Polarisatiegevoelige twee-fotonmicroscopie voor een labelvrije structurele karakterisering van amyloïden

Samenvatting

Dit artikel beschrijft hoe polarisatiegevoelige twee-fotonmicroscopie kan worden toegepast om de lokale organisatie binnen labelvrije amyloïde superstructuren-sferulieten te karakteriseren. Het beschrijft ook hoe het monster moet worden voorbereid en gemeten, de vereiste opstelling moet worden samengesteld en de gegevens moeten worden geanalyseerd om informatie te verkrijgen over de lokale organisatie van amyloïde fibrillen.

Samenvatting

Vergeleken met zijn tegenhanger met één foton is excitatie met twee fotonen gunstig voor bioimaging-experimenten vanwege de lagere fototoxiciteit, diepere weefselpenetratie, efficiënte werking in dicht opeengepakte systemen en verminderde hoekfotoselectie van fluoroforen. De introductie van polarisatieanalyse in twee-fotonfluorescentiemicroscopie (2PFM) zorgt dus voor een nauwkeurigere bepaling van de moleculaire organisatie in een monster in vergelijking met standaard beeldvormingsmethoden op basis van lineaire optische processen. In dit werk richten we ons op polarisatiegevoelige 2PFM (ps-2PFM) en de toepassing ervan bij de bepaling van moleculaire ordening binnen complexe biostructuren-amyloïde sferulieten . Neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer of Parkinson worden vaak gediagnosticeerd door de detectie van amyloïde-eiwitaggregaten die worden gevormd als gevolg van een verstoord eiwitmisvouwingsproces. Het onderzoeken van hun structuur leidt tot een beter begrip van hun creatiepad en bijgevolg tot het ontwikkelen van gevoeligere diagnostische methoden. Dit artikel presenteert de ps-2PFM die is aangepast voor de bepaling van lokale fibrilordening in de runderinsuline-sferulieten en sferische amyloïdogene eiwitaggregaten. Bovendien bewijzen we dat de voorgestelde techniek de driedimensionale organisatie van fibrillen in de sferuliet kan oplossen.

Inleiding

In de afgelopen decennia, hoewel er een aanzienlijke ontwikkeling is geweest van talrijke fluorescentiemicroscopietechnieken voor bioimaging van eiwitten en hun aggregaten¹, zijn er slechts enkele gebruikt om hun lokale ordening binnen het monster op te lossen ^2,3. Fluorescentie lifetime imaging microscopie⁴ werd gebruikt om de intrinsieke structurele heterogeniteit van amyloïde superstructuren-sferulieten te bestuderen. Bovendien zou kwantitatieve bepaling van de lokale ordening in complexe en dicht opeengepakte biostructuren zoals sferulieten kunnen worden opgelost met behulp van polarisatiegevoelige methoden³. Standaard fluorescentietechnieken met oppervlakkige weefselpenetratie zijn echter beperkt, aangezien het gebruik van UV-VIS-golflengten om fluoroforen in vivo te exciteren leidt tot een hoge verstrooiing van weefsellicht⁵. Bovendien vereist dergelijke beeldvorming vaak het ontwerpen en binden van specifieke fluorescerende sondes aan een gericht biomolecuul, waardoor de kosten en de hoeveelheid werk die nodig is om beeldvorming uit te voeren, toenemen.

Om deze problemen aan te pakken, heeft ons team onlangs de polarisatiegevoelige twee-foton geëxciteerde fluorescentiemicroscopie (ps-2PFM) aangepast voor labelvrije beeldvorming van biologische structuren ^6,7. Ps-2PFM maakt het mogelijk om de afhankelijkheid van de intensiteit van de fluorescentie van twee fotonen te meten van de richting van de lineaire polarisatie van de excitatiestraal en de polarisatie van de uitgezonden fluorescentie^{te analyseren 8}. De implementatie van deze techniek vereist aanvulling van het standaard excitatiepad van de multi-fotonenmicroscoopopstelling (Figuur 1) met een halfgolfplaat om het lichtpolarisatievlak te regelen. Vervolgens worden polaire grafieken, die de afhankelijkheid van de intensiteit van de geëxciteerde fluorescentie met twee fotonen van de polarisatie van de excitatielaserstraal weergeven, gemaakt van signalen die worden verzameld door twee lawinefotodiodes, waardoor de twee, onderling loodrecht op elkaar staande componenten van fluorescentiepolarisatie worden verzameld.

