Hier presenteren we een protocol voor een geautomatiseerd celkweeksysteem. Dit geautomatiseerde kweeksysteem vermindert arbeid en komt ten goede aan de gebruikers, waaronder onderzoekers die niet bekend zijn met het hanteren van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS), van het onderhoud van iPS-cellen tot differentiatie in verschillende soorten cellen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Een geautomatiseerd kweeksysteem voor het onderhouden en differentiëren van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's) met een oneindig zelfprolifererend vermogen wordt verwacht dat ze toepassingen hebben op tal van gebieden, waaronder de opheldering van zeldzame ziektepathologieën, de ontwikkeling van nieuwe geneesmiddelen en regeneratieve geneeskunde die gericht is op het herstellen van beschadigde organen. Desondanks is de maatschappelijke implementatie van hiPSC's nog steeds beperkt. Dit is deels te wijten aan de moeilijkheid om differentiatie in cultuur te reproduceren, zelfs met geavanceerde kennis en geavanceerde technische vaardigheden, vanwege de hoge gevoeligheid van iPSC's voor minieme veranderingen in de omgeving. De toepassing van een geautomatiseerd kweeksysteem kan dit probleem oplossen. Experimenten met een hoge reproduceerbaarheid, onafhankelijk van de vaardigheden van een onderzoeker, kunnen worden verwacht volgens een gedeelde procedure tussen verschillende instituten. Hoewel er eerder verschillende geautomatiseerde kweeksystemen zijn ontwikkeld die iPSC-culturen kunnen handhaven en differentiatie kunnen induceren, zijn deze systemen zwaar, groot en kostbaar omdat ze gebruik maken van gehumaniseerde, meervoudig gearticuleerde robotarmen. Om de bovenstaande problemen te verbeteren, hebben we een nieuw systeem ontwikkeld met behulp van een eenvoudig x-y-z as schuifrailsysteem, waardoor het compacter, lichter en goedkoper kan zijn. Bovendien kan de gebruiker in het nieuwe systeem eenvoudig parameters wijzigen om nieuwe afhandelingstaken te ontwikkelen. Zodra een taak is vastgesteld, hoeft de gebruiker alleen nog maar de iPSC voor te bereiden, de reagentia en verbruiksartikelen die nodig zijn voor de gewenste taak van tevoren te leveren, het taaknummer te selecteren en de tijd op te geven. We bevestigden dat het systeem iPSC's in een ongedifferentieerde toestand kon houden door verschillende passages zonder voedingscellen en differentiëren in verschillende celtypen, waaronder cardiomyocyten, hepatocyten, neurale voorlopercellen en keratinocyten. Het systeem zal zeer reproduceerbare experimenten tussen instellingen mogelijk maken zonder dat er geschoolde onderzoekers nodig zijn, en zal de sociale implementatie van hiPSC's in een breder scala van onderzoeksgebieden vergemakkelijken door de belemmeringen voor nieuwe inzendingen te verminderen.
Inleiding
Dit artikel heeft tot doel actuele en gedetailleerde behandelingsprocedures te bieden voor een geautomatiseerd kweeksysteem voor door mensen geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC), dat we hebben geproduceerd in samenwerking met een bedrijf, en om representatieve resultaten te laten zien.
Sinds de publicatie van het artikel in 2007 trekt iPSC wereldwijd de aandacht1. Vanwege de grootste eigenschap dat het in staat is om te differentiëren in elk type somatische cel, wordt verwacht dat het zal worden toegepast op verschillende gebieden, zoals regeneratieve geneeskunde, het ophelderen van de oorzaken van hardnekkige ziekten en het ontwikkelen van nieuwe therapeutische geneesmiddelen 2,3. Bovendien zou het gebruik van menselijke iPSC-afgeleide somatische cellen dierproeven kunnen verminderen, die onderworpen zijn aan aanzienlijke ethische beperkingen. Hoewel er voortdurend tal van homogene iPSC's nodig zijn om nieuwe methoden met iPSC's te onderzoeken, is het te omslachtig om ze te beheren. Bovendien is het hanteren van iPSC moeilijk vanwege de hoge gevoeligheid, zelfs voor subtiele culturele en omgevingsveranderingen.
