Hierin presenteren we een gedetailleerd protocol voor het isoleren en kweken van primaire cochleaire haarcellen van muizen. Aanvankelijk werd het orgaan van Corti onder een microscoop ontleed uit neonatale (3-5 dagen oud) muizenslakkenhuis. Vervolgens werden cellen enzymatisch verteerd tot een eencellige suspensie en geïdentificeerd met behulp van immunofluorescentie na enkele dagen in kweek.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Isolatie en kweek van primaire cochleaire haarcellen van neonatale muizen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Cochleaire haarcellen zijn de sensorische receptoren van het auditieve systeem. Deze cellen bevinden zich in het orgaan van Corti, het zintuig dat verantwoordelijk is voor het gehoor, in het botlabyrint van het binnenoor. Cochleaire haarcellen bestaan uit twee anatomisch en functioneel verschillende typen: buitenste en binnenste haarcellen. Schade aan een van beide leidt tot gehoorverlies. Met name omdat de binnenste haarcellen niet kunnen regenereren en de schade aan hen permanent is. Daarom is in vitro kweek van primaire haarcellen onmisbaar voor het onderzoeken van de beschermende of regeneratieve effecten van cochleaire haarcellen. Deze studie had tot doel een methode te ontdekken voor het isoleren en kweken van haarcellen van muizen.
Na handmatige verwijdering van de cochleaire zijwand werd het auditieve epitheel onder een microscoop minutieus uit de cochleaire modiolus ontleed, gedurende 10 minuten bij 37 °C geïncubeerd in een mengsel bestaande uit 0,25% trypsine-EDTA en voorzichtig gesuspendeerd in kweekmedium met behulp van een pipetpunt van 200 μl. De celsuspensie werd door een celfilter geleid, het filtraat werd gecentrifugeerd en de cellen werden gekweekt in platen met 24 putjes. Haarcellen werden geïdentificeerd op basis van hun vermogen om een mechanotransductiecomplex, myosine-VIIa, tot expressie te brengen, dat betrokken is bij motorische spanningen, en via selectieve labeling van F-actine met behulp van phalloidine. Cellen bereikten >90% samenvloeiing na 4 dagen in kweek. Deze methode kan ons begrip van de biologische kenmerken van in vitro gekweekte haarcellen vergroten en de efficiëntie van cochleaire haarcelculturen aantonen, waardoor een solide methodologische basis wordt gelegd voor verder auditief onderzoek.
Inleiding
Cochleaire haarcellen spelen een belangrijke rol bij de detectie van geluid en de signaaloverdracht naar de gehoorzenuw. Haarcellen zijn mechanistische cellen die functioneren als primaire sensorische receptoren en geluidstrillingen omzetten in elektrische signalen bij gewervelde dieren. Het sensorische epitheel van het binnenoor van zoogdieren bestaat uit een enkele rij binnenste haarcellen en drie rijen buitenste haarcellen. In verschillende basische membraangebieden nemen haarcellen geluiden waar op verschillende frequenties (tussen 20 en 2.000 Hz)1. De functie van buitenste haarcellen is een actief mechanisch versterkingsproces dat helpt bij het verfijnen van het binnenoor van zoogdieren, waardoor een hoge gevoeligheid voor geluid ontstaat. Interne haarcellen zijn verantwoordelijk voor het detecteren van geluiden. Na graduele depolarisatie wordt akoestische informatie via de gehoorzenuwvezels naar de hersenen verzonden2.
Gehoorverlies kan worden veroorzaakt door genetische defecten, veroudering, lawaaitrauma of overmatig gebruik van ototoxische geneesmiddelen, die wereldwijd een groot gezondheidsprobleem vormen 3,4. Gehoorverlies is voornamelijk het gevolg van onomkeerbare schade aan haarcellen5. Hoewel onderzoekers het eens zijn geworden over verschillende details van de etiologie ervan, ontbreekt het aan een alomvattend begrip van de talrijke onderliggende mechanismen, hoewel onderzoekers het eens zijn geworden over verschillende details van de etiologie. Buitenste haarcellen zijn bijzonder kwetsbaar voor akoestische overbelichting6. Mechanosensitieve cochleaire haarcellen zijn betrokken bij leeftijdsgebonden gehoorverlies; De moleculaire en cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de degeneratie van haarcellen blijven echter onbekend. Verschillende veranderingen in de moleculaire processen leiden tot veroudering van haarcellen, oxidatieve stress, reactie op DNA-schade, autofagie en ontregeling van de expressie en transcriptie van genen die verband houden met haarcelspecialisatie7.
