Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Gepseudotypeerde virussen als moleculair hulpmiddel om humorale immuunresponsen tegen SARS-CoV-2 te volgen via neutralisatietest

3.1K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65658

⸱

21 november 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, Biomedicine and Movement, University of Verona, 2Laboratory of Molecular Neurovirology, Faculty of Health Science, University of Brasília, 3Viral Pseudotype Unit, Medway School of Pharmacy, Universities of Kent and Greenwich at Medway

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Pseudogetypeerde virussen (PV's) zijn replicatie-defecte virionen die worden gebruikt om gastheer-virusinteracties te bestuderen onder veiligere omstandigheden dan het hanteren van authentieke virussen. Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd dat laat zien hoe SARS-CoV-2 PV's kunnen worden gebruikt om het neutraliserende vermogen van het serum van patiënten na COVID-19-vaccinatie te testen.

Samenvatting

Pseudogetypeerde virussen (PV's) zijn moleculaire hulpmiddelen die kunnen worden gebruikt om interacties tussen gastheer en virus te bestuderen en om het neutraliserende vermogen van serummonsters te testen, naast hun bekendere gebruik in gentherapie voor de afgifte van een interessant gen. PV's zijn replicatiegebrekkig omdat het virale genoom is verdeeld in verschillende plasmiden die niet in de PV's zijn opgenomen. Dit veilige en veelzijdige systeem maakt het gebruik van PV's in laboratoria van bioveiligheidsniveau 2 mogelijk. Hier presenteren we een algemene methodologie om lentivirale PV's te produceren op basis van drie plasmiden zoals hier vermeld: (1) het ruggengraatplasmide dat het reporter-gen draagt dat nodig is om de infectie te monitoren; (2) het verpakkingsplasmide dat de genen bevat voor alle structurele eiwitten die nodig zijn om de PV's te genereren; (3) het glycoproteïne-expressieplasmide aan het oppervlak van het omhulsel dat het virustropisme bepaalt en het binnendringen van virussen in de gastheercel bemiddelt. In dit werk is SARS-CoV-2 Spike het envelopglycoproteïne dat wordt gebruikt voor de productie van niet-replicatieve SARS-CoV-2 pseudogetypeerde lentivirussen.

In het kort werden verpakkingscellen (HEK293T) met behulp van standaardmethoden samen met de drie verschillende plasmiden getransfecteerd. Na 48 uur werd het supernatans met de PV's geoogst, gefilterd en opgeslagen bij -80 °C. De besmettelijkheid van SARS-CoV-2 PV's werd getest door de expressie van het reporter-gen (luciferase) in een doelcellijn 48 uur na infectie te bestuderen. Hoe hoger de waarde voor relatieve luminescentie-eenheden (RLU's), hoe hoger de infectie-/transductiesnelheid. Bovendien werden de infectieuze PV's toegevoegd aan de serieel verdunde serummonsters om het neutralisatieproces van het binnendringen van pseudovirussen in doelcellen te bestuderen, gemeten als de vermindering van de RLU-intensiteit: lagere waarden die overeenkomen met een hoge neutraliserende activiteit.

Inleiding

Pseudogetypeerde virussen (PV's) zijn moleculaire hulpmiddelen die in de microbiologie worden gebruikt om interacties tussen gastheer en virus en pathogeen-pathogeen te bestuderen 1,2,3,4. PV's bestaan uit een binnenste deel, de virale kern die het virale genoom beschermt, en een buitenste deel, de envelopglycoproteïnen op het oppervlak van het virus dat het tropisme definieert5. Een pseudovirus is replicatie-incompetent in de doelcel omdat het niet alle genetische informatie bevat om nieuwe virusdeeltjes te genereren. Deze combinatie van bijzondere eigenschappen maakt PV's tot een veilig alternatief voor een wildtype virus. Wildtype virussen daarentegen zijn zeer pathogeen en kunnen niet worden gebruikt in BSL 2-laboratoria voor analyse6.

De besmettelijkheid van PV's kan worden gecontroleerd door een reporter-gen, dat meestal codeert voor een fluorescerend eiwit (GFP, RFP, YFP) of een enzym dat chemiluminescente producten produceert (luciferase). Dit zit in een van de plasmiden die worden gebruikt voor PV-productie en is opgenomen in het genoom van het pseudovirus7.

