Hier wordt een nieuw geautomatiseerd apparaat voor kneuzing van ruggenmergletsel voor muizen gepresenteerd, dat nauwkeurig modellen voor dwarslaesie met verschillende gradaties kan produceren.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Geautomatiseerde impactor voor kneuzingsmodel voor dwarslaesie bij muizen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Dwarslaesie (SCI) als gevolg van traumatische verwondingen zoals auto-ongelukken en vallen wordt in verband gebracht met permanente disfunctie van het ruggenmerg. Het maken van kneuzingsmodellen van ruggenmergletsel door het ruggenmerg te beïnvloeden, resulteert in vergelijkbare pathologieën als de meeste ruggenmergletsels in de klinische praktijk. Nauwkeurige, reproduceerbare en handige diermodellen van dwarslaesie zijn essentieel voor het bestuderen van dwarslaesie. We presenteren een nieuw geautomatiseerd apparaat voor kneuzing van ruggenmergletsel voor muizen, het slimme dwarslaesiesysteem van de Guangzhou Jinan University, dat modellen voor dwarslaesie kan produceren met nauwkeurigheid, reproduceerbaarheid en gemak. Het systeem produceert nauwkeurig modellen van verschillende gradaties van dwarslaesie via laserafstandssensoren in combinatie met een geautomatiseerd mobiel platform en geavanceerde software. We gebruikten dit systeem om drie niveaus van muizenmodellen voor ruggenmergletsel te maken, hun Basso-muisschaal (BMS)-scores te bepalen en zowel gedrags- als kleuringstests uit te voeren om de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid ervan aan te tonen. We tonen elke stap van de ontwikkeling van de letselmodellen met behulp van dit apparaat en vormen een gestandaardiseerde procedure. Deze methode produceert reproduceerbare modellen van dwarslaesie-kneuzingsmuizen en vermindert menselijke manipulatiefactoren via handige hanteringsprocedures. Het ontwikkelde diermodel is betrouwbaar voor het bestuderen van dwarslaesiemechanismen en bijbehorende behandelingsbenaderingen.
Inleiding
Dwarslaesie resulteert meestal in permanente disfunctie van het ruggenmerg onder het gewonde segment. Het wordt meestal veroorzaakt door voorwerpen die de wervelkolom raken en hyperextensie van de wervelkolom, zoals verkeersongevallenen valpartijen1. Vanwege de beperkte beschikbaarheid van effectieve behandelingsopties voor dwarslaesie, zal opheldering van de pathogenese van ruggenmergletsels met behulp van diermodellen informatief zijn voor de ontwikkeling van geschikte behandelingsbenaderingen. Het kneuzingsmodel van dwarslaesie veroorzaakt door impact op het ruggenmerg resulteert in de ontwikkeling van diermodellen met vergelijkbare pathologieën als de meesteklinische gevallen van ruggenmergletsel2,3. Daarom is het belangrijk om nauwkeurige, reproduceerbare en handige diermodellen voor kneuzing van ruggenmergletsel te produceren.
