Nierorganoïden genereren in suspensie van geïnduceerde pluripotente stamcellen

Langping Gao; Yue Wang; Gang Wang; Hangdi Wu; Qingtao Yan; Jingjing Wang; Fei Liu; Haidong Fu; Wei Li; Lidan Hu; Jianhua Mao

doi:10.3791/65698

Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Nierorganoïden genereren in suspensie van geïnduceerde pluripotente stamcellen

3.9K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65698

⸱

1 september 2023

Langping Gao^*¹^,² , Yue Wang^*³ , Gang Wang⁴ , Hangdi Wu² , Qingtao Yan¹ , Jingjing Wang¹ , Fei Liu¹ , Haidong Fu¹ , Wei Li⁵ , Lidan Hu¹ , Jianhua Mao¹^,²

¹Department of Nephrology, The Children's Hospital, Zhejiang University School of Medicine, ²Zhejiang University School of Medicine, ³Hubei Normal University, ⁴National Clinical Research Center of Kidney Diseases, Jinling Hospital, Nanjing University School of Medicine, ⁵Clinical Laboratory, The Children’s Hospital, Zhejiang University School of Medicine, National Clinical Research Center for Child Health

^* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol presenteert een uitgebreide en efficiënte methode voor het produceren van nierorganoïden uit geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's) met behulp van suspensiekweekomstandigheden. De primaire nadruk van deze studie ligt op de bepaling van de initiële celdichtheid en de WNT-agonistconcentratie, wat ten goede komt aan onderzoekers die geïnteresseerd zijn in nierorganoïde-onderzoek.

Samenvatting

Nierorganoïden kunnen op verschillende manieren worden gegenereerd uit geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC's). Deze organoïden zijn veelbelovend voor ziektemodellering, screening van geneesmiddelen en mogelijke therapeutische toepassingen. Dit artikel presenteert een stapsgewijze procedure om nierorganoïden te maken van iPSC's, beginnend bij de posterieure primitieve streep (PS) tot het intermediaire mesoderm (IM). De aanpak is gebaseerd op het APEL 2-medium, een gedefinieerd, dierlijk componentvrij medium. Het wordt aangevuld met een hoge concentratie WNT-agonist (CHIR99021) gedurende een duur van 4 dagen, gevolgd door fibroblastgroeifactor 9 (FGF9)/heparine en een lage concentratie CHIR99021 gedurende nog eens 3 dagen. Tijdens dit proces wordt de nadruk gelegd op het selecteren van de optimale celdichtheid en CHIR99021 concentratie aan het begin van iPSC's, aangezien deze factoren van cruciaal belang zijn voor een succesvolle generatie van nierorganoïden. Een belangrijk aspect van dit protocol is de suspensiecultuur in een laag klevende plaat, waardoor de IM zich geleidelijk kan ontwikkelen tot nefronstructuren, die glomeraire, proximale buisvormige en distale buisvormige structuren omvatten, allemaal gepresenteerd in een visueel begrijpelijk formaat. Over het algemeen biedt dit gedetailleerde protocol een efficiënte en specifieke techniek om nierorganoïden te produceren uit verschillende iPSC's, wat zorgt voor succesvolle en consistente resultaten.

Inleiding

De nier speelt een cruciale rol bij het handhaven van fysiologische homeostase, afhankelijk van de functionele eenheid. Nefronen, die afvalstoffen uitscheiden, kunnen de samenstelling van lichaamsvloeistoffen reguleren. Chronische nierziekte (CKD), veroorzaakt door erfelijke mutaties of andere risicofactoren, zal uiteindelijk evolueren naar nierziekte in het eindstadium (ESKD)^1,2. ESKD is blijkbaar te wijten aan de beperkte regeneratiecapaciteit van nefronen. Nierfunctievervangende therapie is dus vereist. Gerichte differentiatie van humane iPSC's maakt het mogelijk om in vitro patiëntspecifieke 3D-ni....