Methodenartikel

Dioscine gemedieerde verlichting van IgA-nefropathie door B-celactivering in vivo te remmen en de galactose-deficiënte IgA1-productie in vitro te verminderen

2.5K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65719

⸱

13 oktober 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Nephrology, Guanganmen Hospital, 2Department of Nephrology, 906 Hospital of Joint Logistic Support Force of People's Liberation Army (PLA), 3Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Deze studie levert experimentele gegevens voor de behandeling van immunoglobuline A-nefropathie (IgAN) met Dioscin (DIO), het actieve ingrediënt van Dioscoreae Nipponicae Rhizoma (DNR), en een paradigma voor het bestuderen van de effecten en onderliggende mechanismen van kruidengeneeskunde in vivo en in vitro.

Samenvatting

De toename van circulerend galactose-deficiënt IgA1 (Gd-IgA1) wordt veroorzaakt door overmatige activering van IgA-positieve secretoire cellen in het proces van mucosale immuunresponsen, wat een cruciale schakel is in de pathogenese van IgA-nefropathie (IgAN). Peyer's patch, de prominente plaats waar B-lymfocyten worden omgezet in IgA-afscheidende plasmacellen, is de primaire bron van IgA. Bovendien is de lagere expressie van kern 1β-1,3-galactosyltransferase (C1GalT1) en zijn moleculaire chaperonne, C1GalT1-specifieke moleculaire chaperonne (Cosmc), gerelateerd aan abnormale glycosylering van IgA1 bij IgAN-patiënten. Onze klinische ervaring toont aan dat de kruidengeneeskunde van Dioscoreae Nipponicae Rhizoma (DNR) proteïnurie en hematurie kan verlichten en de nierfunctie bij IgAN-patiënten kan verbeteren. Dioscine (DIO) is een van de belangrijkste actieve ingrediënten van DNR, dat verschillende farmacologische activiteiten heeft. Deze studie onderzoekt het mogelijke mechanisme van DIO bij de behandeling van IgAN.De IgAN-modelmuis is tot stand gekomen door mucosale immuuninductie. De muizen werden verdeeld in de controle-, model- en DIO-gavagegroepen. De glomerulaire IgA-afzetting bij muizen, renale pathologische veranderingen en B-celmarkers CD20- en CXCR5-expressie in Peyer's patch werden gedetecteerd door immunofluorescentie en immunohistochemie. Na stimulatie van lipopolysaccharide (LPS) werden de effecten van DIO op de proliferatie van DAKIKI-cellen, de secretie van IgA en Gd-IgA1, C1GalT1 en Cosmc bestudeerd door middel van celtelling kit-8 (CCK-8) assay, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) test, kwantitatieve real-time polymerasekettingreactie (QRT-PCR) en western blotting (WB). In in vivo studies werd IgA-afzetting vergezeld van glomerulaire mesangiale hyperplasie en verhoogde expressie van CD20 en CXCR5 in Peyer's patch in de IgAN-modelmuis verlicht door DIO. In vitro studies toonden aan dat 0,25 μg/ml tot 1,0 μg/ml DIO LPS-geïnduceerde DAKIKI-celproliferatie, IgA- en Gd-IgA1-secretie remde en de mRNA- en eiwitexpressie van C1GalT1 en Cosmc opreguleerde. Deze studie toont aan dat DIO de productie van Gd-IgA1 kan verminderen door overmatige activering van IgA-afscheidende cellen te remmen en C1GALT1/Cosmc-expressie te verhogen.

Inleiding

IgA-nefropathie (IgAN) is de meest voorkomende vorm van primaire glomerulonefritis, waarvoor geen specifieke behandeling bestaat, en het blijft een belangrijke oorzaak vannierziekte in het eindstadium. Hoewel de pathogenese van IgAN nog steeds niet volledig wordt begrepen, wordt de "multi-hit-hypothese" algemeen aanvaard en ondersteund door een grote hoeveelheid klinisch en experimenteel onderzoeksbewijs2. De pathogenese van IgAN omvat het activeren van B-cellen en het produceren van galactose-deficiënt IgA1 (Gd-IgA1)3. De toename van circulerend Gd-IgA1 als gevolg van de overmatige proliferatie en activering van IgA-afscheidende cellen tijdens de mucosale immuunrespons is een cruciale schakel in de pathogenese van IgAN 4,5,6. Als centrale plaats voor de proliferatie en activering van de conversie van het fenotype van B-lymfocyten naar IgA-afscheidende cellen, is Peyer's pleister de primaire bron van IgA-secretie, nauw verwant aan het voorkomen en de ontwikkeling van IgAN 7,8. Bovendien werden de proliferatie van IgA1-afscheidende cellen, evenals de expressie van Core 1β-1,3-galactosyltransferase (C1GalT1) en C1GalT1-specifieke moleculaire chaperonne (Cosmc), geassocieerd met abnormale glycosylering van IgA1, die GD-IgA1-productie veroorzaakt bij IgAN-patiënten 6,9.

De klinische studie naar IgAN-behandeling met kruidengeneeskunde is de afgelopen jaren gevorderd. Yiqi Qingjie-formule is een essentiële formule voor de behandeling van IgAN door de afdeling Nefrologie van het Guang'anmen-ziekenhuis. Uit de vorige studie van onze groep bleek dat Gd-IgA1 afnam in het serum van IgAN-patiënten na behandeling met Yiqi Qingjie Formula. Als een van de meest gebruikte kruiden in de Yiqi Qingjie-formule is Dioscoreae Nipponicae Rhizoma (DNR) de gedroogde wortelstok van Dioscorea Nipponica Makino, die verschillende functies heeft, zoals het reguleren van de immuniteit, het onderdrukken van ontstekingen, het verlichten van hoest en astma10,11. Verschillende geleerden behandelden IgAN met DNR en bereikten goede resultaten 12,13,14. Als het belangrijkste actieve ingrediënt in DNR15 verlaagt dioscine (DIO) urinezuur, remt fibrose, remt ontstekingsreacties en anti-oxidatieve stress16,17. Daarom kan DIO een nieuw werkingsmechanisme hebben om de cellulaire secretie van overmatig Gd-IgA1 te remmen en specifieke nierbeschermingseffecten uit te oefenen. Toch is er geen onderzoek gerapporteerd naar het werkingsmechanisme van DIO voor de behandeling van IgAN.