Sinds Allen's uitvinding van het eerste diermodel van dwarslaesie in 1911, is er grote vooruitgang geboekt in de ontwikkeling van instrumenten voor het vaststellen van diermodellen voor dwarslaesie 4,5. Op basis van letselmechanismen worden dwarslaesiemodellen geclassificeerd als kneuzing, compressie, afleiding, ontwrichting, doorsnede of chemischestof 6. Onder hen zijn de kneuzingsmodellen, die externe krachten gebruiken om het ruggenmerg te verplaatsen en te verwonden, het dichtst bij de klinische etiologie van de meeste dwarslaesiepatiënten. Daarom is het kneuzingsmodel door veel onderzoekers gebruikt in onderzoeken naar dwarslaesie 3,7. Verschillende instrumenten worden gebruikt om modellen voor dwarslaesie te ontwikkelen. De impactor van de New York University (NYU) met multicenter dwarslaesie bij dieren (MASCIS) veroorzaakt kneuzingen van ruggenmergletsels door middel van een apparaat met gewichtdruppel8. Na verschillende bijgewerkte versies wordt de MASCIS-impactor veel gebruikt om diermodellen met dwarslaesie te ontwikkelen9. Wanneer de impactstaaf van MASCIS echter valt en het ruggenmerg raakt, kunnen er meerdere verwondingen optreden, wat van invloed is op de mate van letsel in dwarslaesiemodellen. Bovendien is het ook een uitdaging om mechanische precisie te bereiken om de nauwkeurigheid van het instrument en de herhaalbaarheid van het productiemodel te garanderen. De impactoren met oneindige horizon veroorzaken kneuzingen door de kracht die op het ruggenmerg wordt uitgeoefend te beheersen in plaats van zware druppels10. Het maakt gebruik van een computer die is aangesloten op een sensor om de impactkracht tussen de impactor en het ruggenmerg direct te meten. Wanneer de drempel is bereikt, wordt het botslichaam onmiddellijk ingetrokken, waardoor gewichtsterugkaatsing wordt voorkomen en de nauwkeurigheid wordt verbeterd10,11. Het gebruik van deze fijne motoriek om schade toe te brengen kan echter leiden tot inconsistente schade en functionele tekorten6. Het apparaat van de Ohio State University (OSU) comprimeert het dorsale oppervlak van het ruggenmerg met een voorbijgaande snelheid door een elektromagnetische driver 12,13. Dit apparaat is vergelijkbaar met de oneindige horizon-impactoren, omdat het compressies over korte afstand gebruikt om ruggenmergletsels te veroorzaken. Het heeft echter verschillende beperkingen in die zin dat de eerste bepaling van het nulpunt fouten zal veroorzaken als gevolg van de aanwezigheid van het hersenvocht 6,14. Samenvattend zijn er veel instrumenten die kunnen worden gebruikt om diermodellen voor dwarslaesie te ontwikkelen, maar ze hebben allemaal enkele beperkingen die leiden tot onvoldoende nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van diermodellen. Om nauwkeuriger, handiger en reproduceerbaarder muiskneuzingsmodellen van ruggenmergletsel te maken, is daarom een geautomatiseerde en intelligente dwarslaesie-impactor nodig.
We presenteren een nieuwe impactor voor dwarslaesie, Guangzhou Jinan University smart spinal cord injury system (G smart SCI system; Figuur 1), voor het maken van modellen voor dwarslaesiekneuzingen. Het apparaat maakt gebruik van een laserafstandsmeter als positioneringsapparaat, gecombineerd met een geautomatiseerd mobiel platform om aanvallen te automatiseren volgens ingestelde slagparameters, waaronder slagsnelheid, slagdiepte en verblijftijd. Geautomatiseerde bediening vermindert menselijke factoren en verbetert de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van diermodellen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De studies met dieren werden beoordeeld en goedgekeurd door de ethische commissie van de Jinan University.
1. Verdoving van dieren en T10 spinale laminectomie
- Gebruik voor dit onderzoek vrouwelijke jongvolwassen C57/6J-muizen van 8 weken oud. Verdoof de muizen door intraperitoneale injectie van ketamine (100 mg/kg) en diazepam (5 mg/kg). Controleer op succesvolle anesthesie aangegeven door verlies van pijnreflex. Breng dierenartszalf aan op de ogen om uitdroging onder narcose te voorkomen.
- Scheer het haar op de rug van de muizen met een scheerapparaat om de huid te onthullen. Desinfecteer de huid met drie afwisselende rondes jodofoor en alcohol.
- Maak met een scalpel een mediale longitudinale incisie van 2,5 cm in de dorsale huid en leg de wervelkolom bloot op T9-T11-niveau met een pincet.
