Dit protocol presenteert een uitgebreide en efficiënte methode voor het produceren van nierorganoïden uit geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) met behulp van suspensiekweekomstandigheden. De primaire nadruk van deze studie ligt op de bepaling van de initiële celdichtheid en de WNT-agonistconcentratie, wat ten goede komt aan onderzoekers die geïnteresseerd zijn in nierorganoïde-onderzoek.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Nierorganoïden genereren in suspensie van geïnduceerde pluripotente stamcellen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Nierorganoïden kunnen op verschillende manieren worden gegenereerd uit geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's). Deze organoïden zijn veelbelovend voor ziektemodellering, screening van geneesmiddelen en mogelijke therapeutische toepassingen. Dit artikel presenteert een stapsgewijze procedure om nierorganoïden te maken van iPSC's, beginnend bij de posterieure primitieve streep (PS) tot het intermediaire mesoderm (IM). De aanpak is gebaseerd op het APEL 2-medium, een gedefinieerd, dierlijk componentvrij medium. Het wordt aangevuld met een hoge concentratie WNT-agonist (CHIR99021) gedurende een duur van 4 dagen, gevolgd door fibroblastgroeifactor 9 (FGF9)/heparine en een lage concentratie CHIR99021 gedurende nog eens 3 dagen. Tijdens dit proces wordt de nadruk gelegd op het selecteren van de optimale celdichtheid en CHIR99021 concentratie aan het begin van iPSC's, aangezien deze factoren van cruciaal belang zijn voor een succesvolle generatie van nierorganoïden. Een belangrijk aspect van dit protocol is de suspensiecultuur in een laag klevende plaat, waardoor de IM zich geleidelijk kan ontwikkelen tot nefronstructuren, die glomeraire, proximale buisvormige en distale buisvormige structuren omvatten, allemaal gepresenteerd in een visueel begrijpelijk formaat. Over het algemeen biedt dit gedetailleerde protocol een efficiënte en specifieke techniek om nierorganoïden te produceren uit verschillende iPSC's, wat zorgt voor succesvolle en consistente resultaten.
Inleiding
De nier speelt een cruciale rol bij het handhaven van fysiologische homeostase, afhankelijk van de functionele eenheid. Nefronen, die afvalstoffen uitscheiden, kunnen de samenstelling van lichaamsvloeistoffen reguleren. Chronische nierziekte (CKD), veroorzaakt door erfelijke mutaties of andere risicofactoren, zal uiteindelijk evolueren naar nierziekte in het eindstadium (ESKD)1,2. ESKD is blijkbaar te wijten aan de beperkte regeneratiecapaciteit van nefronen. Nierfunctievervangende therapie is dus vereist. Gerichte differentiatie van humane iPSC's maakt het mogelijk om in vitro patiëntspecifieke 3D-nierorganoïden te genereren, die kunnen worden gebruikt om de ontwikkeling van de nieren te bestuderen, patiëntspecifieke ziekten te modelleren en nefrotoxische screening uit te voeren 3,4.
Tijdens de embryonale ontwikkeling zijn de nieren afkomstig van het intermediaire mesoderm (IM), dat zich onderscheidt van de primitieve streep (PS). De klassieke WNT-signaleringsroute kan aanvullende differentiatie van IM induceren met de gecoördineerde deelname van FGF (FGF9, FGF20) en BMP (Bmp7-signalering via JNK)5,6,7. Ze produceren twee belangrijke celpopulaties van nefrische voorlopercellen (NPC): de ureterknop (UB) en het metanefrische mesenchym (MM), die respectievelijk de verzamelkanalen en het nefron vormen. Elk nefron bestaat uit glomerulaire en buisvormige segmenten, zoals de proximale en distale tubuli, en de lus van Henle10,11. Volgens de hierboven genoemde theorie bootsen de momenteel gepubliceerde protocollen de signaalcascades en groeifactorstimulatie na om nierorganoïden te induceren 5,12.
