-CD3-biotine met anti-CD28 streptavidine.
        OPMERKING: Raadpleeg voor aanvullende beschrijvingen rubriek 5 waarin het protocol voor TCR-stimulatie met acute anti-CD3/CD28-injectie wordt beschreven.
    2. Verwijder de sensorcartridge uit de CO2 -vrije couveuse. Gebruik de plaatadapters om de gifstoffen in de sensorcartridge te spuiten. Plaats de plaatadapters zo dat elke kamer speciaal kan worden geladen met gifstoffen of andere acute injecties.
      OPMERKING: Wees voorzichtig bij het pipetteren van de vergiften.
      1. Plaats gifstoffen in de poorten van de sensorcartridge. Als er geen extra injecties worden uitgevoerd, worden poorten AC-poorten geladen met gifstoffen. Piket 20 μl oligomycine in poort A, 22 μl FCCP in poort B, 25 μl rotenon in poort C en 25 μl antimycine A in poort C.
  6. Plaats een uur voordat u met de test op het instrument begint de microtiterplaat in de CO2 -vrije incubator.
  7. Voordat u het instrument start, opent u de software en kalibreert u het instrument. Voer deze taak 30 minuten uit voordat u de microplaat in het instrument laadt om ervoor te zorgen dat er voldoende tijd is voor de kalibratie.
    1. Label de putjes op het softwaresysteem en bekijk het injectieschema.
    2. Plaats tijdens de kalibratie de sensorcartridge in het instrument. De software zal u vragen om de initialisatie en kwaliteitscontrole te voltooien. De kalibratie beoordeelt de pH en O2 op elke put, die zal slagen of falen. Het instrument rapporteert de resultaten op het scherm met een vinkje of een 'X'.

5. Voer een aangepaste versie van de mitochondriale functietest uit met TCR-stimulatie in een apart experiment met een acute anti-CD3/CD28-injectie

OPMERKING: De mitochondriale functietest kan worden uitgevoerd met een acute TCR-simulatie via twee verschillende benaderingen: ofwel 1) met behulp van gebiotinyleerd anti-CD3 + anti-CD28 + streptavidine beschreven in stap 5.2 of 2) anti-CD3/CD28 magnetische kralen beschreven in stap 5.3 Deze afzonderlijke experimenten werken beide om de TCR te stimuleren via een acute injectie tijdens de test.

  1. Als u aanvullende injecties uitvoert, bereid dan de test voor zoals beschreven in rubriek 4. Wijzig de injectieschema's met behulp van de extra kamer voor de injectie. In dit protocol worden anti-CD3/anti-CD28 in poort A van de sensorcartridge geladen. Laad vervolgens de andere poorten op dezelfde manier, met oligomycine in poort B, FCCP in poort C en rotenon en antimycine A in poort D.
  2. Bereid en laad gebiotinyleerde anti-CD3 + anti-CD28 + streptavidine-componenten.
    1. Pipetteer 20 μl gebiotinyleerd anti-CD3 met 10 μg/ml in de daarvoor bestemde putjes in de sensorcartridge.
    2. Pipetteer 20 μl anti-CD28 bij 2 μg/ml + streptavidine bij 20 μg/ml in de daarvoor bestemde putjes in de sensorcartridge.
    3. Pipetteer 20 μl gebiotinyleerd anti-CD3 bij 10 μg/ml + anti-CD28 bij 2 μg/ml + streptavidine bij 20 μg/ml in de daarvoor bestemde putjes in de sensorcartridge.
    4. Zorg ervoor dat de controleputjes zijn voorbereid. Zorg ervoor dat er aangewezen putjes zijn die alleen met media zijn geïnjecteerd, gebiotinyleerd anti-CD3 alleen, anti-CD28 + streptavidine en gebiotinyleerd anti-CD3 + anti-CD28 + streptavidine.
  3. Gebruik een 1:1 kraal-tot-cel verhouding om anti-CD3/CD28 magnetische kralen voor te bereiden en te laden.
    1. In een plaat met 200.000 cellen per putje, pipetteer je 5 μL magnetische kralen naar de aangewezen putjes in de sensorcartridge.
    2. Bereid de aangewezen controleputjes voor met media die alleen voor injectie zijn bestemd.
  4. Pas het volume van de vergiften aan zodat de uiteindelijke concentraties na injectie zijn: 2,5 μM voor oligomycine, 2,0 μM voor FCCP en 0,5 μM voor rotenon en antimycine A.
  5. Zorg ervoor dat het injectieschema is aangepast om de bijgewerkte tijdstippen weer te geven voordat de microplaat op het instrument wordt geladen.
  6. Programmeer de software om de acute TCR-stimulatie in totaal 140 minuten uit te voeren. Wijzig binnen dit tijdsbestek het schema zodat er x10 tijdstippen zijn gemeten voorafgaand aan de injectie met oligomycine.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De glycolytische en oxidatieve metabolische capaciteiten kunnen worden gemeten met behulp van een mitochondriale functionele test die de capaciteiten evalueert door componenten van de elektronentransportketen op bepaalde tijdstippen te richten (Figuur 2A). Er kunnen verschillende injectieschema's op de poorten van de sensorcartridge worden geladen om de traditionele test aan te passen en acute TCR-stimulatie te beoordelen (Figuur 2B,C

