Detectie van het SARS-CoV-2-virus door reverse transcriptie-lus-gemedieerde isotherme amplificatie

Samenvatting

Hier bieden we een compleet protocol om de methode voor het detecteren van het SARS-CoV-2-virus in menselijke monsters te standaardiseren en te implementeren door middel van reverse transcriptielus-gemedieerde isotherme amplificatie (RT-LAMP). Deze methode, die binnen 60 minuten wordt uitgevoerd, kan tegen lage kosten en met behulp van goedkope apparatuur worden aangepast aan elk laboratorium of zorgpunt.

Samenvatting

Het severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) virus heeft een dramatische impact gehad op de menselijke gezondheid. Het blijft een bedreiging voor de moderne samenleving omdat veel mensen sterven als gevolg van infectie. De ziekte wordt gediagnosticeerd met behulp van serologische en moleculaire tests, zoals de gouden standaard real-time polymerasekettingreactie (RT-PCR). Dit laatste heeft verschillende nadelen omdat het gespecialiseerde infrastructuur, dure apparatuur en opgeleid personeel vereist. Hier presenteren we een protocol waarin de stappen worden uiteengezet die nodig zijn om het SARS-CoV-2-virus te detecteren met behulp van reverse transcriptie-lus-gemedieerde isotherme amplificatie (RT-LAMP) in menselijke monsters. Het protocol bevat instructies voor het ontwerpen van primers in silico, het bereiden van reagentia, versterking en visualisatie. Eenmaal gestandaardiseerd, kan deze methode eenvoudig worden geïmplementeerd en binnen 60 minuten worden aangepast aan elk laboratorium of zorgpunt tegen lage kosten en met behulp van goedkope apparatuur. Het is aanpasbaar aan het detecteren van verschillende ziekteverwekkers. Het kan dus mogelijk in het veld en in gezondheidscentra worden gebruikt om tijdige epidemiologische surveillance uit te voeren.

Inleiding

Het severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) veroorzaakt coronavirusziekte 2019 (COVID-19). De Wereldgezondheidsorganisatie heeft op 30 januari 2020 een noodsituatie op het gebied van de volksgezondheid van internationaal belang en op 11 maart 2020 een pandemie uitgeroepen. De pandemie resulteerde in meer dan 760 miljoen gevallen en 6.87 miljoen doden op de datum waarop dit artikel werd geschreven¹.

De impact van dit virus heeft duidelijk gemaakt dat er behoefte is aan betere, nauwkeurigere, snellere en breder beschikbare surveillance-instrumenten om de opsporing en bestrijding van infectieziekten te verbeteren ^2,3. Tijdens de pandemie waren diagnostische tests van SARS-CoV-2 gebaseerd op het detecteren van nucleïnezuur, antilichamen en eiwitten, maar RT-PCR-detectie van nucleïnezuur is de gouden standaard⁴. RT-PCR heeft echter enkele beperkingen; Het vereist gespecialiseerde apparatuur, infrastructuur en personeel dat is opgeleid in moleculaire biologie, waardoor de toepassing ervan wordt beperkt tot gespecialiseerde laboratoria. Verder is het tijdrovend (4-6 uur), exclusief de tijd om de monsters naar het laboratorium te vervoeren, wat dagen⁵ kan duren. Deze beperkingen verhinderen een efficiënte verwerking van de monsters en het verkrijgen van de informatie die nodig is voor noodplanning en epidemiologisch beheer.