Er bestaan momenteel verschillende soorten PV-kernen, waaronder lentivirale deeltjes op basis van het HIV-1-genoom. Het grote voordeel van op HIV-1 gebaseerde PV's ten opzichte van andere platforms is hun intrinsieke integratieproces in het genoom van de doelcel8. Hoewel HIV-1 een zeer besmettelijk virus is en de veroorzaker van aids is, zijn deze lentivirale vectoren veilig te gebruiken vanwege de uitgebreide optimalisatiestappen door de jaren heen. Optimale veiligheidsomstandigheden werden bereikt met de introductie van lentivirale vectoren van de 2e generatie, waarin virale genen werden uitgeput zonder de transductiemogelijkheden te beïnvloeden9. De3e en 4egeneratie droegen bij aan de verhoogde veiligheid van de behandeling van lentivirale vectoren met de verdere splitsing van het virale genoom in afzonderlijke plasmiden10,11. De nieuwste generaties PV's worden over het algemeen gebruikt om lentivirale vectoren voor gentherapie te produceren.

PV's kunnen worden gebruikt om interacties tussen virussen en gastheercellen te bestuderen, zowel tijdens de productie- als de infectiefase. PV's worden vooral gebruikt in pseudovirusneutralisatietests (PVNA). PVNA's worden op grote schaal gevalideerd om het neutralisatiepotentieel van serum of plasma te beoordelen door zich te richten op het virale glycoproteïne op de PV-envelop12,13. Neutralisatieactiviteit, uitgedrukt als de remmende concentratie 50 (IC50), wordt gedefinieerd als de verdunning van serum/plasma die 50% van de toegang tot virale deeltjes blokkeert14. In dit protocol beschreven we de opzet van een PVNA om de antilichaamactiviteit tegen Severe Acute Respiratory Syndrome - Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) te testen in sera die zijn verzameld voor en na ontvangst van een boostervaccindosis.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Dit protocol is goedgekeurd door en volgt de richtlijnen van de Ethische Commissie van de Universiteit van Verona (goedkeuringsprotocol nummer 1538). Geïnformeerde schriftelijke toestemming werd verkregen van de proefpersonen die aan het onderzoek deelnamen. Volbloedmonsters werden verzameld van vrijwilligers van gezondheidswerkers (HCW) die bezig waren met het ontvangen van anti-SARS-CoV-2-vaccins. Deze monsters werden verzameld in plastic buisjes met anticoagulantia voor de daaropvolgende isolatie van serum15.

Alle volgende processen moeten worden uitgevoerd in een biologische kap van klasse 2, die onder steriele omstandigheden werkt. Virushantering moet met zorg worden uitgevoerd en alle afvalproducten moeten worden geneutraliseerd in een verdunde bleekoplossing. Een overzicht van het protocol wordt weergegeven in figuur 1.

figure-protocol-1
Figuur 1: Grafische weergave van een neutralisatietest. (A) PV-productie, (B) PV-titratie en (C) neutralisatietest. Alle procedures worden uitgevoerd in een klasse 2 biologische kap onder steriele omstandigheden. Titratiestap (B) moet worden uitgevoerd om de infectiviteitsniveaus van PV's te standaardiseren voordat ze worden gebruikt in de neutralisatietest (C). Deze figuur is gemaakt met BioRender. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

