Hier wordt een nieuw geautomatiseerd apparaat voor kneuzing van ruggenmergletsel voor muizen gepresenteerd, dat nauwkeurig modellen voor dwarslaesie met verschillende gradaties kan produceren.
Methodenartikel
* These authors contributed equally
Hier wordt een nieuw geautomatiseerd apparaat voor kneuzing van ruggenmergletsel voor muizen gepresenteerd, dat nauwkeurig modellen voor dwarslaesie met verschillende gradaties kan produceren.
Dwarslaesie (SCI) als gevolg van traumatische verwondingen zoals auto-ongelukken en vallen wordt in verband gebracht met permanente disfunctie van het ruggenmerg. Het maken van kneuzingsmodellen van ruggenmergletsel door het ruggenmerg te beïnvloeden, resulteert in vergelijkbare pathologieën als de meeste ruggenmergletsels in de klinische praktijk. Nauwkeurige, reproduceerbare en handige diermodellen van dwarslaesie zijn essentieel voor het bestuderen van dwarslaesie. We presenteren een nieuw geautomatiseerd apparaat voor kneuzing van ruggenmergletsel voor muizen, het slimme dwarslaesiesysteem van de Guangzhou Jinan University, dat modellen voor dwarslaesie kan produceren met nauwkeurigheid, reproduceerbaarheid en gemak. Het systeem produceert nauwkeurig modellen van verschillende gradaties van dwarslaesie via laserafstandssensoren in combinatie met een geautomatiseerd mobiel platform en geavanceerde software. We gebruikten dit systeem om drie niveaus van muizenmodellen voor ruggenmergletsel te maken, hun Basso-muisschaal (BMS)-scores te bepalen en zowel gedrags- als kleuringstests uit te voeren om de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid ervan aan te tonen. We tonen elke stap van de ontwikkeling van de letselmodellen met behulp van dit apparaat en vormen een gestandaardiseerde procedure. Deze methode produceert reproduceerbare modellen van dwarslaesie-kneuzingsmuizen en vermindert menselijke manipulatiefactoren via handige hanteringsprocedures. Het ontwikkelde diermodel is betrouwbaar voor het bestuderen van dwarslaesiemechanismen en bijbehorende behandelingsbenaderingen.
Dwarslaesie resulteert meestal in permanente disfunctie van het ruggenmerg onder het gewonde segment. Het wordt meestal veroorzaakt door voorwerpen die de wervelkolom raken en hyperextensie van de wervelkolom, zoals verkeersongevallenen valpartijen1. Vanwege de beperkte beschikbaarheid van effectieve behandelingsopties voor dwarslaesie, zal opheldering van de pathogenese van ruggenmergletsels met behulp van diermodellen informatief zijn voor de ontwikkeling van geschikte behandelingsbenaderingen. Het kneuzingsmodel van dwarslaesie veroorzaakt door impact op het ruggenmerg resulteert in de ontwikkeling van diermodellen met vergelijkbare pathologieën als de meesteklinische gevallen van ruggenmergletsel2,3. Daarom is het belangrijk om nauwkeurige, reproduceerbare en handige diermodellen voor kneuzing van ruggenmergletsel te produceren.