Om dit probleem op te lossen, wordt van geautomatiseerde kweeksystemen verwacht dat ze taken uitvoeren in plaats van mensen. Sommige groepen hebben een paar geautomatiseerde menselijke pluripotente stamcelkweeksystemen ontwikkeld voor celonderhoud en -differentiatie en hun prestaties gepubliceerd 4,5,6. Deze systemen zijn uitgerust met multi-gelede robotarm(en). Robotarmen hebben niet alleen de verdienste dat ze menselijke armbewegingen sterk nabootsen, maar ook omdat ze hogere kosten voor de arm(en), grotere en zwaardere systeemverpakkingen en tijdrovende onderwijsinspanningen van de ingenieurs vereisen om de beoogde bewegingente verkrijgen 7,8. Om het gemakkelijker te maken om het apparaat te introduceren in meer onderzoeksfaciliteiten op de punten van economisch, ruimte- en personeelsverbruik, hebben we een nieuw geautomatiseerd kweeksysteem ontwikkeld voor het onderhoud en de differentiatie van iPSC in verschillende celtypen9.
Onze reden voor het nieuwe systeem was om een X-Y-Z-asrailsysteem te gebruiken in plaats van meervoudig gelede robotarmen9. Om de complexe handachtige functies van robotarmen te vervangen, hebben we een nieuw idee toegepast op dit systeem, dat automatisch drie soorten specifieke functionele armuiteinden kan veranderen. Hier geven we ook aan hoe gebruikers gemakkelijk taakschema's kunnen maken met eenvoudige bestellingen op software vanwege het ontbreken van vereisten voor de bijdragen van ingenieurs gedurende het hele proces.
Een van de robotkweeksystemen heeft het maken van embryoïde lichamen gedemonstreerd met behulp van platen met 96 putjes als 3D-celaggregaten voor differentiatie4. Het hier gerapporteerde systeem kan geen platen met 96 putjes verwerken. Men bereikte de huidige good manufacturing practice (cGMP)-graad met behulp van een cellijn, hoewel het geen menselijke pluripotente stamcel was5. Het hier beschreven geautomatiseerde kweeksysteem is nu ontwikkeld met het specifieke doel om laboratoriumexperimenten te ondersteunen (figuur 1). Het heeft echter voldoende systemen om een schoon niveau te behouden dat gelijk is aan een veiligheidskast van niveau IV.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De ethische commissie van de Kansai Medical University keurde de generatie en het gebruik goed van de gezonde, van vrijwilligers afgeleide iPSC's genaamd KMUR001 (goedkeuring nr. 2020197). De donor, die openlijk werd gerekruteerd, gaf formele geïnformeerde toestemming en stemde in met het wetenschappelijke gebruik van de cellen.
OPMERKING: De huidige interface (de speciale software met de naam "ccssHMI" die draait onder het Windows XP-besturingssysteem) is het fundamentele bedieningsscherm. Onder de bovengenoemde interface is een reeks tabbladen gerangschikt, waardoor gebruikers verschillende bewerkingen kunnen starten.
1. Laden
- Klik op de knop Laden op het bovenste scherm van de software. Klik op de knop Voorbereiding laden Start .
- Plaats de schaal(en) of bord(en) die in het apparaat moeten worden geplaatst in het apparaat.
NOTITIE: De nodige informatie voor de identificatie van het gerecht moet op elk deksel worden geschreven. - Sluit de voorste schuifruit handmatig en druk op de mechanische veiligheidsbevestigingsknop.
- Selecteer het type en de hoeveelheid gerecht(en) of bord(en) in de software.
- Klik op de knop Voorbereiding laden voltooid . Klik op de knop Start laden .
- Nadat een schotel in het systeem is geüpload, selecteert u de informatie op de schotel, zoals met iPS-cellen of zonder iPS-cellen, in de software. Registreer notities over elk gerecht in de software.
- Klik op de knop Registratie aan het einde om het laden te voltooien.
2. Lossen
- Klik op de knop Verwijderen op het bovenste scherm van de software. Selecteer de schotel(s) die u wilt verwijderen in de software.
- Nadat u de schotel(s) hebt geselecteerd, klikt u op de knop Voorbereiding van het lossen Start . Klik op de knop Start lossen van het lossen .
- Nadat de schaal(en) van de broedmachine naar de werkbank in het systeem zijn overgebracht, drukt u op de knop Schotel verwijderen .
- Open handmatig het schuifraam aan de voorkant en haal de schaal(en) eruit. Sluit de voorste schuifruit handmatig en druk op de mechanische veiligheidsbevestigingsknop.