1. SARS-CoV-2 PV-productie- en besmettelijkheidstest

  1. Zaad 5 x 105 HEK293T cellen in volledig Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, hoge glucose, 10% foetaal runderserum (FBS), 1% L-glutamine, 1% penicilline/streptomycine) in een plaat met 6 putjes (6WP) om een geschikte celdichtheid te bereiken die compatibel is met het gebruikte transfectiereagens. In het geval van transfectie met polyehtylenimine (PEI) (bereid het reagens volgens de instructies van de fabrikant), zorg er dan voor dat de cellen op de dag van transfectie een dichtheid van 40-60% bereiken (stap 1.3). Bewaar de cellen in een bevochtigde incubator bij 37 °C en 5% CO2 .
  2. Vervang voorafgaand aan de transfectie het gebruikte celmedium door vers medium zonder antibiotica (DMEM, hoge glucose, 10% FBS, 1% L-glutamine) om een hogere transfectie-efficiëntie te bereiken.
    OPMERKING: De dag na het zaaien zijn HEK293T cellen klaar om te worden getransfecteerd.
  3. Transfect hechtende HEK293T cellen met een geschikt transfectiereagens volgens de instructies van de fabrikant. Als u PEI gebruikt, bereidt u twee mixen voor en volgt u de onderstaande stappen.
    1. Om mengsel A te bereiden, voegt u 500 ng pCMV-dR8.91 verpakkingsplasmide16, 750 ng pCSFLW-reporterplasmide16 en 450 ng SARS-CoV-2 Spike toe dat plasmide tot expressie brengt in 100 μL gereduceerd serummedium.
    2. Om mengsel B te bereiden, voegt u 17,5 μL PEI (concentratie: 1 mg/ml) toe aan 100 μl van het gereduceerde serummedium.
    3. Laat beide mengsels 5 minuten bij kamertemperatuur (RT) incuberen. Meng vervolgens de inhoud van beide buisjes door de PEI-mix B toe te voegen aan DNA-mix A.
    4. Incubeer de buis gedurende 20-30 minuten bij RT. Draai de buis elke 3-4 minuten zachtjes om het mengen te verbeteren. Voeg tot slot het mengsel toe aan de HEK293T cellen.
  4. Vervang 16-20 uur na de transfectie het kweekmedium door verse, volledige DMEM. Incubeer bij 37 °C en 5% CO2 , om de productie van PV's door getransfecteerde cellen mogelijk te maken.
  5. Oogst 72 uur na de transfectie het supernatans dat PV's bevat. Centrifugeer vervolgens bij 1600 x g gedurende 7 minuten bij kamertemperatuur om celresten en dode cellen te verwijderen en filtreer deze door een celluloseacetaatfilter van 0,45 μm.
  6. OPTIONELE STAP: Om de uiteindelijke opbrengst van de PV-titer te verhogen, voert u meerdere transfecties uit, bundelt u de celmedia die PV's bevatten en concentreert u deze met behulp van concentrerende buizen.
  7. Ga direct verder met de volgende stappen ("PV-titratie", sectie 2) of aliquot het PV-houdende medium in geschikte buizen om tot gebruik bij -80 °C te bewaren. Bereid een extra aliquot (400-500 μl) voor titratie.
    OPMERKING: Het maken van meerdere aliquots garandeert reproduceerbaarheid tussen experimenten door overmatige dooi-vriescycli te vermijden.

2. PV-titratie

  1. Gebruik het verse PV-medium voor de volgende stappen of ontdooi het testaliquot (stap 1.7) om de titratie van de nieuwe virale voorraad uit te voeren. Het bevriezen van aliquots van dezelfde PV-voorraad garandeert de reproduceerbaarheid.
  2. Voeg 50 μL volledige DMEM (of compleet medium dat compatibel is met de gebruikte doelcellijn) toe aan alle putjes van een plaat met 96 putjes (96WP) die nodig is om de PV-voorraad in tweevoud te testen, waarbij rij "A" leeg blijft. Voeg 100 μL PV-voorraad toe aan rij "A". Laat op basis van het aantal te testen preparaten één kolom zonder het virus als "cel alleen"-controle (figuur 2).
  3. Pipetteer 50 μl van rij A naar rij B en herhaal dit proces tot rij G om seriële verdunningen van de oorspronkelijke voorraad te verkrijgen. Gooi het overtollige volume van de laatste rij weg.
  4. Maak de cellen los met trypsine/ethyleendiaminetetra-azijnzuur 1x (EDTA) in Dulbecco's fosfaatbufferzoutoplossing 1x (DPBS 1x), na het verwijderen van het verbruikte medium en het tweemaal wassen van de cellen met DPBS 1x. Bereid de cellen voor op een dichtheid van 4 x 105 cellen/ml.
    OPMERKING: In dit protocol werd PV-infectie getest op de vatbare cellijn HEK293T/ACE2; dergelijke cellen werden afgeleid van HEK293T, getransduceerd met behulp van een lentivirale vector om ACE2-receptor tot expressie te brengen.
  5. Voeg 50 μL van de celsuspensie toe aan elk putje om een celgetal van 2 x 104 cellen per putje te garanderen.
  6. Incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 48 uur.
  7. Voer na de incubatie de Luciferase-test uit om de aflezing te verkrijgen volgens de instructies van de fabrikant. Voeg 100 μL van het luciferase-reagens toe aan de putjes en incubeer gedurende 2 minuten in het donker bij RT. Verplaats de inhoud van elk putje naar een zwarte plaat met 96 putjes (compatibel met de beschikbare plaatlezer) en lees de platen in een plaatlezer met 96 putjes.
    OPMERKING: De luminometer die wordt gebruikt voor de luciferase-uitlezing produceert een spreadsheetbestand met de ruwe, onbewerkte gegevens die zullen worden gebruikt voor stroomafwaartse analyse (in dit geval een Excel-bestand). De infectiviteit van het virus wordt uitgedrukt in relatieve luminescentie-eenheden (RLU) (beschreven in punt 4.1).