Sinds Allen's uitvinding van het eerste diermodel van dwarslaesie in 1911, is er grote vooruitgang geboekt in de ontwikkeling van instrumenten voor het vaststellen van diermodellen voor dwarslaesie 4,5. Op basis van letselmechanismen worden dwarslaesiemodellen geclassificeerd als kneuzing, compressie, afleiding, ontwrichting, doorsnede of chemischestof 6. Onder hen zijn de kneuzingsmodellen, die externe krachten gebruiken om het ruggenmerg te verplaatsen en te verwonden, het dichtst bij de klinische etiologie van de meeste dwarslaesiepatiënten. Daarom is het kneuzingsmodel door veel onderzoekers gebruikt in onderzoeken naar dwarslaesie 3,7. Verschillende instrumenten worden gebruikt om modellen voor dwarslaesie te ontwikkelen. De impactor van de New York University (NYU) met multicenter dwarslaesie bij dieren (MASCIS) veroorzaakt kneuzingen van ruggenmergletsels door middel van een apparaat met gewichtdruppel8. Na verschillende bijgewerkte versies wordt de MASCIS-impactor veel gebruikt om diermodellen met dwarslaesie te ontwikkelen9. Wanneer de impactstaaf van MASCIS echter valt en het ruggenmerg raakt, kunnen er meerdere verwondingen optreden, wat van invloed is op de mate van letsel in dwarslaesiemodellen. Bovendien is het ook een uitdaging om mechanische precisie te bereiken om de nauwkeurigheid van het instrument en de herhaalbaarheid van het productiemodel te garanderen. De impactoren met oneindige horizon veroorzaken kneuzingen door de kracht die op het ruggenmerg wordt uitgeoefend te beheersen in plaats van zware druppels10. Het maakt gebruik van een computer die is aangesloten op een sensor om de impactkracht tussen de impactor en het ruggenmerg direct te meten. Wanneer de drempel is bereikt, wordt het botslichaam onmiddellijk ingetrokken, waardoor gewichtsterugkaatsing wordt voorkomen en de nauwkeurigheid wordt verbeterd10,11. Het gebruik van deze fijne motoriek om schade toe te brengen kan echter leiden tot inconsistente schade en functionele tekorten6. Het apparaat van de Ohio State University (OSU) comprimeert het dorsale oppervlak van het ruggenmerg met een voorbijgaande snelheid door een elektromagnetische driver 12,13. Dit apparaat is vergelijkbaar met de oneindige horizon-impactoren, omdat het compressies over korte afstand gebruikt om ruggenmergletsels te veroorzaken. Het heeft echter verschillende beperkingen in die zin dat de eerste bepaling van het nulpunt fouten zal veroorzaken als gevolg van de aanwezigheid van het hersenvocht 6,14. Samenvattend zijn er veel instrumenten die kunnen worden gebruikt om diermodellen voor dwarslaesie te ontwikkelen, maar ze hebben allemaal enkele beperkingen die leiden tot onvoldoende nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van diermodellen. Om nauwkeuriger, handiger en reproduceerbaarder muiskneuzingsmodellen van ruggenmergletsel te maken, is daarom een geautomatiseerde en intelligente dwarslaesie-impactor nodig.
We presenteren een nieuwe impactor voor dwarslaesie, Guangzhou Jinan University smart spinal cord injury system (G smart SCI system; Figuur 1), voor het maken van modellen voor dwarslaesiekneuzingen. Het apparaat maakt gebruik van een laserafstandsmeter als positioneringsapparaat, gecombineerd met een geautomatiseerd mobiel platform om aanvallen te automatiseren volgens ingestelde slagparameters, waaronder slagsnelheid, slagdiepte en verblijftijd. Geautomatiseerde bediening vermindert menselijke factoren en verbetert de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van diermodellen.
De studies met dieren werden beoordeeld en goedgekeurd door de ethische commissie van de Jinan University.
1. Verdoving van dieren en T10 spinale laminectomie
2. Kneuzing van het T10-ruggenmerg met behulp van het G smart SCI-systeem
3. Postoperatieve zorg
4. Testen van de effecten van ruggenmergletsel
Laminectomie werd uitgevoerd op 24 vrouwelijke muizen (8 weken oud) zoals hierboven beschreven. Muizen in de schijngroep (n=6) werden niet onderworpen aan ruggenmergletsel, terwijl de rest van de muizen, inclusief de 0,5 mm-groep (n=6), de 0,8 mm-groep (n=6) en de 1,1 mm-groep (n=6) werden blootgesteld aan verschillende diepten van ruggenmergimpingement. De BMS-scores werden regelmatig geregistreerd tot 1 maand postoperatief (figuur 4). Er waren significante verschillen in postoperatieve BMS-scores van muizen in verschillende groepen. Na 1 maand hadden muizen in de 0,5 mm-groep 4 tot 6 postoperatieve scores en herstelden ze zich tot een vergelijkbaar niveau als de schijngroep. Muizen in groepen van 0,8 mm en 1,1 mm hadden 1 tot 2 postoperatieve scores. Na 1 maand herstelde de 0,8 mm-groep zich tot 4 tot 6 scores, terwijl muizen in de 1,1 mm-groep nauwelijks herstelden.
