Het muismodel Thyroid Hormone Action Indicator is ontwikkeld om weefselspecifieke kwantificering van de lokale werking van schildklierhormoon mogelijk te maken met behulp van de endogene regulerende machinerie. Onlangs is aangetoond dat het model geschikt is voor het karakteriseren van hormoonverstorende chemicaliën die interageren met de schildklierhormooneconomie, zowel door ex vivo als in vivo methodologieën.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
In vivo karakterisering van hormoonverstorende chemische effecten via schildklierhormoon actie-indicator muis
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Schildklierhormonen (TH) spelen een cruciale rol in het celmetabolisme en de weefselfunctie. De TH-economie is gevoelig voor hormoonontregelende chemicaliën (EDC's) die de hormoonproductie of -werking kunnen verstoren. Veel milieuverontreinigende stoffen zijn EDC's en vormen een opkomende bedreiging voor zowel de menselijke gezondheid als de landbouwproductie. Dit heeft geleid tot een grotere vraag naar goede testsystemen om de effecten van potentiële EDC's te onderzoeken. De huidige methodologieën staan echter voor uitdagingen. De meeste testsystemen maken gebruik van endogene markers die worden gereguleerd door meerdere, vaak complexe regelgevingsprocessen, waardoor het moeilijk is om directe en indirecte effecten te onderscheiden. Bovendien missen in-vitrotestsystemen de fysiologische complexiteit van het EDC-metabolisme en de farmacokinetiek bij zoogdieren. Bovendien omvat blootstelling aan EDC's in het milieu meestal een mengsel van meerdere verbindingen, waaronder in vivo gegenereerde metabolieten, dus de mogelijkheid van interacties kan niet worden genegeerd. Deze complexiteit maakt EDC-karakterisering moeilijk. De Thyroid Hormone Action Indicator (THAI)-muis is een transgeen model met een TH-responsief luciferase-rapportagesysteem, waardoor weefselspecifieke TH-actie kan worden beoordeeld. Men kan de weefselspecifieke effecten van chemicaliën op lokale TH-actie evalueren door de expressie van luciferase-reporter in weefselmonsters te kwantificeren. Bovendien maakt het TAI-muismodel met in vivo beeldvorming longitudinale studies mogelijk naar de effecten van potentiële EDC's bij levende dieren. Deze aanpak biedt een krachtig hulpmiddel voor het testen van langdurige blootstelling, complexe behandelingsstructuren of ontwenning, omdat het de beoordeling mogelijk maakt van veranderingen in lokale TH-actie in de loop van de tijd bij hetzelfde dier. Dit rapport beschrijft het proces van in vivo beeldvormingsmetingen op THAI muizen. Het hier besproken protocol richt zich op het ontwikkelen en in beeld brengen van hyper- en hypothyreoïdiemuizen, die als controles kunnen dienen. Onderzoekers kunnen de gepresenteerde behandelingen aanpassen of uitbreiden om aan hun specifieke behoeften te voldoen, wat een fundamentele benadering biedt voor verder onderzoek.
Inleiding
Schildklierhormoon (TH)-signalering is een fundamentele regulator van het cellulaire metabolisme, essentieel voor een normale ontwikkeling en een optimale weefselfunctie opvolwassen leeftijd. In weefsels wordt de TH-werking nauwkeurig gecontroleerd door een complexe moleculaire machinerie, waardoor weefselspecifiek behoud van lokale TH-niveaus mogelijk is. Deze autonomie van verschillende weefsels ten opzichte van circulerende TH-niveaus is van groot belang 2,3,4.
Talrijke chemische stoffen kunnen de endocriene functies verstoren en worden als verontreinigende stoffen in het milieu aangetroffen. Het is een groeiende zorg dat deze moleculen via afvalwater en landbouwproductie in de voedselketen terecht kunnen komen, waardoor de gezondheid van vee en mensen wordt beïnvloed 5,6,7.
