Methodenartikel

Optogenetische signaleringsactivering in zebravisembryo's

3.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65733

⸱

27 oktober 2023

 ,  ,  ,  , 
1Division of Developmental Biology, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, NIH, 2Instrumentation Development and Engineering Application Solutions, National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, NIH

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Optogenetische manipulatie van signaalroutes kan een krachtige strategie zijn om te onderzoeken hoe signalering wordt gedecodeerd bij ontwikkeling, regeneratie, homeostase en ziekte. Dit protocol biedt praktische richtlijnen voor het gebruik van licht-zuurstof-spanningsgevoelige domeingebaseerde Nodale en botmorfogene proteïne (BMP) signaleringsactivatoren in het vroege zebravisembryo.

Samenvatting

Signaalroutes orkestreren fundamentele biologische processen, waaronder ontwikkeling, regeneratie, homeostase en ziekte. Methoden om signalering experimenteel te manipuleren zijn nodig om te begrijpen hoe signalering wordt geïnterpreteerd in deze uiteenlopende contexten. Moleculair optogenetische hulpmiddelen kunnen omkeerbare, afstembare manipulaties van de activiteit van de signaalroute bieden met een hoge mate van spatiotemporele controle en zijn in vitro, ex vivo en in vivo toegepast. Deze tools koppelen lichtgevoelige eiwitdomeinen, zoals het blauw licht homodimeriserende licht-zuurstof-spanningsdetectie (LOV) -domein, aan signaaleffectoren om lichtafhankelijke experimentele controle over signalering te verlenen. Dit protocol biedt praktische richtlijnen voor het gebruik van het op LOV gebaseerde botmorfogenetisch eiwit (BMP) en knoopsignaalactivatoren bOpto-BMP en bOpto-Nodal in het optisch toegankelijke vroege zebravisembryo. Het beschrijft twee controle-experimenten: een snelle fenotypetest om de juiste experimentele omstandigheden te bepalen, en een immunofluorescentietest om de signalering direct te beoordelen. Samen kunnen deze controle-experimenten helpen bij het opzetten van een pijplijn voor het gebruik van optogenetische hulpmiddelen in vroege zebravisembryo's. Deze strategieën bieden een krachtig platform om de rol van signalering in ontwikkeling, gezondheid en fysiologie te onderzoeken.

Inleiding

Signaalroutes stellen cellen in staat om te reageren op hun omgeving en activiteiten te coördineren op weefsel- en organismebrede schaal. Signalen die cruciaal zijn voor de embryonale ontwikkeling zijn onder meer de TGF-bèta-superfamilieleden, botmorfogenetisch eiwit (BMP) en knooppunt 1,2,3. Tijdens de embryogenese vormen de routes die door deze en andere signalen worden gereguleerd het lichaamsplan door genexpressie en aanvullende processen te beheersen om ervoor te zorgen dat diverse weefsels en organen zich goed ontwikkelen en op de juiste manier met elkaar communiceren. Pathologieën, waaronder geboorteafwijkingen en kanker, kunnen optreden wanneer signalering of reacties op signalering verstoord zijn 4,5,6,7. Ondanks rigoureus onderzoek naar signalering, valt er nog veel meer te ontdekken over hoe niveaus en dynamiek worden gedecodeerd in verschillende contexten 8,9,10,11, vooral tijdens de ontwikkeling12,13,14,15,16,17,18,19.

Om te begrijpen hoe signalering wordt gedecodeerd, zou een ideaal experiment zijn om signaleringsniveaus, timing en/of dynamiek te manipuleren - met een hoge mate van ruimtelijke en temporele controle - en de resultaten te beoordelen. Er worden bijvoorbeeld nauwkeurige ruimtelijke signaleringsgradiënten voorgesteld om zich ontwikkelende weefsels tepatroonen20,21. Het wijzigen van de ruimtelijke verdelingen van signaleringsgradiënten zou helpen bij het testen van deze hypothese22. Bovendien wordt het belang van signaaldynamiek bij het genereren van diverse cellulaire reacties steeds duidelijker: dezelfde signaalroute kan cellen instrueren om te differentiëren of te prolifereren, afhankelijk van de signaalfrequentie, bijvoorbeeld 9,23. Experimentele paradigma's waarin de signaaldynamiek gemakkelijk kan worden gemanipuleerd, zullen waardevol zijn om de relatie tussen dynamieken beslissingen over het lot van cellen te onderzoeken. 8,12,13,14,15.

Historisch gezien zijn er meerdere methoden gebruikt om signalering in ontwikkelingscontexten te manipuleren, wat heeft geleid tot fundamentele ontdekkingen 1,2,3. Signalering kan worden geblokkeerd met behulp van pathway loss-of-function-mutanten, ectopische inhibitorexpressie of antagonisten. Methoden om signalering te activeren zijn onder meer agonisten, recombinante liganden, ectopische expressie van liganden of constitutief actieve receptoren, en pathway inhibitor change-of-function mutanten. Deze methoden variëren langs een continuüm van experimentele controle. Mutanten en ectopische expressie kunnen bijvoorbeeld aan de voorhamerkant van het continuüm vallen: met deze benaderingen kunnen dramatische, systemische veranderingen in de activiteit van de route een vroege dood veroorzaken en onderzoek in latere stadia uitsluiten, of na verloop van tijd resulteren in pleiotrope effecten die moeilijk te ontwarren zijn. Bovendien is het vaak een uitdaging om één signaleringskenmerk tegelijk onafhankelijk te manipuleren, zoals niveau of duur. Aan de andere kant van het continuüm bieden sommige methoden een nauwkeurigere experimentele controle, zoals microfluïdische apparaten die monsters blootstellen aan medicijnen of recombinante eiwitten met temporele en soms ruimtelijke controle 18,24,25, of genetische methoden, waaronder hitteschok-induceerbare en weefselspecifieke promotors die vergelijkbare voordelen kunnen bieden16,26,27. Deze methoden kunnen echter moeilijk uit te voeren zijn, zijn mogelijk niet omkeerbaar, hebben een relatief trage kinetiek of een slechte resolutie en zijn mogelijk niet beschikbaar in sommige modelsystemen.

Moleculair optogenetische benaderingen zijn een krachtige aanvulling op deze toolkit. Deze benaderingen maken gebruik van eiwitten die reageren op verschillende lichtgolflengten om biologische processen te manipuleren, waaronder signalering 8,12,13,14,15, en zijn in de loop van tientallen jaren ontwikkeld voor gebruik in een verscheidenheid aan systemen, van celkweek tot hele dieren12,13,28. In vergelijking met historische benaderingen kan moleculaire optogenetica vaak een hogere mate van spatiotemporele controle bieden over biologische processen: de controller in optogenetische systemen is licht en de controle van de golflengte, intensiteit, duur en blootstellingsfrequentie van licht is relatief eenvoudig. Met geavanceerde systemen zoals confocale en twee-fotonmicroscopen is ruimtelijke controle in het subcellulaire bereik mogelijk 29,30,31. Hulpmiddelen om signalering optogenetisch te manipuleren zijn ontwikkeld en toegepast in verschillende systemen, waaronder die beschreven in Johnson et al.22, Čapek et al.32, Krishnamurthy et al.33 en Huang et al.34. Door gebruik te maken van de ruimtelijke controle die wordt geboden door optogenetica, werd deze strategie bijvoorbeeld onlangs gebruikt om een signaalgradiënt in Drosophila-embryo's te wijzigen, wat aantoont dat vliegenembryogenese verrassend robuust is voor veranderingen in deze gradiënt22. De omkeerbaarheid en snelle aan/uit-kinetiek van optogenetische signaalactivatoren hebben ze ook tot aantrekkelijke hulpmiddelen gemaakt voor het onderzoeken van de decodering van signaaldynamiek 8,12,13,14,15,34,35,36.