Om het potentiële therapeutische mechanisme van DIO op IgAN te onderzoeken en een nieuwe methode voor de behandeling van IgAN te bieden, hebben we experimenten uitgevoerd voor de therapeutische effecten van DIO op IgAN in vivo en in vitro.

Protocol

De ethische commissie van het Guanganmen-ziekenhuis keurde dit experiment goed (ethisch goedkeuringsnummer voor dierproeven: IACUC-GAMH-2023-003).

1. Muizen voorbereiden op de experimentele procedure

  1. Kweek 22 mannelijke Balb/c-muizen van SPF-kwaliteit (6-7 weken oud, lichaamsgewicht 20-25 g) in de dierenfaciliteit van het ziekenhuis/onderzoekscentrum. Verdeel de dieren in controlegroepen (n = 8) en modelgroepen (n = 14) met behulp van de methode met willekeurige getallen.
  2. Na 1 week adaptieve opfok in de laboratoriumkooi, de modelgroep (IgAN-groep) voeden met 0,1% rundergammaglobuline (BGG) oplossing in aangezuurd water met 6 mmol/L HCl gedurende 9 weken volgens het modelleringsprotocol van Zou et al.18.
  3. Injecteer 0,1 ml 0,1% BGG-oplossing in zoutoplossing in de staartader gedurende 3 opeenvolgende dagen terwijl u BGG-oplossing blijft drinken om een IgAN-experimenteel muismodel18 te bereiden.
  4. Laat de controlegroep gedurende 9 weken vrijelijk 6 mmol/L HCl aangezuurd water zonder BGG drinken. Injecteer het overeenkomstige volume zoutoplossing in de staartader gedurende 3 opeenvolgende dagen.
    OPMERKING: De controle- en modelgroepen kregen dezelfde kwaliteit als normaal voer.
  5. Selecteer na de injectie van de staartader willekeurig 2 muizen in de controlegroep en 2 muizen in de modelgroep en onderzoek ze door middel van proteïnurie, lichtmicroscopie en immunofluorescentie om te bepalen of de modellering succesvol was.
    OPMERKING: Er wordt geen voedsel aan de dieren verstrekt, maar het is niet verboden om water te geven; Registreer de urineproductie.
  6. Verzamel urine gedurende 24 uur in metabolische kooien en centrifugeer deze gedurende 5 minuten op 400 x g ; Gooi urinebezinksel weg. Meet na een 10-voudige verdunning van het supernatant de proteïnurieconcentratie met behulp van een urine-eiwittestkit en vermenigvuldig deze vervolgens met de verdunningsfactor en het urinevolume om 24 uur totaal urine-eiwit te verkrijgen.
    OPMERKING: Microscopie- en immunofluorescentiemethoden worden weergegeven in respectievelijk secties 3 en 4.
  7. Nadat u het model met succes hebt voorbereid, verdeelt u 12 muizen in de modelgroep in 6 muizen, elk in de modelgroep (IgAN-groep) en de DIO-gavagegroep (DIO-groep), volgens de methode van de willekeurige getallentabel.
  8. Laat de controlegroep 6 mmol/L HCl aangezuurd water zonder BGG blijven drinken, en de modelgroep 0,1% BGG-oplossing bestaande uit aangezuurd water met 6 mmol/L HCl. Bereken de dosis van de DIO-groep gavage toediening volgens de dosisconversieformule van de farmacologische experimentele methodologie (omgerekend volgens de menselijke lichaamsgewicht van 70 kg)19. Gavage DIO tabletten 0,06 g/kg eenmaal daags gedurende 8 weken.
  9. Verdoof de muizen na 8 weken maagsonde intraperitoneaal met 0,4% pentobarbitalnatrium (60 mg/kg) en isoleer de nieren en de Peyer-pleister na bevestiging van de juiste verdoving door teenknijpen voor daaropvolgende lichtmicroscopie en immunohistochemische analyses.
    OPMERKING: Het schema voor het in vivo model staat in aanvullende figuur 1.

2. Histologische analyse

  1. Paraffinesecties voor nieren en Peyer's patch
    1. Fixeer nierweefsel van 3 mm dik of 1 Peyer's patch met 4% paraformaldehyde gedurende 24 uur, dehydrateer met gradiënt ethanol en xyleen. Dompel 2 uur in was, verzegel en vries in.
    2. Snijd niersecties van 2 μm dik en 4 μm dikke Peyer's patch-secties af en spreid ze uit in warm water. Schep de ongevouwen plakjes op met een schoon glasplaatje en bak ze 1 uur in een oven met constante temperatuur op 40 °C. Begin met kleuren na de voorbewerking van het preparaat.
      OPMERKING: Neem het coronale oppervlak van het hilarische deel van de nier, met een dikte van 3 mm weefselblok.
  2. Ontwax en kleur de paraffinesecties bij kamertemperatuur (RT) gedurende 10 minuten met periodieke zuuroplossing, vermijd licht. Spoel af met gedestilleerd water en veeg drooggekleurd met Schiff's kleuroplossing gedurende 20-30 minuten, vermijd licht. Spoel af met gedestilleerd water tot de secties rood waren onder de microscoop.
  3. Plaats de secties in hematoxylinekleuringsoplossing, kleur de kernen gedurende 3 minuten (te diep gekleurde kernen kunnen worden gedeeld door ethanolhydrochloride) en spoel af met stromend water totdat de objectglaasjes kleurloos zijn.
  4. Voer routinematige uitdroging uit met gradiëntconcentraties van ethanol en xyleen, sluit de secties af met neutrale gom en observeer onder een microscoop. PAS-positief is rood en de kern is blauw.