Een van de belangrijkste uitdagingen bij het aanpakken van dit probleem is het enorme aantal betrokken verbindingen, waaronder zowel geautoriseerde als reeds verboden, maar nog steeds aanwezig zijnde moleculen. In de afgelopen jaren zijn aanzienlijke inspanningen geleverd om testsystemen te ontwikkelen voor het screenen en identificeren van het verstorend potentieel van verschillende chemische stoffen 8,9,10,11. Hoewel deze methoden uitblinken in high-throughput screening van duizenden verbindingen en het identificeren van potentiële bedreigingen, is een gedetailleerde analyse van specifieke in vivo effecten van deze moleculen essentieel om de gevaren van menselijke blootstelling vast te stellen. Een veelzijdige aanpak is dus noodzakelijk bij het bestuderen en karakteriseren van hormoonontregelende chemicaliën (EDC's).
In de context van TH-regulering vereist het begrijpen van de weefselspecifieke gevolgen van blootstelling aan EDC het kwantificeren van lokale TH-actie. Hoewel er verschillende in vivo modellen voor dit doel zijn ontwikkeld, vertrouwen de meeste op endogene markers als outputmaatstaf. Ondanks dat ze fysiologisch zijn, zijn deze markers onderhevig aan tal van regulerende mechanismen, zowel direct als indirect, waardoor hun interpretatie uitdagender wordt. Daarom blijft het karakteriseren van EDC-effecten op TH-regulatie op weefselniveau een belangrijke uitdaging12,13.
Om de uitdagingen van het meten van weefselspecifieke TH-signalering aan te pakken, is onlangs het Thyroid Hormone Action Indicator (THAI) muismodel ontwikkeld. Dit model maakt het mogelijk om veranderingen in lokale TH-actie onder endogene omstandigheden specifiek te kwantificeren. Een luciferase-transgen werd geïntroduceerd in het muizengenoom, dat zeer gevoelig is voor regulatie door TH-actie14. Dit model is effectief gebleken bij het beantwoorden van verschillende onderzoeksvragen die het kwantificeren van veranderingen in lokale weefsel-TH-signalering 14,15,16,17,18 vereisen.
Herkenning van een mogelijk gebruik van het THAI model is het karakteriseren van weefselspecifieke effecten van EDC's op TH-signalering. Het model is onlangs met succes gebruikt om de weefselspecifieke effecten van tetrabroombisfenol A en diclazuril op TH-signalering te onderzoeken15. Hier worden basisprotocollen gepresenteerd voor het gebruik van in vivo beeldvormingstechnieken op het THAI-model als een testsysteem voor het karakteriseren van EDC's die de TH-functie verstoren. Deze methode maakt gebruik van de bioluminescente aard van de luciferine-luciferase-reactie. In wezen katalyseert het transgeen tot expressie gebrachte luciferase-enzym de oxidatie van toegediende luciferine, waarbij lichtgevend licht wordt gegenereerd dat evenredig is met de hoeveelheid luciferase in het weefsel (Figuur 1). Bijgevolg is de gemeten biologische respons luciferase-activiteit, die is gevalideerd als een geschikte maat voor lokale TH-actie14. Hoewel het THAI-model toepasbaar is voor het kwantificeren van TH-actie in vrijwel alle weefsels, richt in vivo beeldvorming zich voornamelijk op TH-actie in de dunne darm (ventrale beeldvorming) en het interscapulaire bruine vetweefsel (BAT, dorsale beeldvorming)14.