Reverse transcriptie-loop-gemedieerde isotherme amplificatie (RT-LAMP) heeft verschillende voordelen ten opzichte van RT-PCR, waardoor het een aantrekkelijke strategie is voor het ontwerpen van toekomstige point-of-care diagnostische tests (POCT), met name in omgevingen met beperkte middelen⁶. Ten eerste is het zeer specifiek omdat het tussen de vier en zes primers gebruikt die zes tot acht gebieden in de doelsequentie herkennen, of het nu DNA of RNA ^7,8 is. Ten tweede, omdat het bij een constante temperatuur werkt, vereist het geen geavanceerde apparatuur zoals real-time thermische cyclers om de versterking te genereren, noch is er hoogopgeleid personeel nodig om het te bedienen. Ten derde is de reactietijd erg kort (~60 min) en worden reagentia gebruikt die niet erg gespecialiseerd zijn, waardoor het een kosteneffectief hulpmiddel is⁶. Gezien het voorgaande en de noodsituatie op gezondheidsgebied veroorzaakt door de COVID-19-pandemie, kan deze techniek worden gezien als een alternatieve diagnostische methode die snel, goedkoop en eenvoudig te implementeren is in elk onderzoekslaboratorium⁹.

Het protocol voor het standaardiseren en implementeren van een RT-LAMP om SARS-CoV-2 te detecteren door middel van colorimetrische methoden met behulp van een thermocycler en een waterbad wordt in dit artikel beschreven (Figuur 1). Kritieke punten, hun beperkingen en alternatieven om ze te bevorderen worden besproken.

Figuur 1: Schema van het protocol voor het versterken van SARS-CoV-2 met behulp van de RT-LAMP-techniek. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

De gebruikte monsters werden geleverd door het klinische laboratorium van het Universitair Ziekenhuis Fundación Valle del Lili en kwamen overeen met het gezuiverde RNA van patiënten die positief testten op COVID-19 met behulp van de RT-qPCR-techniek. Alle patiënten gaven geïnformeerde toestemming voor onderzoek en deze studie werd goedgekeurd door de bio-ethische commissie voor studies bij mensen van het universitair ziekenhuis Fundación Valle del Lili.

1. RT-LAMP primer ontwerp en voorbereiding

OPMERKING: LAMP-primers kunnen worden gebruikt met verschillende platforms, waaronder New England BioLabs (NEB) LAMP, Primer Explorer en LAMP assay versatile analysis (LAVA). Voor dit protocol is echter gebruik gemaakt van de NEB LAMP-tool. Primer-ontwerp kan worden gedaan met behulp van SARS-CoV-2-genomen die zijn verkregen uit de NextStrain database¹⁰. Tabel 1 toont de primerset die in dit protocol wordt gebruikt.