De laatste stap is het data-analyseproces, waarbij rekening wordt gehouden met de impact van de optische elementen, zoals dichroïsche spiegels of een objectief met een hoge numerieke apertuur, op polarisatie. Vanwege de aard van het twee-fotonproces biedt deze methode zowel een verminderde hoekfotoselectie als een verbeterde axiale resolutie, aangezien de excitatie van fluoroforen met twee fotonen buiten het brandpuntsvlak waarschijnlijk beperkt is. Het werd ook bewezen dat soortgelijke methoden met succes konden worden geïmplementeerd voor in vivo beeldvorming van nabij-infraroodsondes (NIR)^{voor beeldvorming} van diep weefsel9. Ps-2PFM is eerder toegepast op beeldfluoroforen in celmembranen¹⁰ en DNA^11,12, evenals niet-standaard fluorescerende markers van biologische systemen, zoals gouden nanodeeltjes¹³. In al deze voorbeelden werd de informatie over de organisatie van biomoleculen echter indirect verkregen en vereiste een vooraf gedefinieerde wederzijdse oriëntatie tussen een fluorofoor en een biomolecuul.

In een van onze recente artikelen hebben we aangetoond dat ps-2PFM met succes kan worden toegepast voor het bepalen van de lokale polarisatie van de autofluorescentie van amyloïde superstructuren en fluorescentie van thioflavine T, een amyloïde-specifieke kleurstof, gebonden aan amyloïde fibrillen in sferulieten⁶. Bovendien hebben we in een andere bewezen dat ps-2PFM kan worden gebruikt om de oriëntatie van amyloïde fibrillen in amyloïde sferulieten te detecteren in een regime van submicrongrootte, wat werd bevestigd door het te correleren met transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) beeldvorming⁷. Het bereiken van dit resultaat was mogelijk dankzij i) intrinsieke autofluorescentie van sferulieten en amyloïden, wanneer ze worden geëxciteerd met één of twee fotonen, intrinsieke autofluorescentie vertonen met emissiemaxima in een bereik van 450 tot 500 nm en absorptiedoorsneden van twee fotonen die vergelijkbaar zijn met standaard fluorescerende kleurstoffen¹⁴, ii) wiskundige modellen die eerder zijn geïntroduceerd om te beschrijven hoe ps-2PEF van kleurstoffen die biologische membranen en DNA-structuren labelen, kunnen worden toegepast op fluorescentie vertoond door sferulieten en kleurstoffen die eraan zijn gebonden ^8,11,15. Daarom raden we ten zeerste aan om, voordat we verder gaan met de analyse, de vereiste theorie door te nemen die wordt beschreven in zowel de hoofdtekst als de ondersteunende informatie van ons eerste artikel over dit onderwerp⁶. Hier presenteren we het protocol voor het toepassen van de ps-2PFM-techniek voor een labelvrije amyloïde structurele karakterisering van runderinsuline sferulieten.

Protocol

1. Voorbereiding van de microscoopglaasjes met volgroeide sferulieten

OPMERKING: Zie de materiaaltabel voor meer informatie over alle materialen, reagentia en apparatuur die in dit protocol worden gebruikt. Alle oplossingen werden bereid met gedeïoniseerd water (18,2 MΩ·cm bij 25 °C) verkregen uit het waterzuiveringssysteem.