Een belangrijk voordeel van de in vivo beeldvormingstechniek is dat het niet meer nodig is om dieren op te offeren voor metingen. Dit stelt onderzoekers in staat om longitudinale en follow-upexperimenten op te zetten als zelfgecontroleerde studies, waardoor de vooringenomenheid tussen proefpersonen en het aantal gebruikte dieren worden verminderd. Dit aspect is met name cruciaal bij EDC-karakterisering, en de kracht en veelzijdigheid van de methode voor dit doel zijn eerder aangetoond 14,15.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Dit protocol is herzien en goedgekeurd door het Comité voor dierenwelzijn van het Instituut voor Experimentele Geneeskunde (PE/EA/1490-7/2017, PE/EA/106-2/2021). De gepresenteerde gegevens zijn afkomstig van FVB/Ant achtergrond14, 3 maanden oude mannelijke TAI-muizen (n = 3-6/groep). FVB/Mierenachtergrond THAISE-dieren hebben de neiging om sterk gepigmenteerde vlekken op hun huid te hebben die de metingen kunnen verstoren. Zoek daarom naar gepigmenteerde vlekken op de huid van het afgebeelde gebied na het verwijderen van de vacht. Dieren hebben geen speciale huisvestingsomstandigheden nodig, tenzij het experiment dit specifiek vereist (bijv. een speciaal dieet).
1. Behandeling van hyperthyreoïdie
OPMERKING: Een algemeen protocol voor het induceren van hyperthyreoïdie bij muizen wordt hier gegeven. De ATA-gids19 biedt gedetailleerde uitleg over de achtergrond van de methoden met de genoemde alternatieven.
- Los T3 (3,5,3'-triiodothyronine, zie materiaaltabel) op in 40 mM NaOH om een stockoplossing te creëren met een concentratie tussen 5-10 mg/ml.
- Verdun de stockoplossing met zoutoplossing tot een eindconcentratie van 0,1 μg/μl.
- Injecteer de verdunde T3-oplossing intraperitoneaal (i.p.) bij wakkere dieren met een volume van 10 μl per gram lichaamsgewicht (bwg). Na 24 uur worden de dieren als hyperthyreoïdie beschouwd.
OPMERKING: T3-behandeling kan worden vervangen door elke andere vorm van behandeling. De behandeling heeft geen invloed op het protocol van in vivo beeldvorming.
2. Hypothyreoïdie behandeling
OPMERKING: Hier wordt alleen een algemeen protocol gegeven voor het induceren van hypothyreoïdie bij muizen. ATA-gids19 beschrijft gedetailleerde uitleg over de achtergronden van de methoden met de genoemde alternatieven.
- Schakel over op een jodiumvrij dieet en voeg KClO4 en methimazol toe aan het drinkwater (0,01 % methimazol, 0,05 % KClO4) (zie materiaaltabel).
- Vervang de drinkoplossing regelmatig (om de 2-3 dagen) door een verse drinkoplossing omdat methimazol lichtgevoelig is en snel afbreekt.
- Houd het behandelingsregime minimaal 2 weken vol, niet langer dan 4 weken. Dieren zullen afvallen en ongemak vertonen. Als dieren nauwelijks bewegen, veel van hun haar hebben verloren of nauwelijks bij bewustzijn zijn, gebruik dan een humaan eindpunt en beëindig ze op welke manier dan ook (volgens institutioneel goedgekeurde protocollen).
- Ga door met de behandeling van hypothyreoïdie in combinatie met andere behandelingen om mogelijk herstel van hypothyreoïdie te voorkomen.
3. In vivo beeldvorming
- Start de software die compatibel is met het in vivo beeldvormingssysteem (zie Materiaaltabel).
- Log in en wacht tot het paneel "Imaging Wizard" is geladen. Het is een kleiner paneel linksonder in het venster.
- Start op de "Imaging Wizard" de camerakoeling door te klikken op Initialiseren in het "Image Wizard paneel". Dit zorgt ervoor dat het instrument een installatieprotocol uitvoert en wacht tot het is voltooid. Het "Imaging Wizard-paneel" wordt blauw en er gaat een groen lampje branden in het paneel wanneer de cameratemperatuur laag genoeg is en het instrument klaar is.
- Stel de temperatuur van het verwarmingskussen in op 30-37 °C om de gemeten dieren warm te houden.
NOTITIE: Ga door met het protocol terwijl u wacht tot de cameratemperatuur optimaal is. - Houd of behandel geen dieren in de buurt van het instrument. Vermijd overmatige hoeveelheden haar die in de lucht rond het instrument circuleren.