In de afgelopen jaren zijn er veel protocollen ontwikkeld om menselijke iPSC's te differentiëren in nierorganoïden 5,6,7,12. Takasato et al.7 optimaliseerden de duur van de behandeling met CHIR (WNT-agonist) vóór vervanging door FGF9. Volgens hun protocol is CHIR-blootstelling gedurende 4 dagen, gevolgd door FGF9 gedurende 3 dagen, de meest effectieve manier om IM van iPSC's te induceren. Transwell-filters werden gebruikt als het kweekformaat in hun procedure; Deze methode is echter moeilijk voor beginners. Daarom probeerden Kumar et al.13 het cultuurformaat te veranderen en kozen ze ervoor om de cultuur op te schorten. Ze dissocieerden de aanhangende cellen op dag 7 om in laaghangende platen te zaaien om ze te helpen zich te assembleren tot embryoïde lichamen (EB's) die nefronachtige structuren bevatten. Het batcheffect van deze methoden was echter duidelijk, vooral bij verschillende iPSC's. Bovendien meldde verschillende literatuur dat de concentratie van CHIR varieerde van 7 μM tot 12 μM 5,13,14.
We speculeerden dat de concentratie van celdichtheid en de CHIR de aanmaak van organoïden in verschillende iPSC's zou kunnen beïnvloeden, en dit is talloze keren geverifieerd in onze experimenten. Het huidige protocol heeft de onderzoeksmethode van Kumar et al.13 enigszins gewijzigd en gebruikers een stapsgewijze procedure geboden. Het schema en het schema van de aanpak zijn weergegeven in figuur 1.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De iPSC's die voor dit onderzoek zijn gebruikt, zijn afkomstig van een commerciële bron. De cellen werden onderhouden met mTeSR-medium op in de handel verkrijgbare platen met een matrix gecoate platen van het basaalmembraan (zie Tabel met materialen). Tabel 1 bevat alle mediumsamenstellingen die in het onderzoek zijn gebruikt.
1. Plateren van iPSC's voor differentiatie en het induceren van posterieure primitieve strepen (PS)
- Was iPSC's op de membraanmatrix-gecoate plaat met 6 putjes met 2 ml DPBS. Zuig het DPBS op met behulp van een pipet.
- Voeg 1 ml van de in de handel verkrijgbare oplossing voor celloslating toe (zie Materiaaltabel) om iPSC's los te maken en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C.
- Voeg 1 ml mTeSR toe aan iPSC's en zorg ervoor dat de cellen van het plastic oppervlak zijn losgekomen.
- Centrifugeer de cellen bij 400 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur (RT). Resuspendeer de celpellet en tel het celaantal met behulp van een hemocytometer.
- Zaai een reeks celdichtheden op een plaat met 24 of 6 putjes bedekt met membraanmatrix en kweek met mTeSR aangevuld met 10 μM Rho-kinaseremmer (Y-27632) (zie materiaaltabel). Kweek ze een nacht in een 37 °C CO2 -incubator.
OPMERKING: Om PS te induceren, variëren de optimale concentratie van CHIR99021 en de geschikte celdichtheden van verschillende iPSC-lijnen. Zaai een reeks dichtheden (bijv. 0,6, 0,9, 1,2, 1,5, 1,8, 2,4 * 103 enkele cellen per vierkante centimeter) en een concentratiebereik van CHIR99021 van 7 μM-12 μM. Start de differentiatie van elke dichtheid en elke CHIR op dezelfde dag. Zoek de optimale concentratie van CHIR99021 en de geschikte celdichtheden in een plaat met 24 putjes en breid de kweek vervolgens uit in platen met 6 putjes. Hier geven we een protocol op basis van een 6-wells plaat. - Zuig de volgende dag de mTeSR op en was de cellen met 2 ml DPBS.
- Voeg 2 ml stadium I-medium toe (stamceldifferentiatiemedium met 8-12 μM CHIR99021) (tabel 1), aangeduid als dag 0.
