Detectie van het SARS-CoV-2-virus door reverse transcriptie-lus-gemedieerde isotherme amplificatie

Samenvatting

Hier bieden we een compleet protocol om de methode voor het detecteren van het SARS-CoV-2-virus in menselijke monsters te standaardiseren en te implementeren door middel van reverse transcriptielus-gemedieerde isotherme amplificatie (RT-LAMP). Deze methode, die binnen 60 minuten wordt uitgevoerd, kan tegen lage kosten en met behulp van goedkope apparatuur worden aangepast aan elk laboratorium of zorgpunt.

Samenvatting

Het severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) virus heeft een dramatische impact gehad op de menselijke gezondheid. Het blijft een bedreiging voor de moderne samenleving omdat veel mensen sterven als gevolg van infectie. De ziekte wordt gediagnosticeerd met behulp van serologische en moleculaire tests, zoals de gouden standaard real-time polymerasekettingreactie (RT-PCR). Dit laatste heeft verschillende nadelen omdat het gespecialiseerde infrastructuur, dure apparatuur en opgeleid personeel vereist. Hier presenteren we een protocol waarin de stappen worden uiteengezet die nodig zijn om het SARS-CoV-2-virus te detecteren met behulp van reverse transcriptie-lus-gemedieerde isotherme amplificatie (RT-LAMP) in menselijke monsters. Het protocol bevat instructies voor het ontwerpen van primers in silico, het bereiden van reagentia, versterking en visualisatie. Eenmaal gestandaardiseerd, kan deze methode eenvoudig worden geïmplementeerd en binnen 60 minuten worden aangepast aan elk laboratorium of zorgpunt tegen lage kosten en met behulp van goedkope apparatuur. Het is aanpasbaar aan het detecteren van verschillende ziekteverwekkers. Het kan dus mogelijk in het veld en in gezondheidscentra worden gebruikt om tijdige epidemiologische surveillance uit te voeren.

Inleiding

Het severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) veroorzaakt coronavirusziekte 2019 (COVID-19). De Wereldgezondheidsorganisatie heeft op 30 januari 2020 een noodsituatie op het gebied van de volksgezondheid van internationaal belang en op 11 maart 2020 een pandemie uitgeroepen. De pandemie resulteerde in meer dan 760 miljoen gevallen en 6.87 miljoen doden op de datum waarop dit artikel werd geschreven¹.

De impact van dit virus heeft duidelijk gemaakt dat er behoefte is aan betere, nauwkeurigere, snellere en breder beschikbare surveillance-instrumenten om de opsporing en bestrijding van infectieziekten....

Protocol

De gebruikte monsters werden geleverd door het klinische laboratorium van het Universitair Ziekenhuis Fundación Valle del Lili en kwamen overeen met het gezuiverde RNA van patiënten die positief testten op COVID-19 met behulp van de RT-qPCR-techniek. Alle patiënten gaven geïnformeerde toestemming voor onderzoek en deze studie werd goedgekeurd door de bio-ethische commissie voor studies bij mensen van het universitair ziekenhuis Fundación Valle del Lili.

1. RT-LAMP primer ontwerp en voorbereiding

OPMERKING: LAMP-primers kunnen worden gebruikt met verschillende platforms, waaronder New England BioLab....

Resultaten

De implementatie van het protocol begint met het ontwerpen van de set primers voor elk doelgen volgens het hierboven beschreven protocol. In juni 2020 werden 5.000 SARS-CoV-2-genomen verkregen uit de NextStrain-database, met een representativiteit van 10% van het Colombiaanse genoom. Deze sequenties werden op elkaar afgestemd om de consensussequentie te verkrijgen die werd gebruikt in het ontwerpproces van de primer. Tabel 1 toont de primerset die is gekozen voor primers RdRp/Hel en RdRp. De primerset vo.......

Discussie

Hoewel de RT-LAMP wordt beschouwd als een aanvullende methodologie voor het uitvoeren van moleculaire diagnostiek, heeft het ook enkele beperkingen en kritieke stappen waarmee rekening moet worden gehouden wanneer het protocol wordt gestandaardiseerd en geïmplementeerd.

De LAMP-standaardisatie voor de detectie van SARS-CoV-2 evalueerde de volgende parameters en componenten in de mastermix: (a) concentratie en temperatuur van uitlijning van de primers; b) concentratie van de enzymen; c) magnesi.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1 kb DNA Ladder	SOLIS BIODYNE	07-12-00050	Bewaar bij -20 °C
50x TAE Electrophoresis Buffer	ThermoScientific	B49	Bewaar bij kamertemperatuur
Accuris High Fidelity Polymerase	ACCURIS LIFE SCIENCE REAGENTS	PR1000-HF-200	Kan worden gebruikt als Q5 High-Fidelity DNA polymerase niet kan worden gekocht. Maak voor het enzym aliquots van een geschikt volume en bewaar bij -20 °C tot gebruik.
Agarose	PanReacAppliChem	A8963,0100	N/A
Bst 3.0 DNA Polymerase 8000 IU/mL	New England BioLabs	M0374S/M0374L	Maak voor het enzym aliquots van een geschikt volume en bewaar bij -20 °C tot gebruik.
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Set	New England BioLabs	N0446S	Bewaar bij -20 °C
Diethyl pyrocarbonate	Sigma-Aldrich	159220-25G	Gebruik met voorzichtigheid onder een afzuigkap
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder, ready-to-use	ThermoScientific	SM0322	Bewaar bij -20 °C
Hydroxy naphthol blue disodium salt	Santa Cruz Biotechnology	sc-215156B	N/A
Q5 High-Fidelity DNA polymerase 2000 IU/mL	New England BioLabs	M0491S/M0491L	Maak voor het enzym aliquots van een geschikt volume en bewaar bij -20 °C tot gebruik.
WarmStart RTx Reverse Transcriptase 15000 IU/mL	New England BioLabs	M0380S/M0380L	Maak voor het enzym aliquots van een geschikt volume en bewaar bij -20 °C tot gebruik.