- Verdoof 1-3 dieren met ketamine-xylazine i.p. injectie (ketamine 50 mg/kg lichaamsgewicht, xylazine 10 mg/kg lichaamsgewicht, zie materiaaltabel). Als alternatief, als een isofluraananesthesiesysteem is geïnstalleerd, volgt u institutioneel goedgekeurde protocollen om isofluraananesthesie te gebruiken, ter vervanging van het ketamine-xylazinemengsel.
OPMERKING: Hypothyreoïdiemuizen zijn gevoeliger voor ketamine-xylazine; Gebruik een halve dosis. - Gebruik oogbeschermingsgel tijdens anesthesie.
- Controleer de pedaalreflex door in de voetzolen te knijpen. Geen enkele pedaalreflex bevestigt de toestand van chirurgische vlakanesthesie.
- Nadat de anesthesie is ingewerkt, verwijdert u de vacht van de afgebeelde lichaamsdelen met behulp van de meest geschikte methode voor het verwijderen van de vacht (epilator, scheren, crème, enz.). Zorg ervoor dat er geen vacht achterblijft op de afgebeelde lichaamsdelen om verstrooiing van lichtgevend licht te voorkomen.
- Los Na-luciferine (zie Materiaaltabel) op in 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) in een concentratie van 15 mg/ml. Luciferine is lichtgevoelig; Vermijd directe blootstelling aan licht. Bewaar de oplossing in amberkleurige buisjes of wikkel het in aluminiumfolie.
- Behandel geschoren dieren met luciferine-oplossing 10 μL/bwg i.p.
- Plaats de dieren in het instrument met het middelpunt van de camera gemarkeerd als een '+' op de pad. Zorg voor de juiste plaatsing door de rasterlijnen te controleren en te bevestigen met een enkele 'Foto'-opname als u het niet zeker weet.
- Wacht 15 minuten na toediening van het substraat voordat u de eerste meting uitvoert. Stel gedurende deze tijd de beeldvormingstijd in het paneel "Image Wizard" in op 3 min voor luminescentie en vink de vakjes aan voor Foto en Luminescentie. De 'foto' is nodig om samen te vallen met luminescentie om de bron van het gemeten signaal te identificeren.
OPMERKING: 15 minuten is nodig voor een optimale opname van het substraat en de weefselverdeling. Het luminescente signaal plateaus 15-20 minuten na toediening van luciferine. Het signaal begint langzaam af te nemen na het plateau. - Voer de eerste meting uit door te klikken op Meten in het paneel "Imaging Wizard".
- Als zowel ventrale als dorsale beeldvorming worden uitgevoerd, herschik dan de dieren zodat het tweede lichaamsdeel onmiddellijk na het afsluiten van de eerste moet worden afgebeeld.
- Nadat de beeldvorming is voltooid, brengt u de dieren terug naar hun kooien en gaat u verder met het experiment met de volgende set dieren.
- Laat de dieren herstellen, wat meestal maximaal 1-2 uur duurt. Plaats een buis gevuld met warm water in de buurt van de dieren om het herstel te vergemakkelijken en controleer vitale functies zoals ademhaling en perfusie.
- Beslis over het lot van gemeten dieren. In de gegevens die in dit artikel worden gepresenteerd, werden de gemeten dieren geëuthanaseerd volgens institutioneel goedgekeurde protocollen voor ex vivo-metingen . Dit is echter niet nodig. Overweeg of euthanasie of vervolgexperimenten ethisch verantwoord zijn.
4. Data-analyse
- Open het bestand "ClickInfo" in de software. Aan de rechterkant van het venster wordt een paneel met de naam "Gereedschapspalet" geopend voor beeldanalyse en -bewerking.
- Converteer schaal naar uitstraling in de linkerbovenhoek van de afbeelding.
- Klik op "Image Adjust".
- Bepaal de optimale binning en kleurenschaal van de afbeeldingen. Zorg ervoor dat alle afbeeldingen dezelfde instellingen gebruiken.