- Kweek ze gedurende 4 dagen in een incubator van 37 °C, ververs fase I medium om de twee dagen.
2. Inducerend nefrogeen intermediair mesoderm (IM)
- Verwijder op dag 4 de stadium I medium en was met 2 ml DPBS.
- Voeg 2 ml stadium II-medium toe aan de cellen (stamceldifferentiatiemedium met 200 ng/ml FGF9, 1 μg/ml heparine en 1 μM CHIR99021) (tabel 1).
- Kweek ze in een incubator van 37 °C en ververs het medium om de 2 dagen tot dag 7.
3. Genereren van nierorganoïden in suspensiecultuur
OPMERKING: Tijdens de observatieperiode van dag 0 tot dag 7 is de toestand van de cellen kritiek. Als de cellen een succesvolle expansie vertonen en zich ophopen zonder noemenswaardig celafval, toont dit de succesvolle afleiding van het intermediaire mesoderm (IM) aan, wat aangeeft dat het klaar is om door te gaan naar de volgende fase. Als de cellen echter tekenen vertonen van initiële apoptose, gevolgd door necrose of breuk, kan dit wijzen op ongepaste concentraties van CHIR99021 of celdichtheden.
- Verwijder op dag 7 het stadium II-medium en was de cellen met 2 ml DPBS.
- Voeg 1 ml van de oplossing voor celloslating toe aan elk putje en incubeer gedurende 5 minuten bij 37 °C totdat de cellen breking vertonen onder fasecontrast.
- Pipetteer 1 ml stadium II-medium in de cellen, meng en zorg ervoor dat de cellen van het oppervlak zijn losgekomen.
- Vang de celsuspensie op in een buisje van 15 ml en centrifugeer gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur op 400 x g .
- Verwijder het supernatans en resuspendeer de celpellet in 2 ml stadium III-medium (stamceldifferentiatiemedium met 200 ng/ml FGF9, 1 μg/ml heparine en 1 μM CHIR99021 in 0,1% methylcellulose (MC), 0,1% polyvinylalcohol (PVA)) aangevuld met 10 μM Rho kinaseremmer (Y-27632) (zie materiaaltabel). Meng het voorzichtig.
- Meng de celsuspensie en het zaad tot een 6-wells plaat met een lage hechting in een verhouding van 1:3. Plaats de plaat op een orbitale schudder (CO 2 -bestendig, roterend met 60 rpm) in een incubator bij 37 °C en 5% CO2 .
- Verwijder 24 uur later de Rho-kinaseremmer (Y-27632) en voeg stadium III-media toe (supplement met stamceldifferentiatiemedium met 200 ng/ml FGF9, 1 μg/ml heparine, 1 μM CHIR99021, 0,1% MC, 0,1% PVA). Cultuur voor 2 dagen. Wijzig het medium in de suspensiecultuur door de onderstaande stappen te volgen:
- Knip de punt van de pipet van 1 ml af met een aseptische schaar.
- Schud de plaat met 6 putjes voorzichtig om de organoïden in het midden van de plaat te plaatsen.
- Zuig de organoïden met de voorbereide pipetten op in een buisje van 15 ml en laat ze 5 minuten staan.
- Zuig het supernatans op en laat de organoïden op de bodem van de buis liggen.
- Voeg het verse medium toe om de organoïden te resuspenderen en terug te plaatsen in een 6-well low-adhesieplaat.
- Blijf de plaat met lage hechting schudden bij 60 tpm in de couveuse. Vervang het stadium III-medium om de twee dagen tot dag 12.
- Verander op dag 12 het medium in stadium IV-medium (stamceldifferentiatiemedium met 0,1% MC en 0,1% PVA).
- Vervang het medium om de twee dagen tot dag 25. De organoïden kunnen zich vanaf dag 12-25 geleidelijk ontwikkelen tot volwassen nefronstructuren.