1. Incubeer de amyloïde sferulieten op basis van het protocol beschreven door Krebs et al¹⁶. met enkele aanpassingen, zoals hieronder beschreven.
   1. Weeg 10 mg insulinepoeder af in een buisje van 1,5 ml.
   2. Los het poeder op met een aliquot van 1 ml van de gedeïoniseerde_H2O/HCl-oplossing (pH 1,5).
   3. Sluit het monster af met de tape en plaats het in een thermische mixer om gedurende 24 uur bij 70 °C (0 rpm) te incuberen.
      OPMERKING: Om beeldvorming van amyloïden in hun oorspronkelijke (d.w.z. gehydrateerde) omgeving uit te voeren en vervorming van het monster als gevolg van uitdroging te voorkomen, is het noodzakelijk om microscoopglaasjes te maken volgens de volgende beschrijving (schema weergegeven in afbeelding 2).
2. Was het glazen objectglaasje van de microscoop grondig met water.
3. Dompel de glaasjes in methanol en laat ze onder omgevingsomstandigheden drogen op een stofvrij doekje.
4. Neem met een automatische pipet een aliquot van 100 μl van de sferuliet uit het buisje (stap 1.1.2) en voeg dit toe aan het putje dat zich in het centrale gedeelte van het objectglaasje bevindt.
5. Bedek de oplossing met een dekglaasje en vermijd de vorming van luchtbellen.
6. Breng het monteerproduct langs de randen van het dekglaasje op het glaasje aan met een automatische pipet om de natuurlijke oplossing van de sferulieten te verzegelen.
   OPMERKING: Het is van groot belang om de bevestiging van de schuif op zowel het dekglaasje als de schuifoppervlakken te deponeren. Doe dit onder de dampende kap i.v.m. de giftigheid van het vluchtige oplosmiddel (xyleen). Zie het inzetstuk in figuur 2.
7. Laat het microscoopmonster onder omgevingsomstandigheden staan zodat het monteermiddel kan uitharden.
   OPMERKING: Het uithardingsproces is temperatuur- en vochtigheidsafhankelijk, maar moet binnen 12 uur zijn voltooid.
8. Controleer of insulinesferulieten correct zijn gevormd met behulp van een gepolariseerde optische microscoop (POM) met gekruiste polarisatoren. Scan door het monster op zoek naar een karakteristiek patroon van heldere gebieden, een Maltees kruis genoemd, zoals weergegeven in figuur 3.
   OPMERKING: De amyloïde sferulieten kunnen worden gedefinieerd als bolvormige superstructuren die worden gekenmerkt door een heterogene morfologie met een kern-schaalstructuur. In detail zijn ze samengesteld uit een amorfe kern en radiaal groeiende amyloïde fibrillen¹⁶. Vanwege het anisotrope karakter van sferuliet structuren, kunnen ze onderscheidend interageren met gepolariseerd licht (bijv. door breking) en hun fase veranderen, wat gemakkelijk kan worden waargenomen onder POM met gekruiste polarisatoren. Deze methode werd gebruikt om alleen volledig ontwikkelde sferulieten te bestuderen die werden gekenmerkt door een modelachtig Maltase-kruispatroon. Bijgevolg werden aggregaten of structureel vervormde sferulieten uitgesloten van verder onderzoek.

2. Bouwen en uitlijnen van het systeem

OPMERKING: Een schematische weergave van een polarisatiegevoelige twee-fotonenmicroscoop is te vinden in figuur 1.