3. Immunohistochemische analyse van de Peyer's patch

  1. Bereid paraffinesecties van de Peyer's patch voor zoals beschreven in stap 2.1.
    OPMERKING: De dikte van de secties voor immunohistochemische en daaropvolgende immunofluorescentie is 4 μm.
  2. Ontwas de paraffinesecties:
    1. Leg de secties 5 minuten in xyleen I, xyleen II gedurende 5 minuten en xyleen III gedurende 5 minuten.
    2. Spoel de objectglaasjes verder 5 minuten af in watervrije ethanol I, watervrije ethanol II gedurende 5 minuten, 85% alcohol gedurende 5 minuten, 75% alcohol gedurende 5 minuten. Spoel de objectglaasjes vervolgens af in gedestilleerd water.
  3. Ophalen van antigeen
    1. Bereid 50x bouillonoplossing van natriumcitraat en verdun met gedestilleerd water tot 1x voor gebruik. Verwarm het 2 minuten in een autoclaaf en plaats de plakjes vervolgens in de autoclaaf en zorg ervoor dat het vloeistofniveau hoger is dan het niveau van de plakjes.
    2. Verwarm 5 minuten op hoge temperatuur en laat de glaasjes vervolgens op natuurlijke wijze afkoelen. Was de plakjes drie keer met PBS-oplossing gedurende 5 minuten elk.
  4. Blokkering van endogene peroxidase: Markeer de randen van het weefsel in een cirkel met een immunohistochemische pen. Incubeer de secties in 3% waterstofperoxide-oplossing gedurende 15 minuten bij RT, beschermd tegen licht, en was de secties drie keer met PBS-oplossing gedurende 5 minuten per keer.
  5. Serumblokkering: Blokkeer de secties door 10% geitenserum te druppelen op de weefselsecties die gedurende 30 minuten bij RT zijn gemarkeerd. Zorg ervoor dat de secties gelijkmatig bedekt zijn met de vlek.
  6. Incubatie van primaire antilichamen: Schud de blokkeringsoplossing voorzichtig af en voeg een deel van het bereide primaire antilichaam toe (CD20 [1:800]; CXCR5 [1:800]) naar de sectie. Leg het gedeelte plat in een natte bak en incubeer een nacht bij 4 °C.
    OPMERKING: Voeg een kleine hoeveelheid water toe aan de natte doos om verdamping van het antilichaam te voorkomen.
  7. Incubatie van secundaire antilichamen: Was de secties driemaal met PBS-oplossing gedurende 5 minuten per keer. Verwijder PBS door de secties droog te schudden, bedek het weefsel met een druppel secundair antilichaam (HRP-label) van de verwante soort van het primaire antilichaam en incubeer gedurende 50 minuten bij RT.
  8. 3,3'-diaminobenzidine (DAB) homogenisatie: Was de secties driemaal gedurende 5 minuten met PBS-oplossing. Nadat u de secties droog hebt geschud, druppelt u de vers bereide DAB-chromogene oplossing op de secties. Observeer de kleurontwikkelingstijd onder de microscoop; Het positieve is bruingeel. Spoel af met kraanwater om de kleurontwikkeling te beëindigen.
  9. Kleuringskernen: Kleuring opnieuw met hematoxyline gedurende ongeveer 1 minuut, wassen met kraanwater en vervolgens 10 minuten spoelen met kraanwater om weer blauw te worden.
  10. Uitdroging en afdichting:
    1. Leg de secties 5 minuten in 75% alcohol en 5 minuten in 85% alcohol. Leg de secties 5 minuten in watervrije ethanol I, 5 minuten in watervrije ethanol II en 5 minuten in watervrije ethanol III.
    2. Was de secties in xyleen I gedurende 5 minuten, haal ze eruit om lichtjes te drogen en sluit de secties af met neutrale gom.
  11. Beeldacquisitie: Verzamel afbeeldingen door microscopisch onderzoek en analyseer door halo-software voor panoramische beeldanalyse van het weefsel.
    OPMERKING: Met hematoxyline gekleurde kernen zijn blauw en DAB-positieve expressie wordt waargenomen als bruingeel.

4. Renale IgA-immunofluorescentie

  1. Bereid paraffinesecties voor de nieren voor zoals beschreven in stap 2.1.
  2. Dewax paraffine secties:
    1. Leg de secties 5 minuten in xyleen I, xyleen II gedurende 5 minuten en xyleen III gedurende 5 minuten. Behandel de secties in watervrije ethanol I, watervrije ethanol II, 95% ethanol, 90% ethanol, 80% ethanol, 70% ethanol en 50% ethanol, elk gedurende 5 minuten, en was met gedestilleerd water.
  3. Proteïnase K ophalen: Schud de secties droog en teken met een histochemische pen een cirkel rond de weefselsectie. Voeg de proteïnase K-werkoplossing (verhouding 1:9 van stockoplossing en PBS) druppelsgewijs toe om het weefsel te bedekken en incubeer bij 37 °C gedurende 30 min. Was de secties drie keer met PBS gedurende elk 5 minuten.
  4. Penetratie van het celmembraan: Schud de secties lichtjes droog en bedek ze vervolgens met 0,1% Triton. Incubeer gedurende 20 minuten bij RT en was de secties drie keer met PBS gedurende elk 5 minuten.
  5. Blokkeren: Voeg druppelsgewijs 10% geitenserum toe om het weefsel gelijkmatig te bedekken voor blokkering bij RT gedurende 30 minuten.
  6. Incubatie van primaire antilichamen: Voeg druppelsgewijs een geschikte hoeveelheid geit-anti-muis AF488-geconjugeerd IgA-antilichaam (1:500) toe om het weefsel gelijkmatig te bedekken en 's nachts bij 4 °C te incuberen.
  7. Kleuringskernen: Was de plakjes driemaal met PBS gedurende elk 5 minuten. Voeg na het verwijderen van de PBS de 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) vlek druppelsgewijs toe aan de secties en incubeer gedurende 15 minuten bij RT, beschermd tegen licht.
  8. Was en verzegel de secties: Was de secties driemaal met PBS gedurende 5 minuten en verzegel ze vervolgens met een antifade-montagemedium.
  9. Microscopie en fotografie: Bekijk de secties onder een fluorescerende microscoop en maak foto's.
    OPMERKING: Voor DAPI is ultraviolette excitatie een golflengte van 330-380 nm en de emissiegolflengte is 420 nm, blauw licht. De excitatiegolflengte van fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) is 465-495 nm en de emissiegolflengte is 515-555 nm, groen licht.