Omdat het binnenoor is ingekapseld in het slaapbeen, diep in het hardste bot van het lichaam, is het experimenteel ontoegankelijk, wat een uitdaging vormt voor onderzoek naar de mechanismen van herstel en regeneratie van haarcellen. Daarom is het opzetten van in vitro culturen voor het onderzoeken van de functie van haarcellen een ideale methode geworden voor onderzoek naar de regeneratie- en letselmechanismen van het binnenoor. De procedures voor het bereiden van cochleaire organotypische culturen zijn beschreven in eerdere studies 8,9,10. Onderzoekers over de hele wereld hebben verschillende cochleaire microdissectie- en oppervlaktevoorbereidingstechnieken gebruikt. Ondanks de aanhoudende uitdagingen zijn verschillende primaire haarcelkweeksystemen met succes in vitro opgezet. Cochleaire orgaanculturen bevatten verschillende celtypen, waaronder haarcellen, Deiters-cellen, Hensen-cellen, pilaarcellen en gehoorzenuwvezels. Een diepgaand begrip van de veranderingen in haarcellen op cellulair en moleculair niveau na letsel zal de ontwikkeling van krachtigere onderzoeksinstrumenten mogelijk maken. Deze studie had tot doel de stappen aan te tonen voor het isoleren van cochleaire organen van neonatale muizen en het enzymatisch losmaken van de overvloedige haarcellen voor in vitro studies. De aard van de gekweekte cellen werd bevestigd met behulp van immunofluorescentiekleuring.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Alle dierproeven zijn goedgekeurd (nr. 2021-847) door de Xi'an Jiaotong University Committee on the Use and Care of Animals.
1. Sterilisatie en materiaalvoorbereiding
- Steriliseer de dissectie-instrumenten met stoomdesinfectie op hoge temperatuur en onder hoge druk en droog ze een nacht in een incubator van 50 °C.
- Bereid van tevoren 100 ml van het kweekmedium met 10% foetaal runderserum (FBS) en 10 mg/ml penicilline/streptomycine (voeg 10 ml FBS en 10 μl penicilline-bouillonoplossing toe aan 90 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (EMEM) en bewaar bij 4 °C.
2. Dissectie en verwijdering van het slaapbeen voor het verzamelen van auditieve epitheel
- Euthanaseer in totaal 10 pasgeboren muizen (tussen P3 en P5) door onthoofding op ijs. Gebruik indien nodig een alternatieve, ethisch goedgekeurde methodologie.
- Houd het hoofd op zijn plaats, open de hoofdhuid langs de sagittale hechting met behulp van een micro-operatieschaar en scheid en fixeer de hoofdhuid bilateraal met de vingers, zoals weergegeven in figuur 1A.
- Verwijder de hersenen met behulp van een kleine periostale lift en snijd de basale schedel in tweeën. Knip de schedel met een schaar en klap naar voren om de schedel te openen; Gebruik de punt van de schaar om de hersenen te schrapen en de basis van de schedel bloot te leggen.
- Observeer de bilaterale slaapbeenderen aan de basis van de schedel (Figuur 1C). Gebruik een schaar om de basis van de schedel langs de middellijn door te knippen, schraap de huid weg en verwijder onnodig bot (Figuur 1D,D').
- Bewaar de slaapbeenderen en breng ze over in steriele petrischalen van 35 mm met verse Hank's gebalanceerde zoutoplossing (HBSS) (Figuur 1E).
- Gebruik twee #5-puntige pincetten om de bulla en het omliggende weefsel uit het petrousachtige deel van het slaapbeen te verwijderen (Figuur 1E).
OPMERKING: In dit stadium zou het benige labyrint in het slaapbeen van de muizen niet volledig verkalkt zijn en gemakkelijk kunnen worden ontleed met een pincet. - Houd de tang met één hand vast om het halfronde deel van het slaapbeen vast te zetten en steek met de andere hand de onderste voet van de pincet in de ronde vensternis om het laterale bot van het slakkenhuis te scheiden van de vestibule van de scala. Verwijder voorzichtig het petroeuze deel van het slaapbeen zonder het OC-epitheel aan te raken. Scheid en verwijder vervolgens voorzichtig het benige labyrint van het slakkenhuis van het basale uiteinde tot het apicale uiteinde (Figuur 1F).
- Micro-isoleer het orgaan van het sensorische epitheel van Corti zorgvuldig van de modiolus met behulp van een #5-puntige pincet (Figuur 1G).
- Houd het spiraalvormige ligament vast, scheid het voorzichtig van de stria vascularis met een micro-operatietang en breng het schone auditieve epitheel over in een steriel kweekschaaltje van 3 mm met HBSS met behulp van een pipet van 200 μl (Figuur 1H).
- Verzamel 20 monsters van elk dier en breng ze snel over naar een steriele petrischaal van 100 mm met HBSS voor de volgende bereidingsstap (Figuur 1).