1. Installeer een femtosecondelaser met de uitgangsgolflengte in het bereik van 690-1.080 nm, bijvoorbeeld werkend op een modusvergrendelde Ti:Sapphire-laser met ~100 fs-pulsen met een herhalingsfrequentie van 80 MHz.
2. Voeg een halfgolfplaat gemonteerd op een rotatietafel toe aan het excitatiepad van de opstelling om de polarisatie van het invallende licht in het XY-microscoopmonstervlak te regelen.
3. Installeer de dichroïsche spiegel om de excitatiestraal van de detectieoptiek af te snijden.
   OPMERKING: De optische eigenschappen van een dichroïsche spiegel moeten het mogelijk maken de excitatiestraal (naar het monster) te reflecteren in het NIR-golflengtebereik en tegelijkertijd transparant te zijn voor het golflengtebereik dat overeenkomt met de emissie van de monsters.
4. Installeer een piëzo-elektrische scantafel voor rasterscans binnen het XY-vlak voor een gekozen Z.
5. Monteer het hoge NA-immersieobjectief, bijvoorbeeld een apochromatisch olie-immersieobjectief 100x/1.4 NA.
   OPMERKING: Aangezien de hele opstelling in een epifluorescentiemodus werkt, passeren de invallende en uitgezonden signalen hetzelfde doel.
6. Voeg in het emissiepad een polariserende bundelsplitser toe die de geëxciteerde emissie van twee fotonen splitst in twee orthogonaal gepolariseerde componenten (I_X en I_Y)
7. Installeer twee fotontellende lawinefotodiodes (APD's) in een configuratie waardoor ze respectievelijk licht kunnen opvangen dat wordt overgedragen en gereflecteerd met behulp van de bundelsplitser (Figuur 1).
8. Monteer de juiste golflengteafhankelijke cut-off filters op het excitatie- en emissiepad van het systeem, bijvoorbeeld een 800 nm long-pass filter direct in het excitatie optische pad en een 700 short-pass filter in het emissiepad.
   NOTITIE: Analyseer de emissiespectra van sferuliet zodat elke mogelijke bijdrage van tweede harmonische generatie (SHG) of laserlicht kan worden uitgesloten met behulp van de juiste emissiefilters. Het is ook vermeldenswaard dat dit systeem ook metingen van polarisatiegevoelige SHG mogelijk zou moeten maken, die kunnen worden gebruikt om de ordening van biomoleculen in de monsters op te lossen. De data-analyse van het SHG-signaal verschilt echter van fluorescentie, die meer in detail werd beschreven door Aït-Belkacem et ^al.17.
9. Lijn het hele systeem uit (met behulp van de uitlijningsmodus die in veel lasers is ingebouwd) totdat vergelijkbare signaalintensiteiten worden verzameld met behulp van beide fotodiodes.
10. Controleer of de excitatiestraal die wordt scherpgesteld door het hoge NA-objectief en wordt afgebeeld op een camera een concentrische cirkelvorm heeft, zoals weergegeven in afbeelding 4A.
11. Pas de scantijd en het bijbehorende vermogen aan om de schade die door de invallende laser op het monster wordt veroorzaakt, tot een minimum te beperken. Voorbeeldige puntvormige verbranding wordt weergegeven in figuur 4B. Meet het nominale vermogen met behulp van een digitale draagbare vermogensmeter die is aangesloten op een fotodiodevermogenssensor die zich bij de ingang van de behuizing van de microscoop bevindt.
    NOTITIE: Biologische monsters kunnen gemakkelijk worden verbrand dankzij laserverlichting. In dit geval bleek het vermogensbereik van 100 -900 μW (bij het brandpunt van de objectieflens) een uitstekende afweging te zijn tussen de stabiliteit van het monster en intense emissie.
12. Test vóór de monstermeting de kwaliteit van de uitlijning van de optica met een isotroop referentiemonster (bijv. fluoresceïne belichaamd in het amorfe polymeer). Om de kalibratiecontrole uit te voeren, volgt u de procedure beschreven in rubriek 3 met behulp van een isotrope referentie in plaats van een amyloïdmonster.
    OPMERKING: In de veronderstelling dat de microscopie-opstelling ideaal is aangepast voor het monster met isotrope eigenschappen, moeten beide 2P-emissiecomponenten (I_X en I_Y) die met twee APD's worden gedetecteerd, worden gekenmerkt door dezelfde intensiteit (Figuur 4C).

3. Meting van de runderinsuline sferulieten

OPMERKING: Om alle beschreven ps-2PF-metingen uit te voeren, werd handgeschreven software gebruikt, die de posities van de piëzo-elektrische trap en de halve golfplaat regelt en het signaal van beide fotodiodes verzamelt, waardoor de XY-scans (rasterscans) van geselecteerde gebieden op microscoopglaasjes kunnen worden uitgezet, evenals polaire grafieken van specifieke monstercoördinaten. Er zijn ook aanvullende opmerkingen aan het protocol toegevoegd, waardoor gebruikers de meting zonder protocol kunnen uitvoeren, aangezien zowel de piëzo-trap als de rotatietrap die wordt gebruikt om de halfgolfplaat te roteren, kunnen worden bestuurd met hun eigen controllers of bijbehorende software. Toch wordt het sterk aanbevolen om een algoritme te schrijven dat de rotatiehoek van een halfgolfplaat combineert met een intensiteit van 2PEF die met beide fotodiodes wordt verzameld, aangezien deze correlatie (polaire grafieken) cruciaal is voor een goede data-analyse die resulteert in structurele informatie.