5. Celcultuur

  1. Verkrijg de humane B-lymfocytenlijn DAKIKI van ATCC, VS. Kweek DAKIKI-cellen in RPMI-1640 medium aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine.
  2. Kweek de cellen in een incubator van 37 °C, 5% CO2 en subcultuur ze elke 2-3 dagen. Gebruik cellen in de logaritmische groeifase voor alle experimenten.
  3. Bij 70%-80% confluentie verzamelt u de cellen met een steriele pipet en centrifugeert u de cellen gedurende 5 minuten op 140 x g . Gooi het supernatant weg, resuspendeer met het serumvrije medium en laat na 24 uur alle cellen in een rustperiode voor de volgende behandeling.

6. LDH-cytotoxiciteitstesten voor het screenen van veilige concentraties DIO op normale DAKIKI-cellen

  1. Zaad DAKIKI-cellen in platen met 96 putjes met een dichtheid van 4x105 cellen/putje en stel een lage controlegroep in, een hoge controlegroep en verschillende concentraties DIO (0,25, 0,5, 1,0, 2,0, 4,0, 8,0 μg/ml). Incubeer in een incubator van 5% CO2, 37 °C gedurende 24 uur na de overeenkomstige behandeling volgens de groeperingsmethode.
  2. Voeg volgens de instructies van de cytotoxiciteitsdetectiekit 5 μL lysaat per putje toe in de hoge controlegroep en plaats de plaat vervolgens gedurende 15 minuten in een incubator van 5% CO2, 37 °C.
  3. Haal de plaat eruit, voeg 100 μL van het reactiemengsel toe aan elk putje, incubeer 10 minuten in het donker bij RT en voeg vervolgens 50 μL van de stopreactieoplossing toe. Meet zo snel mogelijk de OD-waarde bij 490 nm op de microplaatlezer.
  4. Bereken de LDH-afgiftesnelheid van verschillende concentraties DIO en ≤10% als de maximale dosis die wordt toegediend volgens de formule: LDH-afgiftesnelheid = (experimentele put LDH - lage controle LDH) / (hoge controle LDH - lage controle LDH) x 100%.

7. CCK-8 test voor het detecteren van het effect van DIO op de proliferatie van DAKIKI-cellen

  1. Op basis van de resultaten van onze eerdere experimenten20 een IgAN-model opstellen met LPS 40 μg/ml om DAKIKI-cellen te induceren.
  2. Zaai vervolgens 4x105 cellen/putje in platen met 96 putjes en verdeel het in de controle-, model- en DIO-groepen met lage, gemiddelde en hoge concentratie (0.25 μg/ml, 0.5 μg/ml en 1.0 μg/ml). Incubeer de platen gedurende 24 uur in een incubator van 5% CO2, 37 °C.
  3. Voeg vervolgens 20 μl CCK-8-reagens toe aan elk putje en plaats de platen gedurende 2 uur terug in de incubator (5% CO2, 37 °C). Detecteer na de incubatie zo snel mogelijk de OD op een golflengte van 450 nm op de microplaatlezer.

8. ELISA voor het detecteren van het effect van DIO op de secretie van IgA en Gd-IgA1 door DAKIKI-cellen

  1. Zaad DAKIKI-cellen in platen met 6 putjes met een dichtheid van 6x106 cellen/putje, groepeer en behandel de cellen volgens stap 7.2. Kweek de cellen gedurende 24 uur en centrifugeer vervolgens gedurende 10 minuten bij 850 x g bij 4 °C om het supernatans te verkrijgen.
  2. Detecteer IgA- en Gd-IgA1-concentraties volgens de instructies van de kit.

9.qRT-PCR voor het detecteren van het effect van DIO op C1GALT1- en Cosmc-mRNA-niveaus in DAKIKI-cellen

  1. Zaai de DAKIKI-cellen met een dichtheid van 6x106 cellen/putje in een plaat met 6 putjes, groepeer en behandel de cellen zoals vermeld in stap 7.2, en incubeer gedurende 24 uur. Extraheer totaal RNA uit DAKIKI-cellen volgens de instructies van de totale RNA-extractiekit.
  2. Na het nemen van 1 μL geëxtraheerd RNA van elke groep monsters en het meten van de concentratie, transcribeert u omgekeerd 1 μg totaal RNA van elk monster in cDNA volgens de instructies van de kit.
  3. Voer vervolgens RT-PCR-amplificatie uit om de expressie van elk gen te detecteren (95 °C gedurende 15 minuten, 95 °C gedurende 10 s en 60 °C gedurende 30 s). Bereken het expressieniveau van elk gen met behulp van de 2-ΔΔCT-methode met β-actine als interne referentie.
    OPMERKING: De primersequenties waren als volgt:
    C1GALT1: 5'-AAGGTTGACACCACAGCCTAA-3', 5'-CTTTGACGTTTTTGGCCTTT-3";
    Cosmc: 5'-GCTCCTTTTTGAAGGGTGTG-3', 5'-TACTGCAGCCCAAAGACTCA-3';
    β-actine: 5'-TCACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3', 5'-CAGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3'.