3. Aanvulling van verbruiksartikelen: pipetten, buisjes en medium
- Om verbruiksartikelen zoals pipetten, buisjes en medium bij te vullen, klikt u op de knop Verbruiksartikelen op het bovenste scherm van de software en selecteert u vervolgens het item dat moet worden bijgevuld.
- Pipettes
- Klik op de knop Pipet. Selecteer de knop Aanvullen.
- Selecteer een rek dat de gebruiker in de software wil aanvullen. Klik op de knop Start aanvullen .
- Nadat u hebt gecontroleerd of het deksel van de pipetopslag op de werkbank is geopend, opent u handmatig het schuifvenster aan de voorkant en vult u de pipetten indien nodig bij.
- Sluit de voorste schuifruit handmatig en druk op de mechanische veiligheidsbevestigingsknop. Klik op de knop Voltooid aanvullen .
- Klik op de knop Aanvulling instellen en voer de informatie voor de aanvulling in en klik vervolgens op de knop Registratie .
- Klik op de knop Voltooid aanvullen .
- Buizen
- Klik op de knop Tube. Selecteer de knop Aanvullen.
- Selecteer een rek dat de gebruiker in de software wil aanvullen. Klik op de knop Start aanvullen .
- Nadat u hebt bevestigd dat het rek naar boven is verplaatst, klikt u op de knop Tube aanvullen .
- Open handmatig het schuifraam aan de voorkant en vul de buizen indien nodig bij.
- Sluit de voorste schuifruit handmatig en druk op de mechanische veiligheidsbevestigingsknop.
- Klik op de knop Voltooid aanvullen .
- Klik op de knop Aanvulling instellen en voer de informatie voor de aanvulling in en klik vervolgens op de knop Registratie . Klik op de knop Sluiten .
- Gemiddeld
- Klik op de knop Gemiddeld . Selecteer de knop Aanvullen in de software.
- Selecteer een rek uit drie rekken die gebruikers willen aanvullen. Klik op de knop Start aanvullen .
- Nadat u hebt gecontroleerd of het deksel van de mediumopslagruimte is geopend, opent u handmatig het schuifvenster aan de voorkant en vult u het medium bij.
- Sluit de voorste schuifruit handmatig en druk op de mechanische veiligheidsbevestigingsknop.
- Klik op de knop Voltooid aanvullen .
- Klik op de knop Aanvullen en voer de informatie voor het medium in, inclusief de naam en de hoeveelheid van het medium. Voer indien nodig aanvullende opmerkingen in.
- Klik op de knop Registratie .
- Klik op de knop Sluiten .
- Pipettes
4. Taak selectie
- Klik op de knop Taak op het bovenste scherm van de software.
- Selecteer de knop Taakinstelling . Selecteer de gewenste taak in de takenlijst en klik op de knop Volgende stap .
- Geef de datum en tijd op om de taak uit te voeren en klik vervolgens op de knop Registratie . Selecteer een gerecht of bord om de taak uit te voeren en klik vervolgens op de knop Registratie .
- Nadat u de geselecteerde taak opnieuw hebt bevestigd, klikt u op de knop Registratie . Bevestig op het volgende scherm dat de taak is geregistreerd.
- Stel indien nodig de volgende taak op dezelfde manier in.
- Klik op de Start-knop aan het einde. Vervolgens start de taak automatisch op de opgegeven datum en tijd.
NOTITIE: Onmiddellijk na het voltooien van elke taak gaan UV-lampen (die zich aan twee zijden van de kap bevinden) automatisch aan en na 5-30 minuten, in overeenstemming met de hulpinstelling, worden ze uitgeschakeld om de kap in aseptische toestand te houden. Om te stoppen, kunnen gebruikers op de knop Start klikken. - Als gebruikers een geplande taak van tevoren willen annuleren, klikt u op de knop Stoppen .
- Nadat u de taak hebt geselecteerd die u wilt afbreken, klikt u op de knop Taak bewerken .
- Klik op de knop Taak annuleren . Bevestig op het volgende scherm dat de taak is verwijderd.
5. Controleer mobiele afbeeldingen
- Elke taak omvat microscopische observaties (foto's maken) voor en na het taakwerk. Observeer de voortgang van celkweek fotografisch door voor of na elke taak een microscopische fotografietaak op te nemen.
- Selecteer vooraf ingestelde taakprogramma's, waaronder het vooraf selecteren van meerdere specifieke locaties van de schotel of de putplaat voor observatie op een vast punt om dezelfde locatie in de loop van de tijd te bewaken.