1. Primer ontwerp voor LAMP
   1. Verkrijg virale genoomsequenties.
   2. Voer sequentie-uitlijningen uit om de consensussequentie te verkrijgen.
   3. Navigeer naar het NEB LAMP primer design tool platform¹¹ en volg de instructies in de beknopte handleiding. Deze tool produceert dezelfde resultaten als primer explorer V5, maar is veel gebruiksvriendelijker in zijn output. Gebruik de gebruikershandleidingen van de primerverkenner als richtlijn voor het ontwerp van de primer.
2. Thermodynamische evaluatie van de set primers
   1. Gebruik het gereedschap Primer-Dimeer¹² om een thermodynamische analyse uit te voeren op de verkregen primers.
   2. Plaats de primersequenties in het gereedschap. Selecteer vervolgens de optie Multiplexanalyse en Dimeerstructuurrapport.
   3. Selecteer de primersets met een ΔG van niet minder dan -5.
3. Specificiteitsevaluatie van de ontworpen primers
   1. Gebruik de Nucleotide-verzameling (nt/nt) database in BLAST¹³ om elke primer te analyseren.
   2. Om de eerste BLAST-analyse uit te voeren, selecteert u de Refseq_rna database en filtert u de zoekopdracht op de groep geslachten die behoren tot de onderfamilie Orthocoronavirinae. Dit zijn Alphacoronavirus (taxid:693996), Gammacoronavirus (taxid:694013) en Deltacoronavirus (taxid:1159901). Evalueer bovendien de sequentie tegen andere virussen die samen circuleren als H1N1-subtype (taxid:114727), Influenza A-virus (taxid:11320) en Influenza B-virus (taxid:11520).
   3. Om de tweede BLAST-analyse uit te voeren, selecteert u de Betacoronavirus GenBank en filtert u de zoekopdracht met Coronaviridae (taxid:11118) en SARS (taxid:694009). Deze groepen bevatten sequenties van alle geïdentificeerde genomen van het SARS-coronavirus, inclusief genomen die zijn aangetroffen bij vleermuizen, Betacoronavirus (taxid:694002).
   4. Zorg er voor dit protocol voor dat de primers niet overeenkomen met andere genomen dan het doelgenoom, SARS-CoV-2.
4. Voorbereiding van de primer
   1. Draai de injectieflacons met de gevriesdroogde primers rond met een microcentrifuge (10.000 x g, 1 min bij kamertemperatuur [RT]) om verliezen tijdens het openen van de buis te voorkomen.
   2. Rehydrateer het geïyophiliseerde poeder in 0,1% diethylpyrocarbonaat (DEPC) water of nucleasevrij water tot een eindconcentratie van 100 μM (tabel 2) en los het volledig op door op en neer te pipetteren. Draai vervolgens op maximale snelheid (10.000 x g, 1 minuut bij RT) in een microcentrifuge om alle primeroplossingen op de bodem van de buis te verzamelen.
   3. Bereid de 10x primermix onder een bioveiligheidskast met de voorwaartse binnenprimer (FIP), achterwaartse binnenprimer (BIP), voorwaartse buitenprimer (F3), achterwaartse buitenprimer (B3), lus achterwaarts (LB) en lus voorwaarts (LF) primers, zoals gerapporteerd in tabel 2. Om verliezen te voorkomen, pipet of draait u de primeroplossing voorzichtig rond voordat u snel centrifugeert (10.000 x g, 1 minuut bij RT) met een microcentrifuge.
   4. Bewaar de 10x primermix bij -20 °C voor langdurige opslag; Bereid u echter voldoende voor op maximaal vijf experimenten, ongeacht meerdere monsters om te veel vries-dooicycli te voorkomen.
      OPMERKING Als een kleiner volume van de primermix nodig is, pas dan de waarden aan door de nieuwe volumes te berekenen (tabel 2). Bovendien bevatten de RdRp- en RdRp/Hel-sets de LF-primer niet, omdat lusprimers niet nodig zijn voor RT-LAMP-reacties. Vervang daarom het volume LF-primer door nucleasevrij water of 0,1% DEPC-water.