10. Western blotting voor het onderzoeken van het effect van DIO op de expressie van C1GALT1- en Cosmc-eiwitten in DAKIKI-cellen

  1. Zaai de DAKIKI-cellen met een dichtheid van 6x106 cellen/putje in een plaat met 6 putjes. Groepeer en behandel ze zoals vermeld in stap 7.2. Verzamel na 24 uur incubatie elke groep cellen.
  2. Voeg een geschikte hoeveelheid cellyse-oplossing toe (PMSF: fosfataseremmer: RIPA lysisoplossing = 1:1:100) en incubeer gedurende 30 minuten op ijs. Centrifugeer vervolgens bij 13.500 x g gedurende 10 minuten bij 4 °C en vang het supernatant op.
  3. Bepaal de eiwitconcentratie met behulp van de BCA-eiwitconcentratietestkit.
  4. Meng de eiwitmonsters met 5x SDS-PAGE-laadbuffer op 4:1 door middel van vortexen en verwarm de gemengde monsters gedurende 5 minuten op 100 °C om het eiwit te denatureren.
  5. Om eiwitten met verschillende molecuulgewichten te detecteren, voegt u de eiwitmarker (5 μl/putje) en monsters (20 μg/putje) toe aan verschillende banen van een 12% SDS-PAGE-gel, voert u SDS-PAGE-elektroforese uit en brengt u de gel over naar PVDF-membranen.
  6. Blokkeer de membranen met 5% magere melk gedurende 2 uur bij RT en incubeer met de overeenkomstige primaire antilichamen (C1GALT1 [1:1000], Cosmc [1:2000]) gedurende 24 uur. Gebruik β-actine-antilichaam (1:100000) als interne controle.
  7. Was het polyvinylideenfluoride (PVDF) membraan met 1x Tris-gebufferde zoutoplossing, 0,1% Tween 20 wasmiddel (TBST) driemaal (10 min/tijd) en incubeer vervolgens met het overeenkomstige secundaire geitenanti-konijn IgG-antilichaam (1: 10000) bij RT gedurende 2 uur.
  8. Was het membraan opnieuw met TBST (drie keer gedurende 10 minuten elk) en behandel het met een geschikte hoeveelheid verbeterde chemiluminescentie (ECL) werkoplossing (volgens de instructies van de fabrikant) voor detectie van eiwitbanden.
  9. Leg de beelden vast met behulp van het chemiluminescentiebeeldvormingssysteem en voer een semi-kwantitatieve analyse uit van de grijswaarden van eiwitten met behulp van het Image J-beeldanalysesysteem.

11. okt. Statistische analyse

  1. Gebruik een geschikte softwaretoepassing voor het analyseren van de gegevens. Druk alle gegevens uit als het gemiddelde ± SD (standaarddeviatie) en evalueer meerdere monsters door middel van een eenrichtings-ANOVA-test voor vergelijking tussen groepen.
    OPMERKING: SPSS statistische software 26.0 werd gebruikt voor statistische analyse. De LSD-methode werd gebruikt voor tweerichtingsvergelijkingen tussen groepen wanneer de varianties gelijk waren, en de Dunnett T3-methode werd gebruikt voor tweerichtingsvergelijkingen tussen groepen wanneer de varianties niet gelijk waren. P<0,05 werd beschouwd als een statistisch significant verschil.

Resultaten

Effect van DIO op nierweefsel in IgAN muizenmodel

Vergeleken met de controlegroep had het mucosale immuungeïnduceerde IgAN-muizenmodel (modelgroep) een significante toename van proteïnurie (aanvullende figuur 2), was IgA-afzetting zichtbaar in het mesangiale gebied, was de fluorescentie gelijkmatig verdeeld in clusters over het gehele mesangiale gebied (figuur 1A), PAS-kleuring van het nierweefsel vertoonde proliferatie van mesangiale cellen en stromale hyperplasie (figuur 1B), die werd verminderd in de DIO-gavagegroep (DIO-groep).

Effect van DIO op B-lymfocyten in Peyer's patch

Peyer's patch is de belangrijkste plaats van de omzetting van B-lymfocyten in IgA-afscheidende cellen. We namen Peyer's patch als onderzoeksobject om het effect van DIO op B-lymfocyten te observeren door de expressie van B-celmarkers CD20 en CXCR5 te detecteren. Immunohistochemische resultaten toonden aan dat de expressie van CD20 en CXCR5 significant hoger was in de modelgroep in vergelijking met de controlegroep. DIO zou de expressie van de bovengenoemde moleculaire markers kunnen remmen (Figuur 2A,B).

Het veilige concentratiebereik van DIO op DAKIKI-cellen

LDH is een marker van de integriteit van het plasmamembraan en een indicator van celdood, waarbij hogere LDH-afgiftesnelheden duiden op ernstigere celbeschadiging. De LDH-afgiftetest werd gebruikt om het veilige concentratiebereik van DIO te bepalen. De maximale veilige concentratie van DIO werd bepaald door een LDH-afgiftesnelheid van minder dan 10%. De resultaten (figuur 3) toonden geen significante cytotoxiciteit geïnduceerd door DIO bij concentraties van 0,25 tot 1,0 μg/ml. Daarom werd in het volgende onderzoek 0,25, 0,5 en 1,0 μg/ml DIO als doseringsniveau gebruikt.

Effecten van DIO op de proliferatie van DAKIKI-cellen

De experimentele resultaten (Figuur 4) toonden aan dat DIO in vergelijking met de modelgroep (LPS-gestimuleerde groep) de LPS-geïnduceerde DAKIKI-celproliferatie remde op een concentratie-afhankelijke manier. DIO bij concentraties van 0,5 en 1,0 μg/ml remde de door LPS geïnduceerde DAKIKI-celproliferatie significant (P < 0,01).

Effecten van DIO op de secretoire functie van DAKIKI-cellen

Gd-IgA1-niveaus zijn nauw verwant aan het pathologische proces van IgAN, en totaal IgA wordt samen getest als een indicator van de cellulaire secretoire functie. Een ELISA-test werd gebruikt om het IgA- en Gd-IgA1-gehalte in het supernatans van de DAKIKI-celcultuur te detecteren. De resultaten toonden aan (Figuur 5A,B) dat DAKIKI-cellen gestimuleerd door LPS meer IgA uitscheidden in vergelijking met de controlegroep (P < 0,01). Ter vergelijking: DIO remde DAKIKI-cellen significant om IgA (P < 0,01) op een concentratie-afhankelijke manier uit te scheiden. Vergeleken met de controlegroep scheidden DAKIKI-cellen gestimuleerd door LPS meer Gd-IgA1 uit met een statistische tendens (P < 0,10), en DIO remde de Gd-IgA1-secretie van LPS-gestimuleerde DAKIKI-cellen op een concentratie-afhankelijke manier (P < 0,05 en P < 0,01), waaronder DIO bij 1,0 μg/ml de secretie van Gd-IgA1 significant remde met de geremde snelheid van 25%.