Het vroege zebravisembryo is een in vivo systeem dat zeer geschikt is voor optogenetische studies omdat het uitwendig bevrucht, transparant, microscopievriendelijk en genetisch handelbaar is. Blootstelling aan licht is gemakkelijker af te leveren bij embryo's die zich buiten de moeder ontwikkelen, licht kan doordringen en toegang krijgen tot hun niet-ondoorzichtige weefsels, levende zebravisembryo's verdragen beeldvorming goed (naast dat ze transparant zijn), en bestaande genetische methoden bieden eenvoudige mogelijkheden voor knockdown- en overexpressie-experimenten, naast de ontwikkeling van nuttige transgenen37.

Onlangs zijn optogenetische hulpmiddelen ontwikkeld om BMP38- en Nodal39-signalering te activeren in zebravisembryo's met blootstelling aan blauw licht (Figuur 1). We noemen deze tools bOpto-BMP en bOpto-Nodal (b voor blauw licht-geactiveerd en Opto voor optogenetisch). bOpto-BMP/Nodal zijn gebaseerd op vergelijkbare pathway-activeringsmechanismen. De binding van BMP- of Nodal-liganden aan hun respectievelijke receptor-serine-threoninekinasen stimuleert receptorkinasedomeininteracties die leiden tot de fosforylering van signaaleffectoren (Smad1/5/9 voor BMP en Smad2/3 voor Nodal). Gefosforyleerde signaaleffectoren verplaatsen zich vervolgens naar de kern en reguleren de doelgenexpressie3 (Figuur 1A,D). Deze receptorkinase-interacties kunnen lichtresponsief worden gemaakt door receptorkinasen te koppelen aan licht-responsieve dimeriserende eiwitten: Bij blootstelling aan licht zouden deze chimere eiwitten moeten dimeriseren, waardoor de receptorkinasedomeinen op elkaar inwerken en signalering activeren (Figuur 1B, C, E, F). Belangrijk is dat, in tegenstelling tot endogene receptoren, bOpto-BMP/Nodal geen extracellulaire ligandbindende domeinen bevatten, wat zorgt voor ligandonafhankelijke activiteit (Figuur 1C,F). Deze optogenetische activeringsstrategie werd eerst bereikt met receptortyrosinekinasen40,41,42 en vervolgens toegepast op receptorserine-threoninekinasen.

bOpto-BMP/Nodal gebruiken het op blauw licht reagerende (~450 nm) homodimeriserende licht-zuurstof-spanningsdetectie (LOV) domein van de algen Vaucheria fridiga AUREO1-eiwit (VfLOV)43,44. Deze constructen bestaan uit een membraangericht myristoylatiemotief, gevolgd door BMP- of knoopreceptorkinasedomeinen, gefuseerd met een LOV-domein (Figuur 1B,E). Blootstelling aan blauw licht zou LOV-homodimerisatie moeten veroorzaken, wat resulteert in receptorkinasedomeininteracties die leiden tot respectievelijke Smad-fosforylering en pathway-activering (Figuur 1C,F). Voor bOpto-BMP bleek een combinatie van constructen met de type I-receptorkinasedomeinen van Acvr1l (ook bekend als Alk8) en BMPR1aa (ook bekend als Alk3) en het type II-receptorkinasedomein van BMPR2a de signalering38 (Addgene #207614, #207615 en #207616) optimaal te activeren. Voor bOpto-Nodal wordt een combinatie van constructen gebruikt met het type I-receptorkinasedomein van Acvr1ba en het type II-receptorkinasedomein van Acvr2ba39.

bOpto-BMP/Nodal zijn geïntroduceerd in vroege zebravisembryo's door mRNA te injecteren in het eencellige stadium, en worden gebruikt om de rol van signaalduur in Nodale interpretatie te onderzoeken39, om te bepalen waarom zebravissen het vermogen verliezen om te reageren op Nodal45, en om te onderzoeken hoe BMP-doelgenen reageren op verschillende BMP-signaleringsniveaus38. Het is waarschijnlijk dat deze instrumenten nuttig zullen blijven in een breed scala van toekomstige onderzoeken. De kracht van optogenetische signaalactivatoren is echter ook hun zwakte: lichtgevoelige monsters moeten met zorg worden behandeld om onbedoelde ectopische signaleringsactiviteit te voorkomen. Blootstelling aan kamerlicht of zonlicht kan bOpto-BMP/Nodal activeren.

Dit protocol biedt praktische suggesties voor het gebruik van mRNA-gecodeerde LOV-gebaseerde BMP- en knoopactivatoren in vroege zebravisembryo's. Het begint met het beschrijven van een strategie om een lichtbak te bouwen om de uniforme blootstelling aan licht en temperatuur te regelen (Figuur 2, Aanvullend bestand 1, Aanvullend bestand 2, Aanvullend bestand 3, Aanvullend bestand 4, Aanvullend bestand 5, Aanvullend bestand 6, Aanvullend bestand 7, Aanvullend bestand 8). Vervolgens worden twee belangrijke controle-experimenten beschreven die bepalen of een optogenetische signaalactivator zich gedraagt zoals verwacht, d.w.z. dat de activiteit van de route alleen wordt geactiveerd bij blootstelling aan licht (Figuur 3). De eerste controletest omvat het onderzoeken van fenotypes één dag na de bevruchting in aan licht blootgestelde en niet-blootgestelde embryo's (Figuur 3A). mRNA-geïnjecteerde aan licht blootgestelde embryo's, maar niet niet-blootgestelde embryo's, moeten BMP of Nodale overexpressie fenokopiëren (Figuur 4A,B; Met name BMP-fenotypes zijn op dit moment duidelijk te onderscheiden46). Deze test zorgt voor een snelle uitlezing van de activiteit. In de tweede controletest, om te bepalen of fenotypes specifiek worden veroorzaakt door overmatige BMP- of knoopsignalering en om de verandering in signaleringsniveaus direct waar te nemen, wordt immunofluorescentiekleuring gebruikt om gefosforyleerde signaaleffectoren (respectievelijk pSmad1/5/9 of pSmad2/3) te detecteren na een blootstelling van 20 minuten aan licht rond het late blastula-/vroege gastrulatiestadium, wanneer de signaalactiviteit goed is beschreven12, 16,17,47,48,49,50 (Figuur 3B en Figuur 4C). (Merk op dat, hoewel ruimtelijk gelokaliseerde activering is aangetoond voor zowel bOpto-BMP38 als bOpto-Nodal39, dit protocol alleen uniforme strategieën voor blootstelling aan licht en signaleringsactivering beschrijft.) Het is raadzaam om deze controle-experimenten uit te voeren voordat bOpto-BMP/Nodal wordt toegepast op specifieke onderzoeksvragen om de ideale lokale experimentele omstandigheden te bepalen.

Protocol

Onderzoeksprotocollen voor zebravissen werden beoordeeld en goedgekeurd door de NICHD Animal Care and Use Committee van de National Institutes of Health (ASP 21-008). Alle zebravisstudies zijn uitgevoerd in overeenstemming met de Leidraad voor de verzorging en het gebruik van proefdieren.