1. Monteer het preparaat met de sferulieten op de piëzo-elektrische tafel (immobiliseer het glasplaatje met tape). Zorg ervoor dat u het zo monteert dat een dunne glazen zijde (dekglaasje) naar het objectief is gericht, aangezien hoge numerieke objectieven worden gekenmerkt door relatief korte werkafstanden.
   OPMERKING: Aangezien onderdompeling in olie wordt gebruikt, moet een kleine druppel minerale olie op het objectief worden aangebracht voordat het monster wordt gemonteerd en scherpgesteld.
2. Door de XY- en Z-posities te veranderen met behulp van microscoopknoppen, richt u het objectief op een van de sferulieten in de oplossing, maar houd er rekening mee dat, omdat sferuliet diameters meestal in het bereik van tientallen μm liggen, u zich concentreert binnen het centrale gebied van de hele structuur. Zoek naar zwarte en witte halo's rond de specifieke sferuliet als tekenen van respectievelijk onder- en bovenfocus. Pas de "Z"-as aan zodat deze tussen deze uitersten ligt.
   OPMERKING: Het is belangrijk om een geïsoleerd monster te vinden zonder structurele defecten. Extreem kleine sferulieten kunnen afdrijven als gevolg van de materiaalspanning die door het objectief wordt veroorzaakt, terwijl de grootste structuren waarschijnlijk geaggregeerd of sterk vervormd zijn.
3. Centreer de sferuliet in het gezichtsveld van het waargenomen microscopische vlak en bepaal de grootte van de XY-scan door te kijken hoeveel piëzofasestappen in X- en Y-richtingen (weergegeven op de piëzostage-controller of in de software) nodig zijn om het gebied van de hele structuur te bestrijken.
   NOTITIE: Het wordt aanbevolen om het systeem zo in te stellen dat het begin van de XY-scan zich in de buurt van een van de hoeken van de sferuliet bevindt en samenvalt met de nulpositie van de tafel (X en Y = 0)
4. Pas de volgende scanparameters aan:
   1. Pas de polarisatie van de excitatiestraal aan en draai de halfgolfplaat om de polarisatie te verkrijgen die overeenkomt met de "X"- en "Y"-assen van het microscoopmonstervlak.
      OPMERKING: Dit kan worden gedaan door de polaire grafieken van isotroop fluorescerend medium zoals fluoresceïne te meten. Voor dergelijke materialen is de maximale fluorescentie-intensiteit parallel aan de polarisatie van de excitatiestraal; dus het roteren van de halfgolfplaat past de polarisatie aan met de X- en Y-as op het waarnemingsvlak, ook aangeduid als X- en Y-as op polaire grafieken zoals in figuur 4C. Volledige polaire grafieken kunnen worden gemeten door de gemeten 2PEF-intensiteit op beide fotodiodes te verzamelen voor 180° rotatie van de halfgolfplaat (360° rotatie van excitatielichtpolarisatie) en de intensiteit te correleren met de polarisatiehoek van het excitatielicht. Het kan handmatig worden gedaan, door de emissie-intensiteit voor elke halve golfplaathoek afzonderlijk te meten en deze vervolgens samen te voegen tot een polaire grafiek in data-analysesoftware of automatisch, met behulp van speciale of zelfgeschreven software.
   2. Pas de piëzostage-parameters aan: scansnelheid, stap en bereik om het gebied van de hele sferuliet te bestrijken.
      OPMERKING: Het scanbereik moet groter zijn dan de diameter van de sferuliet om de gehele bovenbouw volledig in te kaderen binnen de rasterscan. Lage scansnelheid en stap stellen gebruikers in staat om afbeeldingen van hoge kwaliteit te verkrijgen; Dit kan echter leiden tot verbranding van het monster. Daarom is een afweging afhankelijk van de grootte van de sferuliet noodzakelijk. Deze parameters kunnen niet universeel worden toegepast. Voorbeelden van parameters die in figuur 5A worden gebruikt: scanbereik 45 x 45 μm, scanstap 1 μm en scansnelheid 2 μm/s.
5. Open de sluiter, zet de fotodiodes aan en verzamel en 2P-emissiecomponenten voor elke stap van het geselecteerde scangebied - voor de excitatiestraal die overeenkomstig is gepolariseerd met de X- en vervolgens de Y-as. Voorbeeldige twee-foton geëxciteerde autofluorescentie (2PAF) rasterscans van insulinesferulieten worden weergegeven in figuur 5A.
   OPMERKING: Het meten van rasterscans vereist het correleren van piëzofase-coördinaten met en verzamelde emissiecomponenten, wat handmatig kan worden gedaan door de intensiteit op elk afzonderlijk punt van het geselecteerde gebied te meten en deze vervolgens samen te voegen tot een 2D-matrix, of automatisch, via zelfgeschreven software. Rasterscans kunnen worden gepresenteerd als een optelsom van de intensiteit van de emissiecomponenten of als onderscheidend voor een specifieke emissiecomponent. Omdat ze sterk structuurafhankelijk zijn, zijn structurele vervormingen in sferulieten gemakkelijk zichtbaar. Door de beweging van de microscooptafel kunnen sommige monsters echter buiten het gezichtsveld afdrijven. Daarom moeten afbeeldingen worden gescreend op artefacten. Het is noodzakelijk om de positie van de sferuliet voor en na de scan te controleren.
6. Om een volledige polarisatieanalyse uit te voeren vanaf de specifieke plek op het monster, schakelt u de excitatiestraal uit.
7. Kies vervolgens specifieke coördinaten van piëzostage die overeenkomen met de gekozen locatie op de sferuliet waar de informatie over de oriëntatie van moleculen vereist is met de sub-μm-resolutie.
8. Pas de piëzo-elektrische tafel aan om het gezichtsveld te centreren op aangegeven (X, Y).
9. Schakel de excitatiestraal in en voer een volledige (360°) polarisatieanalyse van en emissie uit door de rotatie van de halfgolfplaat (180° rotatie) in te schakelen. Presenteer 2PF Ix- en Iy-componenten in de vorm van een polaire grafiek (zoals weergegeven in figuur 5B).
   OPMERKING: Deze stap kan op verschillende plaatsen in de steekproef worden herhaald om voldoende gegevens te verzamelen.