- Klik op "ROI-tools" op het "Tool-palet".
- Selecteer interessegebieden door te klikken op "Plaats ROI" in de "ROI-tools". Het gebruik van ROI's van dezelfde grootte of ROI's van verschillende grootte kan ook zinvol zijn, afhankelijk van het experimentele ontwerp.
- Klik op "ROI's meten". Er wordt een nieuw venster geopend met de gegevens van geplaatste ROI's. Exporteer de gegevens met ctr + c-ctrl + v Windows-opdracht naar een organiserende of statistische software naar keuze.
- Gegevens kunnen worden geëxporteerd als totale flux of gemiddelde straling. Kies welke variabele het meest relevant is in de huidige experimentele setting.
- Ga door met de data-analyse in overeenstemming met de experimentele opzet. Individuele berekening van (behandelde achtergrond)waarden als "gemeten effect bij één dier" wordt aanbevolen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Over het algemeen varieert de gemeten stralingssterkte van magnitude 105 tot 1010 p/s/cm2/sr. Exacte waarden kunnen echter variëren tussen dieren binnen dezelfde afbeelding en tussen verschillende afbeeldingen. Daarom kan het vergelijken van ruwe gegevens misleidend zijn. Het is van cruciaal belang om in alle experimenten controle- en achtergrondsignalen vast te stellen, waardoor zelfgestuurde ontwerpen ten zeerste worden aanbevolen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De bedreigingen van hormoonontregelende chemische stoffen (EDC's) voor de menselijke gezondheid worden algemeen erkend; onderzoek naar EDC's staat echter voor formidabele uitdagingen. Deze uitdagingen zijn deels een gevolg van de complexiteit van het endocriene systeem. Van veel EDC's is vastgesteld dat ze tegelijkertijd meerdere endocriene systemen verstoren22. Bovendien bestaat er in de context van de economie van schildklierhormoon (TH) een extra laag van complexiteit als gevolg van weefselspec...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door projectnr. RRF-2.3.1-21-2022-00011, getiteld National Laboratory of Translational Neuroscience, is uitgevoerd met de steun van de herstel- en veerkrachtfaciliteit van de Europese Unie in het kader van het programma Széchenyi Plan Plus.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 3,5,3'-triiodothyronine (T3) | Merck | T2877 | |
| Animals, mice | THAI mouse | ||
| Eye protection gel | Oculotect | 1000 IU/g | |
| Falcon tube | Thermo Fisher Scientific | 50 mL volume | |
| Iodine-free chow diet | Research Diets | custom | |
| IVIS Lumina II in vivo imaging system | Perkin Elmer | - | |
| Ketamine | Vetcentre | E1857 | |
| Living Image software 4.5 | Perkin Elmer | - | provided with the instrument |
| Measuring cylinder | 250 mL | ||
| methimazole | Merck | M8506 | |
| Microfuge tubes | Eppendorf | For diluting treatment materials | |
| NaClO4 | Merck | 71852 | |
| Na-luciferin, substrate | Goldbio | 103404-75-7 | |
| NaOH | Merck | 101052833 | |
| Phoshphate buffer saline | Chem Cruz | sc-362302 | |
| Pipette | Gilson | For diluting treatment materials | |
| Pipette tips | Axygen | For diluting treatment materials | |
| Shaving cream/epilator/shaver | Personal preference | ||
| Syringe | B Braun | 1 mL volume | |
| Syringe needle | B Braun | 0.3 x 12 mm | |
| Xylazine | Vetcentre | E1852 |
Referenties
- Larsen, P. R., Davies, T. F., Hay, I. D. Williams Textbook of Endocrinology. Wilson, J. D., Foster, D. W., Kronenberg, H. M., Larsen, P. R. , W.B. Saunders Co. 389-515 (1998).
- Gereben, B., et al. Cellular and molecular basis of deiodinase-regulated thyroid hormone signaling. Endocr Rev. 29 (7), 898-938 (2008).
