Celvrije DNA-extractie van glasvocht en kamerwatermonsters voor diagnose en monitoring van vitreoretinaal lymfoom

Samenvatting

Een procedure om celvrij DNA uit glasvocht en kamerwater te extraheren om moleculaire studies uit te voeren voor het diagnosticeren van vitreoretinaal lymfoom is hier vastgesteld. De methode biedt de mogelijkheid om tegelijkertijd DNA uit de cellulaire component van het monster te extraheren of te reserveren voor aanvullend onderzoek.

Samenvatting

Vitreoretinaal lymfoom (VRL) vertegenwoordigt een agressief lymfoom, vaak gecategoriseerd als primair diffuus grootcellig B-cellymfoom van het centrale zenuwstelsel. Om VRL te diagnosticeren, worden specimens zoals glasvocht en, meer recentelijk, kamerwater verzameld. Diagnostische tests voor VRL op deze monsters omvatten cytologie, flowcytometrie en moleculair testen. Zowel cytopathologie als flowcytometrie, samen met moleculaire tests met behulp van cellulair DNA, vereisen echter intacte hele cellen. De uitdaging ligt in het feit dat glasvocht en kamerwater doorgaans een lage cellulariteit hebben en dat veel cellen worden vernietigd tijdens het verzamelen, opslaan en verwerken. Bovendien vormen deze monsters extra problemen voor moleculaire tests vanwege de hoge viscositeit van glasvocht en het lage volume van zowel glasvocht als kamerwater. Deze studie stelt een methode voor om celvrij DNA te extraheren uit glasachtig en waterig monsters. Deze benadering vormt een aanvulling op de extractie van cellulair DNA of maakt het mogelijk de cellulaire component van deze monsters te gebruiken voor andere diagnostische methoden, waaronder cytologie en flowcytometrie.

Inleiding

Vitreoretinaal lymfoom (VRL) is een agressief lymfoom geassocieerd met primair diffuus grootcellig B-cellymfoom^van het centrale zenuwstelsel ^1,2,3. VRL is meestal dodelijk vanwege de betrokkenheid ervan bij het centrale zenuwstelsel ^1,2. Hoewel zeldzaam^1,4, presenteert VRL zich vaak met symptomen die lijken op posterieure uveïtis en andere vitreoretinale aandoeningen ^4,5. Bijgevolg hebben patiënten met uveïtissymptomen een diagnose nodig om VRL te bevestigen of uit te sluiten.

Onlangs zijn consensuscriteria voor het diagnosticeren van VRL gepubliceerd, die een combinatie van klinisch onderzoek en laboratoriumbevindingen^omvatten6. Specimens die vaak worden gebruikt om VRL te diagnosticeren, zijn onder meer glasvocht en, meer recentelijk, kamerwater⁷. Glasvocht wordt verkregen door middel van een chirurgische ingreep genaamd pars plana vitrectomie, die toegang geeft tot het achterste segment van het oog⁸.

In het gepresenteerde protocol werden zowel kamerwater als glasvochtmonsters verzameld voor cellulaire en cfDNA-extractie. Na het verdoven van de patiënten en het plaatsen van trocars op ongeveer 4 mm van de cornea-limbus, werd een kamerwatermonster van ongeveer 100-200 μL verkregen met behulp van een tuberculinespuit van 1 ml in de cornea-limbus. Bij pseudofakische patiënten werd onverdund glasvocht verkregen door steriele lucht in de infusie te brengen, waardoor een grotere hoeveelheid onverdund glasvocht (tot 3,5 ml) kon worden verzameld. Bij fakische patiënten werd ongeveer 500 tot 1000 μl onverdund glasvocht verwijderd voordat een infusie met een uitgebalanceerde zoutoplossing werd ingeschakeld. In sommige gevallen werd secundair verdund glasvocht (500 tot 2.000 μL) verzameld door de infusie over te schakelen op vloeistof en de vitrector in de glasvochtrok te plaatsen om dit monster te verkrijgen. De meest verdunde glasvochtfractie werd verzameld door de cassettezak te bewaren (aanvullende figuur 1) aan het einde van de operatie. Zodra deze zak de afdeling pathologie bereikte, werd verdund glasvocht verkregen door vloeistof uit deze zak in conische buizen af te tappen voor daaropvolgende DNA-extractie.