4. Bepaling van de lokale fibrilordening in de runderinsuline sferulieten

OPMERKING: Alle numerieke berekeningen die verband houden met de data-analyse zijn uitgevoerd met behulp van de programmeertaal Python en gebaseerd op de functies die beschikbaar zijn in de bibliotheken NumPy en SciPy. Voor het plotten van de gegevens is de Matplotlib-bibliotheek vereist. Alle berekeningen zijn gebaseerd op formules die in ondersteunende informatie worden gepresenteerd in een van de artikelen van Obstarczyk et ^al.6.

1. Simulatie van de intensiteit van twee-fotonfluorescentie geëxciteerd voor de gespecificeerde verdeling van moleculen met een geselecteerde richting van de polarisatie van het invallende licht (aangeduid met α)
   OPMERKING: De gepresenteerde formules zijn gebaseerd op de aanname van parallelle absorptie- en emissiedipoolmomenten van een fluorofoor. Voor een bespreking van andere gevallen (bijv. verschillende richtingen van de absorptie- en emissiedipoolmomenten, energieoverdracht tussen de fluoroforen), zie het artikel van Le Floc'h et al⁸.
   1. Zoek de parameters die verantwoordelijk zijn voor de variatie van het elektrische veld door polarisatiemenging en depolarisatie-effecten veroorzaakt door de dichroïsche spiegel die in een opstelling is gemonteerd:
      1. γ vertegenwoordigt de amplitudefactor tussen de reflectiviteit van en gepolariseerd licht van een dichroïsche spiegel.
      2. δ staat voor de faseverschuiving (ellipticiteit) tussen en gepolariseerd licht.
         OPMERKING: Het correct definiëren van deze twee parameters is cruciaal voor een succesvolle structurele karakterisering vanwege hun sterke invloed op de vorm van gemeten polaire grafieken^11,18. In het geval van het gepresenteerde systeem werden beide parameters bepaald tijdens ellipsometriemetingen van een dichroïsche spiegel die in een systeem werd toegepast.
   2. Bereken de invallende elektrische veldvectoren die zich voortplanten in de X- en Y-as van elke hoek gemeten tijdens de ps-TPFM-meting met behulp van vergelijkingen (1-5).
      (1)
      (2)
      (3)
      (4)
      (5)
      OPMERKING Als de intensiteit met stap 1° over de hele 360° wordt gemeten, bereken dan de elektrische veldvectoren voor alle 360°. Alle hoeken moeten in radialen zijn. ρ parameter is verbonden met de optische frequentie ω van het gesimuleerde elektrische veld (ρ=ω·t) en geïntegreerd gebruikt van 0 tot 2π tijdens de berekeningen van de invallende elektrische veldvectoren die zich voortplanten in de X- en Y-as voor elke hoek α gemeten tijdens de ps-TPFM-meting.
   3. Definieer de functies voor overgangsdipoolmomenten in richtingen van drie assen van een cartesisch systeem volgens vergelijkingen (6-8):
      (6)
      (7)
      (8)
      OPMERKING: φ is de oriëntatiehoek van de lange as van amyloïde fibrillen in het XY-monsterframe. θ- en φ-hoeken zijn de polaire en azimutale hoeken die worden gebruikt om de oriëntatie van het overgangsdipoolmoment van een fluorofoor te definiëren.
   4. Gebruik de in stap 4.1.3 gedefinieerde functies. om functies te definiëren voor J_x (Φ,θ,φ) en J_Y(Φ,θ,φ), die verantwoordelijk zijn voor de bijdrage van focussering bij strak licht met een hoog numeriek apertuurobjectief aan de fluorescentiepolarisatiedetectie in X- en Y-richting met behulp van vergelijkingen (9, 10).
      (9)
      (10)