Het mechanisme van DIO remt de secretie van Gd-IgA1 door DAKIKI-cellen

Om het mogelijke mechanisme van DIO dat overmatige Gd-IgA1-secretie door DAKIKI-cellen remt, verder te onderzoeken, werden de niveaus van geglycosyleerd transferase C1GALT1 en chaperonne-eiwit Cosmc-mRNA in DAKIKI-cellen gedetecteerd door qRT-PCR, en de resultaten toonden aan (Figuur 6A,B) dat de relatieve mRNA-expressie van C1GALT1 en Cosmc neerwaarts werd gereguleerd in DAKIKI-cellen in de modelgroep in vergelijking met de controlegroep (P < 0,01). DIO verhoogde de relatieve mRNA-expressie van C1GALT1 en Cosmc in verschillende mate in vergelijking met de modelgroep, waarbij DIO 1,0 μg /ml de relatieve mRNA-expressie van C1GALT1 en Cosmc significant opreguleerde (P < 0,05).

Tegelijkertijd werd de WB-methode gebruikt om het effect van DIO op de eiwitexpressie van C1GALT1 en Cosmc in DAKIKI-cellen te detecteren. Vergeleken met de controlegroep nam de eiwitexpressie van C1GALT1 en Cosmc in DAKIKI-cellen in de modelgroep duidelijk af (P < 0,05). Vergeleken met de modelgroep was de eiwitexpressie van C1GALT1 en Cosmc na DIO-interventie opwaarts gereguleerd. De eiwitexpressie van C1GALT1 en Cosmc werd significant verhoogd door DIO bij een concentratie van 1,0 μg/ml (P < 0,05) (Figuur 7A-C).

figure-results-1
Figuur 1: Histopathologie van de nieren. (A) Immunofluorescentiemicroscoop. Niersecties van muizen in elke groep werden gekleurd met anti-IgA (groen) en DAPI (blauw). De bovenstaande schaalbalk van de afbeelding = 200 μm. De onderstaande schaalbalk van de afbeelding = 50 μm. n = 6 per groep. (B) Representatieve foto's van PAS-kleuring van nierweefsel van muizen in de controle-, model- en DIO-groepen. Schaal balk = 30 μm. De neerwaartse pijl toont de mesangiale cellen en de opwaartse pijl toont het stroma. Schaal balk = 30 μm. n = 6 per groep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Effect van DIO op B-lymfocytenmarkers. (A) De expressie van CD20 in de Peyer's patch. Schaal balk = 200 μm. n = 6 per groep. (B) De expressie van CXCR5 in de Peyer's patch. De schaalbalken bevinden zich in de rechterbenedenhoek van de afbeelding. Schaal balk = 200 μm. n = 6 per groep. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3. Screening van de veilige concentratie van DIO op DAKIKI-cellen. Statistische waarden worden uitgedrukt als het gemiddelde ± SD van drie onafhankelijke experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4. Verschillende concentraties DIO beïnvloeden de proliferatie van DAKIKI-cellen. De gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ±SD. Vergeleken met de controlegroep < **P 0,01; vergeleken met de modelgroep #P < 0,05' ##P < 0,01; De resultaten van alle experimenten werden drie keer herhaald. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-5
Figuur 5. DIO remt de secretie van IgA en Gd-IgA1 door DAKIKI-cellen. (A) De ELISA-methode detecteerde de expressie van IgA in elke groep. (B) De ELISA-methode detecteerde de expressie van Gd-IgA1 in elke groep. De gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± SD. Vergeleken met de controlegroep < **P 0,01; vergeleken met de modelgroep, #P < 0,05, ##P < 0,01; Alle experimentele resultaten werden drie keer herhaald. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-6
Figuur 6. Het mechanisme van DIO remt overmatige Gd-IgA1-secretie door DAKIKI-cellen. (A) QRT-PCR detecteerde de mRNA-expressie van C1GALT1. (B) QRT-PCR detecteerde de mRNA-expressie van Cosmc. De gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± SD. Vergeleken met de controlegroep, **P<0,01; vergeleken met de modelgroep < #P 0,05, ##P < 0,01; Alle experimentele resultaten werden drie keer herhaald. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-7
Figuur 7. DIO beïnvloedt de eiwitexpressie van C1GALT1 en Cosmc in DAKIKI-cellen. (A) WB verifieerde de opregulatie van de eiwitexpressie van C1GALT1 en Cosmc door DIO. (B) Semi-kwantitatieve analyse van C1GALT1 expressie werd uitgevoerd met behulp van afbeelding J. (C) Semi-kwantitatieve analyse van Cosmc-expressie met behulp van afbeelding J. De gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ±SD. Vergeleken met de controlegroep,*P < 0,05; vergeleken met de modelgroep, #P < 0,05, ##P < 0,01, werden alle experimentele resultaten drie keer herhaald. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende figuur 1. Het schema voor het in vivo model. Klik hier om deze figuur te downloaden.

Aanvullende figuur 2. Veranderingen in proteïnurie. De gegevens werden uitgedrukt als gemiddelde ± SD; n = 6 per groep. Klik hier om deze figuur te downloaden.