Na 1 maand werden diergedragstesten, waaronder voetfout, rotarod en catwalk, uitgevoerd. In de voetfouttest (figuur 5A) waren er geen significante verschillen in voetfout van de achterpoten tussen de 0,5 mm- en schijngroep. De voetfout van de achterpoten voor de 0,8 mm-groep verschilde echter significant van alle andere groepen. Het percentage voetfouten van muizen in de 1,1 mm-groep was 100% omdat de achterpoten het dier niet op de grond konden ondersteunen en significant verschilden van de andere groepen. In de rotarod-test (Figuur 5B) registreerden we de tijd van latentie om te vallen in verschillende groepen muizen. Zowel de 0,8 mm- als de 1,1 mm-groep verschilden significant van de andere groepen, maar de schijngroep had vergelijkbare resultaten als de 0,5 mm-groep. In de catwalktest (Figuur 6) registreerden en analyseerden we de regelmatigheidsindex en het achterste maximale contactoppervlak bij verschillende groepen muizen. Er waren significante verschillen in regelmaat index en achterste maximale contactgebieden tussen muizen in verschillende groepen, wat significante verschillen in loopfuncties impliceert tussen muizen met verschillende diepten van ruggenmergletsel. Daarom kunnen muizenmodellen met verschillende diepten van ruggenmergletsel en met significante verschillen in hun achterpootfuncties worden gemaakt met behulp van het ontwikkelde apparaat.
Ten slotte hebben we het ruggenmerg van muizen verwijderd (Figuur 7A) en secties gemaakt voor hematoxyline- en eosine (HE)-kleuring (Figuur 7C). Er waren verschillende gradaties van schade in zowel ruggenmergbeelden als HE-gekleurde secties. Samenvattend hebben we met behulp van het voorgestelde instrument nauwkeurig verschillende gradaties van muizenmodellen voor ruggenmergletsels ontwikkeld.

Figuur 1: Guangzhou Jinan universiteit Smart dwarslaesiesysteem (G smart SCI systeem). Bevestig de spinale startonderbreker voor het immobiliseren van de muis op de draagtafel. Stel impactparameters in via het touchscreen. Gebruik een laterale microdriver om de laterale posities van de drager aan te passen en gebruik het touchscreen om de frontale posities aan te passen. De laserafstandsmeter bevestigt de impactpositie en meet de impacthoogte, zodat de impactkop nauwkeurig kan slaan volgens de ingestelde slagpositie en diepte. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Het touchscreen van de bediening. (A) Op de parameterpagina kunnen de schadeparameters, waaronder de impactsnelheid (0,5 -2,0 m/s), de impactdiepte (0 -3 mm) en de verblijftijd (500 -2 ms) worden ingesteld. (B) Op de bewegende pagina kan de hoogte van de slagkop en de positie van de spinale fixator worden ingesteld. (C) Als u op de voorbereidingspagina op de knop Gereed klikt, worden de slagkop en de draagtafel automatisch in een specifieke positie gezet op basis van de ingestelde parameters. Door op de Start-knop te klikken, raakt de slagkop het ruggenmerg op basis van de ingestelde parameters. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Ruggenmerg na letsel. (A) Schijngroep. De spinale startonderbreker immobiliseerde de T10-wervels en het ruggenmerg wordt na laminectomie zonder schade blootgelegd. (B) Groep van 0,5 mm. Het ruggenmerg raakte licht gewond nadat het op een diepte van 0,5 mm was geraakt en er was een kleine hoeveelheid congestie. (C) Groep van 0,8 mm. Het ruggenmerg was matig gewond en had duidelijke congestie nadat het op een diepte van 0,8 mm was geraakt. (D) 1,1 mm groep. Het ruggenmerg raakte ernstig gewond nadat het op een diepte van 1,1 mm was geraakt en er was veel congestie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: De BMS-scores. De BMS-scores van muizen werden geregistreerd vanaf de eerste postoperatieve dag tot een maand postoperatief (n = 6 /groep). *p< 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 vergeleken met eenrichtings-ANOVA. De datum wordt uitgedrukt als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Voetvaltest