Methodenartikel

Bepaling van de procoagulerende activiteit van extracellulaire blaasjes (EV) met behulp van EV-geactiveerde stollingstijd (EV-ACT)

DOI:

10.3791/65661

⸱

4 augustus 2023

 ,  ,  ,  , 
1Key Laboratory of Post-Neurotrauma Neurorepair and Regeneration in Central Nervous System, Ministry of Education and Tianjin Neurological Institute, Tianjin Medical University General Hospital, 2Department of Neurosurgery, Tianjin Medical University General Hospital, 3Department of Neurosurgery, Tianjin Huanhu Hospital, 4Department of Medical Oncology, Tianjin Medical University General Hospital

In dit artikel

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol onderzoekt het gebruik van extracellulair vesikel (EV)-rijk plasma als indicator van het stollingsvermogen van EV. EV-rijk plasma wordt verkregen door een proces van differentiële centrifugatie en daaropvolgende recalcificatie.

Samenvatting

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De rol van extracellulaire blaasjes (EV) bij verschillende ziekten krijgt steeds meer aandacht, met name vanwege hun krachtige procoagulerende activiteit. Er is echter dringend behoefte aan een bedtest om de procoagulerende activiteit van EV in klinische omgevingen te beoordelen. Deze studie stelt het gebruik van trombine-activeringstijd van EV-rijk plasma voor als een maat voor de procoagulerende activiteit van EV. Gestandaardiseerde procedures werden gebruikt om natriumgecitreerd volbloed te verkrijgen, gevolgd door differentiële centrifugatie om EV-rijk plasma te verkrijgen. Het EV-rijke plasma en calciumchloride werden aan de testbeker toegevoegd en de veranderingen in visco-elasticiteit werden in realtime gevolgd met behulp van een analysator. De natuurlijke stollingstijd van EV-rijk plasma, aangeduid als EV-ACT, werd bepaald. De resultaten toonden een significante toename van EV-ACT wanneer EV werd verwijderd uit plasma verkregen van gezonde vrijwilligers, terwijl het significant afnam wanneer EV werd verrijkt. Bovendien werd EV-ACT aanzienlijk verkort in menselijke monsters van pre-eclampsie, heupfracturen en longkanker, wat wijst op verhoogde niveaus van plasma-EV en bevordering van hypercoagulatie in het bloed. Met zijn eenvoudige en snelle procedure is EV-ACT veelbelovend als test aan het bed voor het evalueren van de stollingsfunctie bij patiënten met hoge plasma-EV-spiegels.

Inleiding

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Trombose, die wordt veroorzaakt door hypercoagulabiliteit, speelt een belangrijke rol bij verschillende ziekten, waaronder hersentrauma1, pre-eclampsie2, tumoren3 en fractuurpatiënten4. Het mechanisme dat ten grondslag ligt aan hypercoagulabiliteit is complex en onlangs is de nadruk gelegd op de rol van extracellulaire blaasjes (EV) bij stollingsstoornissen. EV's zijn blaasjesachtige lichamen met een dubbellaagse structuur die loskomen van het celmembraan, variërend in diameter van 10 nm tot 1000 nm. Ze worden in verband gebracht met een verscheidenheid aan ziekteprocessen, met name stollingsstoornissen5. Verschillende onderzoeken hebben EV's geïdentificeerd als een veelbelovende voorspeller van het risico op trombose 6,7. De procoagulerende activiteit van EV's hangt af van de expressie van stollingsfactoren, voornamelijk weefselfactor (TF) en fosfatidylserine (PS). EV's met een robuuste procoagulerende activiteit verbeteren de katalytische efficiëntie van tenase en protrombinecomplex aanzienlijk, waardoor trombine-gemedieerd fibrinogeen en lokale trombose worden bevorderd8. Verhoogde niveaus van EV's en hun causale verband met hypercoagulabiliteit zijn waargenomen bij tal vanziekten9. Bijgevolg is het standaardiseren van de detectie van EV's en het rapporteren van hun procoagulerende activiteit een belangrijk onderzoeksgebied10.