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

In dit artikel schetsen we een protocol om de mitochondriale functie van naïeve en effector CD8 T-cellen te beoordelen. We beschrijven en vergelijken methoden om zowel antigeenspecifieke als polyklonale CD8 T-cellen te bereiden met behulp van OT-I- en C57BL/6-muizen. Onze resultaten tonen aan dat er vergelijkbare trends in het metabolisme zijn, ondanks de methode van activering en voorbehandeling in CD8 T-cellen. Uit de gegevens blijkt dat antigeenspecifieke activering leidt tot meer met...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen concurrerende belangen om bekend te maken.

Dankbetuigingen

De Hertz Foundation, de Amy Davis Foundation, de Moore Family Foundation en de Heidi Horner Foundation hebben onschatbare steun verleend, waarvoor we dankbaar zijn. Dit werk werd ook gedeeltelijk ondersteund door NIH-subsidies aan RMT (AI052157, AI136534), terwijl JAT werd ondersteund door de Hertz Graduate Fellowship.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Antimycin ASigma-AldrichA8674
Anti-CD28Biolegend102116
Anti-CD3/CD28 DynabeadsThermoFisher11456D
Biotinylated anti-CD3Biolegend317320
Bovine Serum AlbuminSigma-Aldrich108321-42-2
CD8a+ T cell isolation kitMiltenyi Biotec130-104-075
Cell Strainers (100 µm)CELL TREAT229485
Ethylenediaminetetraacetic acidSigma-AldrichE8008
FicollSigma-Aldrich26873-85-8density gradient medium 
FCCP ((4-(trifluoromethoxy) phenyl) carbonohydrazonoyl dicyanide)Sigma-AldrichC2920
GlucoseSigma-AldrichG-6152
GlutamineSigma-AldrichG7513
LS ColumnsMiltenyi Biotec130-042-401Positive selection columns
Magnetic cell separation columnMiltenyi Biotec130-042-301
MicroplateAgilent102601-100
OligomycinSigma-Aldrich75351
PyruvateSigma-Aldrich113-24-6
Recobinant IL-2PeproTech200-02
RotenoneSigma-AldrichR8875
Seahorse mediaAgilent103576-100
Sensor cartridgeAgilent102601-100
StreptavidinSigma-AldrichA9275
Sterile 6 well plateCELL TREAT230601
Sterile 24 well plateCELL TREAT229524
XF CalibrantAgilent102601-100