figure-protocol-2
Figuur 2: Representatieve lay-out van een plaat met 96 putjes voor PV-titratie. Een vast volume PV-houdend supernatans wordt toegevoegd aan rij A, kolommen 1-11, en serieel verdund. De laatste kolom blijft over als het besturingselement "alleen cel". Deze figuur is gemaakt met BioRender. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

3. Neutralisatietest

  1. Ontdooi de sera van patiënten op ijs. Inactiveer serummonsters door ze gedurende 30 minuten bij 56 °C te incuberen.
  2. Voeg in een plaat met 96 putjes 50 μl van de verse, volledige DMEM (of volledig medium dat compatibel is met de gebruikte doelcellijn) toe in elk van de volgende putjes: van rij B (kolommen 1-10) tot rij H (kolommen 1-10). Doe 95 μl van de verse, volledige DMEM in rij A (kolommen 1-10). Voeg respectievelijk 50 μl en 100 μl volledige DMEM toe aan de putjes van kolom 11 en 12. Dit zijn respectievelijk de geïnfecteerde (viruscontrole of VC) en niet-geïnfecteerde (alleen cel of CC) controles (Figuur 3).
  3. Voeg 5 μl warmte-geïnactiveerde serum-/plasmamonsters toe in rij A (kolommen 1-10). Elk monster wordt in tweevoud uitgevoerd. Meng met een meerkanaalspipet de monsters in de eerste rij en verplaats 50 μL medium met serum van rij A naar rij B. Herhaal dit proces tot de laatste rij (Figuur 3). Gooi de resterende 50 μL weg.
  4. Ontdooi het benodigde aantal aliquots van PV's en verdun tot ≥ 104 RLU/ml. Voeg 50 μl van het verdunde PV-bevattende medium toe aan elk putje (van kolom 1 tot kolom 11) met behulp van een meerkanaalspipet om een 1:1 verdunning van door warmte geïnactiveerd serum/plasma tot virus te bereiken. Incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 1 uur om de antilichamen in de serummonsters te laten binden aan het SARS-CoV-2-spike-eiwit op de PV's.
  5. Bereid ten minste 5 ml suspensie van gevoelige cellen (HEK293T/ACE2) met een celdichtheid van 4 x 105 cellen/ml. Voeg 50 μl van de celsuspensie toe aan elk putje en incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 48 uur.
  6. Voer na de incubatie de luciferase-testaflezing uit volgens de instructies van de fabrikant, zoals beschreven in stap 2.7.
    OPMERKING: De luminometer die wordt gebruikt voor het uitlezen van luciferase produceert een spreadsheetbestand (in dit geval .xlsx) met de ruwe, onbewerkte gegevens die zullen worden gebruikt voor stroomafwaartse analyse (het Luciferase-testbestand).

figure-protocol-3
Figuur 3: Plaatweergave op basis van serumverdunning. Helderrood komt overeen met een grotere hoeveelheid serum en helderblauwe strook (kolom 11) komt overeen met geïnfecteerde celcontrole (VC, viruscontrole). Lichtblauwe baan (kolom 12) komt overeen met niet-geïnfecteerde cellen (CC, celcontrole). Deze figuur is gemaakt met BioRender. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

4. Titratie-analyse

  1. Wijs in het Luciferase-testbestand de namen/titels toe aan de bijbehorende monsters.
  2. Vermenigvuldig de RLU-meting met de verdunningsfactoren (van boven naar beneden in het rooster: 20x, 40x, 80x, 160x, 320x, 640x, 1.280x, 2.560x) om RLU/ml te verkrijgen. Als er verschillende verdunningsfactoren worden gebruikt, verander dan de vermenigvuldigingsfactoren dienovereenkomstig.
  3. Bereken de gemiddelde RLU/ml voor elk PV-preparaat.

