Hier beschrijven we de isolatie, kweek en adipogene inductie van stromale vasculaire fractie-afgeleide preadipocyten uit periaorta-vetweefsel van muizen, waardoor de perivasculaire vetweefselfunctie en de relatie met vasculaire cellen kunnen worden bestudeerd.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Isolatie, kweek en adipogene inductie van van stromale vasculaire fractie afgeleide preadipocyten uit periiaorta-vetweefsel van muizen
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Perivasculair vetweefsel (PVAT) is een vetweefseldepot dat de bloedvaten omringt en de fenotypes van witte, beige en bruine vetcellen vertoont. Recente ontdekkingen hebben licht geworpen op de centrale rol van PVAT bij het reguleren van vasculaire homeostase en deelname aan de pathogenese van hart- en vaatziekten. Een uitgebreid begrip van PVAT-eigenschappen en -regulatie is van groot belang voor de ontwikkeling van toekomstige therapieën. Primaire culturen van periaorta-adipocyten zijn waardevol voor het bestuderen van de PVAT-functie en de overspraak tussen periaorta-adipocyten en vasculaire cellen. Dit artikel presenteert een economisch en haalbaar protocol voor de isolatie, kweek en adipogene inductie van stromale vasculaire fractie-afgeleide preadipocyten uit periaorta-vetweefsel van muizen, dat nuttig kan zijn voor het modelleren van adipogenese of lipogenese in vitro. Het protocol schetst weefselverwerking en celdifferentiatie voor het kweken van periaorta-adipocyten van jonge muizen. Dit protocol zal de technologische hoeksteen vormen voor het onderzoek naar de PVAT-functie.
Inleiding
Perivasculair vetweefsel (PVAT), een perivasculaire structuur die bestaat uit een mengsel van rijpe adipocyten en een stromale vasculaire fractie (SVF), wordt verondersteldparacriene interactie aan te gaan met de aangrenzende vaatwand via het secretoom1. Als een kritische regulator van vasculaire homeostase is PVAT-disfunctie betrokken bij de pathogenese van hart- en vaatziekten 2,3,4. De SVF van adipocytenweefsel bestaat uit verschillende verwachte celpopulaties, waaronder endotheelcellen, immuuncellen, mesotheelcellen, neuronale cellen en vetstam- en voorlopercellen (ASPC's)5,6. Het is algemeen bekend dat ASPC's die zich in de SVF van vetweefsel bevinden, aanleiding kunnen geven tot rijpe adipocyten5. Hieruit wordt afgeleid dat SVF een kritische bron is van rijpe adipocyten in PVAT. Verschillende onderzoeken hebben aangetoond dat PVAT-SVF kan differentiëren tot volwassen adipocyten onder specifieke inductieomstandigheden 6,7,8.
Momenteel zijn er twee isolatiesystemen voor het isoleren van SVF uit vetweefsel, de ene is enzymatische vertering en de andere is niet-enzymatisch9. Enzymatische methoden resulteren doorgaans in een hogere opbrengst van kernhoudende voorlopercellen10. Tot op heden zijn de voordelen van SVF bij het bevorderen van vasculaire regeneratie en neovascularisatie bij wondgenezing, urogenitale en hart- en vaatziekten op grote schaal aangetoond11, vooral in de dermatologie en plastische chirurgie12,13. De klinische toepassingsmogelijkheden van PVAT-afgeleide SVF zijn echter niet goed onderzocht, wat kan worden toegeschreven aan het ontbreken van een gestandaardiseerde methode voor de isolatie van SVF uit PVAT. Het doel van dit protocol is om een gestandaardiseerde aanpak vast te stellen voor de isolatie, kweek en adipogene inductie van SVF-afgeleide preadipocyten van muizen PVAT rond de thoracale aorta, waardoor verder onderzoek naar de PVAT-functie mogelijk wordt. Dit protocol optimaliseert weefselverwerking en celdifferentiatietechnieken voor het kweken van periaorta-adipocyten verkregen van jonge muizen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
De dierprotocollen werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van het Shanghai Chest Hospital, aangesloten bij de Shanghai Jiao Tong University School of Medicine (goedkeuringsnummer: KS23010) en waren in overeenstemming met de relevante ethische voorschriften. Mannelijke en vrouwelijke C57BL/6-muizen van 4-8 weken oud hebben de voorkeur voor dit experiment.