Discussie

Het kenmerkende pathologische kenmerk van IgAN is de afzetting van IgA1- en GD-IgA1-bevattende immuuncomplexen in het mesangiale gebied van de glomerulus21,22. Het verminderen van de vorming van immuuncomplexen kan nierbeschadiging verminderen en de klinische symptomen van IgAN verlichten. In een in vivo experiment bestudeerden we de therapeutische effecten van DIO op IgAN, en we ontdekten dat DIO de IgA-afzetting in de nier van IgAN-modelmuizen kan verminderen. Het is aangetoond dat de accumulatie van IgA-afscheidende cellen in de nier verband houdt met de pathogenese van IgAN23. Als een belangrijke plaats van proliferatie en activering van B-lymfocyten, is Peyer's patch een belangrijke bron van IgA-afscheidende cellen, dus we onderzochten de expressie van B-lymfocytmarkers (CD20, CXCR5) in Peyer's patch en ontdekten dat DIO de expressie van B-lymfocyten in het Peyer's patch van IgAN-muizenmodel zou kunnen remmen. Deze experimentele resultaten zouden een basis kunnen vormen voor het toepassen van DIO bij de behandeling van IgAN.

We hebben de volgende experimenten In vitro uitgevoerd om het werkingsmechanisme van DIO op IgAN verder te onderzoeken. Ten eerste is al eerder aangetoond dat DAKIKI, een EBV-vereeuwigde B-cellijn die IgA1 afscheidt, waarvan een deel GD-IgA124 is, ideaal is voor in vitro onderzoek naar het werkingsmechanisme van het geneesmiddel op IgAN. We kozen voor DAKIKI-cellen om het moleculaire mechanisme van DIO bij de behandeling van IgAN te onderzoeken. Bovendien speelt de mucosale inflammatoire immuunrespons een integrale rol in de pathogenese van IgAN. Zoals hierboven vermeld, gebruiken we LPS om DAKIKI-cellen te stimuleren, die pro-inflammatoire factoren kunnen vrijgeven en ontstekingsreacties kunnen mediëren, die het mechanisme van mucosale immuunresponsen in IgAN beter kunnen nabootsen. Het in vitro cellulaire model kan helpen bij het onderzoeken van de mogelijkheid en het mechanisme van andere geneesmiddelen voor de behandeling van IgAN. De resultaten toonden aan dat DIO de proliferatie van door LPS gestimuleerde DAKIKI-cellen op een concentratie-afhankelijke manier remde. DIO zou de secretie van IgA en Gd-IgA1 in DAKIKI-cellen veroorzaakt door LPS-stimulatie kunnen remmen en de expressie van mRNA en eiwit van C1GalT1 en zijn chaperonne Cosmc in DAKIKI-cellen kunnen opreguleren, wat suggereert dat DIO de secretie van Gd-IgA1 zou kunnen verminderen door C1GALT1/Cosmc-expressie te reguleren en zo de overmatige activering van DAKIKI-cellen te remmen.

Tijdens de experimentele procedures moeten de belangrijkste stappen worden opgemerkt. De concentratie van Gd-IgA1 in het DAKIKI-celsupernatans ligt niet binnen het detectiebereik van de ELISA-kit (1.56 ~ 100 ng/ml) en het verzamelde supernatans moet worden gecentrifugeerd door een ultrafiltratiebuis om het geconcentreerde Gd-IgA1 te verkrijgen. Zorg er ook voor dat het volume supernatans dat van elke groep begint hetzelfde is en dat het uiteindelijke volume concentraat dat na ultrafiltratie wordt verkregen, hetzelfde is.

In deze studie gebruikten we tegelijkertijd zowel in vitro als in vivo methoden, die elkaar wederzijds kunnen ondersteunen in farmacologische effecten en een voorbeeld kunnen zijn voor het bestuderen van de effecten en hun mechanismen van kruidengeneeskunde. Er zijn nog een aantal zaken voor verbetering vatbaar in dit protocol. Ten eerste hebben we geen bloedconcentraties gedetecteerd in de DIO-gagegroep van de muizen; daarom wordt de concentratie van DIO die overeenkomt met bloedconcentraties niet gebruikt in vitro-experimenten . Ten tweede werd alleen het DIO-monomeer, het actieve bestanddeel van DNR, onderzocht; de effecten van andere componenten van DNR op IgAN moeten nog verder worden bestudeerd.

Concluderend biedt deze studie een experimentele basis voor de behandeling van IgAN met DIO, het actieve ingrediënt van DNR. Deze studie stelde een cellulair pathologisch model van IgAN vast door de mucosale immuunrespons van IgAN zowel in vitro als in vivo na te bootsen. Het geeft een nieuw idee voor het bestuderen van traditionele Chinese geneeskunde om IgAN te voorkomen en te behandelen.

Openbaarmakingen

De auteurs verklaren dat ze geen concurrerende financiële belangen hebben.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (81973675).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Anti-CD20/MS4A1 AntibodyBoster Biotechnology CompanyA03780-3
Antifade mounting mediumBeyotime, Shanghai, ChinaP0128S
Balb/c miceBeijing Weitong Lihua Laboratory Animal Technology Co., Ltd.110322220101424000
blocking serumSolarbio, Beijing, ChinaSL038
Bovine gamma globulinShangHai YuanYe Biotechnology CompanyS12031
C1GALT1 polyclonal antibodyProteintech Group, Inc,USA27569-1-AP
Citrate antigen retrieval solution(50×)Phygene Biotechnology CompanyPH0422
COSMC polyclonal antibodyProteintech Group, Inc,USA19254-1-AP
Cytotoxiciy detection kitRoche Company4744926001
Dako REAL EnVision detection system, Peroxidase/DAB+DakoK5007
DAPIInvitrogenD1306
DioscinNational Institute For Food and Drug Control111707-201703
DIO tabletsChengdu No 1 Pharmaceutical Co. Ltd.H51023866
ECL working solutionMerck Biotechnology, IncWBKLS0100 
Enhanced cell counting kit-8Beyotime, Shanghai, ChinaC0043
Fasking one-step removal of gene cDNA first-strand synthesis premixTIANGEN,Beijing, ChinaKR118-02
Glycogen Periodic acid Schiff (PAS) stain kit BaSO Biotechnology CompanyBA4080A
Goat anti-mouse IgA-AF488SouthernBiotech1040-30
Goat anti-rabbit IgG antibody (H+L), HRP conjugatedBeiJing Bioss Biotechnology CompanyBS-0295G-HRP
Human Gd-IgA1 ELISA kitIBL27600
Human IgA ELISA kitMultiSciences (LiankeBio)70-EK174-96
Pierce BCA protein assay kitThermo Scientific23227
PMSF solutionBeyotime, Shanghai, ChinaST507
Proteinase K Phygene Biotechnology CompanyPH1521
Rabbit anti-CXCR5 polyclonal antibody BeiJing Bioss Biotechnology Companybs-23570R
RIPA lysis bufferBeyotime, Shanghai, ChinaP0013B
RNAsimple total RNA extraction kitTIANGEN,Beijing, ChinaDP419
RPMI Medium 1640Solarbio, Beijing, China31800
Super-Bradford protein assay kitCWBIO, Beijing, ChinaCW0013
Triton X-100Beyotime, Shanghai, ChinaST795
β-Actin Rabbit mAbAbclonal, Wuhan, ChinaAC026