1. Het bouwen van een lichtbak

  1. Om de blootstelling aan licht en de temperatuur te regelen, construeert u een lichtbak die een light-emitting diode (LED) microplaatverlichting als lichtbron gebruikt (Figuur 2A, Tabel met materialen, Aanvullend bestand 1, Aanvullend bestand 2). Deze aanpasbare verlichting biedt dynamische, programmeerbare controle over meerdere golflengten.
    OPMERKING: Er zijn veel mogelijke strategieën om een lichtbak te bouwen, en een alternatieve aanpak kan geschikter zijn (zie bijv. Gerhardt et al.51, Bugaj et al.52, Kumar en Khammash 53, en meer bij https://www.optobase.org/materials/).
  2. Neem de volgende kenmerken op in de lichtbak: temperatuurregeling (28 °C is ideaal voor zebravisembryo's), uitsluiting van ongewenst licht (bijv. kamerlicht en zonlicht), uniforme afgifte van blauw licht dat het doelgebied bestrijkt (bijv. 6-wells plaat) en controle over de lichtintensiteit en belichtingsdynamiek.
    OPMERKING: bOpto-BMP/Nodal worden geactiveerd door blauw licht, maar sommige optogenetische hulpmiddelen reageren op andere golflengten. Gebruik de juiste golflengte voor het optogenetische hulpmiddel.
  3. Boor een gat door de bovenkant van een incubator (Figuur 2B) dat iets breder is dan de LED-uitgangslens.
    1. Zorg ervoor dat er zich geen elektrische componenten in de bovenkant van de couveuse bevinden die door boren worden vernietigd (Tabel met materialen). Dit kan worden vastgesteld door contact op te nemen met de fabrikant van de incubator en dit rechtstreeks te vragen.
    2. Als er een bestaand gat op het bovenpaneel van de incubator zit, gebruik dan een stappenboor om de gatgrootte te vergroten tot 1.25 inch. Gebruik anders een gatenzaag van 1.25 inch met prieel.
    3. Als er interne panelen zijn die de lichtbron blokkeren, boor dan de juiste gatmaat om ervoor te zorgen dat de lichtkegel niet wordt geblokkeerd (Figuur 2A). Panelen zijn meestal gemaakt van dun plaatstaal, dus gebruik lage snelheden en metaalboren om schade te voorkomen (kobaltboor aanbevolen).
  4. Bouw een LED-houder om de LED-microplaatverlichting aan de bovenkant van de incubator te bevestigen (Figuur 2C, Aanvullend bestand 3, Aanvullend bestand 4, Aanvullend bestand 5, Aanvullend bestand 6, Aanvullend bestand 7, Aanvullend bestand 8).
    1. Monteer vier M3 kubusafstandhouders op het verticale beugelstuk met behulp van M3-schroeven.
    2. Bevestig de twee zijbeugels links en rechts van de kubusafstandhouders van de verticale beugel. Monteer nog een kubusafstandhouder op het overgebleven gat op de zijbeugels.
    3. Monteer het verticale beugelstuk op de LED-microplaatverlichting (Materiaaltabel) met behulp van M6-schroeven. Plaats de LED-lenspakking over de lens van het LED-systeem.
    4. Monteer de gemonteerde stukken op de montage van het couveusepaneel en vervolgens op de M3-afstandhouders op de verticale en zijbeugels. Plaats de couveusepakking over het geboorde gat bovenop de couveuse.
    5. Plaats de bevestiging van het couveusepaneel bovenop de pakking van de broedmachine en zorg ervoor dat de pakking en paneelopeningen concentrisch zijn met het gat van de broedstoof. Monteer het paneel aan de bovenkant van de couveuse met behulp van schroeven nr. 8. Zorg ervoor dat deze afdichting lichtdicht is.
  5. Plaats een bord met 6 putjes op de bovenste plank van de couveuse. Bepaal of de lichtstraal de plaat gelijkmatig bedekt (Figuur 2A). Gebruik een vel papier om de lichtdekking te visualiseren.
  6. Als de hele plaat niet door de straal wordt bedekt, vergroot dan de afstand tussen de LED en de plaat door de plank naar beneden te bewegen. Voor het hier beschreven systeem is ~14 inch tussen de LED en de plank voldoende.
  7. Gebruik een lichtmeter om het instralingsniveau en de ruimtelijke uniformiteit te bepalen (tabel met materialen).
  8. Om onbedoelde blootstelling aan zonlicht en kamerlicht te voorkomen, gebruikt u tochtstrips om ervoor te zorgen dat de deur van de couveuse lichtdicht is (Figuur 2A).
  9. Zebravisembryo's ontwikkelen zich robuust bij 28 °C54. Gebruik een geheugenkaartthermometer om ervoor te zorgen dat de lichtbak 28 °C kan bevatten.

2. Genereren van mRNA voor injectie

OPMERKING: pCS2+ is de vectorruggengraat voor bOpto-BMP-constructies38 en bOpto-Nodal-constructies39. Deze vector is ampicillineresistent. bOpto-BMP is samengesteld uit drie constructen (Figuur 1B): BMPR1aa-LOV (Addgene # 207614): Vermoedelijk kinasedomein van de type I BMPR1aa-receptor (ook bekend als Alk3) gefuseerd met LOV; Acvr1l-LOV (Addgene # 207615): Vermeend kinasedomein van de type I Acvr1l-receptor (ook bekend als Alk8) gefuseerd met LOV; en BMPR2a-LOV (Addgene # 207616): vermeend kinasedomein van de type II BMPR2a-receptor en volgend C-terminaal domein gefuseerd met LOV. bOpto-Nodal is samengesteld uit twee constructen (Figuur 1E): Acvr1ba-LOV: vermeend kinasedomein van de type I Acvr1ba-receptor (ook bekend als Acvr1b) gefuseerd met LOV; Acvr2ba-LOV: Vermeend kinasedomein van de type II Acvr2ba-receptor (ook bekend als Acvr2b) gefuseerd met LOV.

  1. Om plasmiden te lineariseren, verteert u tussen 2-5 μg plasmide-DNA met behulp van NotI-restrictie-enzym bij 37 °C gedurende 1-3 uur (materiaaltabel).
    OPMERKING: Het is ook mogelijk om gelineariseerd DNA te genereren met behulp van het plasmide als PCR-sjabloon.
  2. Zuiver DNA met behulp van een standaard op kolommen gebaseerde zuiveringskit (Tabel met materialen).
  3. Gebruik een in vitro SP6-transcriptiekit zoals een mMessage mMachine-kit om RNA te transcriberen van de gelineariseerde sjabloon (Materiaaltabel). Stel twee reacties in volgens de aanbevelingen van de fabrikant om een hogere opbrengst te garanderen.
  4. Zuiver RNA met behulp van een standaard op kolommen gebaseerde RNA-opruimkit (Tabel met materialen). Het is ook mogelijk om te zuiveren via neerslag.

