Wild-type blokkerende PCR gecombineerd met Sanger-sequencing voor detectie van laagfrequente somatische mutatie

Samenvatting

Dit artikel introduceert de toepassing van een laagfrequente detectiemethode op basis van Sanger-sequencing bij angioimmunoblastisch lymfoom. Zorg voor een basis voor het toepassen van deze methode op andere ziekten.

Samenvatting

Bij het monitoren van minimal residual disease (MRD) na tumorbehandeling zijn er hogere eisen aan de ondergrens van detectie dan bij het detecteren van geneesmiddelresistentiemutaties en circulerende tumorcelmutaties tijdens de therapie. Traditionele Sanger-sequencing heeft 5%-20% wildtype mutatiedetectie, dus de detectielimiet kan niet aan de overeenkomstige vereisten voldoen. De wild-type blokkerende technologieën waarvan is gemeld dat ze dit overwinnen, zijn onder meer blocker displacement amplification (BDA), niet-uitbreidbaar vergrendeld nucleïnezuur (LNA), hot-spot-specifieke sondes (HSSP), enz. Deze technologieën gebruiken specifieke oligonucleotidesequenties om wildtype te blokkeren of wildtype te herkennen en combineren dit vervolgens met andere methoden om wildtype-amplificatie te voorkomen en mutantamplificatie te versterken, wat leidt tot kenmerken zoals hoge gevoeligheid, flexibiliteit en gemak. Dit protocol maakt gebruik van BDA, een wildtype blokkerende PCR in combinatie met Sanger-sequencing, om de detectie van RHOA G17V laagfrequente somatische mutaties te optimaliseren, en de detectiegevoeligheid kan 0,5% bereiken, wat een basis kan vormen voor MRD-monitoring van angioimmunoblastisch T-cellymfoom.

Inleiding

Minimal residual disease (MRD) is het kleine aantal kankercellen dat na de behandeling nog in het lichaam aanwezig is. Vanwege hun kleine aantal leiden ze niet tot fysieke tekenen of symptomen. Ze worden vaak niet gedetecteerd door traditionele methoden, zoals microscopische visualisatie en/of het volgen van abnormale serumeiwitten in het bloed. Een MRD-positief testresultaat duidt op de aanwezigheid van resterende zieke cellen. Een negatief resultaat betekent dat er geen zieke cellen achterblijven. Na de behandeling van kanker kunnen de resterende kankercellen in het lichaam actief worden en zich gaan vermenigvuldigen, waardoor de ziekte terugvalt. Het detecteren van MRD is een indicatie dat de behandeling niet volledig effectief was of dat de behandeling onvolledig was. Een andere reden voor MRD-positieve resultaten na de behandeling kan zijn dat niet alle kankercellen reageerden op de therapie of omdat de kankercellen resistent werden tegen de gebruikte medicijnen^.

Angioimmunoblastisch T-cellymfoom (AITL) is een subtype van perifeer T-cellymfoom (PTCL) afgeleid van T-folliculaire helpercellen²; het is het meest voorkomende type T-cellymfoom, goed voor ongeveer 15%-20% van PTCL³. Het is een groep verwante maligniteiten die het lymfestelsel aantasten. De cel van oorsprong is de folliculaire T-helpercel. De WHO-classificatie van 2016 categoriseert het als angioimmunoblastisch T-cellymfoom⁴. In 2022 hernoemde de WHO het tot Nodaal T-folliculair helpercellymfoom, angioimmunoblastisch type (nTFHL-AI), samen met Nodaal T-folliculair helpercellymfoom, folliculair type (nTFHL-F) en Nodaal T-folliculair helpercellymfoom, niet anders gespecificeerd (nTFHL-NOS), gezamenlijk aangeduid als nodulair folliculair helper T-cellymfoom (nTFHL). Dit werd gedaan om de belangrijke klinische en immunofenotypische kenmerken en vergelijkbare T-folliculaire helper (TFH) genexpressiesignaturen en mutanten te identificeren. Genetisch gezien wordt nTFHL-AI gekenmerkt door de progressieve verwerving van somatische mutaties in vroege hematopoëtische stamcellen via TET2- en DNMT3A-mutaties, terwijl RHOA- en IDH2-mutaties ook aanwezig zijn in TFH-tumorcellen⁵. Verschillende onderzoeken hebben aangetoond dat de RHOA G17V-mutatie voorkomt bij 50%-80% van de AITL-patiënten 6,7,8,9. Het RHOA-eiwit dat wordt gecodeerd door het RHOA-gen wordt geactiveerd door guanosinetrifosfaat (GTP)-binding en geïnactiveerd door guanosinedifosfaat (GDP)-binding. Wanneer het wordt geactiveerd, kan het zich binden aan een verscheidenheid aan effectoreiwitten en een verscheidenheid aan biologische processen reguleren. Fysiologisch gezien medieert RHOA de migratie en polariteit van T-cellen, speelt het een rol bij de ontwikkeling van thymocyten en bemiddelt het de activering van pre-T-celreceptor (pre-TCR)-signalering¹⁰. De RHOA G17V-mutatie is een mutatie met functieverlies die een drijvende rol speelt in de pathogenese van lymfoom¹¹. De detectie van de laagfrequente mutatie is nuttig voor de MRD-monitoring van AITL.