Cytopathologie van glasvocht wordt vaak beschouwd als de gouden standaard⁹. Verschillende onderzoeken hebben echter een beperkte gevoeligheid aangetoond als gevolg van verwerking en minimale cellulariteit^10,11,12. Flowcytometrie kan helpen bij het identificeren van klonale B-cellen, maar kan ook worden beperkt door een lage cellulariteit en de kwetsbaarheid van grote lymfoomcellen^13,14,15. Zowel cytopathologie als flowcytometrie vereisen intacte hele cellen. Veel van deze cellen worden vernietigd tijdens het verzamelen, opslaan en verwerken. Wanneer moleculair testen wordt uitgevoerd met behulp van DNA dat is geëxtraheerd uit intacte cellen (cellulair DNA), lijdt het aan dezelfde beperking. Bovendien vermindert het verdelen van het beperkte glasvochtmonster voor al deze tests de hoeveelheid materiaal die voor elke test beschikbaar is.

Celvrij DNA (cfDNA) vertegenwoordigt een andere bron van DNA waarvoor geen intacte cellen nodig zijn. cfDNA van glasvochtmonsters is gebruikt voor de detectie van VRL ^16,17 en oogmelanoom¹⁸. In dit protocol wordt cellulair en celvrij DNA geëxtraheerd uit glasvocht en waterige vloeistof om VRL te detecteren.

Protocol

Het huidige protocol volgt de richtlijnen voor menselijke zorg en met goedkeuring van de institutionele beoordelingsraad (IRB) van de Universiteit van Michigan. Hiervoor is een ontheffing van geïnformeerde toestemming verkregen van IRB. Er zijn geen relevante in- of exclusiecriteria voor de betrokken patiënten.

1. Scheiding van cellulaire en celvrije componenten

OPMERKING: Er kunnen drie soorten monsters worden ontvangen voor VRL-diagnostische tests: glasvocht (onverdund; vloeistof van vitrectomie verzameld voorafgaand aan het begin van de infusie), verdund glasvocht in een cassettezak (figuur 1) en kamerwater (vloeistof uit de voorste oogkamer).

1. Voor onverdunde glasvocht, die zeer stroperig is, verdunnen met 3-5 ml PBS om het pipetteren te vergemakkelijken.
2. Voor verdund glasvocht in de cassettezak (aanvullende afbeelding 1), laat de vloeistof in conische buizen van 50 ml lopen (één voor elke 45 ml vloeistof).
3. Het kamerwater heeft een zeer laag volume (<200 μL). Om een maximaal herstel van de cellen te garanderen, brengt u het monster over in een buis van 1,5 ml, spoelt u de oorspronkelijke microcentrifugebuis van 500 μl waarin het monster is verzameld met een gelijk volume PBS en voegt u het toe aan het buisje van 1,5 ml.
4. Centrifugeer glasvocht of waterige vloeistof bij 3.000 x g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
5. Verwijder het supernatans voorzichtig met een pipet en zorg ervoor dat u de gepelleteerde cellen niet verstoort.

2. DNA-extractie uit de cellulaire component

1. Voeg een geschikte hoeveelheid cellyse-oplossing toe (300 μl voor kleine pellets, 1 ml of meer voor grotere pellets) (zie materiaaltabel). Mix door op en neer te pipetteren.
2. Wanneer de oplossing volledig gelyseerd is, voegt u 1/3 van het totale volume van de eiwitneerslagoplossing toe (100 μl voor 300 μl lysaat) (zie materiaaltabel).
3. Draai krachtig gedurende 20-30 s. Centrifugeer gedurende 3 minuten op 3.000 x g bij kamertemperatuur.
4. Pipetteer 300 μL isopropanol in een schone microcentrifugebuis. Pipetteer het supernatans van de vorige stap voorzichtig in de isopropanolbuis.
5. Voeg 1,5 μl glycogeen van 20 mg/ml toe (voor lysis van 300 μl) (zie materiaaltabel).
6. Meng goed door inversie en plaats het monster vervolgens gedurende 1 uur tot een nacht in een vriezer van -20 °C om DNA-precipitatie te bevorderen.
7. Centrifugeer de buis van 1,5 ml gedurende 5 minuten bij 3.000 x g bij kamertemperatuur. Pipetteer de isopropanol.
8. Voeg 0,5 ml 70% ethanol toe en keer de buis om om de pellet te wassen.
9. Centrifugeer gedurende 1 minuut op 3.000 x g op kamertemperatuur en decanteer de ethanol. Herhaal de ethanol wasbeurt eenmaal.
10. Keer de buis om op schoon gaas om de oplossing af te tappen en droog de pellet of decanteer. Draai het DNA snel rond in een microcentrifuge en pipetteer de resterende druppel ethanol met een wegwerppipetpunt met fijne punt (zodra er geen ethanolresten meer in de buis zitten, moet het DNA binnen 5-10 minuten droog zijn en klaar om te hydrateren).
11. Voeg 45 μL DNA-hydratatieoplossing (zie Materiaaltabel) toe aan de gedroogde DNA-pellet.
12. Plaats de buis in een verwarmingsblok van 50 °C en laat deze 1-2 uur oplossen. Piped het DNA op en neer om het hydratatieproces te versnellen.
    NOTITIE: Voeg meer DNA-hydratatieoplossing toe als het monster te stroperig lijkt.