Tot op heden zijn er slechts enkele commerciële kits beschikbaar voor het detecteren van de procoagulerende activiteit van EV's. De MP-Activity-test en de MP-TF-assay, geproduceerd door een commercieel bedrijf, zijn functionele tests die worden gebruikt om de procoagulerende activiteit van EV in plasma11 te meten. Deze tests maken gebruik van een principe dat vergelijkbaar is met dat van enzymgekoppelde immunosorbenttests om PS en TF op EV's te detecteren. Deze kits zijn echter duur en beperkt tot een paar onderzoeksinstellingen op hoog niveau. Het proces is complex en tijdrovend, waardoor het een uitdaging is om ze in klinische omgevingen te implementeren. Bovendien mengt een commercieel ontwikkelde procoagulerende fosfolipide (PPL)-assay PS-vrij plasma met testplasma, waarbij de stollingstijd wordt gemeten om kwantitatief niveaus van PS-positieve EV's te detecteren12. Deze tests richten zich echter voornamelijk op PS en TF op EV's, waarbij andere stollingsroutes over het hoofd worden gezien waarbij circulerende EV's betrokken kunnen zijn12.

Het plasmastollingssysteem is ingewikkeld en omvat zowel "onzichtbare" als "zichtbare" componenten, waaronder stollingsmiddelen, anticoagulantia, fibrinolytische systemen en EV's die in het plasma zijn gesuspendeerd. Fysiologisch zorgen deze componenten voor een dynamisch evenwicht. Bij pathologische aandoeningen dragen aanzienlijk verhoogde EV's in de circulatie bij aan hypercoagulabiliteit, met name bij patiënten met hersentrauma, pre-eclampsie, fracturen en verschillende soorten kanker13. Momenteel omvat de evaluatie van de stollingsstatus in klinische laboratoria voornamelijk het beoordelen van het stollingssysteem, het antistollingssysteem en fibrinolyse 14,15,16,17. Protrombinetijd, geactiveerde partiële tromboplastinetijd, trombinetijd en internationale genormaliseerde ratio worden vaak gebruikt om stollingsfactorniveaus in het stollingssysteem te evalueren18. Recente studies hebben echter aangetoond dat deze tests de hypercoagulabiliteit van bepaalde ziekten niet volledig weerspiegelen19. Andere testmethoden, zoals trombo-elastometrie (TEG), rotatie-TEG en sonoclotanalyse, meten visco-elastische veranderingen in volbloed20,21. Aangezien volbloedmonsters veel bloedcellen en bloedplaatjes bevatten, is de kans groter dat deze tests de stollingsstatus van het monster als geheel aangeven. Sommige onderzoekers hebben gerapporteerd over de rol van bloedcellen en bloedplaatjes bij procoagulantia-activiteit22,23. Een recente studie ontdekte ook dat eerdere stollingsfunctietests moeilijkheden ondervinden bij het detecteren van veranderingen in de procoagulerende activiteit van microdeeltjes24. Daarom is een hypothese geopperd dat de procoagulerende functie van EV's kan worden geëvalueerd door visco-elastische metingen van de geactiveerde stollingstijd (ACT) in EV-rijk plasma.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Het verzamelen van menselijke monsters werd goedgekeurd door de Medisch-Ethische Commissie van het Tianjin Medical University General Hospital. De inzameling van menselijk veneus bloed volgde strikt de richtlijn van de Nationale Gezondheidscommissie van China, namelijk WS/T 661-2020 Richtlijn voor het verzamelen van veneuze bloedmonsters. In het kort werd bloed afgenomen van gezonde personen met geïnformeerde toestemming van de voorste ader in het brachiale gebied, en de monsters werden gemengd met 3,2% natriumcitraat-anticoagulans in een verhouding van 1:9. Toen alleen monsters van natriumcitraatanticoagulantia werden verzameld, werd het eerste verzamelvat weggegooid. De verwerkingsstroom werd binnen 0,5 uur na monsterafname gestart. Volwassen gezonde proefpersonen werden gerekruteerd voor monsterafname na het verkrijgen van geïnformeerde toestemming. Uitsluitingscriteria voor patiënten waren: (1) een recente intravasculaire trombose, (2) lever- en nierfunctiestoornis, (3) hypertensie, hyperlipidemie, diabetes en andere chronische ziekten, (4) behandeling met aspirine of antistollingsmiddelen, (5) menstruatie en zwangerschap.