Referenties

  1. Patsoukis, N., et al. PD-1 alters T-cell metabolic reprogramming by inhibiting glycolysis and promoting lipolysis and fatty acid oxidation. Nat Commun. 6, 6692(2015).
  2. Scharping, N. E., et al. Mitochondrial stress induced by continuous stimulation under hypoxia rapidly drives T cell exhaustion. Nat Immunol. 22, 205-215 (2021).
  3. Schurich, A., et al. Distinct Metabolic Requirements of Exhausted and Functional Virus-Specific CD8 T Cells in the Same Host. Cell Rep. 16 (5), 1243-1252 (2016).
  4. Zhang, L., Romero, P. Metabolic control of CD8(+) T cell fate decisions and antitumor immunity. Trends Mol Med. 24 (1), 30-48 (2018).
  5. Batabyal, R., et al. Metabolic dysfunction and immunometabolism in COVID-19 pathophysiology and therapeutics. Int J Obes (Lond). 45 (6), 1163-1169 (2021).
  6. Chavakis, T. Immunometabolism: Where immunology and metabolism meet. J Innate Immun. 14, 1-3 (2022).
  7. Frezza, C., Mauro, C. Editorial: The metabolic challenges of immune cells in health and disease. Front Immunol. 6, 293(2015).
  8. Wang, X., Ping, F. F., Bakht, S., Ling, J., Hassan, W. Immunometabolism features of metabolic deregulation and cancer. J Cell Mol Med. 23 (2), 694-701 (2019).
  9. Turner, J. A., et al. Lysophosphatidic acid modulates CD8 T cell immunosurveillance, metabolism, and anti-tumor immunity. Nat Commun. 14, 3214(2023).
  10. Coussens, L. M., Werb, Z. Inflammation and cancer. Nature. 420, 860-867 (2002).
  11. Jiang, Y., Li, Y., Zhu, B. T-cell exhaustion in the tumor microenvironment. Cell Death Dis. 6 (6), e1792(2015).
  12. Krangel, M. S. Mechanics of T cell receptor gene rearrangement. Curr Opin Immunol. 21 (2), 133-139 (2009).
  13. Barber, D. L., et al. Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Nature. 439, 682-687 (2006).
  14. Beltra, J. C., et al. Developmental relationships of four exhausted CD8(+) T cell subsets reveals underlying transcriptional and epigenetic landscape control mechanisms. Immunity. 52 (5), 825-841 (2020).
  15. Bengsch, B., et al. Bioenergetic insufficiencies due to metabolic alterations regulated by the inhibitory receptor PD-1 are an early driver of CD8(+) T cell exhaustion. Immunity. 45 (2), 358-373 (2016).
  16. Blank, C. U., et al. Defining 'T cell exhaustion'. Nat Rev Immunol. 19, 665-674 (2019).
  17. Dolina, J. S., Van Braeckel-Budimir, N., Thomas, G. D., Salek-Ardakani, S. CD8(+) T cell exhaustion in cancer. Front Immunol. 12, 715234(2021).
  18. Mognol, G. P., et al. Exhaustion-associated regulatory regions in CD8(+) tumor-infiltrating T cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (13), E2776-E2785 (2017).
  19. Wang, D., et al. A comprehensive profile of TCF1(+) progenitor and TCF1(-) terminally exhausted PD-1(+)CD8(+) T cells in head and neck squamous cell carcinoma: implications for prognosis and immunotherapy. Int J Oral Sci. 14 (1), 8(2022).
  20. Vardhana, S. A., et al. Impaired mitochondrial oxidative phosphorylation limits the self-renewal of T cells exposed to persistent antigen. Nat Immunol. 21, 1022-1033 (2020).
  21. Kang, S., Brown, H. M., Hwang, S. Direct antiviral mechanisms of interferon-gamma. Immune Netw. 18 (5), e33(2018).
  22. Samuel, C. E. Antiviral actions of interferons. Clin Microbiol Rev. 14, 778-809 (2001).
  23. Schellekens, H., Weimar, W., Cantell, K., Stitz, L. Antiviral effect of interferon in vivo may be mediated by the host. Nature. 278, 742(1979).
  24. Radoja, S., et al. CD8(+) tumor-infiltrating T cells are deficient in perforin-mediated cytolytic activity due to defective microtubule-organizing center mobilization and lytic granule exocytosis. J Immunol. 167 (9), 5042-5051 (2001).
  25. van der Windt, G. J., et al. Mitochondrial respiratory capacity is a critical regulator of CD8+ T cell memory development. Immunity. 36 (1), 68-78 (2012).
  26. Balmer, M. L., et al. Memory CD8(+) T cells require increased concentrations of acetate induced by stress for optimal function. Immunity. 44 (6), 1312-1324 (2016).
  27. Pereira, R. M., Hogan, P. G., Rao, A., Martinez, G. J. Transcriptional and epigenetic regulation of T cell hyporesponsiveness. J Leukoc Biol. 102, 601-615 (2017).
  28. Sen, D. R., et al. The epigenetic landscape of T cell exhaustion. Science. 354, 1165-1169 (2016).
  29. Quintana, A., et al. T cell activation requires mitochondrial translocation to the immunological synapse. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (36), 14418-14423 (2007).
  30. Brindley, D. N. Lysophosphatidic acid signaling in cancer. Cancers (Basel). 12 (12), 3791(2020).
  31. Chae, C. S., et al. Tumor-derived lysophosphatidic acid blunts protective type I interferon responses in ovarian cancer. Cancer Discov. 12, 1904-1921 (2022).