Sanger-sequencing wordt al meer dan 40 jaar gebruikt als de gouden standaard voor het detecteren van bekende en onbekende mutaties. De detectielimiet is echter slechts 5%-20%, wat de toepassing ervan voor detectie van laagfrequente mutaties beperkt^{tot 12,13}. Bij Sanger-sequencing kan de detectiegevoeligheid worden verlaagd tot 0,1% door de traditionele PCR te vervangen door BDA, een wild-blocking-technologie¹⁴. BDA-technologie voegt voornamelijk een niet-overeenkomende primer toe die complementair is aan het mutanttype bij het ontwerpen van conventionele primers om te concurreren met het wildtype om het doel van het versterken van het mutanttype te bereiken. De sleutel tot het ontwerp van de primer is de mismatch-primer en de terminalmodificatie. Tegelijkertijd ligt het verschil tussen de Gibbs-vrije energie van de twee primers volgens het structurele principe van DNA tussen 0,8 kcal/mol en 5 kcal/mol. Een andere belangrijke stap in deze techniek is het onderdrukken van wild-type versterking door de verhouding tussen wild-type en blokkerende primers aan te passen^14,15.

Op dit moment omvatten veelgebruikte laagfrequente somatische mutatiedetectietechnieken PCR-gebaseerde allelspecifieke PCR (allelspecifieke polymerasekettingreactie, ASPCR), amplificatie-refractair mutatiesysteem PCR (amplificatie-refractair mutatiesysteem-PCR, ARMS-PCR) die wordt gebruikt voor genotypering van SNP met behulp van vuurvaste primers. Het ontwerpen van primers voor de mutante en normale allelen maakt selectieve amplificatie en digitale PCR (Droplet Digital PCR, ddPCR) mogelijk, een methode voor het uitvoeren van digitale PCR die is gebaseerd op water-olie-emulsiedruppeltechnologie¹⁶. Een monster wordt gefractioneerd in 20.000 druppeltjes en voor elke druppel wordt een PCR-amplificatie van de sjabloonmoleculen gedaan met een gevoeligheid van 1 x ^10-5; blocker displacement amplification (BDA) is ook een op PCR gebaseerde verrijkingsmethode voor zeldzame allels die wordt gebruikt voor nauwkeurige detectie en kwantificering van SNV's en indels tot 0,01% VAF in een sterk gemultiplexte omgeving; vergrendelde nucleïnezuurtechnologie (niet-uitbreidbaar vergrendeld nucleïnezuur, LNA), is een klasse van RNA-analogen met hoge affiniteit waarin de ribosering is vergrendeld in de ideale conformatie voor Watson-Crick-binding; hotspot-specifieke sondes (Hot-Spot-Specific Probe, HSSP), overlappen de doelprimersequentie, bevatten een enkele mutatie en worden gemodificeerd met een C3-afstandhouder aan ^{het C3}'-uiteinde om amplificatie door qPCR 14,16,17,18 te voorkomen. Wanneer er een mutatie in de sequentie bestaat, hecht de HSSP zich competitief aan de doelmutatie en voorkomt dat de primer zich bindt aan de doelmutantsequentie, waardoor de sequentieamplificatie stopt; NGS (next-generation sequencing) - op immunoglobuline high-throughput sequencing (igHTS) Kanker gepersonaliseerde profilering door diepe sequencing (CAAP-seq), het is een op sequencing gebaseerde methode van de volgende generatie die wordt gebruikt om circulerend DNA in kankercellen te kwantificeren (gevoeligheid is 1 x ^10-4); enz. Onder hen zijn de meeste methoden gebaseerd op PCR en kunnen ze slechts een klein aantal mutatieplaatsen detecteren, en de op NGS gebaseerde methoden kunnen meerdere plaatsen detecteren, maar de kosten zijn hoog en het proces is ingewikkeld 14,16,17,18. Er zijn meldingen gedaan over de detectie van RHOA G17V laagfrequente mutaties op basis van de qPCR, maar de detectielimiet kan slechts ongeveer 2% ^bereiken19. Er is geen rapport over de detectie van RHOA G17V laagfrequente mutatie op basis van Sanger-sequencing. Hier demonstreren we de toename van de gevoeligheid die wordt bereikt door BDA, een wildtype blok-PCR in combinatie met Sanger-sequencing, om de detectie van RHOA G17V laagfrequente somatische mutaties te optimaliseren, en de detectiegevoeligheid kan 0,5% bereiken. Aanvullende gegevens voor IDH2 en JAK1 worden ook verstrekt.