5. Analyse van de neutralisatietest van PV's

  1. Wijs in het Luciferase-assay-spreadsheetbestand (in dit geval .xlsx) de bijbehorende titels toe aan de geteste monsters. Voer de verdunningsfactor van het monster in (40s, 80x, 160x, 320x, 640x, 1.280x, 2.560x, 5.120x). Bereken de Log10 van de verdunningsfactoren.
  2. Bereken de gemiddelde RLU van niet-geïnfecteerde en geïnfecteerde controle (Figuur 3, respectievelijk kolommen 11 en 12). Deze waarden zijn nuttig voor de normalisatie in stap 5.5.
  3. Open een nieuw document voor gegevensanalyse. Selecteer X/Y-analyse, voer X in als Getallen en Y als Voer 2 replicatiewaarden in naast elkaar subkolommen in.
  4. Voer Log10 (verdunning) waarden in als X getallen. Voer de dubbele RLU van de monsters in.
  5. Ga naar Analyseren > Normaliseren > Alle voorbeelden op hetzelfde blad markeren. Voer de gemiddelde VC- en CC-waarden in respectievelijk Hoe wordt 0% gedefinieerd? en Hoe wordt 100% gedefinieerd?. Klik op OK.
  6. Ga op het genormaliseerde gegevensblad naar Analyse > XY-analyses > Niet-lineaire analyses (curve fit). Markeer alle voorbeelden en klik op OK. Selecteer voor de dosis-respons - remming log(remmer) versus genormaliseerde respons - variabele helling.
  7. Wijzig onder Beperking HillSlope in Moet kleiner zijn dan 0.
  8. Markeer onder Uitvoer Overzichtstabel en grafiek maken. Klik op OK om de definitieve analyses te verkrijgen. Een werkblad met een sjabloon voor de analyse is opgenomen in aanvullend dossier 1.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Dit protocol beschrijft de productie van SARS-CoV-2 PV's en een stroomafwaartse toepassing van deze PV's om de neutralisatieactiviteit van serum/plasma te analyseren van proefpersonen die anti-COVID-19-vaccinatie krijgen17. Bovendien kan dit protocol worden toegepast om pseudotypen van elke zorgwekkende SARS-CoV-2-variant (VOC) te produceren om de evolutie van de neutraliserende respons te testen. Ondanks dat dit protocol de studie van de humorale immuunrespons na COVID-19-vaccinatie vergemakkelij...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Hoewel het gebruik van een wildtype virus de werkelijke infectie simuleert, zijn lentivirale PV's een veiligere optie om de mechanismen te bestuderen die verband houden met het binnendringen en infecteren van virussen zonder de strikte veiligheidseisen die nodig zijn om met pathogene virussen te werken 4,20,21. PV's zijn samengesteld uit een replicatie-defecte virale kern omgeven door het glycoproteïne van een pathogeen virus, w...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren geen belangenverstrengeling te hebben.

Dankbetuigingen

We erkennen de bijdrage van de vrijwilligers van de gezondheidswerkers. Dit project werd ondersteund door het Department of Excellence 2023/2027, MUR, Italië. AR en DZ werden ondersteund door PRIN2022 (EU-financiering; NextGenerationEU)