2. RT-LAMP reactie

1. Schakel de laminaire stromingskast in volgens de instructies van de fabrikant en wacht minimaal 3 minuten totdat de luchtstroom is gestabiliseerd.
2. Zodra de luchtstroom stabiel is, reinigt en ontsmet u de interne oppervlakken van de kast met behulp van een aseptische techniek. Gebruik hiervoor de volgende ontsmettingsmiddelen in deze volgorde: 1000 ppm quaternair ammonium (benzalkoniumchloride), 2% hypochloriet, 3% waterstofperoxide en 70% ethanol.
   OPMERKING: In dit geval houdt de aseptische techniek in dat het ontsmettingsmiddel wordt aangebracht en met servetten van binnen in de cabine naar buiten wordt verwijderd zonder over eerder gereinigde oppervlakken te gaan.
3. Reinig met behulp van de ontsmettingsmiddelen uit stap 2.2 de materialen die de cabine binnenkomen in dezelfde volgorde.
   OPMERKING: Micropipetten, filtertipdozen, kolven met buisjes van 1,5 ml en 0,6 ml, PCR-buisjes van 0,2 ml, rekken en een bekerglas van 400 ml moeten in de kast worden gebracht.
4. Neem wat servetten en nitrilhandschoenen mee naar de cabine. Schakel daarna de kast uit en stel deze gedurende 15 minuten bloot aan ultraviolet (UV) licht.
   LET OP: Om weefsel- en DNA-schade door langdurige blootstelling aan straling te voorkomen, dient u UV-licht te vermijden totdat de in stap 2.4 ingestelde tijd is verstreken.
   NOTITIE Voer de montage uit die wordt weergegeven in afbeelding 2 voordat u met het protocol begint en begin met het waterbad na het voltooien van stap 2.4. Het is van cruciaal belang om de metalen container bijna tot de rand met drinkwater te vullen en de temperatuur van de ijzeren laboratoriumverwarmingsplaat in te stellen op 90 °C, omdat dit zal resulteren in een temperatuur van ~66,3 °C in het systeem, dat wordt bewaakt met de kwikthermometer.
5. Nadat de bestralingsperiode is afgelopen, start u de kast opnieuw op en volgt u de aanbevelingen in stap 1.1.
6. Plaats de reagentia (tabel 3, tabel 4 en tabel 5) in een met ijs gevulde koelbox of een kleine koelkast van polystyreen. Zet de container in de kast nadat je deze hebt schoongemaakt met 70% ethanol.
7. Bereid in een microcentrifugebuisje van 0,6 ml het LAMP-mengsel van het te amplificeren gen (RdRp, N-A en RdRp/Hel), waarbij alleen de volgende componenten worden toegevoegd: 10x Buffer, MgSO₄, dNTP's, 1x primersmix en nucleasevrij water of 0,1% DEPC-water; Meng goed door te pipetteren om te homogeniseren.
   LET OP: Vanwege onjuiste behandeling en gedrag in de kast bestaat er een groot risico op verontreiniging met het reagens. De volgende regels moeten worden gevolgd om dit probleem te verhelpen: (i) gebruik steriele en filtertips; ii) gebruik één punt voor elk reagens; iii) langzaam en voorzichtig bewegen om te voorkomen dat de laminaire stroming wordt verstoord; (iv) de orde te handhaven en zo min mogelijk materialen te gebruiken; en (v) gebruik verschillende handschoenen om de mix te bereiden en het genetisch materiaal toe te voegen.
   OPMERKING: Bewaar alle reagentia, vooral enzymen, op ijs, omdat temperatuurveranderingen ze kunnen denatureren en de polymerase-activiteit kunnen veranderen.
8. Plaats de buis(en) van 0,6 ml met gesloten dop in een verwarmingsblok en incubeer gedurende 5 minuten bij 95 °C.
   NOTITIE: Schakel het verwarmingsblok voor buizen van 1.5-2.0 ml die zich buiten de kast bevinden ten minste 30 minuten aan voordat u begint met de bereiding van de LAMP-mix en controleer de temperatuur (95 °C) met een kwik- of alcoholthermometer.
9. Wanneer de incubatie is voltooid, plaatst u de buizen gedurende 5 minuten in een met ijs gevulde polystyreenkoeler.
10. Plaats de buisjes terug in de laminaire flowkast en voltooi de voorbereiding van de LAMP-mix door de enzymen DNA-polymerase (Bst 3.0), reverse transcriptase en high-fidelity DNA-polymerase toe te voegen (Tabel 3, Tabel 4 en Tabel 5). In het geval van colorimetrische detectie, voeg de kleurstof hydroxinaphthol blauw (HNB) toe.
11. Na het toevoegen van deze reagentia mengt u de LAMP-reagentia goed door ze te pipetteren om de enzymen en kleurstof op te lossen.
12. Vul elke PCR-buis met 22,0 μL van het mengsel en zorg ervoor dat er geen luchtbellen ontstaan. Voeg vervolgens 3,0 μL 0,1% DEPC-water of nucleasevrij water toe aan de negatieve controle of tube no template control (NTC) en zet de resterende buis(sen) opzij voor de toevoeging (genetisch materiaal).
    OPMERKING: Bewaar de PCR-buisjes in een met ijs gevulde koeler totdat het monster wordt toegevoegd om te voorkomen dat het Bst 3.0-enzym wordt geactiveerd en de reactie voortijdig wordt gestart.
13. Verwijder alle materialen uit de kast en gebruik 70% ethanol om de oppervlakken schoon te maken. Schakel het vervolgens uit volgens de instructies van de fabrikant.
14. Voeg in een aparte ruimte 3 μL van het monster toe aan elke PCR-buis en homogeniseer het grondig. Gebruik hiervoor een micropipet van 20 μl en filtertips.
    LET OP: De micropipet die wordt gebruikt om het genetische materiaal toe te voegen, mag uitsluitend voor dit doel worden gebruikt en kan niet worden gebruikt om het mengsel te bereiden. Op deze manier wordt contaminatie van de reagentia voorkomen. Bewaar bovendien te allen tijde RNA-monsters op het ijs om de kans op RNA-afbraak te verkleinen. Gebruik de volgende persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) voor de toevoeging van het monster: wegwerpjas, pet, N95-masker, legging, laboratoriumbril en nitrilhandschoenen.
15. Voordat u de colorimetrische reactie uitvoert, maakt u foto's van de PCR-buisjes met een camera van hoge kwaliteit. De startkleur bij HNB is violet.
16. Voer de reactie uit in het volgende systeem of de volgende apparatuur: (i) thermische cycler en (ii) waterbad.
    1. Thermische cycler: Plaats de buizen in het reactieblok en plaats het thermoprofiel (zie tabel 6) op de apparatuur.
    2. Waterbad: Doe de buizen in ronde bakjes en pas ze goed aan om te voorkomen dat ze eruit komen. Plaats daarna de containers in het waterbad (Figuur 2A, B) op de temperatuur vermeld in Tabel 6.
17. In het geval van het waterbad, zodra de slangen zich in het systeem bevinden, start u de timer voor 60 minuten (tabel 6).
18. Haal de buizen na de inwerktijd uit de thermische cycler of het waterbad en bewaar ze bij 4 °C voor de elektroforetische run of bij -20 °C tot gebruik.
19. Als er een colorimetrische reactie is uitgevoerd, maak dan foto's van de PCR-buisjes met een camera van hoge kwaliteit. De uiteindelijke kleur bij HNB is hemelsblauw.