6. Passeren en differentiatie
- Volg de stappen in secties 1-5 en stel het geautomatiseerde celkweeksysteem in om passaging en differentiatie uit te voeren. De instrumentinstellingen voor passaging, cardiomyocytendifferentiatie, hepatocytendifferentiatie, neurale voorloperceldifferentiatie en keratinocytendifferentiatie worden weergegeven in respectievelijk tabel 1, tabel 2, tabel 3, tabel 4 en tabel 5.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Onderhoud van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen
We gebruikten drie hPSC-lijnen (RIKEN-2F, 253G1 en KMUR001). We hebben het onderhoudsprotocol geoptimaliseerd door middel van dagelijks handmatig uitgevoerde experimenten en de gedetailleerde programma's verder geoptimaliseerd door de zeven voorbereidende experimenten die door het systeem zijn uitgevoerd. Schuifspanningen die worden veroorzaakt door de vloeistofsnelheden van de spuugstroom van verschillende pipetten die door mensen worden...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Een cruciale stap in het protocol is dat als een gebruiker fouten vindt, u op elk gewenst moment op de knop annuleren, stoppen of resetten klikt en opnieuw begint vanaf de eerste stap. De software kan menselijke fouten voorkomen, waaronder dubbele boekingen, het openen van deuren terwijl de systeemtaken actief zijn en een gebrek aan aanvulling. Een ander cruciaal punt voor succesvolle en efficiënte differentiatie naar de gewenste somatische cel is de juiste selectie van pluripotente stamcellijnen, omdat elke pluripotente...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteur heeft niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Deze studie werd ondersteund door een subsidie van het New Business Promotion Center, Panasonic Production Engineering Co., Ltd., Osaka, Japan.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
```html
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.15% bovine serum albumin fraction V | Fuji Film Wako Chemical Inc., Miyazaki, Japan | 9048-46-8 | |
| 1% GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| 10 cm plastic plates | Corning Inc., NY, United States | 430167 | |
| 253G1 | RKEN Bioresource Research Center | HPS0002 | |
| 2-mercaptoethanol | Thermo Fisher Scientific | 21985023 | |
| Actinin mouse | Abcam | ab9465 | |
| Activin A | Nacali Tesque | 18585-81 | |
| Adenine | Thermo Fisher Scientific | A14906.30 | |
| Albumin rabbit | Dako | A0001 | |
| All-trans retinoic acid | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 186-01114 | |
| Automated culture system | Panasonic | ||
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
| bFGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 062-06661 | |
| BMP4 | Thermo Fisher Scientific | PHC9531 | |
| Bovine serum albumin | Merck | 810037 | |
| CHIR-99021 | MCE, NJ, United States #HY-10182 | 252917-06-9 | |
| Defined Keratinocyte-SFM | Thermo Fisher Scientific | 10744019 | Human keratinocyte medium |
| Dexamethasone | Merck | 266785 | |
| Dihexa | TRC, Ontario, Canada | 13071-60-8 | rac-1,2-Dihexadecylglycerol |
| Disposable hemocytometer | CountessTM Cell Counting Chamber Slides, Thermo Fisher Scientific | C10228 | |
| Dorsomorphin | Thermo Fisher Scientific | 1219168-18-9 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium/F12 | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 12634010 | |
| EGF | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 053-07751 | |
| Essential 8 | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Human pluripotent stem cell medium |
| Fetal bovine serum | Biowest, FL, United States | S140T | |
| FGF-basic | Nacalai Tesque Inc. | 19155-07 | |
| Forskolin | Thermo Fisher Scientific | J63292.MF | |
| Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030081 | Glutamine supplement |
| Goat IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A11056 | |
| HNF-4A goat | Santacruz | 6556 | |
| Hydrocortisone | Thermo Fisher Scientific | A16292.06 | |
| Hydrocortisone 21-hemisuccinate | Merck | H2882 | |
| iMatrix511 Silk | Nippi Inc., Tokyo, Japan | 892 021 | Cell culture matrix |
| Insulin-transferrin-selenium | Thermo Fisher Scientific | 41400045 | |
| Keratin 1 mouse | Santacruz | 376224 | |
| Keratin 10 rabbit | BioLegend | 19054 | |
| KMUR001 | Kansai Medical University | Patient-derived iPSCs | |
| Knockout serum replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