- Fixeer T10-facetten bilateraal met behulp van een spinale fixator. Zorg ervoor dat de wervelkolom stabiel vastzit. Zorg ervoor dat de paravertebrale spieren worden gestript en verwijder de processus spinosus en de laminae met behulp van een microslijpboor om het ruggenmerg van het T10-segment bloot te leggen.
2. Kneuzing van het T10-ruggenmerg met behulp van het G smart SCI-systeem
- Zet de schakelaar aan en wacht tot het apparaat automatisch terugkeert naar de oorspronkelijke staat. Plaats de spinale fixator in het G smart SCI-systeem en zet deze vast met schroeven.
- Stel met behulp van het bedieningsaanraakscherm (Figuur 2A) schadeparameters in, waaronder impactsnelheid (1 m/s), impactdiepte (0.5 mm, 0.8 mm en 1.1 mm voor drie verschillende sets muizen) en verblijftijd (500 ms)15.
- Lijn de laserafstandsmeter uit in het midden van het blootliggende ruggenmerg door het platform te verplaatsen. (Figuur 2B)
- Klik op de knop Gereed op het aanraakscherm (Figuur 2C). De slagkop past zich automatisch aan een specifieke hoogte aan op basis van instellingsparameters. De draagtafel verplaatst automatisch de plaats van de inslag van het ruggenmerg onder de slagkop.
- Druk handmatig op de slagkop om de inslagplaats verder te bepalen. Klik op de Start-knop , de slagkop raakt het ruggenmerg op basis van ingestelde parameters.
- Haal de muizen uit het apparaat en observeer onder een stereomicroscoop (20x) om een dwarslaesie vast te stellen (Figuur 3). Om het succes van modelontwikkeling te bepalen, observeert u lokale congestie, collaps en wervelvliesbreuk.
- Hecht de spier, fascia en huid laag voor laag met behulp van 3-0 hechtingen. Plaats de muizen in een warme doos en wacht op hun herstel.
3. Postoperatieve zorg
- Injecteer meloxicam (5 mg/kg) dagelijks subcutaan gedurende 7 dagen na de operatie. Leeg de blaas elke 8 uur handmatig totdat de blaasfuncties zijn hersteld.
- Verwijder 14 dagen na de operatie de hechtdraadjes.
4. Testen van de effecten van ruggenmergletsel
- Bereken de BMS-scores voor muizen vanaf de eerste postoperatieve dag16,17.
- Voer op de 30epostoperatieve dag diergedragsexperimenten uit, waaronder catwalk, voetfout en rotarod16,17. Catwalk: Recordafstand van 45 cm; Maximale looptijd 8 s; Camera winst 28.02; Intensiteitsdrempel 0,01. Voetfout: Noteer 60 stappen voor elke muis. Rotarod: Toerental 20 tpm. Noteer de tijd die de muis nodig heeft om te vallen en noteer deze als 120 s voor meer dan 120 s.
- Verdoof de muizen op de 31e postoperatieve dag door intraperitoneale injectie van ketamine (100 mg/kg) en diazepam (5 mg/kg) en euthanaseer de muizen vervolgens door perfusie met 4% PFA. Verwijder het ruggenmerg voorzichtig en onderschep 5 mm boven en onder de plaats van de verwonding voor het inbedden van paraffine. Maak een doorsnede van 5 μm van het midden van de dwarslaesie van de muis en voer hematoxyline- en eosinekleuringuit 17.