en rotarodtest. (A) Voetfouten van de achterpoten bij muizen met verschillende gradaties van ruggenmergletsels (n = 6 /groep). p <0,001 vergeleken met eenrichtings-ANOVA. (B) De latentie om te vallen tijdens de versnellende rotarod werd vergeleken bij muizen met verschillende gradaties van ruggenmergletsels (n = 6 /groep). * p < 0,05, *** p < 0,001 in vergelijking met eenrichtings-ANOVA. De datum wordt uitgedrukt als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Catwalktest. (A, C) Regelmatigheidsindices bij muizen met verschillende gradaties van ruggenmergletsels (n = 6 /groep). * p < 0,05, *** p < 0,001 in vergelijking met eenrichtings-ANOVA. (B, D) Achterste maximale contactgebieden werden automatisch geanalyseerd met behulp van de software (n = 6 /groep). ** p < 0,01, *** p < 0,001 in vergelijking met enkele reis ANOVA. De datum wordt uitgedrukt als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Kleuring van het ruggenmerg en H&E. (A) Ruggenmerg van muizen met verschillende gradaties van letsel 1 maand na de operatie. (B) Uitvergrote cijfers. (C) H&E-kleuring van dwarslaesieplaatsen bij muizen met verschillende gradaties van letsel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Dwarslaesie kan leiden tot sensorische en motorische stoornissen, wat kan leiden tot ernstige lichamelijke en geestelijke beperkingen. In China varieert het aantal gevallen van ruggenmergletsels in verschillende provincies van 14,6 tot 60,6 per miljoen18. De toename van de prevalentie van dwarslaesie zal de druk op de gezondheidszorg vergroten. Momenteel zijn er beperkte effectieve behandelingsopties voor dwarslaesie, verwondingen omdat de pathomechanismen en herstelprocessen nog niet volledig worden begrepen19. Er is behoefte aan nauwkeurige en reproduceerbare diermodellen voor dwarslaesie om de pathomechanismen en herstelprocessen van ruggenmergletsels te onderzoeken. Hiervoor ontwikkelden we een nauwkeurig, herhaalbaar en eenvoudig dwarslaesie-instrument.
Veel apparaten, waaronder de NYU-MASCIS-impactor, oneindige horizon-impactor en OSU-impactor, worden gebruikt om kneuzingsmodellen van ruggenmergletsels te maken 8,9,12,13,20. Deze apparaten zijn complex om te bedienen en kunnen grote fouten veroorzaken als gevolg van verschillende vaardigheden van het personeel. Bovendien zijn er verschillende gebreken in het ontwerp van deze apparaten waardoor ze minder nauwkeurig en reproduceerbaar zijn6. De specifieke locatie van de dwarslaesie bepaalt de ernst ervan, dus tijdens het opstellen van dwarslaesiemodellen bepaalt de positioneringsmethode de nauwkeurigheid van modellering21. Het G smart SCI-systeem maakt gebruik van een laserafstandsmeter om de plaats van de dwarslaesie te lokaliseren en past de hoogte van de slagkop aan op basis van de afstandsmetergegevens om de slagdiepte in te stellen. Een ander percussie-apparaat dat gebruik maakt van laserpositionering is de Louisville injury system apparatus (LISA) impactor van de Indiana University School of Medicine15. Hoewel LISA gebruik maakt van laserpositionering, vereist het handmatige bepaling en aanpassing van de hoogte van de slagkop om een gecontroleerde slagdiepte te bereiken, wat de menselijke tussenkomst verhoogt. Ondertussen maakt LISA gebruik van pneumatische stakingen en laptopbesturing, die meer experimentele ruimte vergen en de bedrijfskosten verhogen10. Het G smart SCI-systeem vermindert menselijke fouten door het bedieningsproces semi-automatisch te maken en is gemakkelijk te verplaatsen vanwege het lichte ontwerp.
Op basis van ingestelde parameters kan het apparaat het ruggenmerg van muizen nauwkeurig beïnvloeden, waardoor modellen worden gemaakt met verschillende gradaties van ruggenmergletsels. In deze studie vertoonden muizen met verschillende gradaties van ruggenmergletsels significante verschillen in functies van de achterpoten. Belangrijk is dat de tests reproduceerbaar zijn en consistent SCI-modellen kunnen genereren.