1. Voorbereiding van chirurgische instrumenten, buffers en kweekmedia
- Chirurgische instrumenten met autoclaaf (bijv. chirurgische scharen en standaardtangen) bij 121 °C gedurende 30 min. Desinfecteer microchirurgische instrumenten met 75% alcohol.
- Bereid steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) aangevuld met 1% v/v penicilline-streptomycine en nog eens 10 ml PBS aangevuld met 10% v/v penicilline-streptomycine.
OPMERKING: In de volgende paragrafen, indien niet specifiek vermeld, verwijst PBS naar regulier steriel PBS. - Bereid Krebs Ringer HEPES BSA-buffer voor: 1% runderserumalbumine (BSA), 20 mM HEPES opgelost in Krebs Ringer-oplossing.
- Bereid verse verteringsoplossing: collagenase type 1 (1 mg/ml) en dispase II (4 mg/ml) opgelost in Krebs Ringer HEPES BSA-buffer. Steriliseer de oplossing met een filter van 0,2 μm.
- Bereid een met collageen beklede plaat met 12 putjes voor.
- Verdun de collageenoplossing (1 mg/ml) met steriel gedeïoniseerd water tot een concentratie van 40 μg/ml. Voeg 1 ml van de verdunde collageenoplossing toe aan het oppervlak van elk putje om een concentratie van 6-10 μg/cm tebereiken2. Incubeer de coating gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Verwijder de resterende oplossing en spoel elk putje 2x na met 1 ml PBS. Gebruik de plaat onmiddellijk, of laat de plaat aan de lucht drogen in een klasse II laminaire stromingskap en bewaar de gecoate plaat bij 2-8 °C. Sluit bij opslag de gecoate platen af met parafilm.
- Bereid kweekmedium voor: Dulbecco's-Modified Eagles Medium (DMEM) met een hoog glucosegehalte, 10% foetaal runderserum (FBS), 1% v/v penicilline-streptomycine. Maximaal 2 weken bewaren bij 4 °C.
- Bereid lipogeen inductiemedium voor: DMEM met hoge glucosegehalte, 10% FBS, 1% v/v penicilline-streptomycine, 1 nM triiodothyronine, 1 μM rosiglitazon, 1 μM insuline, 0,5 mM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) en 1 μM dexamethason. Maximaal 2 weken bewaren bij 4 °C.
- Bereid onderhoudsmedium voor: DMEM met hoge glucose, 10% FBS, 1% v/v penicilline-streptomycine, 1 nM triiodothyronine, 1 μM rosiglitazon en 1 μM insuline. Maximaal 2 weken bewaren bij 4 °C.
2. Dissectie en isolatie van perivasculair vetweefsel (PVAT)
- Euthanaseer de muis door cervicale dislocatie onder 2% isofluraananesthesie of met een overdosis kooldioxide. Spray met 75% alcohol voor het desinfecteren van de huid.
- Plaats de muis in rugligging (naar boven gericht).
- Til de huid op, maak een kleine incisie en scheid de huid en buikspieren botweg met een chirurgische schaar langs de ventrale middellijn van het bekken naar de nek. Leg het hart en de longen bloot door het middenrif en de ribben langs beide zijden van de middellijn door te snijden.
- Verwijder voorzichtig de lever, milt, darmen en nieren. Vermijd het doorsnijden van de darmwand.
- Verwijder de longen en slokdarm.
- Til het hart voorzichtig op met een pincet in de ene hand en scheid de aorta van de wervelkolom met een chirurgische schaar in de andere hand. Plaats vervolgens het hart en de aorta in een petrischaal van 60 mm met PBS die 1% v/v penicilline-streptomycine bevat.
- Haal een microchirurgische pincet en een microchirurgische schaar uit de alcohol en spoel ze af met 25 ml PBS om de overtollige alcohol te verwijderen. Verwijder onder een stereomicroscoop de thymus en ander weefsel van het hart en de aorta, verwijder vervolgens het hart en laat de aorta achter met de PVAT's.
- Breng de aorta met de PVAT's over in een schone petrischaal van 60 mm met PBS die 1% v/v penicilline-streptomycine bevat.
- Gebruik een microchirurgische pincet om PVAT's te strippen, waarbij één pincet de aorta fixeert en de andere het vetweefsel eraf trekt. Verwijder het vaatweefsel zoveel mogelijk en minimaliseer schade aan het perivasculaire vetweefsel.
- Verzamel de PVAT rond de thoracale aorta in de microcentrifugebuis van 2 ml met DMEM met een hoog glucosegehalte, aangevuld met 1% v/v penicilline-streptomycine op ijs.