- Gebruik voor statistische analyse commerciële software. Gegevens uitdrukken als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM) en vergelijken met behulp van eenrichtings-ANOVA; P < 0,05 werd als significant beschouwd.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Laminectomie werd uitgevoerd op 24 vrouwelijke muizen (8 weken oud) zoals hierboven beschreven. Muizen in de schijngroep (n=6) werden niet onderworpen aan ruggenmergletsel, terwijl de rest van de muizen, inclusief de 0,5 mm-groep (n=6), de 0,8 mm-groep (n=6) en de 1,1 mm-groep (n=6) werden blootgesteld aan verschillende diepten van ruggenmergimpingement. De BMS-scores werden regelmatig geregistreerd tot 1 maand postoperatief (figuur 4). Er waren significante verschillen in postoperatieve BMS...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Dwarslaesie kan leiden tot sensorische en motorische stoornissen, wat kan leiden tot ernstige lichamelijke en geestelijke beperkingen. In China varieert het aantal gevallen van ruggenmergletsels in verschillende provincies van 14,6 tot 60,6 per miljoen18. De toename van de prevalentie van dwarslaesie zal de druk op de gezondheidszorg vergroten. Momenteel zijn er beperkte effectieve behandelingsopties voor dwarslaesie, verwondingen omdat de pathomechanismen en herstelprocessen nog niet volledig wor...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs verklaren dat er geen tegenstrijdige financiële belangen zijn.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China, nrs. 82102314 (naar ZSJ) en 32170977 (naar HSL) en Natural Science Foundation van de provincie Guangdong, nrs. 2022A1515010438 (naar ZSJ) en 2022A1515012306 (naar HSL). Deze studie werd ondersteund door het Clinical Frontier Technology Program van het First Affiliated Hospital van Jinan University, China, nrs. JNU1AF- CFTP- 2022- a01206 (naar HSL). Deze studie werd ondersteund door Guangzhou Science and Technology Plan Project, nrs. 202201020018 (naar HSL), 2023A04J1284 (naar ZSJ) en 2023A03J1024 (naar HSL).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.01M PBS (poeder, pH7.2-7.4) | Solarbio Life Sciences | P1010 | |
| 2,2,2-Tribromoethanol | Macklin | 75-80-9 | |
| 4% paraformaldehyde weefselfixeermiddel | Biosharp life science | BL539A | |
| Biomicroscoop | Leica | LCC50 HD | |
| CatWalk | Noldus Information Technology | CatWalk XT 9.1 | |
| Dekglas | CITOTEST Scientific | 10212432C | |
| Inbeddingsmachine | Changzhou Zhongwei Electronic Instrument | BMJ-A | |
| Ethanol absoluut | DAMAO | 64-17-5 | |
| FootFaultScan | Clever Sys Inc. | - | |
| Glijschaal | CITOTEST Scientific | 80302-2104 | |
| Hematoxyline en Eosine Kleuringsset | Beyotime Biotechnology | C0105S | |
| Microslijpboor | FEIYUBIO | 19-7010 | |
| Muisruggengraatfixator | RWD Life Science | 68094 | |
| Paraffine microtoom | Thermo | shandon finesse 325 | |
| RotaRod voor Muizen | Ugo Basile | 47600 | |
| Stereomicroscoop | KUY NICE | SZM-7045 | |
| Tert-Amyl alcohol | Macklin | 75-85-4 | |
| Xyleen | China National Pharmaceutical | #10023418 |
Referenties
- Venkatesh, K., Ghosh, S. K., Mullick, M., Manivasagam, G., Sen, D. Spinal cord injury: pathophysiology, treatment strategies, associated challenges, and future implications. Cell and Tissue Research. 377 (2), 125-151 (2019).
- Chiu, C. W., Cheng, H., Hsieh, S. L. Contusion Spinal Cord Injury Rat Model. Bio Protocol. 7 (12), e2337(2017).
- Thygesen, M. M., Guldbæk-Svensson, F., Rasmussen, M. M., Lauridsen, H. Contusion Spinal Cord Injury via a Microsurgical Laminectomy in the Regenerative Axolotl. Journal of Visualized Experiments. (152), 60337(2019).
- Anderson, T. E. A controlled pneumatic technique for experimental spinal cord contusion. Journal of Neuroscience Methods. 6 (4), 327-333 (1982).