      OPMERKING: K₁, K₂, K₃ factoren zijn gerelateerd aan het microscoopobjectief dat wordt gebruikt tijdens de ps-TPFM-meting. In deze experimenten werd een apochromatisch olie-immersieobjectief van 100x/1.4 NA gebruikt en de factoren K₁, K₂, K₃ waren respectievelijk 2.945, 0.069 en 1.016.
   5. Definieer een functie voor f(Ω), een moleculaire hoekverdeling, afhankelijk van de halve opening van een fluorofoorkegel Ψ, met een variabele dikte ΔΨ; Gebruik vergelijking (11). De grafische weergave van alle drie de hoeken met betrekking tot amyloïdfibril is weergegeven in figuur 6.
      (11)
      OPMERKING: Wees voorzichtig bij het schrijven van de exponent - de macht van 2 werkt op het functieargument, niet op de hele functie!
   6. Definieer alle f_{WWIJKL-factoren} zoals weergegeven in vergelijkingen (12-21).
      (12)
      (13)
      (14)
      (15)
      (16)
      (17)
      (18)
      (19)
      (20)
      (21)
   7. Bereken de intensiteit van de geëxciteerde fluorescentie van twee fotonen en voor elke gemeten hoek (op dezelfde manier als in punt 4.1.2) met behulp van vergelijkingen (22, 23).
      = (22)
      = (23)
   8. Controleer of de simulatie correct werkt aan de hand van de volgende variabelewaarden (geplaatst in de legenda van Figuur 7) en vergelijk de verkregen resultaten met Figuur 7A-C.
      OPMERKING: Alle graden moeten in radialen worden geschreven.
2. Pas de gesimuleerde intensiteiten aan in de intensiteit van twee-foton-geëxciteerde autofluorescentie van runderinsulinesferulieten verzameld tijdens ps-2PFM-metingen.
   OPMERKING: Het oplossen van de sferulaatstructuur op basis van ps-2PFM-metingen vereist het gebruik van de vergelijkingen die in het protocol zijn geschreven om de theoretische intensiteit van twee-foton geëxciteerde fluorescentie te simuleren en alle parameters te passen die verband houden met de bestelling van moleculaire fluorofoor. Het vereist meerdere iteraties over de verschillende waarden van Φ, een hoek die de rotatie van de fibril in het XY-microscoopmonster beschrijft, en ΔΨ, aberraties van de conische verdeling van de emissiedipool Ψ als gevolg van de moleculaire rotaties in filamenten voor vaste Ψ tot het bereiken van de hoogst mogelijke R 2-coëfficiënt tussen genormaliseerde intensiteit van het door twee fotonen geëxciteerde fluorescentiesignaal verzameld tijdens de meting en genormaliseerde intensiteiten gesimuleerd volgens Stap 4.1 van het protocol.
   1. Bepaal de halve hoek Ψ .
      OPMERKING: Voor runderinsuline sferulieten moet deze gelijk zijn aan Ψ = 29°⁶.
   2. Passende workflow:
      1. Kies de waarde van Φ van 0° tot 180° (in figuur 8A en 8B Φ = respectievelijk 16° en 127°).
      2. Kies de waarde van ΔΨ van 0° tot 90° (in figuur 8A,B, ΔΨ = respectievelijk 24° en 1°).
      3. Bereken (vergelijking 22) en (vergelijking 23) voor het gehele gemeten bereik van θ-hoeken met behulp van de gekozen waarden van Φ en ΔΨ.
      4. Vergelijk de intensiteiten die tijdens simulaties zijn berekend (beide genormaliseerd tot de maximale waarde van
      5. Bereken ) met genormaliseerde intensiteiten van
      6. Bereken en (beide genormaliseerd naar de maximale waarde van ) gemeten tijdens ps-2PFM-meting.
         OPMERKING: In de gepresenteerde experimenten werden de Pearson-correlatiecoëfficiënten voor product-momenten berekend met behulp van de functie "corrcoef" uit de NumPy Python-bibliotheek.
   3. Kies uiteindelijk de waarden van Φ en ΔΨ die leiden tot de hoogste correlatiecoëfficiënten en convergentie tussen de gesimuleerde intensiteiten en het gemeten signaal, vergelijkbaar met wat wordt weergegeven in figuur 8.