Dit artikel biedt een gedetailleerd protocol van het RHOA G17V-detectieschema voor lage frequenties door Sanger-sequencing en biedt een referentie voor de ontwikkeling van meer laagfrequente mutatiedetectie op basis van het Sanger-sequencingplatform. Deze methode kan worden gebruikt om mogelijke mutaties in resistentie tegen geneesmiddelen en minimale residuen in tumoren op te sporen en te monitoren.

Protocol

Deze studie werd goedgekeurd door de medisch-ethische toetsingscommissie van het Yongzhou Central Hospital (goedkeuringsnummer: 2024022601). De deelnemers gaven geïnformeerde toestemming.

1. Primer ontwerp

1. Conventioneel primerontwerp: Ontwerp primers volgens de gerapporteerde primerontwerpregels²⁰, primerontwerp door NCBI Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome). Voor de mutatieplaats van RHOA G17V zijn alle referentiesequenties voor het ontwerp van conventionele primers de gemuteerde basensequentie. Zorg ervoor dat de ontworpen omgekeerde amplificatieprimers de mutatieplaatsvolgorde bevatten en dat de gloeitemperatuur van de primers ongeveer 60 °C is.
2. BDA primer ontwerp
   1. Ontwerp de wildblokkerende primer met een lengte van ongeveer 20-30 basenparen (bp), met 2-4 gemodificeerde basen, en de gewijzigde basen bestaande uit A en T. Zorg ervoor dat de blokkerende primer 6-14 bp overlapt met de mutatieversterkende primer, die wordt gebruikt om te concurreren met de mutatieversterkende primer.
   2. Ontwerp de primer met een gloeitemperatuur voor de uiteindelijk ontworpen mutantversterkingsprimers en wildblokkerende primers ingesteld op ongeveer 60 °C, en het verschil in Gibbs vrije energie tussen 0,8-5 kcal/mol. Voor gedetailleerde berekeningsregels, zie literatuur¹⁵.
      OPMERKING: Wanneer de ontworpen primers niet aan de bovenstaande voorwaarden voldoen, kunnen bases handmatig worden toegevoegd of afgetrokken voor aanpassing. De definitieve lijst met ontworpen primers wordt weergegeven in Tabel 1 en Tabel 2.

2. Monstervoorbereiding en DNA-extractie

OPMERKING: Experimentele verificatiemonsters zijn allemaal afkomstig van perifere bloed-, beenmerg- of solide tumormonsters van humaan lymfoompatiënten. Er waren 10 positieve monsters: 3 waren solide tumormonsters, 4 waren beenmergmonsters en 3 waren perifere bloedmonsters. Er zijn 30 negatieve monsters van gezonde mensen.