- Allen, A. R. SURGERY OF EXPERIMENTAL LESION OF SPINAL CORD EQUIVALENT TO CRUSH INJURY OF FRACTURE DISLOCATION OF SPINAL COLUMN: A PRELIMINARY REPORT. Journal of the American Medical Association. LVII (11), 878-880 (1911).
- Cheriyan, T., et al. Spinal cord injury models: a review. Spinal Cord. 52 (8), 588-595 (2014).
- Yan, R., et al. A modified impactor for establishing a graded contusion spinal cord injury model in rats. Annals of Translational Medicine. 10 (8), 436(2022).
- Gruner, J. A. A monitored contusion model of spinal cord injury in the rat. Journal of Neurotrauma. 9 (2), 123-126 (1992).
- Ghnenis, A. B., et al. Evaluation of the Cardiometabolic Disorders after Spinal Cord Injury in Mice. Biology (Basel). 11 (4), 495(2022).
- Scheff, S. W., Rabchevsky, A. G., Fugaccia, I., Main, J. A., Lumpp, J. E. Jr Experimental modeling of spinal cord injury: characterization of a force-defined injury device. Journal of Neurotrauma. 20 (2), 179-193 (2003).
- Hong, Y. R., et al. Ultrasound stimulation improves inflammatory resolution, neuroprotection, and functional recovery after spinal cord injury. Scientific Reports. 12 (1), 3636(2022).
- Noyes, D. H. Electromechanical impactor for producing experimental spinal cord injury in animals. Medical & Biological Engineering & Computing. 25 (3), 335-340 (1987).
- Stokes, B. T., Noyes, D. H., Behrmann, D. L. An electromechanical spinal injury technique with dynamic sensitivity. Journal of Neurotrauma. 9 (3), 187-195 (1992).
- Pearse, D. D., et al. Histopathological and behavioral characterization of a novel cervical spinal cord displacement contusion injury in the rat. Journal of Neurotrauma. 22 (6), 680-702 (2005).
- Wu, X., et al. A Tissue Displacement-based Contusive Spinal Cord Injury Model in Mice. Journal of Visualized Experiments. (124), 54988(2017).
- Forgione, N., Chamankhah, M., Fehlings, M. G. A Mouse Model of Bilateral Cervical Contusion-Compression Spinal Cord Injury. Journal of Neurotrauma. 34 (6), 1227-1239 (2017).
- Ji, Z. S., et al. Highly bioactive iridium metal-complex alleviates spinal cord injury via ROS scavenging and inflammation reduction. Biomaterials. 284, 121481(2022).
- Chen, C., Qiao, X., Liu, W., Fekete, C., Reinhardt, J. D. Epidemiology of spinal cord injury in China: A systematic review of the chinese and english literature. Spinal Cord. 60 (12), 1050-1061 (2022).
- Flack, J. A., Sharma, K. D., Xie, J. Y. Delving into the recent advancements of spinal cord injury treatment: a review of recent progress. Neural Regeneration Research. 17 (2), 283-291 (2022).
- Khuyagbaatar, B., Kim, K., Kim, Y. H. Conversion Equation between the Drop Height in the New York University Impactor and the Impact Force in the Infinite Horizon Impactor in the Contusion Spinal Cord Injury Model. Journal of Neurotrauma. 32 (24), 1987-1993 (2015).
- Alizadeh, A., Dyck, S. M., Karimi-Abdolrezaee, S. Traumatic Spinal Cord Injury: An Overview of Pathophysiology, Models and Acute Injury Mechanisms. Frontiers in Neurology. 10, 282(2019).
- Bilgen, M. A new device for experimental modeling of central nervous system injuries. Neurorehabilitation and Neural Repair. 19 (3), 219-226 (2005).
- Khan, M., et al. GSNOR and ALDH2 alleviate traumatic spinal cord injury. Brain Research. 1758, 147335(2021).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