3. Isolatie van stromale vasculaire fractie (SVF)
- Spoel de verzamelde weefsels achtereenvolgens met PBS met 10% v/v penicilline-streptomycine en PBS met 1% v/v penicilline-streptomycine.
OPMERKING: Vanaf deze stap moeten alle experimenten onder steriele omstandigheden worden uitgevoerd in een laminaire stromingskap van klasse II. - Breng de weefsels over in een steriele petrischaal van 60 mm, voeg 200 μL digestieoplossing toe en hak ze met een steriele schaar instukken van 1 mm.
- Breng het mengsel over in een centrifugebuis van 15 ml met behulp van een plastic pipetpunt, het uiteinde verbreed door een steriele schaarsnede, en voeg 6 ml digestieoplossing toe om de verteringsreactie op gang te brengen.
OPMERKING: Eén digestiereactie (3 ml digestieoplossing) is voldoende voor PVAT-depots van zes muizen. - Incubeer de weefsels bij 37 °C in een incubator met een orbitale shaker (frequentie 150 rpm voor effectief mengen) gedurende 30-45 min. Bind de buizen plat op een rek om de buizen horizontaal te laten schudden. Schud krachtig op en neer met de hand gedurende 10 seconden om de 5-10 minuten.
OPMERKING: De spijsvertering kan worden stopgezet wanneer een homogene, gelige spijsverteringsvloeistof wordt gezien zonder dat er weefselfragmenten achterblijven. - Zeef de verteerde weefsels door een celzeef van 70 μm in een centrifugebuis van 50 ml. Spoel de celzeef met een gelijk volume kweekmedium om de celopbrengst te maximaliseren en de vertering te stoppen.
- Breng het filtraat over in een nieuwe centrifugebuis van 15 ml en centrifugeer gedurende 10 minuten bij 1.800 × g . Keer de buis om om het supernatans weg te gooien en resuspendeer de pellets in 5 ml PBS. Centrifugeer op 1.800 × g gedurende 5 min.
- Gooi het supernatans weg door de buis om te keren en resuspendeer de pellets in een geschikte hoeveelheid kweekmedium.
OPMERKING: De celpellets die van elke zes muizen worden verzameld, worden geresuspendeerd in 1 ml kweekmedium en gezaaid in een putje van een plaat met 12 putjes. - Zaai de cellen in een met collageen beklede plaat met 12 putjes en incubeer bij 37 °C in een vochtige atmosfeer met 5% CO2 gedurende een nacht.
- Aspireer de volgende dag het kweekmedium op, was de cellen met voorverwarmd (37 °C) PBS met 1% v/v penicilline-streptomycine om celresten en rode bloedcellen te verwijderen, en voeg elk putje 1 ml vers kweekmedium toe.
4. Adipogene inductie van SVF-afgeleide preadipocyten uit periaorta-vetweefsel
- Verander het kweekmedium om de dag totdat de cellen ~60-70% samenvloeiing bereiken.
OPMERKING: Het duurt meestal 3-4 dagen voordat de cellen 60-70% samenvloeiing bereiken. - Wanneer de cellen 60-70% samenvloeiing bereiken, zuigt u het kweekmedium op en vervangt u het door bruin adipogeen inductiemedium. Beschouw de dag van inductie van adipogene differentiatie als dag 0 van differentiatie.
- Na 72 uur (dag 3 van differentiatie) het medium verversen met onderhoudsmedium. Vervang het onderhoudsmedium elke 2 dagen totdat de cellen worden gebruikt voor experimenten.
- Analyseer de adipogene cellen op een geschikte manier, zoals Oil Red O-kleuring14 en western blotting15.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Met behulp van dit hierboven beschreven protocol hebben we zorgvuldig PVAT's rond thoracale aorta's van muizen geïsoleerd (Figuur 1A-D). Na het wassen en fijnhakken van de PVAT's met behulp van een steriele schaar (figuur 1E,F), werden weefselfragmenten verteerd in een digestieoplossing met collagenase type 1 (1 mg/ml) en dispase II (4 mg/ml) en gedurende 30-45 minuten bij 37 °C op een shaker geïncubeerd (figuur 1G
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
We stellen een praktische en haalbare aanpak voor voor de isolatie en adipogene inductie van SVF-afgeleide preadipocyten uit periaorta-vetweefsel van muizen. De voordelen van dit protocol zijn dat het eenvoudig en voordelig is. Voldoende muizen zijn van cruciaal belang voor een succesvolle isolatie, omdat onvoldoende weefsel kan leiden tot een lage SVF-dichtheid en een slechte groeitoestand, wat uiteindelijk de lipogene efficiëntie beïnvloedt. Bovendien is de leeftijd van de muis een belangrijke factor om rekening mee te...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten, financieel of anderszins, te melden.