1. Extractie van beenmerg- en perifere bloedmonsters
   1. Voeg 400 μL beenmerg- of perifeer bloedmonster en reagentia toe aan de overeenkomstige buisjes volgens de vereisten en extraheer volgens de extractieprocedure van de fabrikant.
   2. Bereid nieuwe monsterbuisjes en microcentrifugebuisjes van 1,5 ml voor. Nummer de monsterbuisjes van 1-24. Markeer de afdekkingen van de 1,5 ml buisjes met de naam van het monster en de extractiedatum in de volgorde van de namen op de overeenkomstige bloedafnamebuisjes. Markeer 1-24 op de zijkant van de microcentrifugebuis voor één-op-één correspondentiecontrole.
   3. Voeg 40 μL proteïnase K-oplossing toe aan het monsterbuisje en voeg 400 μL volbloedmonster toe (voor volumes van minder dan 400 μL, vul tot 400 μL met PBS).
   4. Zet het monsterbuisje (1-24), de pipetpunt (inclusief pipetdeksel) en het opvangbuisje in de overeenkomstige posities. Extraheer DNA volgens de procedure van de fabrikant.
2. Extractie van in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde (FFPE) monsters
   1. Plaats de monsters en reagentia in de overeenkomstige buisjes volgens de vereisten en extraheer volgens de extractieprocedure van de fabrikant.
   2. Voeg 1,1 ml proteïnase K-opslagbuffer (PK-oplossing) toe aan het proteïnase K droge poeder, vortex, en meng goed om een proteïnase K-oplossing te verkrijgen met een concentratie van 10 mg/ml. Bewaren bij -20 °C.
   3. Haal de proteïnase K-oplossing eruit en smelt deze volledig bij kamertemperatuur. Laat de droge thermostaat draaien en stel de temperatuur in op 55 °C.
   4. Neem een microcentrifugebuisje van 1,5 ml en schrijf de naam van het monster erop. Neem minder dan 30 mg weefsel en doe het in de microcentrifugebuis. Voeg vervolgens 500 μL Deparaffinebuffer en 20 μL proteïnase K-oplossing toe aan de buis.
   5. Plaats de microcentrifugebuis na het vortexmengen gedurende ten minste 10 s in een droge thermostaat en houd deze gedurende 90 minuten warm op 55 °C.
   6. Zorg ervoor dat de centrifugekolom in de filterbuis past. Nadat de incubatie is voltooid, brengt u het monster, inclusief vloeistof en weefsel, over naar de spinkolom. Centrifugeer op 16.500 x g gedurende 5 minuten om alle vloeistof in de filterbuis te centrifugeren.
   7. Neem 1 monsterbuisje (zonder dop) dat bij de kit is geleverd en schrijf de naam van het monster erop. Breng de vloeistof over van de filterbuis van 400 μL naar de monsterbuis.
   8. Nadat de voorbehandeling en voorbereiding van het monster zijn voltooid, plaatst u de bijbehorende verbruiksartikelen en reagentia op de overeenkomstige posities en voert u DNA-extractie uit volgens de instructies van de fabrikant.
3. DNA-kwaliteitscontrole
   1. Meet de concentratie en zuiverheid van het geëxtraheerde DNA en zorg ervoor dat de DNA-concentratie ≥ 25 ng/μL is. Noteer de DNA-concentratie van elk monster en gebruik het onmiddellijk voor latere detectie of bevriezing bij -20 °C.
      OPMERKING: OD260/OD280-waarden worden over het algemeen gebruikt om de zuiverheid van DNA-monsters te testen. De normale OD260/OD280-waarde is ongeveer 1,7-1,9, wat aangeeft dat de DNA-zuiverheid goed is; als de OD260/OD280-waarde ≤1,7 is, geeft dit aan dat er mogelijk sprake is van eiwitverontreiniging; als de OD260/OD280-waarde ≥2.0 is, geeft dit aan dat er mogelijk RNA-besmetting is of dat DNA is afgebroken.