4. Immunofluorescentiekleuring van nierorganoïden
- Verzamel nierorganoïden in een tube van 15 ml en was ze met 2 ml PBS.
- Nadat u het 5-10 minuten hebt laten opstijven, fixeert u de nierorganoïden gedurende 20 minuten in vers bereide 2% PFA bij 4 °C.
- Verwijder de PFA en was de organoïden met 1 ml PBS met 0,3% Triton X-100 (0,3% PBST), schud het gelijkmatig op een shaker (met een rotatiesnelheid van maximaal 60 tpm) gedurende 8 minuten, laat het 5 minuten staan en verwijder vervolgens het supernatant. Herhaal dit drie keer.
LET OP: De organoïden kunnen 2-4 weken bewaard worden in 0,3% PBST bij 4° C. - Incubeer de vaste organoïden met 10% ezelinnenserum in PBST (blokkeerbuffer) (zie materiaaltabel) gedurende een nacht bij 4 °C.
- Verdun de primaire antilichamen (vermeld in de materiaaltabel) in een blokkeerbuffer met een verhouding van 1:300.
- Incubeer de organoïden met primaire antilichamen 's nachts bij 4 °C met agitatie.
OPMERKING: Zorg ervoor dat glomeruli en tubuli tegelijkertijd op één organoïde kunnen worden gekleurd. - Was de organoïden met 1 ml 0,3% PBST, schud het gelijkmatig op een shaker (met een rotatiesnelheid van niet meer dan 60 tpm) gedurende 8 minuten, laat het 5 minuten staan en verwijder dan het supernatant. Herhaal dit drie keer.
- Incubeer de organoïden met secundaire antilichamen (vermeld in de materiaaltabel) en DAPI 's nachts bij 4 °C met agitatie. Herhaal dan stap 4.7.
OPMERKING: Zowel het secundaire antilichaam als DAPI worden verdund in blokkerende oplossing, secundair antilichaam (1:400) en DAPI (1:1000). - Na de kleuring de organoïden uitdrogen met methanol (25%, 50%, 75% en 100% gedurende elk 5 minuten) en vervolgens doordringen met benzylalcohol en benzylbenzoaat (BABB, verhouding 1:2) (zie materiaaltabel) gedurende 5 minuten.
- Plak de geklaarde organoïden op een schaal met glazen bodem (zie Tabel met materialen) en onderzoek ze met confocale microscopie.
OPMERKING: Kies bij het maken van afbeeldingen de petrischaal op de bodem van de glazen schaal en plaats bij het doordringen de BABB direct in de petrischaal om de bodem van de schaal vochtig te houden.
5. In-vitrobepaling van de opname van dextraan
- Incubeer de organoïden op dag 25 met 100 μg/ml fluorescentie-gelabeld dextran (zie materiaaltabel) gedurende 4 uur in een incubator bij 37 °C en 5% CO2.
- Schakel 4 uur later over naar een nieuw medium en leg live celkweekbeelden vast met behulp van een breedveldfluorescentiemicroscoop.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De productie van IM wordt bereikt door canonieke WNT-signalering te activeren met behulp van de GSK3-remmer CHIR99021, gevolgd door FGF9/heparine. Van dag 0 tot dag 4 breiden iPSC's zich snel uit en nemen ze ruitvormige of driehoekige vormen aan. De samenvloeiing bereikt 90%-100% en accumuleert gelijkmatig tot dag 7. Bij suspensiecultuur vormen de aggregaten spontaan nefronstructuren na dissociatie op dag 7. De nierorganoïden die door suspensiecultuur zijn gemaakt, vertonen buisvormige structuren en kunnen na 18 dagen ag...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Er is een gedetailleerd protocol beschreven voor het genereren van nierorganoïden uit iPSC's, waarbij kleine wijzigingen worden aangebracht in het basale medium, de initiële celdichtheid en de concentratie van CHIR99021. In verschillende experimenten bleken de kritische factoren voor het succesvol genereren van nierorganoïden de initiële differentiatie van het intermediaire mesoderm (IM) en de celtoestand op dag 7 te zijn. Bovendien vertoonden verschillende iPSC-lijnen variaties in celproliferatie en differentiatiepotent...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs meldden geen potentieel belangenconflict.