Referenties

  1. Knoppova, B., et al. The origin and activities of IgA1-containing immune complexes in IgA nephropathy. Frontiers in Immunology. 7, 117(2016).
  2. Suzuki, H., et al. The pathophysiology of IgA nephropathy. Journal of The American Society of Nephrology. 22 (10), 1795-1803 (2011).
  3. He, L., et al. Synthetic double-stranded RNA poly(I:C) aggravates IgA nephropathy by triggering IgA class switching recombination through the TLR3-BAFF axis. American Journal of Nephrology. 42 (3), 185-197 (2015).
  4. Zhao, N., et al. The level of galactose-deficient IgA1 in the sera of patients with IgA nephropathy is associated with disease progression. Kidney International. 82 (7), 790-796 (2012).
  5. Xing, Y., et al. C1GALT1 expression is associated with galactosylation of IgA1 in peripheral B lymphocyte in immunoglobulin a nephropathy. BMC Nephrology. 21 (1), 18(2020).
  6. Qin, W., et al. External suppression causes the low expression of the Cosmc gene in IgA nephropathy. Nephrology Dialysis Transplantation. 23 (5), 1608-1614 (2008).
  7. Sakai, F., et al. Lactobacillus gasseri SBT2055 induces TGF-β expression in dendritic cells and activates TLR2 signal to produce IgA in the small intestine. PLoS One. 9 (8), 105370(2014).
  8. Gutzeit, C., Magri, G., Cerutti, A. Intestinal IgA production and its role in host-microbe interaction. Immunological Reviews. 260 (1), 76-85 (2014).
  9. Serino, G., et al. In a retrospective international study, circulating miR-148b and let-7b were found to be serum markers for detecting primary IgA nephropathy. Kidney International. 89 (3), 683-692 (2016).
  10. Lu, F., et al. Therapeutic effect of Rhizoma Dioscoreae Nipponicae on gouty arthritis based on the SDF-1/CXCR 4 and p38 MAPK pathway: an in vivo and in vitro study. Phytotherapy research: PTR. 28 (2), 280-288 (2014).
  11. Wang, W., Xu, L., Zhou, L., Wan, S., Jiang, L. A Network pharmacology approach to reveal the underlying mechanisms of Rhizoma Dioscoreae Nipponicae in the treatment of asthma. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine: eCAM. 2022, 4749613(2022).
  12. Tian, W. W., Wei, Y. Professor TONG Xiaolin used the experience of Dioscoreae Nipponicae. Jilin Journal of Chinese Medicine. 40 (05), 589-592 (2020).
  13. Rao, X. R., Bai, Y. W. Das Xiwen's experience in treating IgA nephropathy. Beijing Journal of Traditional Chinese Medicine. 9, 691-693 (2008).
  14. Si, Y., Zhang, Y. A data mining study on the pattern of medication use in the treatment of IgA nephropathy by Professor Zhang Yu. Journal of Chinese Physician. 20 (01), 109-111 (2018).
  15. Jiang, H., et al. Optimization of the enzymatic extraction technology of Diosgenin from Dioscorea nipponica. Chinese Traditional Patent Medicine. 39 (03), 621-624 (2017).
  16. Qi, M., et al. Dioscin alleviates lipopolysaccharide-induced inflammatory kidney injury via the microRNA let-7i/TLR4/MyD88 signaling pathway. Pharmacological Research. 111, 509-522 (2016).
  17. Yang, L., et al. Recent advances in the pharmacological activities of Dioscin. BioMed Research International. 2019, 5763602(2019).
  18. Nal Zou, J., et al. Toll-like receptor 4 signaling pathway in the protective effect of Pioglitazone on experimental immunoglobulin A nephropathy. Chinese Medical Journal. 130 (8), 906-913 (2017).
  19. Xu, S. Y., Bian, R. L., Chen, X. Pharmacological experiments methodology. Chinese Pharmacological Bulletin. 1, 19(1992).
  20. Shen, J. C., Ren, Y., Rao, X. R., You, Y., Li, S. Network pharmacology, molecular docking, and in vitro experiments to explore the molecular mechanism of Dioscorea Nipponica Makion in the treatment of IgA nephropathy. World Journal of Integrated Traditional and Western Medicine. 16 (12), 2246-2254 (2021).
  21. Mestecky, J., et al. IgA nephropathy: molecular mechanisms of the disease. Annual Review of Pathology. 8, 217-240 (2013).
  22. Novak, J., et al. IgA1-containing immune complexes in IgA nephropathy differentially affect proliferation of mesangial cells. Kidney International. 67 (2), 504-513 (2005).
  23. Nihei, Y., et al. Identification of IgA autoantibodies targeting mesangial cells redefines the pathogenesis of IgA nephropathy. Science Advances. 9 (12), (2023).
  24. Raska, M., et al. Identification and characterization of CMP-NeuAc: GalNAc-IgA1 alpha2,6-sialyltransferase in IgA1-producing cells. Journal of Molecular Biology. 369 (1), 69-78 (2007).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Behandeling met dioscinePeyerse plakketDAKIKI cellenC1GalT1 expressieCosmc expressieimmunohistochemieWestern blotting

Gerelateerde artikelen