3. MRNA injecteren

  1. Maak ten minste 1 dag voor de injecties injectieschalen en met agarose beklede 6-wells platen.
    1. Bereid 200 ml van 1% agarose in zebravisembryomedium en magnetron tot de agarose volledig is opgelost. Elk standaard zebravisembryomedium moet acceptabel zijn; Sluit methyleenblauw echter uit van het embryomedium, omdat dit de stroomafwaartse beeldvorming in andere toepassingen kan beïnvloeden.
    2. Giet de gesmolten agarose voorzichtig in plastic petrischaaltjes van 100 mm x 15 mm. Vul de schalen halverwege.
    3. Spoel een spuitgietvorm af met embryomedium en plaats deze voorzichtig op gesmolten agarose, zorg ervoor dat er geen luchtbellen tussen de mal en agarose blijven zitten. Gebruik tape om een lipje aan de achterkant van de mal te maken voor eenvoudige plaatsing en ophalen.
    4. De mal moet drijven in de gesmolten agarose. Als de mal zinkt, haal hem dan voorzichtig uit de gesmolten agarose en herhaal stap 3.1.3.
    5. Nadat agarose is gestold, gebruikt u het lipje om de schimmel voorzichtig te verwijderen. Dit kan worden versneld door het gerecht op 4 °C te plaatsen.
    6. Maak met agarose beklede platen met 6 putjes als u werkt met gedechorioneerde embryo's voor immunofluorescentie-experimenten.
    7. Gebruik een plastic wegwerppipet van 10 ml om voldoende gesmolten agarose over te brengen om de bodem van elk putje van een bord met 6 putjes te bedekken.
    8. Bewaar injectieschaaltjes en borden met 6 putjes bij 4 °C. Ze kunnen onmiddellijk worden gebruikt of worden bewaard totdat de agarose is uitgedroogd of besmet (meestal 2-3 weken).
    9. Bereid pipetpunten van gevlamd glas voor als u met gedechorioneerde embryo's werkt voor immunofluorescentie-experimenten.
    10. Steek het uiteinde van een glazen pipet in een vlam van een bunsenbrander en draai continu totdat de randen glad zijn. Gedechorioneerde embryo's moeten comfortabel door het uiteinde van de pipet passen. Laat de opening niet krimpen tot onder de diameter van een embryo.
    11. Koop of trek micro-injectienaalden (Tabel met materialen). Het is raadzaam om op de dag van de injecties extra naalden beschikbaar te hebben voor het geval een vervanging nodig is.
  2. Zet de dag voor de injecties zebraviskwekers op volgens de standaard operationele procedures (SOP's) van het instituut. Houd mannetjes en vrouwtjes gescheiden.
    1. Schakel de temperatuurregelaar van de lichtbak in om 28 °C te behouden. Om ervoor te zorgen dat de temperatuur van de lichtbak op 28 °C blijft, controleert u de temperatuur met een geheugenkaartthermometer (Tabel met materialen).
    2. Bereid mRNA-injectiemix(en) voor. Injecteer equimolaire hoeveelheden van elk construct. Het is noodzakelijk om empirisch te bepalen welke hoeveelheid moet worden geïnjecteerd.
    3. De transcriptiegrootten van bOpto-BMP zijn als volgt:
      Acvr1l-LOV = 2007 nucleotiden (nt)
      BMPR1aa-LOV = 1983 nt
      BMPR2a-LOV = 3409 nt
    4. Om equimolaire hoeveelheden te injecteren, injecteert u 1,01x meer van het Acvr1l-construct dan BMPR1aa; injecteer 1,72x meer van het BMPR2a-construct dan BMPR1aa.
    5. De transcriptiegrootten van bOpto-Nodal zijn als volgt:
      Acvr1ba-LOV en Acvr2ba-LOV zijn beide 1962 nt.
    6. Om equimolaire hoeveelheden te injecteren, injecteert u dezelfde hoeveelheid van elk construct.
    7. Bereid equimolaire injectiemengsels voor, waarbij alle mRNA's die gericht zijn op één route worden gecombineerd tot één injectiemengsel. Voeg indien gewenst fenolrode injectietracer toe. Voor de gegevens in figuur 4 werd 15 pg van elk bOpto-Nodal construct (Acvr1ba-LOV en Acvr2ba-LOV) gebruikt, en voor bOpto-BMP 7,8 pg Acvr1l-LOV en BMPR1aa-LOV, en 13,4 pg BMPR2a-LOV.
    8. Bewaar injectiemengsels bij -20 °C. Zodra de optimale concentratie van het injectiemengsel is bepaald, maakt u aliquots van 5-10 μl en bewaart u deze bij -20 °C of -80 °C.
  3. Injectie dag
    1. Als u een fenotyperingstest uitvoert (Figuur 3A), injecteer dan via het chorion rechtstreeks in het midden van de cel in het eencellige stadium volgens de SOP van uw laboratorium. Het chorion beschermt embryo's tegen omgevingsstressoren en houdt gelyseerde embryo's in bedwang. Dit is nuttig bij het scoren voor een nauwkeurige kwantificering van gelyseerde embryo's (Figuur 4A,B).
    2. Als een immunofluorescentietest wordt uitgevoerd (Figuur 3B), zullen embryo's uiteindelijk moeten worden gedechorioneerd voor beeldvorming (Figuur 4C). Injecteer daarom rechtstreeks in het midden van de cel van gedechorioneerde embryo's in het eencellige stadium (zie Rogers et al.55 voor het dechorioneringsprotocol). Als alternatief kunnen embryo's na fixatie handmatig worden gedechorioneerd, maar dit is omslachtiger dan dechorioneren met pronase.
    3. Gebruik pipetten van gevlamd glas om gedechorioneerde embryo's te hanteren (stap 3.1.10). Zorg ervoor dat u gedechorioneerde embryo's niet blootstelt aan lucht of plastic, waardoor embryo's gaan lyseren. Behandel gedechorioneerde embryo's voorzichtig.
    4. Bereid een extra schaaltje met niet-geïnjecteerde embryo's voor als een proxy om de progressie van het stadium te evalueren (zie stap 4.3.5). Zorg ervoor dat proxy-embryo's afkomstig zijn van dezelfde set experimentele embryo's, zodat alle embryo's tegelijkertijd van dezelfde ouders zijn bevrucht. Dit is nuttig voor de immunofluorescentietest waarbij het stadium relevant is, maar is niet nodig voor de fenotyperingstest.
    5. Gebruik de volgende voorwaarden voor zowel de fenotyperings- als de immunofluorescentietest: 1) niet-geïnjecteerd, niet-belicht, 2) niet-geïnjecteerd, blootgesteld aan licht, 3) geïnjecteerd, onbelicht, 4) geïnjecteerd, blootgesteld aan licht. Selecteer minimaal 30 embryo's per aandoening. Voor een optimale gezondheid van het embryo mag u niet meer dan 30 embryo's per putje uitbroeden in een plaat met 6 putjes.
    6. Breng de embryo's na injectie terug naar gelabelde petrischalen of met agarose beklede platen met 6 putjes (voor gedechorioneerde embryo's) en incubeer ze bij 28 °C. Embryo's zijn nog niet lichtgevoelig. Behandel geïnjecteerde embryo's alsof ze lichtgevoelig zijn na 1,5 uur na de bevruchting (hpf).

4. Experiment met blootstelling aan licht

OPMERKING: Blootstelling aan ~450 nm licht met een bestralingssterkte van 45 W/m2 activeert op robuuste wijze bOpto-BMP/Nodal zonder duidelijke fototoxiciteit (voor informatie over de lichtmeter, zie Tabel met materialen). Het niveau van optogenetisch geactiveerde signalering kan worden afgestemd door de bestralingswaarden te wijzigen38. Fototoxiciteit zal echter moeten worden beoordeeld bij hogere bestralingen.