Resultaten

Het gepresenteerde protocol biedt stapsgewijze begeleiding bij de voorbereiding van amyloïde superstructuren voor testen met ps-2PFM, de constructie van het microscopische systeem en metingen van het juiste monster. Vóór de laatste reeks metingen is het echter van vitaal belang om de APD's goed uit te lijnen met een isotrope referentie, wat zou moeten resulteren in het verzamelen van een symmetrisch signaal van vergelijkbare vorm en intensiteit op beide detectoren (Figuur 4C). Zelfs minimale...

Discussie

Polarisatiegevoelige twee-fotonmicroscopie is een waardevol hulpmiddel voor het bestuderen van de lokale ordening van fibrillen in de amyloïde superstructuren, waarvoor slechts kleine aanpassingen van de standaard multifotonenopstelling nodig zijn. Omdat het werkt op niet-lineaire optische verschijnselen, kunnen verminderde hoekfotoselectie en verbeterde axiale resolutie worden bereikt in vergelijking met één-foton geëxciteerde fluorescentiemicroscopiemethoden. Bovendien leidt het tot een lagere lichtverstrooiing, lagere...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
Steekproefvoorbereiding
Dekvlakken, 24 x 24 mm	Chemland	04-298.202.04
DPX-montant voor histologie	Sigma-Aldrich	6522	Diamantmontant
Eppendorf Safe-Lock buisjes, 1,5 mL, polypropyleen	Chemland	02-63102
Eppendorf ThermoMixer C	Eppendorf		Gebruikt voor sferuliet incubatie
HLP 5UV Waterzuiveringssysteem	Hydrolab		Bron van gedistilleerd water gebruikt in steekproefvoorbereiding
Zoutzuur (≥37%, APHA ≤10),	Sigma-Aldrich	30721-M
Insulinepoeder uit de pancreas van runderen (≥25 eenheden/mg (HPLC))	Sigma-Aldrich	I5500
Methanol (HPLC-kwaliteit)	Sigma-Aldrich	270474
Microscoopglaasjes met een concaaf, 76 x 26 x 1 mm	Chemland	04-296.202.09
Olympus BX60	Olympus		Gepolariseerd optisch microscoop gebruikt in figuur 2
PTFE draadverbindingstape, 12 mm x 12 mm x 0,1 mm, 60 gm2	Chemland	VIT131097
Microscoop ps-2PFM-opstelling
Chameleon Ultra II	Coherent
FELH0800 - Ø25,0 mm Longpass Filter	Thorlabs
FESH0700 - Ø25,0 mm Shortpass Filter	Thorlabs
IDQ100 foton-telling avalanchediodes	ID Quantique
Multifoton kort-pass emissiefilter 720 nm	Semrock
Gemonteerde achromatische Half-Wave Plate, 690-1200 nm	Thorlabs
Nikon Plan Apo Oil Immersion 100x/1.4 NA	Nikon
piezo 3D-trap	Piezosystem Jena
Polariserende straalsplitser	Thorlabs
S130C - Slimme Fotodiode Vermogenssensor, Si, 400 - 1100 nm, 500 mW	Thorlabs
Software
LabView 2018	National Instruments		Versie 18.0.1f2
Matplotlib-bibliotheek			Versie 3.3.2
NumPy-bibliotheek			Versie 1.19.2
SciPy-bibliotheek			Versie 1.5.2
Spyder Python 3 IDE			Versie 4.1.5