3. Analyse van amplificatieproducten in agarosegel

OPMERKING: Deze stappen worden voorgesteld als aanvullende controles op de colorimetrische reactie of controle op prestaties tijdens de standaardisatiestap. Dit komt omdat de techniek een enorm besmettingsrisico kan vormen voor het laboratorium dat deze tests uitvoert.

1. Plaats het bed in de elektroforesekamer zodat de randrubbers de wanden raken, waardoor een afgesloten ruimte ontstaat voor de toevoeging van agarose (interne kamer) (Figuur 3A, B).
2. Weeg na voltooiing van stap 3.1 de benodigde hoeveelheid agarose af in een bekerglas van 500 ml om een gel van 2% te verkrijgen. Voeg daarna het vereiste volume van 0,5x Tris-acetaat EDTA (TAE) buffer toe en magnetron gedurende 1-2 minuten.
   OPMERKING: De agarose is volledig gesmolten als hij doorschijnend en klontvrij is wanneer hij uit de oven wordt gehaald. Als dit niet wordt bevestigd, kunnen er slecht gegeleerde gebieden overblijven, waardoor de elektroforetische run en visualisatie van de versterkingsproducten worden gewijzigd.
3. Haal het bekerglas uit de oven en giet de agarose in de inwendige kamer die in stap 3.1 is ontstaan (figuur 3C). Controleer vervolgens of er geen luchtbellen zijn en als die er zijn, verwijder deze dan met een micropipetpunt.
4. Plaats de kam om de kuiltjes te vormen en laat de agarose ongeveer 30 minuten geleren bij kamertemperatuur (RT).
5. Voeg na deze tijd 5 ml 0,5x TAE-buffer toe om het verwijderen van de kammen en het bed met de gel te vergemakkelijken. Plaats de gel vervolgens zo dat de putjes in de anode zitten (Figuur 3D).
6. Vul de elektroforesekamer met 0.5x TAE-buffer tot de door de fabrikant gespecificeerde capaciteit en zorg ervoor dat de elektroden in contact zijn met de buffer.
7. Voeg 3 μL molecuulgewichtmarker toe aan het eerste putje van de gel en voeg 9 μL NTC en elk monster toe aan de volgende putjes. Maak deze door 7 μL van het amplificatieproduct te combineren met 3 μL laadbuffer; laad vervolgens 9 μL van dit mengsel in de putjes van de gel.
8. Bedek de elektroforesekamer met het deksel en sluit de kabels aan op de voedingspoorten in het kleurenpatroon. Stel de stroombron in op de volgende parameters: 100 V en constante stroomsterkte gedurende 120 min.
9. Nadat de elektroforetische run is voltooid, plaatst u de gel in de container met de kleuroplossing (ethidiumbromide) en incubeert u gedurende 30 minuten.
10. Verwijder na incubatie de gel uit de kleuroplossing en doe deze in een zak met ritssluiting. Dit voorkomt contaminatie van de apparatuur die zal worden gebruikt om de amplicons te visualiseren.
11. Visualiseer de gel op een transilluminator of imager zoals de Amersham Imager 600.