  1. Tijdgevoelige stap. Verwijder in het 4- tot 16-cellige stadium, ongeveer 1.5 hpf, onbevruchte en ongezonde embryo's. Herverdeel indien nodig om ervoor te zorgen dat elk putje hetzelfde aantal embryo's heeft (niet meer dan 30).
    OPMERKING: Het is belangrijk om deze stap rond het 4- tot 16-cellige stadium uit te voeren, omdat embryo's lichtgevoelig worden als het geïnjecteerde mRNA wordt vertaald naar eiwit. We hebben geen bewijs waargenomen dat embryo's significant lichtgevoelig zijn vóór 1,5 hpf. Om onbedoelde fotoactivering te minimaliseren bij het beoordelen van embryo's na 1.5 hpf, gebruikt u rood licht of bedek u lichtbronnen - inclusief microscoopstadia - met rood gelfilterpapier dat LOV-dimeriserende blauwe golflengten blokkeert (Tabel met materialen).
    1. Evalueer embryo's consequent om onbevooroordeelde verdelingen tussen omstandigheden en experimenten te garanderen.
  2. Gebruik voor de fenotyperingstest het volgende 1-daagse protocol voor blootstelling aan licht vanaf 1,5 hpf (Figuur 3A).
    1. Wikkel de onbelichte bedieningsplaat in aluminiumfolie. Deze plaat moet zowel niet-geïnjecteerde als geïnjecteerde embryo's bevatten. Zorg ervoor dat de plaat volledig bedekt is en zorg ervoor dat er geen scheuren in de folie komen. Plaats deze plaat op de onderste plank van de lichtbak van 28 °C (Figuur 2A).
    2. Plaats de blootgestelde plaat op de bovenste plank van de lichtbak van 28 °C (Figuur 2A). Zorg ervoor dat het deksel op de schaal zit om verdamping van embryomedium te voorkomen. Schakel het blauwe licht in (een bestralingssterkte van 45 W/m2 activeert de signalering krachtig).
    3. Sluit de deur van de lichtbak om onbedoelde blootstelling aan licht in de kamer te voorkomen. Plaats desgewenst een geheugenkaartthermometer in de lichtbak voordat u de deur sluit. Open de deur pas als het fenotype 1 dag na de bevruchting is gescoord (dpf; zie stap 5.1).
  3. Stel voor de immunofluorescentietest embryo's gedurende 20 minuten bloot aan blauw licht, beginnend bij ongeveer 40% epiboly56 (~6 hpf) en fixeer onmiddellijk na blootstelling aan licht, samen met de niet-blootgestelde controles (Figuur 3B). Een blootstelling van 20 minuten aan blauw licht bij 40% epiboly activeert reproduceerbaar de signalering.
    1. Wikkel rond 1.5 hpf zowel de blootgestelde als de onbelichte gerechten afzonderlijk in aluminiumfolie. Zorg ervoor dat de vaat volledig bedekt is en zorg ervoor dat er geen scheuren in de folie komen. Laat de proxy-schotel onuitgepakt. Plaats de verpakte schalen en de onverpakte proxyschaal in de lichtbak van 28 °C (figuur 2A). Schakel de LED nog niet in.
    2. Als u meer dan één hoeveelheid mRNA test, sorteert u voor de niet-blootgestelde aandoening embryo's die met verschillende hoeveelheden zijn geïnjecteerd in individuele met agarose beklede platen met 6 putjes, wat onbedoelde blootstelling aan licht tijdens de daaropvolgende fixatie zal helpen minimaliseren.
    3. Sluit de deur van de lichtbak om onbedoelde blootstelling aan licht in de kamer te voorkomen.
    4. Verdun formaldehydevoorraad tot 4% in 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en aliquot 1 ml in vooraf gelabelde microcentrifugebuisjes van 2 ml met ronde bodem, één buisje per conditie. Bewaren bij 4 °C.
    5. Verwijder rond 5 hpf de proxyschaal met niet-geïnjecteerde embryo's en beoordeel het ontwikkelingsstadium met behulp van een dissectiescoop. Het stadium van de vervangende embryo's moet overeenkomen met het stadium van de lichtgevoelige embryo's in de verpakte schaaltjes.
    6. Verwijder ook de ingepakte vaat, zodat alle gerechten dezelfde temperatuur ervaren. Herhaal dit totdat proxy-embryo's 40% epiboly (~6 hpf) hebben bereikt. De progressie van de embryogenese is temperatuurgevoelig54; Daarom, hoe langer de schalen buiten de broedmachine zijn, hoe langer het duurt voordat de embryo's 40% epiboly bereiken.
    7. Zodra de proxy-embryo's 40% epiboly hebben bereikt, pakt u de blootgestelde schaal uit en plaatst u deze op de bovenste plank van de lichtbak (Figuur 2A). Laat de onbedekte schaal(en) ingepakt en plaats ze op de onderste plank. Schakel onmiddellijk het blauwe licht in, sluit de deur en stel een timer in op 20 minuten (een instraling van 45 W/m2 activeert de signalering krachtig).
    8. Om u voor te bereiden op de fixatie, elimineert u zoveel mogelijk licht in de kamer (jaloezieën sluiten, de bovenlichten uitschakelen, schermen uitschakelen, enz.). Zorg ervoor dat de formaldehydehoudende buizen op de juiste manier zijn geëtiketteerd. Onmiddellijk voor fixatie formaldehydehoudende buizen van 4 °C verwijderen en naast de lichtbak plaatsen.
    9. Tijd- en lichtgevoelige stap. Wees voorbereid om snel te bewegen aan het einde van de blootstelling van 20 minuten aan het licht. Open na 20 minuten de deur van de lichtbak en verwijder de onbelichte schaal.
    10. Gebruik een pipetpunt van gevlamd glas om lichtgevoelige embryo's snel maar voorzichtig over te brengen in het voorbereide overeenkomstige buisje met 4% formaldehyde.
    11. Minimaliseer de terugplaatsingstijd (<45 s) van lichtgevoelige embryo's om onbedoelde blootstelling aan licht te voorkomen. Zorg ervoor dat er geen luchtbellen in de pipet zitten. Blootstelling aan de lucht zal gedechorioneerde embryo's vernietigen.
    12. Om embryo's in formaldehyde te werpen, dompelt u de glazen pipetpunt onder in de formaldehyde en laat u de embryo's in de vloeistof zinken. Minimaliseer de hoeveelheid embryomedium die naar de formaldehyde wordt overgebracht door de embryo's aan het einde van de punt te houden.
    13. Nadat de embryo's zijn teruggeplaatst, plaatst u de pipet terug in hetzelfde putje en pipet u op en neer om eventuele vastzittende embryo's los te maken. Dit voorkomt dat embryo's van meerdere aandoeningen per ongeluk in één buisje terechtkomen.
    14. Herhaal onmiddellijk de stappen 4.3.11-4.3.13 voor de niet-blootgestelde, niet-geïnjecteerde embryo's, gevolgd door de blootgestelde embryo's (geïnjecteerde en niet-geïnjecteerde).
    15. Bewaar vaste embryo's een nacht bij 4 °C.

5. Evaluatie van het experiment

  1. Fenotype scoren en beeldvorming
    1. Verwijder bij 1 dpf, idealiter tussen 24-32 hpf, embryo's uit de lichtbak om fenotypes te beoordelen met behulp van een ontleedscoop en maak een scorerubriek. Dit is het experimentele eindpunt; Onbedoelde fotoactivering is niet langer een probleem.
    2. Scoor voor het gemak embryo's terwijl ze nog in het chorion zitten. Gebruik een pipet of sonde om embryo's te verplaatsen om ze vanuit meerdere hoeken te bekijken.
      1. Embryo's die overmatige BMP-signalering ervaren, zullen worden geventraleerd met verschillende gradaties van ernst, zoals in detail beschreven in Kishimoto et al. 199746 (figuur 4A, linkerpaneel). Embryo's die een teveel aan nodale signalering ervaren, hebben een reeks ontwikkelingsstoornissen die verband houden met een teveel aan mesendoderm (figuur 4A, rechterpaneel)1,3,47,57,58,59,60. Ze zullen vaak met 1 dpf hebben gelyseerd.
    3. Scoor elk embryo in alle omstandigheden (Figuur 4B). Maak een overzichtsbeeld van alle embryo's in elk putje. Dechorioneer indien gewenst individuele representatieve embryo's en breng ze in beeld in methylcellulose (figuur 4A).
  2. Immunofluorescentiekleuring en beeldvorming
    1. Na het uitbroeden van embryo's in 4% formaldehyde bij 4 °C gedurende een nacht, formaldehyde verwijderen en 3-5x wassen met 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing met Tween20 (PBST). Verwijder PBST en voeg 100% methanol toe.
    2. Sluit de buizen en keer ze voorzichtig om om de resterende PBST en methanol te mengen. 2x wassen met methanol en bewaren bij -20 °C gedurende minimaal 2 uur tot jaren.
    3. Voor pSmad1/5/9 (BMP) immunofluorescentieprotocol, zie Rogers et al.38. Voor pSmad2/3 (Nodal) immunofluorescentieprotocol zie van Boxtel et al.17 en Rogers et al.47.
    4. Breng immunogekleurde embryo's in beeld met behulp van een microscoop die optische coupes kan maken (bijv. een confocale of lichtbladmicroscoop). Vermijd verzadiging en handhaaf identieke beeldvormingsomstandigheden tussen alle monsters die met hetzelfde antilichaam zijn gekleurd.
    5. Afbeelding binnen 5 dagen na voltooiing van de immunofluorescentiekleuring, omdat de fluorescentie na verloop van tijd kan vervagen.