3. Enzymatische desaggregatie voor het verkrijgen van auditieve haarcellen
- Breng het auditieve epitheel over in 10 ml verse DMEM met 0,25% trypsine en incubeer gedurende 12 minuten bij 37 °C.
- Scheid met behulp van een pipetpunt van 200 μl de haarcellen voorzichtig van de basale lamina en andere cellen onder een operatiemicroscoop.
- Voeg nog eens 10 ml kweekmedium toe om de desaggregatie te remmen.
- Filtreer de zwevende cellen in het kweekmedium door een filter van 70 μm, vang het filtraat op in een schoon buisje van 50 ml en centrifugeer het gedurende 5 minuten bij 300 × g .
- Resuspendeer de haarcellen in ten minste 5 ml kweekmedium door ze voorzichtig op en neer te pipetteren met behulp van een pipetpunt van 1.000 μl. Vermijd het introduceren van bubbels.
- Plaats van tevoren een dekglaasje op de bodem van een bord met zes putjes. Tel de cellen en kweek ze met een dichtheid van 106 cellen/ml in platen met zes putjes.
- Kweek de aanhangende cellen in 2 ml DMEM (met 10% FBS, 100 eenheden/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine) bij 37 °C en 5% CO2. Verander het cultuurmedium elke dag.
OPMERKING: Er moet worden vermeld dat het gebruik van dit protocol niet resulteert in het verkrijgen van pure haarcellen. Op basis van deze primaire celkweekmethode raden we aan om d2- of d3-cellen te gebruiken voor verder onderzoek, aangezien haarcellen ongeveer 70% van de cellen in kweek kunnen uitmaken en in een goede staat kunnen verkeren.
4. Immunofluorescerende kleuring
- Oogst de gekweekte cellen van d1 tot d6 (één putje per dag). Zuig het kweekmedium op en spoel de cellen 2x met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Fixeer cellen met 4% paraformaldehyde gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur (RT).
- Verwijder het fixeermiddel en spoel de cellen gedurende 3 x 3 minuten met PBS.
- Permeabiliseer de cellen met PBS met 0,2% Triton X-100 gedurende 10 minuten bij RT.
- Incubeer de gepermeabiliseerde cellen met een blokkerende oplossing bestaande uit 10% FBS in PBS gedurende 20 minuten bij RT.
- Kleuring van de cellen met anti-myosine monoklonaal antilichaam (verdund bij 1:200 in PBS) bij 4 °C gedurende een nacht.
- Was de cellen 3x met steriel PBS en incubeer ze met secundair antilichaam (Alexa Fluor 594 geit anti-konijn MYO7A, verdund 1:500 in PBS) en fluoresceïne-gelabeld phalloidine (Alexa Fluor 488, om de celstructuur te identificeren) gedurende 2 uur bij RT.
- Spoel de cellen 3x met PBS om de secundaire antilichamen te verwijderen.
- Voeg 1-2 druppels montagemedium met DAPI toe aan de objectglaasjes, monteer de dekglaasjes en plaats ze onder een confocale laserscanmicroscoop om foto's van de cellen te maken.
5. Statistische analyse
- Voer een tweerichtingsvariantieanalyse (ANOVA) uit, gevolgd door Tukey's post-hoctests om de veranderingen in de grijze waarden van myosine-VIIa en falloidine in de loop van de tijd te analyseren. Gebruik de lettermarkeringsmethode om statistische verschillen te markeren.