  32. Kremer, K. N., et al. LPA suppresses T cell function by altering the cytoskeleton and disrupting immune synapse formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (15), e2118816119(2022).
  33. Mathew, D., et al. LPA5 is an inhibitory receptor that suppresses CD8 T-cell cytotoxic function via disruption of early TCR signaling. Front Immunol. 10, 1159(2019).
  34. Mathew, D., Torres, R. M. Lysophosphatidic acid is an inflammatory lipid exploited by cancers for immune evasion via mechanisms similar and distinct from CTLA-4 and PD-1. Front Immunol. 11, 531910(2020).
  35. Oda, S. K., et al. Lysophosphatidic acid inhibits CD8 T cell activation and control of tumor progression. Cancer Immunol Res. 1 (4), 245-255 (2013).
  36. Lidgerwood, G. E., Pitson, S. M., Bonder, C., Pebay, A. Roles of lysophosphatidic acid and sphingosine-1-phosphate in stem cell biology. Prog Lipid Res. 72, 42-54 (2018).
  37. Torres, R. M., Turner, J. A., D'Antonio, M., Pelanda, R., Kremer, K. N. Regulation of CD8 T-cell signaling, metabolism, and cytotoxic activity by extracellular lysophosphatidic acid. Immunol Rev. 317 (1), 203-222 (2023).
  38. Turner, J. A., et al. BRAF modulates lipid use and accumulation. Cancers (Basel). 14 (9), 2110(2022).
  39. Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
  40. Li, Y., Kurlander, R. J. Comparison of anti-CD3 and anti-CD28-coated beads with soluble anti-CD3 for expanding human T cells: differing impact on CD8 T cell phenotype and responsiveness to restimulation. J Transl Med. 8, 104(2010).
  41. Ralli, M., et al. Immunotherapy in the treatment of metastatic melanoma: current knowledge and future directions. J Immunol Res. 2020, 9235638(2020).
  42. Philip, M., Schietinger, A. CD8(+) T cell differentiation and dysfunction in cancer. Nat Rev Immunol. 22, 209-223 (2022).
  43. Bajrai, L. H., et al. Understanding the role of potential pathways and its components including hypoxia and immune system in case of oral cancer. Sci Rep. 11, 19576(2021).
  44. Nicholls, D. G. Mitochondrial proton leaks and uncoupling proteins. Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1862, 148428(2021).
  45. Tyrakis, P. A., et al. S-2-hydroxyglutarate regulates CD8(+) T-lymphocyte fate. Nature. 540, 236-241 (2016).
  46. Guo, Y., et al. Metabolic reprogramming of terminally exhausted CD8(+) T cells by IL-10 enhances anti-tumor immunity. Nat Immunol. 22, 746-756 (2021).
  47. Notarangelo, G., et al. Oncometabolite d-2HG alters T cell metabolism to impair CD8(+) T cell function. Science. 377 (6614), 1519-1529 (2022).
  48. Yang, K., et al. T cell exit from quiescence and differentiation into Th2 cells depend on Raptor-mTORC1-mediated metabolic reprogramming. Immunity. 39 (6), 1043-1056 (2013).
  49. Ricciardi, S., et al. The translational machinery of human CD4(+) T cells is poised for activation and controls the switch from quiescence to metabolic remodeling. Cell Metab. 28 (6), 895-906.e5 (2018).
  50. Moller, S. H., Hsueh, P. C., Yu, Y. R., Zhang, L., Ho, P. C. Metabolic programs tailor T cell immunity in viral infection, cancer, and aging. Cell Metab. 34 (3), 378-395 (2022).
  51. Alrubayyi, A., et al. Functional restoration of exhausted CD8 T cells in chronic HIV-1 infection by targeting mitochondrial dysfunction. Front Immunol. 13, 908697(2022).
  52. Vignali, P. D. A., et al. Hypoxia drives CD39-dependent suppressor function in exhausted T cells to limit antitumor immunity. Nat Immunol. 24, 267-279 (2023).
  53. Ogando, J., et al. PD-1 signaling affects cristae morphology and leads to mitochondrial dysfunction in human CD8(+) T lymphocytes. J Immunother Cancer. 7 (1), 151(2019).
  54. Billingham, L. K., et al. Mitochondrial electron transport chain is necessary for NLRP3 inflammasome activation. Nat Immunol. 23, 692-704 (2022).
  55. Eberhardt, D. R., et al. EFHD1 ablation inhibits cardiac mitoflash activation and protects cardiomyocytes from ischemia. J Mol Cell Cardiol. 167, 1-14 (2022).
  56. Hou, T., et al. Identification of EFHD1 as a novel Ca(2+) sensor for mitoflash activation. Cell Calcium. 59 (5), 262-270 (2016).
  57. Mun, S. A., et al. Structural and biochemical characterization of EFhd1/Swiprosin-2, an actin-binding protein in mitochondria. Front Cell Dev Biol. 8, 628222(2020).
  58. Stein, M., et al. A defined metabolic state in pre B cells governs B-cell development and is counterbalanced by Swiprosin-2/EFhd1. Cell Death Differ. 24 (7), 1239-1252 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Effector T cellenNa eve T cellenBio energetische analyseCell Mito Stress TestZuurstofconsumptiesnelheidExtracellulaire verzuringTCR stimulatieIsolatie met magnetische beads

Gerelateerde artikelen