1. Isolatie van EV-rijk plasma

  1. Centrifugeer de monsters bij 120 x g gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur om bloedcellen te verwijderen. Het supernatans is bloedplaatjesrijk plasma. Breng vervolgens het bovenste 1/2 van het supernatans over in een nieuwe centrifugebuis met een pipet.
  2. Centrifugeer het bloedplaatjesrijke plasma bij 1500 x g gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur om de bloedplaatjes te verwijderen. Het supernatans is bloedplaatjesarm plasma. Breng vervolgens het bovenste 1/2 van het supernatans over in een nieuwe centrifugebuis.
  3. Centrifugeer het bloedplaatjesarme plasma bij 13000 x g gedurende 2 minuten bij kamertemperatuur om celresten te verwijderen. Het supernatans is EV-rijk plasma. Breng vervolgens het bovenste 1/2 van het supernatans over in een nieuwe centrifugebuis voor latere tests.

2. Detectie van EV-ACT van het monster door de analysator

  1. Schakel de stollingsanalysator in (zie Materiaaltabel) en verwarm het instrument voor op 37 °C. Installeer de wegwerpsonde en testbeker en start vervolgens de kwaliteitscontroleprocedure van de machine.
    OPMERKING: Wanneer de waarde van het viskeuze weerstandssignaal op het scherm als een rechte lijn wordt weergegeven, betekent dit dat de detectie niet wordt verstoord en dat de kwaliteitscontrole van de status van de analysator gekwalificeerd is. De testprocedure kan worden gestart nadat de zelftest is gekwalificeerd.
  2. Voer voorbeeldinformatie in het systeem in. Breng vervolgens 200 μL EV-rijk plasma over in de testbeker, gevolgd door 20 mM 170 μL calciumchloride. Klik op de startknop. De magnetische roerstaaf in de testbeker zal het monster en calciumchloride volledig mengen. Sluit het deksel en de sonde begint de verandering in de monsterweerstand te detecteren.
    NOTITIE: Nadat de test is voltooid, zal de analysator automatisch "test voltooid" vragen. De tijd van EV-ACT wordt weergegeven en geregistreerd door het systeem. Het resultaat wordt uitgedrukt in de tijdseenheid "seconde". Gooi de sonde weg en test de beker.

3. Kwaliteitscontrole op basis van flowcytometrie van het EV-rijke plasmamonster

  1. EV's werden voor het eerst geïdentificeerd aan de hand van hun grootte (0,1-1 μm). Pas de parameters van de flowcytometer van tevoren aan en stel de "poort" van EV in met behulp van in de handel verkrijgbare polystyreenkorrels (0,5, 0,9 en 3,0 μm) (zie Materiaaltabel).
    OPMERKING: Het parelmengsel bestaat uit fluorescerende bolletjes met verschillende diameters die het groottebereik van microvesikels (0,5 en 0,9 μm) en bloedplaatjes (0,9 μm en 3 μm) bestrijken.
  2. Pas de spanning van de voorwaartse verstrooiing en de zijverstrooiing aan en zorg ervoor dat de microsferen van 0.9 μm in het juiste gebied vallen. Het EV-gebied kan worden getekend op basis van de diameter van de microbol.
  3. Breng 50 μL EV-rijk plasma over in de stroombuis, gevolgd door 450 μL gefilterde fosfaatbufferzoutoplossing. Meng de vloeistof grondig in de stroombuis. Detecteer ten slotte de monsters met behulp van flowcytometrie25.
  4. Gebruik Ultra Rainbow fluorescerende deeltjes (zie materiaaltabel) om het aantal EVs.In kort te kwantificeren, voeg 10 μL van de deeltjes toe aan het monster vóór de stroomdetectie en bereken de EV-concentratie met behulp van de volgende formule nadat de monsterdetectie is voltooid: 10.120 * EV (#) / (microbeads * volume) * verdunningsfactor26.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De trombineactiveringstijd van EV-rijk plasma werd gemeten met behulp van een visco-elastische methodeanalysator voor plasmastollingstijdmeting. De machine bestaat uit vier hoofdcomponenten: een elektronische signaalomvormer, een sonde, een detectietank en een verwarmingselement (Figuur 1A,B). De sonde maakt gebruik van hoogfrequente en lage amplitude-oscillaties om veranderingen in de plasmaviscositeit te detecteren. Dagelijkse kwaliteitscontrole omvat voornamelijk luchtkwa...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In deze studie werd de bereiding van EV-rijk plasma beschreven en werd de rationaliteit van de methode geverifieerd met behulp van flowcytometrie. Vervolgens werden de opnieuw verkalkte plasmamonsters geanalyseerd op ACT-tijd met behulp van een stolselanalysator op basis van visco-elasticiteitsprincipes24. Zoals te zien is in figuur 3A, bleek de concentratie EV's verkregen door ultracentrifugatie de EV-ACT-tijd te verkorten, terwijl het supernatans na ultracentrifugat...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle auteurs verklaarden dat er geen sprake is van potentiële belangenconflicten.