| L-ascorbic acid 2-phosphate | A8960, Merck | A8960 | |
| Leibovitz’s L-15 medium | Fuji Film Wako Chemical Inc. | 128-06075 | |
| Matrigel | Corning Inc. | 354277 | |
| Mouse IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21202 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| Nestin mouse | Santacruz | 23927 | |
| Neurobasal medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Neurofilament rabbit | Chemicon | AB1987 | |
| Neutristem | Sartrius AG, Göttingen, Germany | 05-100-1A | cell culture medium |
| Oct 3/4 mouse | BD | 611202 | |
| PBS(-) | Nacalai Tesque Inc., Kyoto, Japan | 14249-24 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo488 | Thermo Scientific | A21206 | |
| Rabbit IgG(H+L) AlexaFluo546 | Thermo Scientific | A10040 | |
| Recombinant human albumin | A0237, Merck, Darmstadt, Germany | A9731 | |
| Rho kinase inhibitor, Y-27632 | Sellec Inc., Tokyo, Japan | 129830-38-2 | |
| RIKEN 2F | RKEN Bioresource Research Center | HPS0014 | undifferentiated hiPSCs |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific #11875 | 12633020 | |
| SB431542 | Thermo Fisher Scientific | 301836-41-9 | |
| Sodium L-ascorbate | Merck | A4034-100G | |
| SSEA-4 mouse | Millipore | MAB4304 | |
| StemFit AK02N | Ajinomoto, Tokyo, Japan | AK02 | cell culture medium |
| TnT rabbit | Abcam | ab92546 | |
| TRA 1-81 mouse | Millipore | MAB4381 | |
| Triiodothyronine | Thermo Fisher Scientific | H34068.06 | |
| TripLETM express enzyme | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States | 12604013 | |
| Trypan blue solution | Nacalai Tesque, Kyoto, Japan | 20577-34 | |
| Tryptose phosphate broth | Merck | T8782-500G | |
| Wnt-C59 | Bio-techne, NB, United Kingdom | 5148 | |
| β |
Referenties
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Tanaka, T., et al. In vitro pharmacologic testing using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications. 385 (4), 497-502 (2009).
- Egashira, T., et al. Disease characterization using LQTS-specific induced pluripotent stem cells. Cardiovascular Research. 95 (4), 419-429 (2012).
- Sasamata, M., et al. Establishment of a robust platform for induced pluripotent stem cell research using Maholo LabDroid. SLAS technology. 26 (5), 441-453 (2021).
- Tristan, C. A., et al. Robotic high-throughput biomanufacturing and functional differentiation of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 16 (12), 3076-3092 (2021).
- Konagaya, S., Ando, T., Yamauchi, T., Suemori, H., Iwata, H. Long-term maintenance of human induced pluripotent stem cells by automated cell culture system. Scientific Reports. 5, 16647(2015).
- McClymont, D. W., Freemont, P. S. With all due respect to Maholo, lab automation isn't anthropomorphic. Nature Biotechnology. 35 (4), 312-314 (2017).
- Gonzalez, F., Zalewski, J. Teaching joint-level robot programming with a new robotics software tool. Robotics. 6 (4), 41(2017).
- Bando, K., Yamashita, H., Tsumori, M., Minoura, H., Okumura, K., Hattori, F. Compact automated culture system for human induced pluripotent stem cell maintenance and differentiation. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 1074990(2022).
- Tohyama, S., et al. Glutamine oxidation is indispensable for survival of human pluripotent stem cells. Cell Metabolism. 23 (4), 663-674 (2016).
- Yamashita, H., Fukuda, K., Hattori, F. Hepatocyte-like cells derived from human pluripotent stem cells can be enriched by a combination of mitochondrial content and activated leukocyte cell adhesion molecule. JMA journal. 2 (2), 174-183 (2019).
- Shimojo, D., et al. Rapid, efficient and simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells. Molecular Brain. 8 (1), 79(2015).
- Nishimoto, R., Kodama, C., Yamashita, H., Hattori, F. Human induced pluripotent stem cell-derived keratinocyte-like cells for research on Protease-Activated Receptor 2 in nonhistaminergic cascades of atopic dermatitis. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 384 (2), 248-253 (2023).
- International Stem Cell Initiative. Screening ethnically diverse human embryonic stem cells identifies a chromosome 20 minimal amplicon conferring growth advantage. Nature Biotechnology. 29 (12), 1132-1144 (2011).
- Keller, A., et al. Genetic and epigenetic factors which modulate differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Human Reproduction Update. 24 (2), 162-175 (2018).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