3. PCR-amplificatie

1. Bereiding van primers
   1. Bereiding van de primer stock oplossing
      1. Verwijder het droge poeder van de primer en centrifugeer op 5400-8400 x g gedurende 2-3 minuten. Controleer de nmol-waarde van de primer en open langzaam het deksel. Gebruik een pipet met het overeenkomstige volume dubbel gedestilleerd water (ddH₂O), dat 10x van de nM-waarde is, en voeg het langzaam toe langs de wand van de primerbuis.
      2. Bereid primers voor op 0,1 nM/μL of 100 μM stockoplossing (bijv. de nM-waarde is 21,1; dienovereenkomstig is het toe te voegen water 211 μL). Vortex meng grondig en centrifugeer vervolgens kort om ervoor te zorgen dat de oplossing de bodem van elk putje bereikt. Schrijf de naam van de primer, de configuratiegegevens en de configuratiepersoon op de buisdop. Plaats het in de overeenkomstige opslagplaats voor de voorraadoplossing.
   2. Bereiding van de primeroplossing
      1. Pipetteer 5 μl voorwaartse primer, 5 μl omgekeerde primer, 50 μl wildtype primer stockoplossing en 40 μl ddH₂O in een schone microcentrifugebuis. Pipetteer herhaaldelijk 2x-3x, vortex om te mengen en direct af te draaien.
      2. Schrijf de naam van de primer, de datum van configuratie en de persoon die deze heeft geconfigureerd op de buisdop en plaats deze op de overeenkomstige opslaglocatie van de werkoplossing.
2. PCR-amplificatie procedure
   1. Voeg voor elke reactie 5 μL PCR-amplificatie-enzymmastermix, 1 μL primer-werkoplossing en 1 μL DNA-sjabloon toe (de invoerhoeveelheid van de sjabloon moet 400 ng bereiken, als de DNA-concentratie niet voldoende is; verhoog het volume DNA en verminder het volume ddH₂O toegevoegd) en 3 μL ddH₂O. Vortex om direct te mengen en af te draaien.
   2. Plaats de PCR-reactiebuis op het vooraf ingestelde PCR-instrument voor PCR-amplificatie. Stel het thermische cyclusprogramma van het PCR-instrument als volgt in en voer het uit:
      95 °C gedurende 3 min; 20 cycli van 95 °C gedurende 30 s, 68 °C gedurende 15 s (afname 0,5 °C per cyclus), 72 °C gedurende 1 min; 16 cycli van 95 °C gedurende 30 s, 58 °C gedurende 15 s, 72 °C gedurende 1 min; en 72 °C gedurende 10 min.
3. Voer gelelektroforese uit op het PCR-product met 2% agarose om te controleren of het doelfragment wordt geamplificeerd.
4. Zuivering van PCR-producten
   1. Breng purificase I en purificase II op kamertemperatuur en draai ze direct af. Bereid de zuiveringsreactie van het PCR-product als volgt voor: 1 μl purificase I, 0,5 μl purificase II, 3 μl PCR-product en 3,5 μl ddH₂O.
   2. Plaats de PCR-reactiebuis op het vooraf ingestelde PCR-instrument voor PCR-amplificatie. Stel het thermische cyclusprogramma van het PCR-instrument als volgt in en laat de machine draaien:
      37 °C gedurende 30 min, 95 °C gedurende 15 min.