In het protocol omvatten de meest kritieke stappen het nauwkeurig uitvoeren van laminectomie, het stabiliseren van de stekels van muizen en het gebruik van de laser voor nauwkeurige positionering om de nauwkeurigheid en herhaalbaarheid van het experiment te garanderen. Tijdens het ontwerpproces hebben we enkele verbeteringen aan het apparaat aangebracht. We ontdekten dat het podium na de aanval niet gemakkelijk kon terugkeren naar het bereikpunt, daarom hebben we een knop toegevoegd om terug te keren naar het bereikpunt. Bovendien konden de gewenste parameters niet snel worden aangepast, daarom hebben we een numeriek toetsenbord toegevoegd voor invoer. De langzaam opladende elektromagnetische aandrijving in de eerste versie was ook verbeterd. Dit apparaat is momenteel beperkt tot het opzetten van modellen met kneuzing van thoracale dwarslaesie. Er moeten studies worden uitgevoerd ter ondersteuning van het gebruik van dit instrument bij het opstellen van modellen voor dwarslaesie bij ratten of modellen voor cervicale dwarslaesie.
Verder beschreef Dr. Bilgen van de University of Kansas Medical School een computergestuurd impactorapparaat, dat letsel aan het centrale zenuwstelsel (CZS) kan veroorzaken, waaronder traumatisch hersenletsel (TBI) en ruggenmergletsel (SCI)22. Net als ons apparaat maakt dit apparaat ook gebruik van een verscheidenheid aan gecommercialiseerde apparatuur en systemen, dus het werd met succes gecommercialiseerd en23 gebruikt. De apparatuur die we beschrijven heeft de kenmerken van automatisering, nauwkeurigheid en gemak, en zal naar verwachting in de toekomst op de markt worden gebracht en meer dwarslaesieonderzoekers ten goede komen.
Samengevat hebben we een geautomatiseerde ruggenmergimpactor voor muizen ontworpen om SCI-kneuzingsmodellen te maken. Het apparaat verbetert de nauwkeurigheid met een laserafstandsmeter en vermindert menselijke fouten via een geautomatiseerd bedieningsproces. Bovendien is het G smart SCI-systeem gemakkelijker te bedienen en te dragen dan andere apparaten, wat het onderzoek naar dwarslaesie gemakkelijker maakt. Belangrijk is dat het apparaat nauwkeurig en reproduceerbaar verschillende klassen van SCI-muizenmodellen kan creëren, afhankelijk van de behoeften van het experiment.
De auteurs verklaren dat er geen tegenstrijdige financiële belangen zijn.
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China, nrs. 82102314 (naar ZSJ) en 32170977 (naar HSL) en Natural Science Foundation van de provincie Guangdong, nrs. 2022A1515010438 (naar ZSJ) en 2022A1515012306 (naar HSL). Deze studie werd ondersteund door het Clinical Frontier Technology Program van het First Affiliated Hospital van Jinan University, China, nrs. JNU1AF- CFTP- 2022- a01206 (naar HSL). Deze studie werd ondersteund door Guangzhou Science and Technology Plan Project, nrs. 202201020018 (naar HSL), 2023A04J1284 (naar ZSJ) en 2023A03J1024 (naar HSL).
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.01M PBS (poeder, pH7.2-7.4) | Solarbio Life Sciences | P1010 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Macklin | 75-80-9 | |
| 4% paraformaldehyde weefselfixeermiddel | Biosharp life science | BL539A | |
| Biomicroscoop | Leica | LCC50 HD | |
| CatWalk | Noldus Information Technology | CatWalk XT 9.1 | |
| Dekglas | CITOTEST Scientific | 10212432C | |
| Inbeddingsmachine | Changzhou Zhongwei Electronic Instrument | BMJ-A | |
| Ethanol absoluut | DAMAO | 64-17-5 | |
| FootFaultScan | Clever Sys Inc. | - | |
| Glijschaal | CITOTEST Scientific | 80302-2104 | |
| Hematoxyline en Eosine Kleuringsset | Beyotime Biotechnology | C0105S | |
| Microslijpboor | FEIYUBIO | 19-7010 | |
| Muisruggengraatfixator | RWD Life Science | 68094 | |
| Paraffine microtoom | Thermo | shandon finesse 325 | |
| RotaRod voor Muizen | Ugo Basile | 47600 | |
| Stereomicroscoop | KUY NICE | SZM-7045 | |
| Tert-Amyl alcohol | Macklin | 75-85-4 | |
| Xyleen | China National Pharmaceutical | #10023418 |