Resultaten

De implementatie van het protocol begint met het ontwerpen van de set primers voor elk doelgen volgens het hierboven beschreven protocol. In juni 2020 werden 5.000 SARS-CoV-2-genomen verkregen uit de NextStrain-database, met een representativiteit van 10% van het Colombiaanse genoom. Deze sequenties werden op elkaar afgestemd om de consensussequentie te verkrijgen die werd gebruikt in het ontwerpproces van de primer. Tabel 1 toont de primerset die is gekozen voor primers RdRp/Hel en RdRp. De primerset vo...

Discussie

Hoewel de RT-LAMP wordt beschouwd als een aanvullende methodologie voor het uitvoeren van moleculaire diagnostiek, heeft het ook enkele beperkingen en kritieke stappen waarmee rekening moet worden gehouden wanneer het protocol wordt gestandaardiseerd en geïmplementeerd.

De LAMP-standaardisatie voor de detectie van SARS-CoV-2 evalueerde de volgende parameters en componenten in de mastermix: (a) concentratie en temperatuur van uitlijning van de primers; b) concentratie van de enzymen; c) magnesi...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1 kb DNA Ladder	SOLIS BIODYNE	07-12-00050	Bewaar bij -20 °C
50x TAE Electrophoresis Buffer	ThermoScientific	B49	Bewaar bij kamertemperatuur
Accuris High Fidelity Polymerase	ACCURIS LIFE SCIENCE REAGENTS	PR1000-HF-200	Kan worden gebruikt als Q5 High-Fidelity DNA polymerase niet kan worden gekocht. Maak voor het enzym aliquots van een geschikt volume en bewaar bij -20 °C tot gebruik.
Agarose	PanReacAppliChem	A8963,0100	N/A
Bst 3.0 DNA Polymerase 8000 IU/mL	New England BioLabs	M0374S/M0374L	Maak voor het enzym aliquots van een geschikt volume en bewaar bij -20 °C tot gebruik.
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set	New England BioLabs	N0446S	Bewaar bij -20 °C
Diethyl pyrocarbonate	Sigma-Aldrich	159220-25G	Gebruik met voorzichtigheid onder een afzuigkap
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder, ready-to-use	ThermoScientific	SM0322	Bewaar bij -20 °C
Hydroxy naphthol blue disodium salt	Santa Cruz Biotechnology	sc-215156B	N/A
Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2000 IU/mL	New England BioLabs	M0491S/M0491L	Maak voor het enzym aliquots van een geschikt volume en bewaar bij -20 °C tot gebruik.
WarmStart RTx Reverse Transcriptase 15000 IU/mL	New England BioLabs	M0380S/M0380L	Maak voor het enzym aliquots van een geschikt volume en bewaar bij -20 °C tot gebruik.