Method Article

Vergelijking van twee representatieve methoden voor differentiatie van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen in mesenchymale stromale cellen

DOI:

10.3791/65729

⸱

October 20th, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1National Clinical Research Center for Child Health, The Children's Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2Department of Nephrology, The Children's Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 3Zhejiang University School of Medicine, 4Liangzhu Laboratory, Zhejiang University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit protocol beschrijft en vergelijkt twee representatieve methoden voor het differentiëren van hiPSC's in mesenchymale stromale cellen (MSC's). De monolaagmethode wordt gekenmerkt door lagere kosten, eenvoudigere bediening en gemakkelijkere osteogene differentiatie. De embryoïde lichamen (EB's) methode wordt gekenmerkt door een lager tijdsverbruik.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mesenchymale stromale cellen (MSC's) zijn volwassen pluripotente stamcellen die op grote schaal worden gebruikt in de regeneratieve geneeskunde. Aangezien somatische weefsel-afgeleide MSC's worden beperkt door beperkte donatie, kwaliteitsvariaties en bioveiligheid, is er de afgelopen 10 jaar een grote toename geweest in de inspanningen om MSC's te genereren uit door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's). Eerdere en recente inspanningen in de differentiatie van hiPSC's in MSC's waren gecentreerd rond twee kweekmethodologieën: (1) de vorming van embryoïde lichamen (EB's) en (2) het gebruik van monolaagcultuur. Dit protocol beschrijft deze twee representatieve methoden voor het afleiden van MSC uit hiPSC's. Elke methode heeft zijn voor- en nadelen, waaronder tijd, kosten, celproliferatievermogen, de expressie van MSC-markers en hun vermogen tot differentiatie in vitro. Dit protocol toont aan dat beide methoden volwassen en functionele MSC's kunnen afleiden uit hiPSC's. De monolaagmethode wordt gekenmerkt door lagere kosten, eenvoudigere bediening en gemakkelijkere osteogene differentiatie, terwijl de EB-methode wordt gekenmerkt door een lager tijdsverbruik.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mesenchymale stromale cellen (MSC's) zijn van mesoderm afgeleide volwassen pluripotentestamcellen1. MSC's zijn aanwezig in bijna alle bindweefsels2. Sinds MSC's voor het eerst werden ontdekt in de jaren 1970 en met succes werden geïsoleerd uit het beenmerg in 1987 door Friedenstein et al.3,4,5, is een verscheidenheid aan menselijke somatische (inclusief foetale en volwassen) weefsels gebruikt voor het isoleren van MSC's zoals bot, kraakbeen, pezen, spieren, vetweefsel en hematopoëtisch ondersteunend stroma

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. hiPSC's onderhoud

  1. Ontdooien van hiPSC
    1. Haal de cellen uit de vloeibare stikstof en ontdooi de cellen snel in een waterbad van 37 °C. Breng de ontdooicellen over in een buis van 15 ml die is voorbereid met 3 ml iPSC-onderhoudsmedium (materiaaltabel). Meng het medium voorzichtig.
    2. Centrifugeer op 300 x g gedurende 5 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen voorzichtig in 1 ml iPSC-onderhoudsmedium met 10 μM Y-27632 (pipetteer de cellen 2-3 keer op en neer).
    3. Breng de celsuspensie over in een weefselkweekplaat met 6 putjes bedekt met groeifactorgereduceerde (GFR)-extracellul....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Volgens het protocol (Figuur 1A) werden hiPSC's gedifferentieerd in MSC's via de EB-vormings- en monolaagkweekmethoden. Tijdens de differentiatie vertoonden de cellen verschillende representatieve morfologieën (Figuur 1B,C).

Zoals te zien is in figuur 1B, vertonen de hiPSC-kolonies een typische compacte morfologie vóór differentiatie met een duidelijke grens die bestaat uit dicht opeengep.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dit protocol werden twee representatieve methoden onderzocht om hiPSC's te differentiëren in MSC's: 20,21,22,23,24,25,26,27,28,30. Beide methoden waren in staat om MSC's af te leiden u.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

We zijn alle leden van het Mao en Hu Lab, vroeger en nu, enorm dankbaar voor de interessante discussies en geweldige bijdragen aan het project. We zijn het National Clinical Research Center for Child Health dankbaar voor de geweldige steun. Deze studie werd financieel ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (U20A20351 aan Jianhua Mao, 82200784 aan Lidan Hu), de Natural Science Foundation van de provincie Zhejiang in China (nr. LQ22C070004 naar Lidan Hu).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Alizarin red staining kitBeyotime BiotechnologyC0148S
Anti-human-CD105 (PE)Biolegend323206
Anti-human-CD34 (FITC)Biolegend343503
Anti-human-CD45 (APC)Biolegend304011
Anti-human-CD73( APC)Biolegend344006
Anti-human-CD90 (FITC)Biolegend328108
Ascorbic acidSolarbioA8100
BMP-6NovoproteinC012
Carbon dioxide level shakerCrystalCO-06UC6
Compensation BeadsBioLegend424601
CryoStor CS10STEMCELL Technology07959
DexamethasoneBeyotime BiotechnologyST1254
DMEM/F12  mediumServicebioG4610
Fetal bovine serumHAKATAHS-FBS-500
FGF2Stemcell78003.1
GelatinSigma-AldrichG2500-100G
GlutaMAXGibco35050061
human IgG1 isotype control APCBioLegend403505
human IgG1 isotype control FITCBioLegend403507
human IgG1 isotype control PEBioLegend403503
Human TGF-β1Stemcell78067
Human TruStain FcX BioLegend422301
IBMXBeyotime BiotechnologyST1398
IndomethacinSolarbioSI9020
InsulinBeyotime BiotechnologyP3376
iPSC maintenance mediumSTEMCELL Technology85850
ITS Media SupplementBeyotime BiotechnologyC0341-10mL
Matrigel, growth factor reducedBD Corning354230
Oli Red O staining kitBeyotime BiotechnologyC0158S
ProlineSolarbioP0011
Sodium pyruvateThermoFisher11360-070
TGFβ3NovoproteinCJ44
Toluidine blue staining kitSolarbioG2543
TrypLE Express Enzyme(1x) Gibco12604013
Ultra-Low Attachment 6 Well PlateCostar3471
VerseneGibco15040-66
Y-27632Stemcell72304
α-MEMHycloneSH30265
β-glycerophosphateSolarbioG8100

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Weng, Z., et al. Mesenchymal stem/stromal cell senescence: Hallmarks, mechanisms, and combating strategies. Stem Cells Translational Medicine. 11 (4), 356-371 (2022).
  2. Soliman, H., et al. Multipotent stromal cells: One n....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Induced Pluripotent Stem CellsMesenchymal Stromal CellsEmbryoid Body FormationMonolayer CultureMSC DifferentiationFlow CytometryOsteogenic DifferentiationSpindle Shaped MorphologyMSC MarkersRegenerative Medicine

Related Articles