Dankbetuigingen
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (82130012 en 81830010) en de Nurture-projecten voor fundamenteel onderzoek van het Shanghai Chest Hospital (subsidienummer: 2022YNJCQ03).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 0.2 μm syringe filters | PALL | 4612 | |
| 12-well plate | Labselect | 11210 | |
| 15 mL centrifuge tube | Labserv | 310109003 | |
| 3,3',5-triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma-Aldrich | T-2877 | 1 nM |
| 50 mL centrifuge tube | Labselect | CT-002-50A | |
| anti-adiponectin | Abcam | ab22554 | 1:1,000 working concentration |
| anti-COX IV | CST | 4850 | 1:1,000 working concentration |
| anti-FABP4 | CST | 2120 | 1:1,000 working concentration |
| anti-PGC1α | Abcam | ab191838 | 1:1,000 working concentration |
| anti-PPARγ | Invitrogen | MA5-14889 | 1:1,000 working concentration |
| anti-UCP1 | Abcam | ab10983 | 1:1,000 working concentration |
| anti-α-Actinin | CST | 6487 | 1:1,000 working concentration |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | 1% |
| C57BL/6 mice aged 4-8 weeks of both sexes | Shanghai Model Organisms Center, Inc. | ||
| Cell Strainer 70 µm, nylon | Falcon | 352350 | |
| Collagen from calf skin | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Collagenase, Type 1 | Worthington | LS004196 | 1 mg/mL |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | 1 μM |
| Dispase II | Sigma-Aldrich | D4693-1G | 4 mg/mL |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000-044 | 10% |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034-25G | 20 mM |
| High glucose DMEM | Hyclone | SH30022.01 | |
| IBMX | Sigma-Aldrich | I7018 | 0.5 mM |
| Incubator with orbital shaker | Shanghai longyue Instrument Eruipment Co.,Ltd. | LYZ-103B | |
| Insulin (cattle) | Sigma-Aldrich | 11070-73-8 | 1 μM |
| Isoflurane | RWD | R510-22-10 | |
| Krebs-Ringer's Solution | Pricella | PB180347 | protect from light |
| Microsurgical forceps | Beyotime | FS233 | |
| Microsurgical scissor | Beyotime | FS217 | |
| Oil Red O | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | A600395-0050 | |
| PBS (Phosphate-buffered saline) | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd | B548117-0500 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-035-146 | 1:5,000 working concentration |
| Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-035-144 | 1:5,000 working concentration |
| Rosiglitazone | Sigma-Aldrich | R2408 | 1 μM |
| Standard forceps | Beyotime | FS225 | |
| Surgical scissor | Beyotime | FS001 |
Referenties
- Akoumianakis, I., Antoniades, C. The interplay between adipose tissue and the cardiovascular system: is fat always bad. Cardiovascular Research. 113 (9), 999-1008 (2017).
- Huang, C. L., et al. Thoracic perivascular adipose tissue inhibits VSMC apoptosis and aortic aneurysm formation in mice via the secretome of browning adipocytes. Acta Pharmacologica Sinica. 44 (2), 345-355 (2023).
- Xia, N., Li, H. The role of perivascular adipose tissue in obesity-induced vascular dysfunction. British Journal of Pharmacology. 174 (20), 3425-3442 (2017).
- Brown, N. K., et al. Perivascular adipose tissue in vascular function and disease: a review of current research and animal models. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (8), 1621-1630 (2014).
- Ferrero, R., Rainer, P., Deplancke, B. Toward a consensus view of mammalian adipocyte stem and progenitor cell heterogeneity. Trends in Cell Biology. 30 (12), 937-950 (2020).
- Angueira, A. R., et al. Defining the lineage of thermogenic perivascular adipose tissue. Nature Metabolism. 3 (4), 469-484 (2021).
- Boucher, J. M., et al. Rab27a regulates human perivascular adipose progenitor cell differentiation. Cardiovascular Drugs and Therapy. 32 (5), 519-530 (2018).
- Saxton, S. N., Withers, S. B., Heagerty, A. M. Emerging roles of sympathetic nerves and inflammation in perivascular adipose tissue. Cardiovascular Drugs and Therapy. 33 (2), 245-259 (2019).