Dankbetuigingen
We zijn alle leden van Mao en Hu Lab, vroeger en nu, enorm dankbaar voor de interessante discussies en geweldige bijdragen aan het project. We danken het National Clinical Research Center for Child Health voor de geweldige steun. Deze studie werd financieel ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (U20A20351 aan Jianhua Mao, 82200784 aan Lidan Hu), de Natural Science Foundation van de provincie Zhejiang in China (nr. LQ22C070004 aan Lidan Hu), en de Natural Science Foundation van de provincie Jiangsu (subsidies nr. BK20210150 aan Gang Wang).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat-Bottom | NEST | Cat #701003 | |
| Accutase | STEMCELL Technologies | Cat #07920 | |
| Antibodies | |||
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | Cat #100-51-6 | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | Cat #120-51-4 | |
| Biological Safety Cabinet | Haier | Cat #HR40  A2 | |
| Biotin anti-human LTL (1:300) | Vector Laboratories | Cat #B-1325 | |
| Blood mononuclear cells hiPS-B1 (iPSc, female) | N/A | N/A | |
| Carbon dioxide level shaker | HAMANY | Cat #C0-06UC6 | |
| Chemicals, peptides, and recombinant proteins | |||
| CHIR99021 (Wnt pathway activator) | STEMCELL Technologies | Cat #72054 | |
| Costar Multiple 6 Well Cell Culture Plate | Corning | Cat #3516 | |
| Costar Ultra-Low Attachment 6 Well Plate | Corning | Cat #3471 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | Cat #07930 | |
| DAPI stain Solution | Coolaber | Cat #SL7102 | |
| Dextran, Alexa Fluor 647 | Thermo SCIENTIFIC | Cat #D22914 | |
| DMEM/F-12 HEPES-free | Servicebio | Cat #G4610 | |
| Donkey Anti-Sheep IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | Cat #ab150179 | |
| Donkey serum stoste | Meilunbio | Cat #MB4516-1 | |
| D-PBS (without calcium, magnesium, phenol red) | Solarbio Life Science | Cat #D1040 | |
| Dry Bath Incubator | Shanghai Jingxin | Cat #JX-10 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032210 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032220 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032310 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032320 | |
| Dylight 649-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032620 | |
| Experimental models: Cell Lines | |||
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | Thermo SCIENTIFIC | Cat #370 | |
| Geltre LDEV-Free | Gibco | Cat #A1413202 | |
| Glass Bottom Culture Dishes | NEST | Cat #801002 | |
| Goat anti-human CUBN (1:300) | Santa Cruz Biotechnology | Cat #sc-20607 | |
| Heparin Solution (Cell culture supplement) | STEMCELL Technologies | Cat #07980 | |
| Human Recombinant FGF-9 | STEMCELL Technologies | Cat #78161 | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | Cat #CKX53 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | OLYMPUS | Cat #FV3000 | |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | Cat #M7027 | |
| Micro Centrifuge | HENGNUO | Cat #2-4B | |
| Mouse anti-human CD31 (1:300) | BD Biosciences | Cat #555444 | |
| Mouse anti-human ECAD (1:300) | BD Biosciences | Cat #610182 | |
| Mouse anti-human Integrin beta 1 (1:300) | Abcam | Cat #ab30394 | |
| Mouse anti-human MEIS 1/2/3 (1:300) | Thermo SCIENTIFIC | Cat #39795 | |
| Mowiol 4-88 (Polyvinylalcohol 4-88) | Sigma-Aldrich | Cat #81381 | |
| mTeSR1 5X Supplement | STEMCELL Technologies | Cat #85852 | |