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
0.45 μm filterSARSTEDT83 1826
6-well plateSARSTEDT83 3920
96-well plateSARSTEDT8,33,924
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter UnitsMerck10403892
Black Opaque 96-well MicroplatePerkin Elmer60005270
Dulbecco's Modified Eagle Medium SIGMA-ALDRICHD6546 - 500ML
Dulbecco's phosphate buffered saline (PBS 1x)AUROGENEAU-L0615-500
Foetal Bovine SerumAUROGENEAU-S1810-500
Graphpad Prism version 7graphpad dotmaticsNAIn het manuscript vervangen we de commerciële naam door 'data-analyseprogramma'
HEK293T cellsATCCCRL-3216
HEK293T/ACE2 cellsATCCCRL-3216HEK293T is getransduceerd om ACE2 over te expresseren met een lentiviraal vector.
L-glutamine AUROGENEAU-X0550-100
Luminometer - Victor3Perkin ElmerHH35000500In het manuscript vervangen we de commerciële naam door  'luminometer' 
Opti-MEMThermo Fisher Scientific11058021In het manuscript vervangen we de commerciële naam door 'gereduceerd serummedium' 
p8.91 packaging plasmidDi Genova et al., 2021Een vriendelijke gift van Prof. Nigel Temperton (ref 16.)
pCSFLW reporter plasmidDi Genova et al., 2021Een vriendelijke gift van Prof. Nigel Temperton (ref 16.)
Penicillin/streptomycinAUROGENEAU-L0022-100
Polyethylenimine, branched (PEI) (25 kDa)SIGMA-ALDRICH408727
RRL.sin.cPPT.SFFV/Ace2.IRES-puro.WPRE (MT126)Addgene145839Dit plasmide werd gebruikt om HEK293Tcellen/ACE2 te genereren
SARS-CoV-2 Spike expressing plasmidAddgenepGBW-m4137382
steadylite plus Reporter Gene Assay SystemPerkin Elmer6066759In het manuscript vervangen we de commerciële naam door 'luciferase-meetreagens'
Trypsin EDTA 1xAUROGENEAU-L0949-100