- Fekete, C., Lechan, R. M. Central regulation of hypothalamic-pituitary-thyroid axis under physiological and pathophysiological conditions. Endocr Rev. 35 (2), 159-194 (2014).
- Bianco, A. C., et al. Paradigms of Dynamic Control of Thyroid Hormone Signaling. Endocr Rev. 40 (4), 1000-1047 (2019).
- Zoeller, R. T. Endocrine disrupting chemicals and thyroid hormone action. Adv Pharmacol. 92, 401-417 (2021).
- Guarnotta, V., Amodei, R., Frasca, F., Aversa, A., Giordano, C. Impact of chemical endocrine disruptors and hormone modulators on the endocrine system. Int J Mol Sci. 23 (10), 5710(2022).
- La Merrill, M. A., et al. Consensus on the key characteristics of endocrine-disrupting chemicals as a basis for hazard identification. Nat Rev Endocrinol. 16 (1), 45-57 (2020).
- Fini, J. B., et al. An in vivo multiwell-based fluorescent screen for monitoring vertebrate thyroid hormone disruption. Environ Sci Technol. 41 (16), 5908-5914 (2007).
- Mughal, B. B., Fini, J. B., Demeneix, B. A. Thyroid-disrupting chemicals and brain development: an update. Endocr Connect. 7 (4), 160-186 (2018).
- Dong, M., Li, Y., Zhu, M., Li, J., Qin, Z. Tetrabromobisphenol a disturbs brain development in both thyroid hormone-dependent and -independent manners in xenopus laevis. Molecules. 27 (1), 249(2021).
- Beck, K. R., Sommer, T. J., Schuster, D., Odermatt, A. Evaluation of tetrabromobisphenol A effects on human glucocorticoid and androgen receptors: A comparison of results from human- with yeast-based in vitro assays. Toxicology. 370, 70-77 (2016).
- Li, J., Li, Y., Zhu, M., Song, S., Qin, Z. A multiwell-based assay for screening thyroid hormone signaling disruptors using thibz expression as a sensitive endpoint in xenopus laevis. Molecules. 27 (3), 798(2022).
- Myosho, T., et al. Preself-feeding medaka fry provides a suitable screening system for in vivo assessment of thyroid hormone-disrupting potential. Environ Sci Technol. 56 (10), 6479-6490 (2022).
- Mohacsik, P., et al. A Transgenic mouse model for detection of tissue-specific thyroid hormone action. Endocrinology. 159 (2), 1159-1171 (2018).
- Sinko, R., et al. Tetrabromobisphenol A and diclazuril evoke tissue-specific changes of thyroid hormone signaling in male thyroid hormone action indicator Mice. Int J Mol Sci. 23 (23), 14782(2022).
- Sinko, R., et al. Different hypothalamic mechanisms control decreased circulating thyroid hormone levels in infection and fasting-induced non-thyroidal illness syndrome in male thyroid hormone action indicator mice. Thyroid. 33 (1), 109-118 (2023).
- Salas-Lucia, F., et al. Axonal T3 uptake and transport can trigger thyroid hormone signaling in the brain. Elife. 12, 82683(2023).
- Liu, S., et al. Triiodothyronine (T3) promotes brown fat hyperplasia via thyroid hormone receptor alpha mediated adipocyte progenitor cell proliferation. Nat Commun. 13 (1), 3394(2022).
- Bianco, A. C., et al. American thyroid association guide to investigating thyroid hormone economy and action in rodent and cell models. Thyroid. 24 (1), 88-168 (2014).
- Silva, J. E., Larsen, P. R. Adrenergic activation of triiodothyronine production in brown adipose tissue. Nature. 305 (5936), 712-713 (1983).
- Bianco, A. C., Silva, J. E. Intracellular conversion of thyroxine to triiodothyronine is required for the optimal thermogenic function of brown adipose tissue. J Clin Invest. 79 (1), 295-300 (1987).
- Caporale, N., et al. From cohorts to molecules: Adverse impacts of endocrine disrupting mixtures. Science. 375 (6582), 8244(2022).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