4. Sequentiebepaling van PCR-producten na zuivering

1. Sequencing
   1. Breng de sequentie-amplificatie-enzymmastermix, buffer en ddH₂O op kamertemperatuur. Nadat het reagens vloeibaar is geworden, centrifugeert u het onmiddellijk.
   2. Bereid het sequentiereactiesysteem als volgt voor: 1,8 μl sequentiebuffer, 0,4 μl sequencing-amplificatie-enzymmastermix, 1 μl sequencingprimer, 0,8 μl gezuiverd PCR-product en 6 μl ddH₂O.
   3. Plaats de PCR-reactiebuis op het vooraf ingestelde PCR-instrument voor PCR-amplificatie. Stel het thermische cyclusprogramma van het PCR-instrument als volgt in en draai: 96 °C gedurende 3 minuten; 28 cycli van 96 °C gedurende 25 s, 56 °C gedurende 15 s, 60 °C gedurende 4 min.
   4. Nadat de sequentiereactie is voltooid, verwijdert u het product uit het PCR-instrument. Bewaar reactieproducten in de koelkast, beschermd tegen licht.
2. Zuivering van sequencing producten
   1. Draai de magnetische kralen grondig. Voeg 10 μL magnetische kralen en 40 μL 80% alcohol toe aan de plaat met 96 putjes en sluit de plaat af met een film.
   2. Plaats de plaat met 96 putjes met magnetische kralen en alcohol gedurende 10 s op de vortexshaker om de magnetische kralen volledig te suspenderen en te mengen (let op of er magnetische parelneerslag aan de onderkant is en pas op dat de vloeistof niet op de afdichtingsfilm komt). Zet het op een horizontale oscillator en bind het vast met een elastiekje om 3-5 minuten te trillen (maximale versnelling).
   3. Plaats na het oscilleren de PCR-plaat op de magnetische standaard, let erop dat u deze stevig aandrukt. Houd de standaard gedurende 3 minuten op 4 °C voor statische adsorptie en nadat de magnetische kralen allemaal aan de muur zijn geadsorbeerd, verwijdert u de afdichtingsfilm en giet u de afvalvloeistof eruit.
   4. Voeg 40 μL 80% alcohol toe aan de PCR-plaat, spoel de korrels af en giet de afvalvloeistof af. Leg de plaat op absorberend papier en dep er zachtjes op (laat de PCR-plaat niet loskomen van de schijf). Herhaal 1x.
   5. Plaats het absorberende papier ondersteboven samen met de magnetische plaat in de centrifuge op 120 x g voor een snelle centrifuge.
   6. Plaats de PCR-plaat met de magnetische kralen na het verwijderen van de alcohol 3-5 minuten in de oven op 60 °C. Droog de kralen volledig af.
      NOTITIE: Als er geen oven is, plaats de plaat dan 10 minuten op kamertemperatuur.
   7. Voeg na het drogen 40 μL zuiver water toe. Plaats de afdichtingsfilm op de plaat en schud deze 3-5 s op een vortexshaker. Leg de plaat op een horizontale shaker, bind hem stevig vast en schud hem 3-5 minuten om het gezuiverde sequencingproduct op te lossen.
   8. Draai het opgeloste sequencingproduct rond op 180 x g en gebruik het product voor genomische analyse met behulp van capillaire elektroforese²¹ (merk op dat de ondersteunende schijf aan het monsterbord moet worden toegevoegd).
3. Analyse van de resultaten van de sequencing
   1. Verkrijg de sequencingresultaten van de software. Raadpleeg de softwarehandleiding voor gedetailleerde bedieningsprocedures. Gebruik de referentiesequentie van NCBI.

Resultaten

Vergelijk de sequentie van het testmonster met de referentiesequentie om de mutatiestatus van het testmonster te bepalen. Op BDA gebaseerde WBT-PCR-technologie kan de bekende RHOA G17V-mutatie en andere laagfrequente mutaties detecteren in het amplificatie-interval van stroomopwaartse en stroomafwaartse primers. Zie figuur 1. Twee extra genen, namelijk IDH2 en JAK1, werden ook geanalyseerd met behulp van deze methode, respectievelijk Figuur 2 en Figuur 3. De resultaten laten zien dat deze methode vrij gevoelig is in het detecteren van laagfrequente mutaties.

Figuur 1: Sequentieresultaat voor RHOA. Van boven naar beneden toont de figuur de basenmutatie van de RHOA G17-site geamplificeerd door WBT-PCR en de sequentieresultaten na traditionele PCR-amplificatie die overeenkomen met wildtype RHOA G17. De middelste afbeelding toont de sequentieresultaten van de c.50G>T-mutatie na amplificatie met WBT-PCR-primers wanneer de detectiegevoeligheid 0,5% is. De onderste afbeelding toont de sequentieresultaten van de c.49-50delinsTT-mutatie na amplificatie met WBT-PCR-primers wanneer de detectiegevoeligheid 0,5% is. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Sequentieresultaat voor IDH2. Van boven naar beneden toont de bovenstaande figuur de basismutatie van de IDH2 R172-site geamplificeerd door WBT-PCR en de sequentieresultaten na traditionele PCR-amplificatie die overeenkomen met wildtype IDH2 R172. De bovenste afbeelding toont de sequentieresultaten van de c.515G>A-mutatie na amplificatie met WBT-PCR-primers wanneer de detectiegevoeligheid 0,5% is. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Sequentieresultaat voor JAK1. Van boven naar beneden toont de bovenstaande figuur de basenmutatie van de JAK1 S703-site geamplificeerd door WBT-PCR en de sequentieresultaten na traditionele PCR-amplificatie die overeenkomen met wildtype JAK1 S703. De bovenste afbeelding toont de sequentieresultaten van de c.2108G>T-mutatie na amplificatie met WBT-PCR-primers wanneer de detectiegevoeligheid 0,5% is. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Abc	Primer sequentie
RHOA-VF	ATAACCTTTTGGTGCCAGGT
RHOA-VR	GCTGAAGACTATGAGCAAGCA
VvE-WTB	AGCAAGCATGTCTCTCCACAGGCAAAA
Sequencing primer	ATAACCTTTTGGTGCCAGGT