- Ferroni, L., De Francesco, F., Pinton, P., Gardin, C., Zavan, B. Methods to isolate adipose tissue-derived stem cells. Methods in Cell Biology. 171, 215-228 (2022).
- Senesi, L., et al. Mechanical and enzymatic procedures to isolate the stromal vascular fraction from adipose tissue: preliminary results. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 88(2019).
- Andia, I., Maffulli, N., Burgos-Alonso, N. Stromal vascular fraction technologies and clinical applications. Expert Opinion on Biological Therapy. 19 (12), 1289-1305 (2019).
- Suh, A., et al. Adipose-derived cellular and cell-derived regenerative therapies in dermatology and aesthetic rejuvenation. Ageing Research Reviews. 54, 100933(2019).
- Bellei, B., Migliano, E., Picardo, M. Therapeutic potential of adipose tissue-derivatives in modern dermatology. Experimental Dermatology. 31 (12), 1837-1852 (2022).
- Kraus, N. A., et al. Quantitative assessment of adipocyte differentiation in cell culture. Adipocyte. 5 (4), 351-358 (2016).
- Figueroa, A. M., Stolzenbach, F., Tapia, P., Cortés, V. Differentiation and imaging of brown adipocytes from the stromal vascular fraction of interscapular adipose tissue from newborn mice. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (192), (2023).
- Ma, Y., et al. Methotrexate improves perivascular adipose tissue/endothelial dysfunction via activation of AMPK/eNOS pathway. Molecular Medicine Reports. 15 (4), 2353-2359 (2017).
- Li, X., Ballantyne, L. L., Yu, Y., Funk, C. D. Perivascular adipose tissue-derived extracellular vesicle miR-221-3p mediates vascular remodeling. FASEB Journal. 33 (11), 12704-12722 (2019).
- Ruan, C. C., et al. Perivascular adipose tissue-derived complement 3 is required for adventitial fibroblast functions and adventitial remodeling in deoxycorticosterone acetate-salt hypertensive rats. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 30 (12), 2568-2574 (2010).
- Adachi, Y., et al. Beiging of perivascular adipose tissue regulates its inflammation and vascular remodeling. Nature Communications. 13 (1), 5117(2022).
- Ye, M., et al. Developmental and functional characteristics of the thoracic aorta perivascular adipocyte. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (4), 777-789 (2019).
- Stanek, A., Brożyna-Tkaczyk, K., Myśliński, W. The role of obesity-induced perivascular adipose tissue (PVAT) dysfunction in vascular homeostasis. Nutrients. 13 (11), 3843(2021).
- Queiroz, M., Sena, C. M. Perivascular adipose tissue in age-related vascular disease. Ageing Research Reviews. 59, 101040(2020).
- Fitzgibbons, T. P., et al. Similarity of mouse perivascular and brown adipose tissues and their resistance to diet-induced inflammation. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (4), H1425-H1437 (2011).
- Chang, L., et al. Loss of perivascular adipose tissue on peroxisome proliferator-activated receptor-γ deletion in smooth muscle cells impairs intravascular thermoregulation and enhances atherosclerosis. Circulation. 126 (9), 1067-1078 (2012).
- Piacentini, L., et al. Genome-wide expression profiling unveils autoimmune response signatures in the perivascular adipose tissue of abdominal aortic aneurysm. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (2), 237-249 (2019).
- Wang, Z., et al. RNA sequencing reveals perivascular adipose tissue plasticity in response to angiotensin II. Pharmacological Research. 178, 106183(2022).
- Shi, K., et al. Ascending aortic perivascular adipose tissue inflammation associates with aortic valve disease. Journal of Cardiology. 80 (3), 240-248 (2022).
- Fu, M., et al. Neural crest cells differentiate into brown adipocytes and contribute to periaortic arch adipose tissue formation. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 39 (8), 1629-1644 (2019).
- Gil-Ortega, M., Somoza, B., Huang, Y., Gollasch, M., Fernández-Alfonso, M. S. Regional differences in perivascular adipose tissue impacting vascular homeostasis. Trends in Endocrinology & Metabolism. 26 (7), 367-375 (2015).
- Bar, A., et al. In vivo magnetic resonance imaging-based detection of heterogeneous endothelial response in thoracic and abdominal aorta to short-term high-fat diet ascribed to differences in perivascular adipose tissue in mice. Journal of the American Heart Association. 9 (21), e016929(2020).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