3. Celvrije DNA-extractie

1. De hoeveelheid supernatans uit stap 1.5 is variabel. Voeg 70 μL conditioneringsbuffer toe (zie Materiaaltabel) voor elke milliliter van het supernatant.
2. Meng de reinigingskralen goed door te vortexen. Voeg 10 μL klaringskorrels toe bij verwerking <14 ml celvrij supernatant, 20 μl bij verwerking van 14-40 ml.
3. Meng het monster/parelmengsel goed door te vortexen. Centrifugeer op 3.000 x g gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
4. Zonder de pellet te verstoren, pipetteert u het supernatans en laat u 100 μl achter als 10 μl klaringskorrels worden gebruikt, en 200 μl als 20 μl klaringskorrels worden gebruikt.
5. Voeg een gelijk volume Urine Pellet Digestion buffer (zie Tabel met materialen) toe aan de pellet en resuspendeer de pellet goed door vortexen of pipetteren.
6. Voeg proteïnase K (5% (v/v)) toe aan de geresuspendeerde pellet (voeg bijvoorbeeld 10 μL proteïnase K toe aan het mengsel van 200 μl) en meng goed door middel van zachte vortexen.
7. Incubeer het pelletmengsel bij 55 °C gedurende 30 min.
8. Voeg een volume genomische lysisbuffer (zie materiaaltabel) toe aan het verteringsmengsel (bijv. 210 μl genomische lysisbuffer op 210 μl verteringsmengsel) en meng door vortexen.
9. Breng de in de handel verkrijgbare spinkolom (zie Materiaaltabel) over naar een nieuwe opvangbuis.
10. Voeg 200 μL Urine DNA Prep-buffer toe aan de centrifugekolom, centrifugeer op ≥16.000 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur en gooi de doorstroming weg.
11. Voeg 700 μL urine-DNA-wasbuffer toe aan de kolom, centrifugeer bij ≥16.000 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur en gooi de doorstroming weg.
12. Herhaal de stap met 200 μL Urine DNA wasbuffer.
13. Breng de spinkolom over naar een DNase/RNase-vrije microcentrifugebuis.
14. Voeg het juiste volume DNA-elutiebuffer (op basis van de uit te voeren moleculaire tests) rechtstreeks toe aan de kolommatrix en laat het 3-5 minuten bij kamertemperatuur staan.
    OPMERKING: In de voorbeeldgevallen werd 30 μL elutiebuffer gebruikt. Er wordt meer elutiebuffer gebruikt als aanvullende tests nodig zijn.
15. Centrifugeer bij ≥16.000 x g bij kamertemperatuur gedurende 1 minuut om het celvrije DNA te verkrijgen.

Resultaten

Deze extractiemethoden werden uitgevoerd op een beperkt aantal gevallen om te zorgen voor voldoende opbrengst en amplifieerbaarheid van celvrij DNA in vergelijking met cellulair DNA van de glasachtige (vier) en waterige (vier) monsters. Van deze monsters zijn de DNA-opbrengsten van de celvrije component van deze vloeistoffen vergelijkbaar met die van de cellulaire component (tabel 1). Cellulair en cfDNA van deze monsters werden ook geëvalueerd met behulp van moleculaire tests, zoals voor de VRL-geassocieerde mutatie MYD88 L265P. Een allel-specifieke real-time PCR voor MYD88 L265P (Figuur 1) illustreert de detectie van deze VRL-geassocieerde mutatie in zowel cellulair DNA als cfDNA. In dit voorbeeld blijkt de ziektelast hoger te zijn in de celvrije component, zoals geïllustreerd door een lagere (cyclusdrempel (Ct). Deze gegevens illustreren dat cfDNA geëxtraheerd uit glasvocht en kamerwater met behulp van deze methode resulteert in een bron van DNA die ook kan worden toegepast op diagnostische moleculaire tests.