Tabel 1: De definitief ontworpen primerlijst van RHOA.

IDH2 R172 primer
Abc	Primer sequentie
IDH2-VF	CTGGTTGAAAGATGGCGGCT
IDH2-VR	TACCTGGTCGCCATGGGC
IDH2-WTB	GCCATGGGCGTGCCTGCCAAAAT
Sequencing primer	CTGGTTGAAAGATGGCGGCT
JAK1 gen primer
Abc	Primer sequentie
JAK1-VF	ACTCTGAGGCCGAGTAGT
JAK1-VR	CCATTATGGACATCAGGACATTC
JAK1-WTB	GGACATTCTCACCAAGTAGCTCAGAAAA
Sequencing primer	ACTCTGAGGCCGAGTAGT

Tabel 2: De definitief ontworpen primerlijst van IDH2 en JAK1.

Discussie

De WTB-PCR op basis van BDA-technologie, beschreven in dit artikel, introduceert een niet-overeenkomende primer die complementair is aan het mutanttype bij het ontwerpen van conventionele primers om te concurreren met het wildtype, het wildtype te onderdrukken en het mutantproduct te versterken. Vervolgens werden de WTB-PCR-producten gesequenced voor mutatieanalyse. Het nut van WTB-PCR/Sanger is de eenvoud en hoge gevoeligheid. Volgens het detectieschema dat in dit artikel is vastgesteld, kunnen de meeste bestaande op Sanger gebaseerde assays worden toegevoegd met suppressorprimers via BDA, waardoor de detectiegevoeligheid wordt verhoogd. De RHOA G17V-mutatie die in dit artikel wordt geïntroduceerd, werd gesequenced door Sanger-sequencing na WTB-PCR op basis van BDA-technologie. Wanneer de inputhoeveelheid DNA 400 ng bereikt, kan de detectiegevoeligheid 0,5% of zelfs 0,1% bereiken. De detectiegevoeligheid van verschillende genen moet worden bevestigd door de hoeveelheid DNA-input, gensequentie, enz.

De sleutel tot WTB-PCR is het ontwerp van primers, en deze technologie kan alleen bekende mutaties detecteren. In dit artikel wordt een toepassing van deze technologie in Sanger-sequencing beschreven. Deze technologie kan ook worden toegepast op sequencing van de volgende generatie, kwantitatieve PCR, enz., en kan ook worden gebruikt bij multiplex PCR-detectie. Deze WTB-PCR kan de ondergrens van deze detectiemethoden verlagen en kan beter worden toegepast op MRD-monitoring. De meeste methoden op basis van PCR kunnen slechts een klein aantal mutatieplaatsen detecteren, en op NGS gebaseerde methoden kunnen meerdere plaatsen detecteren, maar de kosten zijn hoog en het proces is ingewikkeld 14,15,16,17,18. WTB-PCR heeft de kenmerken van hoge gevoeligheid, lage kosten en sterke flexibiliteit, waardoor het een ideale keuze is voor detectie van laagfrequente mutaties, wat de detectiegevoeligheid van Sanger-sequencing en de toepassing ervan bij MRD-detectie aanzienlijk kan verbeteren.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Automatische DNA extractor	9001301	Qiagen
DNA nucleïnezuurdetector	Q32854	Thermo fisher
PCR-amplificatiekit	P4600	merck
PCR-instrument	C1000 Touch	Biorad
Proteinase K-oplossing	D3001-2-A	zymo research
Proteinase K-opslagbuffer	D3001-2-C	zymo research
Sequencing-amplificatie-enzymkit	P7670-FIN	Qiagen