Resultaten

Het doel van de twee hier beschreven controle-experimenten is om te bepalen of bOpto-BMP/Nodal hun respectievelijke routes activeren als reactie op blootstelling aan blauw licht zonder de signalering te beïnvloeden in afwezigheid van licht, zoals verwacht. Gebruik deze besturingselementen om de juiste experimentele workflow in uw laboratorium tot stand te brengen voordat u bOpto-BMP/Nodal toepast op uw onderzoeksvragen die u interesseren.

De fenotyperingstest kan in slechts 2 dagen worden voltooid en geeft een nuttige indicatie van de signaalactiviteit en fototoxiciteit (Figuur 3A). Geïnjecteerde, aan blauw licht blootgestelde embryo's moeten overtollige BMP-signalering fenokopiëren (ventralisatie46; Figuur 4A, linkerpaneel) of Nodale signalering (ontwikkelingsstoornissen gerelateerd aan extra mesendoderm 1,3,47,57,58,59,60 (Figuur 4A, rechterpaneel)). Als ze worden geïnjecteerd, zijn aan licht blootgestelde embryo's afebootscopisch, test dan de kwaliteit van het mRNA en overweeg meer te injecteren, en controleer de strategie voor blootstelling aan licht nogmaals om een constante blootstelling aan fel licht te garanderen (~450 nm licht met een bestralingssterkte van 45 W/m2 zou de signalering sterk moeten activeren). Daarentegen moeten geïnjecteerde, niet-blootgestelde embryo's er identiek uitzien als niet-geïnjecteerde broers en zussen. Indien geïnjecteerd, vertonen niet-blootgestelde embryo's fenotypes, verminder de hoeveelheid geïnjecteerd mRNA en beoordeel de experimentele opzet opnieuw om ervoor te zorgen dat niet-blootgestelde embryo's worden beschermd tegen blootstelling aan licht. De gegevens in figuur 4B tonen de resultaten van typische fenotyperingsexperimenten met geschikte mRNA-hoeveelheden en blootstellingsomstandigheden: sterke signaalactiviteit is duidelijk in geïnjecteerde, aan licht blootgestelde embryo's, met slechts een klein deel van de geïnjecteerde, niet-blootgestelde embryo's die fenotypes vertonen.

De fenotyperingstest biedt ook de mogelijkheid om de fototoxiciteit te beoordelen. Als de fototoxiciteit verwaarloosbaar is, moeten niet-geïnjecteerde, aan licht blootgestelde embryo's er wildtype uitzien, vergelijkbaar met niet-geïnjecteerde, niet-blootgestelde embryo's. Als niet-geïnjecteerde, aan licht blootgestelde embryo's defecten hebben, maar niet-geïnjecteerde, niet-blootgestelde embryo's, overweeg dan om de lichtinstraling te verminderen. Een bestralingssterkte van 45 W/m2 activeert de signalering krachtig zonder duidelijke fototoxiciteit. De gegevens in figuur 4B vertonen geen zorgwekkende verschillen tussen niet-geïnjecteerde, aan licht blootgestelde en niet-geïnjecteerde, niet-blootgestelde embryo's, wat wijst op een verwaarloosbare fototoxiciteit.

Hoewel de immunofluorescentietesten meer tijd en moeite vergen (~1 week) in vergelijking met de fenotyperingstest (2 dagen), biedt immunofluorescentiekleuring een directe uitlezing van de activiteit van de signaalroute en kan het subtiele signaalveranderingen onthullen die mogelijk niet worden weerspiegeld door de grove morfologie. Immunofluorescentie is vooral belangrijk om reacties op bOpto-Nodal te beoordelen, omdat overmatige nodale signalering vaak resulteert in embryo's die met 1 dpf lyseren - wat vele oorzaken kan hebben - in tegenstelling tot de specifieke ventralisatiefenotypes die kenmerkend zijn voor overmatige BMP-signalering46 (Figuur 4A). Geïnjecteerde, aan blauw licht blootgestelde embryo's moeten een uniforme toename van Smad1/5/9 of Smad2/3-fosforylering vertonen in vergelijking met niet-geïnjecteerde, aan licht blootgestelde embryo's. Als de niveaus niet of slechts zwak worden verhoogd, test dan de kwaliteit van het mRNA en overweeg meer te injecteren, en controleer de strategie voor blootstelling aan licht dubbel. Een blootstelling van 20 minuten aan blauw licht met een instralingssterkte van 45 W/m2 rond 40% epiboly zou de signalering sterk moeten activeren. Als pSmad-kleuring niet-uniform is, probeer dan mRNA in het midden van de cel te injecteren (in plaats van in de dooier), wat kan resulteren in een meer uniforme mRNA-distributie.

Geïnjecteerde, niet-blootgestelde embryo's moeten pSmad-niveaus hebben die vergelijkbaar zijn met niet-geïnjecteerde embryo's. Anekdotisch hebben we een lekkendere Smad-fosforylering waargenomen met bOpto-Nodal dan bOpto-BMP. Als de pSmad-niveaus worden verhoogd in geïnjecteerde, niet-blootgestelde embryo's, verminder dan de hoeveelheid geïnjecteerd mRNA. Beoordeel bovendien de experimentele opstelling opnieuw om ervoor te zorgen dat 1) niet-blootgestelde embryo's niet per ongeluk aan licht worden blootgesteld en 2) de blootstelling aan licht tijdens fixatie minimaal is. Tijdens de fixatiestap is het van cruciaal belang om niet meer dan 45 seconden te laten verstrijken tussen het verwijderen uit de lichtbak en onderdompeling in formaldehyde. Minimaliseer bovendien tijdens deze stap de blootstelling aan kamerlicht en zonlicht door jaloezieën te sluiten, witte lichtbronnen uit te schakelen, rood licht te gebruiken of witte lichtbronnen te bedekken met gelfilterpapier dat blauw licht blokkeert (Materiaaltabel).

De gegevens in figuur 4C tonen de resultaten van typische immunofluorescentiekleuringsexperimenten met de juiste mRNA-hoeveelheden en lichtblootstellingsomstandigheden: pSmad-niveaus zijn vergelijkbaar in niet-geïnjecteerde en niet-blootgestelde embryo's, terwijl geïnjecteerde, aan licht blootgestelde embryo's hogere niveaus van Smad-fosforylering vertonen.