Dankbetuigingen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Natural Science Foundation of China, subsidie nr. 81930031, 81901525. Daarnaast danken we Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd. voor het verstrekken van machines en technische begeleiding.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
AccuCount Ultra Rainbow Fluorescent Particles3.8 microm; Spherotech, Lake Forest, IL, USAVoor kwantitatieve detectie van MP
Calcium chlorideWerfen (china)002000680020 mM
Century Clot analyzerTianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., LtdHet principe is om plasmaviscositeit te meten door middel van een veelzijdige methode
Disposable probe and test cupTianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd
LSR Fortessa flow cytometerBD, USAGebruikt voor het detecteren van MP
Megamix polystyrene beadsBiocytex, Marseille, France7801De Megamix bestaat uit een mengsel van microbead van geselecteerde diameters: 0,5 µm, 0,9 µm en 3 µm.

Referenties

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zhang, J., Zhang, F., Dong, J. F. Coagulopathy induced by traumatic brain injury: systemic manifestation of a localized injury. Blood. 131 (18), 2001-2006 (2018).
  2. Han, C., Chen, Y. Y., Dong, J. F. Prothrombotic state associated with preeclampsia. Current Opinion in Hematology. 28 (5), 323-330 (2021).
  3. Campello, E., Bosch, F., Simion, C., Spiezia, L., Simioni, P. Mechanisms of thrombosis in pancreatic ductal adenocarcinoma. Best Practice & Research Clinical Haematology. 35 (1), 101346(2022).
  4. You, D., et al. Identification of hypercoagulability with thrombelastography in patients with hip fracture receiving thromboprophylaxis. Canadian Journal of Surgery. 64 (3), E324-E329 (2021).
  5. Shah, R., Patel, T., Freedman, J. E. Circulating extracellular vesicles in human disease. The New England Journal of Medicine. 379 (10), 958-966 (2018).
  6. Zang, X., et al. Hepatocyte-derived microparticles as novel biomarkers for the diagnosis of deep venous thrombosis in trauma patients. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 29, 10760296231153400(2023).
  7. Chen, Y., et al. Annexin V(-) and tissue factor(+) microparticles as biomarkers for predicting deep vein thrombosis in patients after joint arthroplasty. Clinica Chimica Acta. 536, 169-179 (2022).
  8. Wang, C., Yu, C., Novakovic, V. A., Xie, R., Shi, J. Circulating microparticles in the pathogenesis and early anticoagulation of thrombosis in COVID-19 with kidney injury. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 784505(2021).
  9. Lacroix, R., Dubois, C., Leroyer, A. S., Sabatier, F., Dignat-George, F. Revisited role of microparticles in arterial and venous thrombosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (Suppl 1), 24-35 (2013).
  10. Cointe, S., et al. Standardization of microparticle enumeration across different flow cytometry platforms: results of a multicenter collaborative workshop. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 15 (1), 187-193 (2017).
  11. Ayers, L., Harrison, P., Kohler, M., Ferry, B. Procoagulant and platelet-derived microvesicle absolute counts determined by flow cytometry correlates with a measurement of their functional capacity. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 25348(2014).
  12. Mooberry, M. J., et al. Procoagulant microparticles promote coagulation in a factor XI-dependent manner in human endotoxemia. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (5), 1031-1042 (2016).
  13. Zhao, Z., et al. Cellular microparticles and pathophysiology of traumatic brain injury. Protein & Cell. 8 (11), 801-810 (2017).
  14. Bolliger, D., Tanaka, K. A. Point-of-care coagulation testing in cardiac surgery. Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 43 (4), 386-396 (2017).
  15. Ganter, M. T., Hofer, C. K. Coagulation monitoring: current techniques and clinical use of viscoelastic point-of-care coagulation devices. Anesthesia & Analgesia. 106 (5), 1366-1375 (2008).
  16. Samuelson, B. T., Cuker, A., Siegal, D. M., Crowther, M., Garcia, D. A. Laboratory assessment of the anticoagulant activity of direct oral anticoagulants: a systematic review. Chest. 151 (1), 127-138 (2017).