| mTeSR1 Basal Medium | STEMCELL Technologies | Cat #85851 | |
| Nunc CryoTube Vials | Thermo SCIENTIFIC | Cat #377267 | |
| Others | |||
| Rabbit anti-human GATA3 (1:300) | Cell Signaling Technology | Cat #5852S | |
| Rabbit anti-human LRP2 (1:300) | Sapphire Bioscience | Cat #NBP2-39033 | |
| Rabbit anti-human Synaptopodin (1:300) | Abcam | Cat #ab224491 | |
| Rabbit anti-human WT1 (1:300) | Abcam | Cat #ab89901 | |
| Rabbit anti-mouse PDGFR (1:300) | Abcam | Cat #ab32570 | |
| Recombinant Human Serum Albumin (rHSA) | YEASEN | Cat #20901ES03 | |
| Sheep anti-human NPHS1 (1:300) | R&D Systems | Cat #AF4269 | |
| STEMdiff APEL 2 Medium | STEMCELL Technologies | Cat #05275 | |
| Streptavidin Cy3 (1:400) | Gene Tex | Cat #GTX85902 | |
| Versene (1X) | Gibco | Cat #15040066 | |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | Cat #72304 |
Referenties
- Tekguc, M., et al. Kidney organoids: a pioneering model for kidney diseases. Translational Research. 250, 1-17 (2022).
- Hill, N. R., et al. Global prevalence of chronic kidney disease - a systematic review and meta-analysis. PLOS ONE. 11 (7), 0158765(2016).
- Rossi, G., Manfrin, A., Lutolf, M. P. Progress and potential in organoid research. Nature Reviews Genetics. 19 (11), 671-687 (2018).
- Takasato, M., et al. Directing human embryonic stem cell differentiation towards a renal lineage generates a self-organizing kidney. Nature Cell Biology. 16 (1), 118-126 (2014).
- Morizane, R., Lam, A. Q., Freedman, B. S., Kishi, S., Valerius, M. T., Bonventre, J. V. Nephron organoids derived from human pluripotent stem cells model kidney development and injury. Nature Biotechnology. 33 (11), 1193-1200 (2015).
- Freedman, B. S., et al. Modelling kidney disease with CRISPR-mutant kidney organoids derived from human pluripotent epiblast spheroids. Nature Communications. 6 (1), 8715(2015).
- Takasato, M., et al. Kidney organoids from human iPS cells contain multiple lineages and model human nephrogenesis. Nature. 526 (7574), 564-568 (2015).
- Mugford, J. W., Sipilä, P., McMahon, J. A., McMahon, A. P. Osr1 expression demarcates a multi-potent population of intermediate mesoderm that undergoes progressive restriction to an Osr1-dependent nephron progenitor compartment within the mammalian kidney. Developmental biology. 324 (1), 88-98 (2008).
- SaxOn, L., Sariola, H. Early organogenesis of the kidney. Pediatric Nephrology. 1, 385-392 (1987).
- Kobayashi, A., et al. Six2 defines and regulates a multipotent self-renewing nephron progenitor population throughout mammalian kidney development. Cell Stem Cell. 3 (2), 169-181 (2008).
- Boyle, S., et al. Fate mapping using Cited1-CreERT2 mice demonstrates that the cap mesenchyme contains self-renewing progenitor cells and gives rise exclusively to nephronic epithelia. Developmental Biology. 313 (1), 234-245 (2008).
- Nishinakamura, R. Human kidney organoids: progress and remaining challenges. Nature Reviews Nephrology. 15 (10), 613-624 (2019).
- Kumar, S. V., et al. Kidney micro-organoids in suspension culture as a scalable source of human pluripotent stem cell-derived kidney cells. Development. 146 (5), 172361(2019).
- Takasato, M., Er, P. X., Chiu, H. S., Little, M. H. Generation of kidney organoids from human pluripotent stem cells. Nature Protocols. 11 (9), 1681-1692 (2016).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