figure-results-1
Figuur 1: bOpto-BMP en -Nodale signalering activatie strategie . (A) De endogene BMP-signaleringsroute wordt geactiveerd door BMP-ligandbinding, wat leidt tot de vorming van een type I/II-receptorcomplex, fosforylering van Smad1/5/9 en expressie van BMP-doelgenen. De type I-receptoren BMPR1aa en Acvr1l zijn ook bekend als respectievelijk Alk3 en Alk8. BMPR2a is een type II-receptor. (B) bOpto-BMP-constructies38. Vermeende kinasedomeinen van BMPR1aa en Acvr1l zijn gefuseerd met LOV; de BMPR2a-LOV-fusie bevat het vermeende kinasedomein en het receptor C-terminale domein (CTD). Alle fusies zijn membraangericht met een myristoylatiemotief (Myr). Domeinen worden gescheiden door glycine-serine (GS) linkers. Constructen worden op de CTD getagd met een HA-epitooptag. Deze combinatie van drie constructen bleek de BMP-signalering optimaal te activeren. (C) bOpto-BMP-gemedieerde activering van BMP-signalering. Bij blootstelling aan blauw licht dimeriseren LOV-domeinen, waarvan wordt gedacht dat het complexe vorming en signaalactivering veroorzaakt. (D) De endogene nodale signaalroute wordt geactiveerd door nodale ligandbinding, wat leidt tot de vorming van een type I/II-receptorcomplex, fosforylering van Smad2/3 en expressie van nodale doelgenen. De type I-receptor Acvr1ba en de type II-receptor Acvr2ba zijn ook bekend als respectievelijk Acvr1b en Acvr2b. (E) bOpto-Nodale constructies39. Vermeende kinasedomeinen van Acvr1ba en Acvr2ba zijn gefuseerd met LOV. Alle fusies zijn membraangericht met een myristoylatiemotief (Myr). Domeinen worden gescheiden door GS-linkers. Constructen worden op de CTD getagd met een HA-epitooptag. (F) activering van bOpto-Nodal-gemedieerde knoopsignalering. Bij blootstelling aan blauw licht dimeriseren LOV-domeinen, waarvan wordt gedacht dat het complexe vorming en signaalactivering veroorzaakt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-2
Figuur 2: Temperatuurgeregelde lichtbak voor optogenetische experimenten . (A) Een LED-microplaatverlichting wordt aan de bovenkant van een incubator gemonteerd met behulp van een op maat gemaakte LED-houder. Zebravisembryo's in een plaat met 6 putjes op de eerste plank worden blootgesteld aan licht door een gat dat in de bovenkant van de incubator is geboord. De onderste plank bevat een tweede set onbelichte controle-embryo's in een in aluminiumfolie verpakte plaat met 6 putjes. De deur van de couveuse is bekleed met tochtstrips om onbedoelde blootstelling aan kamerlicht of zonlicht te voorkomen. (B) Detail van de procedure om een gat in de incubator te maken met behulp van een stappenboor. Het incubatormodel dat hier wordt gebruikt, heeft een intern paneel waarvoor een tweede, groter gat moest worden geboord (Materiaaltabel). (C) Detail van de aangepaste LED-houder ontworpen voor een verlichtingssysteem met drie golflengten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-3
Figuur 3: workflow voor bOpto-BMP/Nodal-experimenten. Fenotype-assay en pSmad-immunofluorescentiekleuring om de activiteit van bOpto-BMP/Nodal te testen. Embryo's worden geïnjecteerd met mRNA in het eencellige stadium en uiterlijk 1,5 uur na de bevruchting (hpf) overgebracht naar een lichtbak. (A) Fenotype-assay. Geïnjecteerde embryo's en niet-geïnjecteerde broers en zussen worden in het donker grootgebracht of blootgesteld aan uniform blauw licht vanaf 1,5 hpf tot 1 dag na de bevruchting (dpf). Optogenetische signaalactiviteit kan worden geëvalueerd door embryo's te scoren op fenotypes die consistent zijn met overmatige pathway-activiteit. (B) pSmad immunofluorescentiekleuring. Geïnjecteerde embryo's en niet-geïnjecteerde broers en zussen worden in het donker grootgebracht tot 40% epiboly (~6 hpf). De helft van de geïnjecteerde en de helft van de niet-geïnjecteerde embryo's wordt vervolgens gedurende 20 minuten blootgesteld aan uniform blauw licht. Na blootstelling worden alle embryo's gefixeerd en onderworpen aan immunofluorescentiekleuring voor pSmad. Verhoogde niveaus van pSmad1/5/9 of pSmad2/3 weerspiegelen respectievelijk optogenetische activering van BMP of knoopsignalering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figure-results-4
Figuur 4: Beoordeling van door licht geactiveerde signaleringsreacties in zebravisembryo's. Zebravisembryo's werden in het eencellige stadium geïnjecteerd met mRNA dat codeert voor bOpto-BMP/Nodal. (A) Embryo's werden ofwel in het donker gekweekt of blootgesteld aan uniform blauw licht vanaf 1,5 uur na de bevruchting (hpf). Fenotypes werden gescoord 1 dag na de bevruchting (dpf). Representatieve fenotypes worden getoond. Overmatige BMP-signalering leidt tot ventralisatie (linkerpaneel), terwijl overmatige knoopsignalering ontwikkelingsstoornissen veroorzaakt die verband houden met extra mesendoderm (rechterpaneel). Schaalbalk = 500 μm. (B) Kwantificering van het fenotype. Geïnjecteerde embryo's en niet-geïnjecteerde broers en zussen werden in het donker grootgebracht vanaf 1,5 hpf (zwarte bol). De helft van de geïnjecteerde en de helft van de niet-geïnjecteerde embryo's werden blootgesteld aan uniform blauw licht (blauwe lamp). (C) Geïnjecteerde embryo's en niet-geïnjecteerde broers en zussen werden in het donker grootgebracht vanaf 1,5 hpf (zwarte bol). Bij 40% epiboly (~6 hpf) werd de helft van de geïnjecteerde en de helft van de niet-geïnjecteerde embryo's blootgesteld aan uniform blauw licht (blauwe lamp). Na 20 minuten werden alle embryo's gefixeerd en onderworpen aan immunofluorescentiekleuring voor gefosforyleerd Smad1/5/9 of Smad2/3. Hogere pSmad-intensiteiten duiden respectievelijk op een verhoogde BMP/Nodale signalering. Schaalbalk = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullend bestand 1: Lichtbak volledige montage. 3D PDF-bestand met een 3D-weergave van de volledige lichtbakconstructie. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 2: Lichtbak exploded view. 3D PDF-bestand met een 3D-weergave van de geëxplodeerde lichtbak. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 3: Grote lichtpakking. CAD-tekeningbestand (. DWG-formaat) om de grote lichtpakking voor de LED-houder te fabriceren met behulp van een lasersnijder. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 4: Kleine lichte pakking. CAD-tekeningbestand (. DWG-formaat) om de kleine lichtpakking voor de LED-houder te fabriceren met behulp van een lasersnijder. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 5: Acryl platformbasis. CAD-tekeningbestand (. DWG-formaat) om de acrylplatformbasis van de LED-houder te fabriceren met behulp van een lasersnijder. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 6: Acryl platform verticaal. CAD-tekeningbestand (. DWG-formaat) om de LED-houder acrylplatform verticaal te fabriceren met behulp van een lasersnijder. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 7: Acryl steun links. CAD-tekeningbestand (. DWG-formaat) om de LED-houder acryl linker steun te fabriceren met behulp van een lasersnijder. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend bestand 8: Acryl steun rechts. CAD-tekeningbestand (. DWG-formaat) om de LED-houder acryl rechtersteun te fabriceren met behulp van een lasersnijder. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussie

Injectie van mRNA is de huidige strategie om bOpto-BMP/Nodal af te leveren aan zebravisembryo's. Deze methode heeft verschillende nadelen. Ten eerste varieert de juiste hoeveelheid mRNA tussen laboratoria. De gebruikte hoeveelheid moet voldoende zijn om de signalering robuust te activeren bij blootstelling aan licht, maar zonder onbedoelde activering in het donker. Het is een goed idee om verschillende hoeveelheden te testen om optimale mRNA-niveaus te vinden, en eenmaal vastgesteld, aliquots van een mastermix te maken om dezelfde hoeveelheid mRNA reproduceerbaar te introduceren. Ten tweede kan een ongelijke verdeling van geïnjecteerd mRNA leiden tot ongelijke signaalactivering. Van injecteren in het midden van de cel (niet in de dooier) wordt gedacht dat het een gelijkmatige mRNA-distributie bevordert. Ten slotte, omdat geïnjecteerd mRNA na verloop van tijd wordt afgebroken, is deze benadering mogelijk niet geschikt voor experimenten met oudere embryo's. In de toekomst zouden deze problemen kunnen worden aangepakt door transgene zebravislijnen die alomtegenwoordig bOpto-BMP/Nodal tot expressie brengen met een maternale of geneesmiddel-induceerbare promotor. Hoewel het werken met potentieel lichtgevoelige volwassen zebravissen in deze context een uitdaging kan zijn, zijn zebravissen 61,62 en Drosophila 22,34,35,63 transgenen met optogenetische hulpmiddelen met succes ontwikkeld.