- Voer aanvullende eenrichtings-ANOVA's uit, gevolgd door Tukey's post-hoctests om de phalloidine-positieve celverhouding tussen celmonsters van dag 1 tot dag 6 en de myosine-VII-positieve celverhouding op dezelfde dagen te vergelijken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Volgens dit protocol hebben we de geïsoleerde cellen gezaaid. Primaire cochleaire haarcelzaden werden als succesvol beschouwd als de cellen niet in het kweekmedium dreven en zich binnen 24 uur verspreidden. We bepaalden het aantal haarcellen nadat ze zich hadden gehecht en zich op de bodem van de schaal in platte aggregaten hadden verspreid. Na 1 dag werden levende haarcellen stevig aan de bodem van de kweekschaal gehecht en werden niet-klevende cellen verwijderd door te spoelen met PBS. Doorgaans verdubbelde het aantal ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Vergeleken met de HEI-OC1-cellijn repliceerden primaire culturen van haarcellen nauwkeuriger de fysiologische toestand van cellen in vivo. Daarom lijkt de auditieve primaire kweekmethode die is ontwikkeld door levende cellen uit cochleaire organen te isoleren en ze onmiddellijk te kweken, een waardevol hulpmiddel te zijn voor uitgebreid onderzoek naar auditieve systemen. Bepaalde technieken zijn cruciaal voor een succesvolle cultuur. Ten eerste vergroot het minimaliseren van de duur van de scheiding van het orgaan van Co...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (NFSC 82101224 aan YG)
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 100 mm BioLite cellcultuurschaal | Thermo Fisher Scientific | 130182 | gebruik voor cultuur |
| 35 mm Nunc cellcultuurschaal | Thermo Fisher Scientific | 150318 | gebruik voor cultuur |
| 6-well palate | Thermo Fisher Scientific | 310109005 | gebruik voor cultuur |
| 70 µm celstrainers | BD Company | 352350 | gebruik voor filter |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | immunofluorescente kleuring |
| Anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11008 | immunofluorescente kleuring |
| dag 3-5 neonatale muis | geleverd door Xi'an Jiaotong University | ||
| Dulbecco’s Gemodificeerd Eagle Medium | Thermo Fisher Scientific | 11965092 | gebruik voor cultuur |
| Fetaal bovien serum | Thermo Fisher Scientific | 12483020 | gebruik voor cultuur |
| Pincet | Dumont | 5# | gebruik voor dissectie |
| Leica anatomisch microscoop | Duitsland | S9i | gebruik voor dissectie |
| Penicilline/streptomycine | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | gebruik voor cultuur |
| Konijn polycloonaal voor Myosine VIIa | Abcam company | ab92996 | immunofluorescente kleuring |
| Schaar | Belevor | 10cm/04.0524.10 | gebruik voor dissectie |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | 9036-19-5 | immunofluorescente kleuring |
| Trypsine | Thermo Fisher Scientific | 25200072 | gebruik voor cultuur |
Referenties
- Tani, T., Koike-Tani, M., Tran, M. T., Shribak, M., Levic, S. Postnatal structural development of mammalian Basilar Membrane provides anatomical basis for the maturation of tonotopic maps and frequency tuning. Sci Rep. 11 (1), 7581(2021).
- Goutman, J. D., Elgoyhen, A. B., Gomez-Casati, M. E. Cochlear hair cells: The sound-sensing machines. FEBS Lett. 589 (22), 3354-3361 (2015).
- Joo, Y., et al. The Contribution of Ototoxic Medications to Hearing Loss Among Older Adults. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 75 (3), 561-566 (2020).
- Nieman, C. L., Oh, E. S. Hearing Loss. Ann Intern Med. 173 (11), ITC81-ITC96 (2020).
- Mao, H., Chen, Y. Noise-Induced Hearing Loss: Updates on Molecular Targets and Potential Interventions. Neural Plast. 2021, 4784385(2021).
- Morioka, S., et al. Hearing vulnerability after noise exposure in a mouse model of reactive oxygen species overproduction. J Neurochem. 146 (4), 459-473 (2018).
- Liu, H., et al. Molecular and cytological profiling of biological aging of mouse cochlear inner and outer hair cells. Cell Rep. 39 (2), 110665(2022).
- Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic Culture of Neonatal Murine Inner Ear Explants. Front Cell Neurosci. 13, 170(2019).
- Ding, D., et al. Cisplatin ototoxicity in rat cochlear organotypic cultures. Hear Res. 282 (1-2), 196-203 (2011).
- Abitbol, J., et al. Cisplatin-induced ototoxicity in organotypic cochlear cultures occurs independent of gap junctional intercellular communication. Cell Death Dis. 11 (5), 342(2020).
- Li, S., et al. Myosin-VIIa is expressed in multiple isoforms and essential for tensioning the hair cell mechanotransduction complex. Nat Commun. 11 (1), 2066(2020).
- Kalinec, G. M., Park, C., Thein, P., Kalinec, F. Working with auditory HEI-OC1 cells. J Vis Exp. (115), (2016).
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. J Vis Exp. (107), (2016).
- Xu, J., et al. Identification of mouse cochlear progenitors that develop hair and supporting cells in the organ of Corti. Nat Commun. 8, 15046(2017).
- Zheng, J., et al. Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells. Nature. 405 (6783), 149-155 (2000).
- Ruel, J., et al. Impairment of SLC17A8 encoding vesicular glutamate transporter-3, VGLUT3, underlies nonsyndromic deafness DFNA25 and inner hair cell dysfunction in null mice. Am J Hum Genet. 83 (2), 278-292 (2008).
- Seal, R. P., et al. Sensorineural deafness and seizures in mice lacking vesicular glutamate transporter 3. Neuron. 57 (2), 263-275 (2008).
- Luo, Z., et al. Three distinct Atoh1 enhancers cooperate for sound receptor hair cell development. Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (32), e2119850119(2022).
- Kalinec, G., Thein, P., Park, C., Kalinec, F. HEI-OC1 cells as a model for investigating drug cytotoxicity. Hear Res. 335, 105-117 (2016).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