Figuur 1: MYD88 L265P allel-specifieke real-time PCR. Representatieve amplificatiegrafiek met MYD88 L265P allel-specifieke real-time PCR voor cellulair en celvrij DNA (elke PCR-reactie uitgevoerd in tweevoud). De drempel voor cyclusdrempel (Ct) wordt aangegeven door de groene lijn. De punten waarop amplificatie van cfDNA (blauwe en bruine sporen) en cellulair DNA (rode en groene sporen) - elk uitgevoerd in tweevoud - de drempel bereiken, worden gelabeld. Achtergrondfluorescentie is aanwezig in de buurt van 1.00e-003. Er is een hogere mutatielast aanwezig in de celvrije component, zoals blijkt uit een lagere Ct. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

	Cellulair	Cel-vrij
Glasvocht 1	130.5	67.5
Glasvocht 2	337.5	105
Glasvocht 3	150	168
Glasvocht 4	1816	654
Waterig 1	58.5	40.5
Waterig 2	153	225
Waterig 3	117	454.5
Waterig 4	TL	27

Tabel 1: Cellulaire en celvrije DNA-extractieopbrengsten. DNA-opbrengst (in ng) voor vier onverdunde glasvochtvloeistoffen en vier waterige humorvloeistoffen (voorkamer) van vier verschillende individuen op basis van fluorometrische DNA-kwantificering. TL = te laag om te kwantificeren.

Aanvullende afbeelding 1: Glasachtig cassettezakje. Voorbeeld van een glasachtig cassettezakje met verdunde glasvochtvloeistof. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Vitreoretinaal lymfoom (VRL) is een agressief grootcellig B-cellymfoom ^1,2,3 waarvan de symptomen andere vitreoretinale aandoeningen kunnen nabootsen ^4,5. Moleculair testen van glasvocht en, meer recentelijk, kamerwater is een kritische methode geworden om de diagnose VRL te stellen of uit te sluiten. Deze vloeistoffen hebben echter een zeer laag volume en hebben vaak een lage cellulariteit. Veel van de cellen in deze vloeistoffen kunnen ook beschadigd raken tijdens het verzamelen, opslaan en verwerken^13,14,15. Als gevolg hiervan zijn de DNA-opbrengsten van deze monsters vaak laag. Bovendien moeten de cellen uit deze vloeistoffen worden gedeeld met andere diagnostische methoden, waaronder cytopathologie en flowcytometrie. Celvrij DNA (cfDNA) in deze vloeistoffen biedt een andere bron van DNA waarvoor geen intacte cellen nodig zijn.

Dit protocol scheidt de cellulaire en celvrije componenten van glasvocht of waterige vloeistof. Glasvocht wordt verdund met PBS om pipetteren mogelijk te maken vanwege de viscositeit. Waterige vloeistof wordt behandeld om een maximale terugwinning van deze vloeistof met een zeer laag volume te garanderen.

Een vergelijking van de DNA-opbrengsten van deze twee componenten illustreert dat er aanzienlijk extra nucleïnezuur kan worden afgeleid uit de celvrije component. Moleculair testen van cfDNA, zoals MYD88 L265P allel-specifieke real-time PCR, toont aan dat VRL kan worden gedetecteerd in de celvrije component van glasvocht en kamerwater, evenals in de cellulaire component. In veel gevallen is de relatieve hoeveelheid VRL hoger in de celvrije component dan in de cellulaire (Figuur 1).

Extractie van de celvrije component van glasvocht en waterige vloeistof maakt moleculaire evaluatie mogelijk van een component van deze vloeistoffen die anders zou worden weggegooid. Omdat VRL vertegenwoordigd is in cellulaire en celvrije componenten, kunnen cellulair DNA en cfDNA worden gecombineerd om het beschikbare DNA van deze beperkte monsters te maximaliseren. Als alternatief kan de celvrije component van deze vloeistoffen worden gebruikt voor moleculaire tests, en de cellulaire component kan worden gebruikt voor tests waarvoor intacte cellen nodig zijn, dwz cytopathologie en flowcytometrie. Op deze manier kan worden voorkomen dat aan elke test afzonderlijke aliquots van deze vloeistoffen worden toegewezen, waardoor de gevoeligheid van elke test voor de detectie van VRL in het gedrang kan komen. Gezien het succes van deze methode in glas- en waterige monsters, kan deze methode ook nuttig zijn in andere beperkte vloeistoffen om de hoeveelheid DNA die beschikbaar is voor moleculaire tests te vergroten.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
2-Propanol (Isopropanol)	Fischer	A415-500
DNA Clean & Concentrator-10	Zymo Research	D4011
DNA Clean & Concentrator-5	Zymo Research	D4003
Gentra Puregene Cell Lysis Solution	Qiagen	158906
Gentra Puregene DNA Hydration Solution	Qiagen	158916
Gentra Puregene Protein Precipitation Solution	Qiagen	158912
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Sigma	P-4417
Quick-DNA Urine Kit	Zymo Research	D3061	Conditionering buffer; bevat ook clearing beads, Proteinase K en spin kolommen
Ultrapure Glycogen, 20 µg/µL (20 mg/mL)	Thermo Fisher/Invitrogen	10814010