  17. Maier, C. L., Sniecinski, R. M. Anticoagulation monitoring for perioperative physicians. Anesthesiology. 135 (4), 738-748 (2021).
  18. Tuktamyshov, R., Zhdanov, R. The method of in vivo evaluation of hemostasis: Spatial thrombodynamics. Hematology. 20 (10), 584-586 (2015).
  19. Tsantes, A. G., et al. Higher coagulation activity in hip fracture patients: A case-control study using rotational thromboelastometry. International Journal of Laboratory Hematology. 43 (3), 477-484 (2021).
  20. Premkumar, M., et al. COVID-19-related dynamic coagulation disturbances and anticoagulation strategies using conventional D-dimer and point-of-care Sonoclot tests: a prospective cohort study. BMJ Open. 12 (5), e051971(2022).
  21. Sakai, T. Comparison between thromboelastography and thromboelastometry. Minerva Anestesiologica. 85 (12), 1346-1356 (2019).
  22. Yan, M., et al. TMEM16F mediated phosphatidylserine exposure and microparticle release on erythrocyte contribute to hypercoagulable state in hyperuricemia. Blood Cells, Molecules and Diseases. 96, 102666(2022).
  23. Yu, H., et al. Hyperuricemia enhances procoagulant activity of vascular endothelial cells through TMEM16F regulated phosphatidylserine exposure and microparticle release. The FASEB Journal. 35 (9), e21808(2021).
  24. Gao, Y., et al. MPs-ACT, an assay to evaluate the procoagulant activity of microparticles. Clinical and Applied Thrombosis/Hemostasis. 29, 10760296231159374(2023).
  25. Wang, J., et al. Brain-derived extracellular vesicles induce vasoconstriction and reduce cerebral blood flow in mice. Journal of Neurotrauma. 39 (11-12), 879-890 (2022).
  26. Tan, J., et al. Analysis of circulating microvesicles levels and effects of associated factors in elderly patients with obstructive sleep apnea. Frontiers in Aging Neuroscience. 13, 609282(2021).
  27. Kubo, H. Extracellular vesicles in lung disease. Chest. 153 (1), 210-216 (2018).
  28. Gilani, S. I., Weissgerber, T. L., Garovic, V. D., Jayachandran, M. Preeclampsia and Extracellular Vesicles. Current Hypertension Reports. 18 (9), 68(2016).
  29. Pourakbari, R., Khodadadi, M., Aghebati-Maleki, A., Aghebati-Maleki, L., Yousefi, M. The potential of exosomes in the therapy of the cartilage and bone complications; emphasis on osteoarthritis. Life Science. 236, 116861(2019).
  30. Shi, J., Gilbert, G. E. Lactadherin inhibits enzyme complexes of blood coagulation by competing for phospholipid-binding sites. Blood. 101 (7), 2628-2636 (2003).
  31. Dasgupta, S. K., Le, A., Chavakis, T., Rumbaut, R. E., Thiagarajan, P. Developmental endothelial locus-1 (Del-1) mediates clearance of platelet microparticles by the endothelium. Circulation. 125 (13), 1664-1672 (2012).
  32. Frey, B., Gaipl, U. S. The immune functions of phosphatidylserine in membranes of dying cells and microvesicles. Seminars in Immunopathology. 33 (5), 497-516 (2011).
  33. Rikkert, L. G., Coumans, F. A. W., Hau, C. M., Terstappen, L., Nieuwland, R. Platelet removal by single-step centrifugation. Platelets. 32 (4), 440-443 (2021).
  34. Chen, Y., et al. Association of placenta-derived extracellular vesicles with pre-eclampsia and associated hypercoagulability: a clinical observational study. BJOG. 128 (6), 1037-1046 (2021).
  35. Liu, Y., et al. The potential applications of microparticles in the diagnosis, treatment, and prognosis of lung cancer. Journal of Translational Medicine. 20 (1), 404(2022).
  36. Piwkham, D., et al. The in vitro red blood cell microvesiculation exerts procoagulant activity of blood cell storage in Southeast Asian ovalocytosis. Heliyon. 9 (1), e12714(2023).
  37. Patil, R., Ghosh, K., Shetty, S. A simple clot based assay for detection of procoagulant cell-derived microparticles. Clinical Chemistry and Laboratory Medicine. 54 (5), 799-803 (2016).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Extracellulaire blaasjesEV rijk plasmadifferenti le centrifugatiebloedstollingstollingsanalyzerhypercoagulabele toestandbedside stollingsonderzoek

Gerelateerde artikelen