Referenties

  1. Ozaki, D. A., et al. International technology transfer of a GCLP-compliant HIV-1 neutralizing antibody assay for human clinical trials. Plos One. 7 (1), e30963(2012).
  2. Pouget, M., et al. Generation of liposomes to study the effect of Mycobacterium tuberculosis lipids on HIV-1 cis- and trans-infections. International Journal of Molecular Sciences. 22 (4), 1945(2021).
  3. McKay, L. G. A., et al. The HCV envelope glycoprotein down-modulates NF-κB signalling and associates with stimulation of the host endoplasmic reticulum stress pathway. Frontiers in Immunology. 13, 831695(2022).
  4. Xiang, Q., Li, L., Wu, J., Tian, M., Fu, Y. Application of pseudovirus system in the development of vaccine, antiviral-drugs, and neutralizing antibodies. Microbiological Research. 258, 126993(2022).
  5. Li, Q., Liu, Q., Huang, W., Li, X., Wang, Y. Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses. Reviews in Medical Virology. 28, e1963(2018).
  6. D'Apice, L., et al. Comparative analysis of the neutralizing activity against SARS-CoV-2 Wuhan-Hu-1 strain and variants of concern: Performance evaluation of a pseudovirus-based neutralization assay. Frontiers in Immunology. 13, 981693(2022).
  7. Falzarano, D., Groseth, A., Hoenen, T. Development and application of reporter-expressing mononegaviruses: current challenges and perspectives. Antiviral Research. 103, 78-87 (2014).
  8. Gutierrez-Guerrero, A., Cosset, F. -L., Verhoeyen, E. Lentiviral vector pseudotypes: Precious tools to improve gene modification of hematopoietic cells for research and gene therapy. Viruses. 12, 1016(2020).
  9. Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).
  10. Dull, T. A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. Journal of Virology. 72 (11), 8463-8471 (1998).
  11. Berkhout, B. A Fourth generation lentiviral Vector: Simplifying genomic gymnastics. Molecular Therapy. 25 (8), 1741-1743 (2017).
  12. Wu, X. Development and evaluation of a pseudovirus-luciferase assay for rapid and quantitative detection of neutralizing antibodies against Enterovirus 71. Plos One. 8 (6), e64116(2013).
  13. Ferrara, F., et al. Development of lentiviral vectors pseudotyped with Influenza B hemagglutinins: application in vaccine immunogenicity, mAb potency, and sero-surveillance studies. Frontiers in Immunology. 12, 661379(2021).
  14. Hu, J., et al. Development of cell-based pseudovirus entry assay to identify potential viral entry inhibitors and neutralizing antibodies against SARS-CoV-2. Genes & Diseases. 7 (4), 551-557 (2020).
  15. Dalle Carbonare, L., et al. Serology study after BTN162b2 vaccination in participants previously infected with SARS-CoV-2 in two different waves versus naïve. Communications Medicine. 1 (1), 38(2021).
  16. Di Genova, C., et al. Production, titration, neutralisation, storage and lyophilisation of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) lentiviral pseudotypes. Bio-protocol. 11 (21), e4236(2021).
  17. Chmielewska, A. M., Czarnota, A., Bieńkowska-Szewczyk, K., Grzyb, K. Immune response against SARS-CoV-2 variants: The role of neutralization assays. NPJ Vaccines. 6 (1), 1-8 (2021).
  18. Chen, Q., et al. Development and optimization of a sensitive pseudovirus-based assay for HIV-1 neutralizing antibodies detection using A3R5 cells. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (1), 199-208 (2018).
  19. Gauger, P. C., Vincent, A. L. Serum virus neutralization assay for detection and quantitation of serum neutralizing antibodies to influenza A virus in swine. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 2123, 321-333 (2020).
  20. Miglietta, R., Pastori, C., Venuti, A., Ochsenbauer, C., Lopalco, L. Synergy in monoclonal antibody neutralization of HIV-1 pseudoviruses and infectious molecular clones. Journal of Translational Medicine. 12 (1), 346(2014).
  21. Chen, M., Zhang, X. -E. Construction and applications of SARS-CoV-2 pseudoviruses: A mini review. International Journal of Biological Sciences. 17 (6), 1574-1580 (2021).
  22. Zipeto, D., et al. Induction of human immunodeficiency virus neutralizing antibodies using fusion complexes. Microbes and Infection. 8 (6), 1424-1433 (2006).
  23. WHO Coronavirus (COVID-19) Dashboard. , https://covid19.who.int (2022).
  24. Zhou, P. A pneumonia outbreak associated with a new coronavirus of probable bat origin. Nature. 579 (7798), 270-273 (2020).
  25. Chen, X., Huang, H., Ju, J., Sun, R., Zhang, J. Impact of vaccination on the COVID-19 pandemic in U.S. states. Scientific Reports. 12 (1), 1554(2022).
  26. Stefani, C., Fantoni, T., Bissoli, M., Thomas, J., Ruggiero, A. HIV and SARS-CoV-2 Co-Infection: From Population Study Evidence to In Vitro Studies. Life. 12 (12), 2089(2022).
  27. Watson, O. J., et al. Global impact of the first year of COVID-19 vaccination: a mathematical modelling study. The Lancet Infectious Diseases. 22 (9), 1293-1302 (2022).
  28. Cantoni, D. Analysis of antibody neutralisation activity against SARS-CoV-2 variants and seasonal human coronaviruses NL63, HKU1, and 229E induced by three different COVID-19 vaccine olatforms. Vaccines. 11 (1), 58(2023).
  29. Siracusano, G., et al. Different decay of antibody response and VOC sensitivity in naïve and previously infected subjects at 15 weeks following vaccination with BNT162b2. Journal of Translational Medicine. 20 (1), 22(2022).
  30. Ruggiero, A. SARS-CoV-2 vaccination elicits unconventional IgM specific responses in naïve and previously COVID-19-infected individuals. eBioMedicine. 77, (2022).
  31. Piubelli, C. Subjects who developed SARS-CoV-2 specific IgM after vaccination show a longer humoral immunity and a lower frequency of infection. eBioMedicine. 89, 104471(2023).
  32. Zhang, G. F. Infectivity of pseudotyped SARS-CoV-2 variants of concern in different human cell types and inhibitory effects of recombinant spike protein and entry-related cellular factors. Journal of Medical Virology. 95 (1), e28437(2023).
  33. da Costa, K. A. S. Influenza A (N1-N9) and Influenza B (B/Victoria and B/Yamagata) neuraminidase pseudotypes as tools for pandemic preparedness and improved influenza vaccine design. Vaccines. 10 (9), 1520(2022).
  34. Condor Capcha, J. M. Generation of SARS-CoV-2 spike pseudotyped virus for viral entry and neutralization assays: a 1-week protocol. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 7, 618651(2021).
  35. Diomede, L., et al. Doxycycline inhibition of a pseudotyped virus transduction does not translate to inhibition of SARS-CoV-2 infectivity. Viruses. 13 (9), 1745(2021).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

SARS-CoV-2 Spikehumorale immuunresponsinteractie tussen gastheer en viruslentivirale pseudotypenreportergen-assayHEK293T-cellenserumneutralisatieluciferase-assay
Gepseudotypeerde virussen als moleculair hulpmiddel om humorale immuunresponsen tegen SARS-CoV-2 te volgen via neutralisatietest
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.