Het vermijden van onbedoelde fotoactivering is een algemene uitdaging met optogenetische hulpmiddelen. Behandel geïnjecteerde embryo's ouder dan 1,5 hpf voor het gemak als lichtgevoelig. Onbedoelde blootstelling aan licht kan vaak worden vermeden door borden of schalen eenvoudig in aluminiumfolie te wikkelen. Voor experimenten die visuele observatie van levende embryo's ouder dan 1,5 hpf vereisen, is het echter mogelijk om rode lichtbronnen te gebruiken of om witte lichtbronnen te bedekken met goedkoop gelfilterpapier dat LOV-dimeriserende golflengten blokkeert (Tabel met materialen).

De hier beschreven lichtbak is ontworpen voor specifieke toepassingen die nauwkeurige controle vereisen over lichtstralingsniveaus, dynamiek en golflengten (Afbeelding 2). Andere voordelen van deze lichtbak zijn onder meer een gelijkmatige blootstelling aan licht, verwaarloosbare onbedoelde monsterverwarming, voldoende ruimte voor meerdere platen met 6 putjes en langlevende, spectraal goed gekarakteriseerde lichtbronnen. Afhankelijk van de onderzoekstoepassing kunnen echter verschillende strategieën voor blootstelling aan licht de voorkeur hebben. Veel laboratoria hebben eenvoudigere en kosteneffectievere uniforme lichtblootstellingssystemen ontwikkeld met een kleinere voetafdruk, waaronder het bekleden van incubatoren met LED-strips, het ophangen van LED-panelen boven monsters of het opnemen van LED's in deksels van kweekschalen 32,38,39,40,64,65,66. Belangrijk is dat de lichtbak die in dit protocol wordt gebruikt, gebruikers niet in staat stelt om onafhankelijk individuele putten te regelen (in tegenstelling tot Bugaj et al.52) of ruimtelijke controle te bieden over blootstelling aan licht. Ruimtelijk gelokaliseerde optogenetische activering is aangetoond met bOpto-BMP38 en bOpto-Nodal39 met behulp van lasers in respectievelijk SPIM of confocale systemen, en is ook gerealiseerd met vele andere optogenetische strategieën in een verscheidenheid aan modelsystemen (besproken in Rogers en Müller12). Sommige benaderingen hebben zelfs een subcellulaire ruimtelijke resolutie bereikt 29,30,31. Hoewel de implementatie van ruimtelijk gelokaliseerde lichtblootstellingssystemen buiten het bereik van dit protocol valt, zijn ruimtelijke activeringsexperimenten met bOpto-BMP/Nodal theoretisch mogelijk met gespecialiseerde apparatuur zoals digitale microspiegels of maskeringsbenaderingen. Lezers worden aangemoedigd om de uitgebreide literatuur over doe-het-zelf-lichtbakken voor optogenetische experimenten te verkennen voordat ze zich committeren aan een strategie voor blootstelling aan licht (zie bijv. Gerhardt et al.51, Bugaj et al.52, Kumar en Khammash 53 en meer op https://www.optobase.org/materials/).

Moleculair optogenetische strategieën bieden vaak een hogere mate van spatiotemporele controle over biologische processen in vergelijking met historische benaderingen zoals mutanten, ectopische genexpressie, recombinante eiwitten en medicijnen. Lezers die geïnteresseerd zijn in de voordelen van optogenetische benaderingen, kunnen andere gepubliceerde hulpmiddelen verkennen die beschikbaar zijn in zebravissen en andere organismen. Deze omvatten hulpmiddelen om aanvullende signaalroutes te manipuleren 32,65,67,68, genexpressie 61,64,66,69,70,71 te reguleren, eiwitlokalisatie 31,72 te veranderen en apoptose 62 te activeren . Deze tools en vele andere zijn handig gecatalogiseerd op OptoBase, een samengestelde webbron voor moleculaire optogenetica-benaderingen28. Voor degenen die geïnspireerd zijn om nieuwe optogenetische hulpmiddelen te maken, bevat de bron ook nuttige beschrijvingen van lichtgevoelige eiwitten die zijn gebruikt in een breed scala aan strategieën, waaronder lichtgevoelige eiwitten die reageren op groene, rode en nabij-infrarode golflengten. We zijn verheugd dat de wetenschappelijke gemeenschap het volledige potentieel van moleculair optogenetische benaderingen zal realiseren.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Financiering voor dit protocol werd verstrekt door het NICHD Intramuraal Programma aan KWR (ZIA HD009002-01). We danken Jeff Farrell en zijn lab voor hun verhelderende feedback, Will Anderson voor uitstekende technische ondersteuning, Leanne Iannucci voor het stresstesten van het protocol en het meten van de bestraling, en de NIH Shared Zebrafish-faciliteit voor hun harde werk om de zebravis gezond te houden.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Een lichtbak en lichtblootstellingsprotocol bouwen
#8 x 1" Hex zelfborende schroefMcMaster-Carr99663A2221.4.5
Digitaal optisch vermogen en energiemeterThorLabsPM100D1.7
4
Incubator (142 liter)Boekel Scientific1394001.3.1
Incubatorpaneelmontage (1/4" dik zwart gegoten acryl)Aangepast onderdeel / Piedmont PlasticsIncubator_panel1.4.4
Grote HSS spiraalvormige groeffreesCO-ZSDB0001TA1.3.2
LED lenspakking, Incubator pakking; 1/32" dikke zwarte siliconenMcMaster-Carr5812T121.4.3
1.4.4
LED microplaatverlichterPrizmatixNA1.1
1.4.3
M3 10mm kubusafstandhouderNewark Eletronics005.60.5331.4.1
M3 x 10mm 316SS platkopschroefMcMaster-Carr91801A1561.4.1
M6 x 10mm 316SS platkopschroefMcMaster-Carr91801A3051.4.3
Geheugenkaart thermometerFisherbrand15-081-1111.9
3.2.1
Microscoop dia vermogen meter sensorkop (150 mW)ThorLabsS170C1.7
4
Rode gelfilterpapier #E106Rosco / B&H Foto & Electronics110084014805-E1064.2.1
Zijbeugels (1/4" dik zwart gegoten acryl)Aangepast onderdeel / Piedmont PlasticsSide_bracket1.4.2
Verticale beugel (1/4" dik zwart gegoten acryl)Aangepast onderdeel / Piedmont PlasticsVertical_bracket1.4.1
Weerbescherming: Lichte EPDM-schuim, 1/2" wd 1/4" tkMcMaster-Carr8694K121.8
mRNA genereren
EZNA MicroElute Cycle Pure KitOmegaD6293-022.4
GeneJET Miniprep Kit (250 rxns)Thermo ScientificK05032.2
Microsample incubator (Hybex)SciGene1057-30-02
Microsample incubator 1,5 ml buisblok (Hybex)SciGene1057-34-02
Nanodrop One SpectrofotometerThermo ScientificND-ONE-W2.4
NotI-HF restrictie-enzymNew England Biolabs (NEB)R3189L2.1
pCS2-Opto-Alk3Addgene2076142
pCS2-Opto-Alk8Addgene2076152
pCS2-Opto-BMPR2aAddgene2076162
RNeasy Mini Kit (250 rxns)Qiagen741062.3
mRNA injecteren
Agarose (UltraPure)Invitrogen / Thermo Fisher165005003.1.1
250 ml glazen bekersFisherbrandFB1002503.3.2
6-wels borden (doos van 50)Falcon08 772 1B3.1.6
B-8A kogelgewrichtNarishigeB-8A3.3
Tegendruk unit (microinjectie rig component)Applied Scientific Instrumentation (ASI)BPU3.3
Voetschakelaar (microinjectie rig component)Applied Scientific Instrumentation (ASI)FWS3.3
GJ-1 magnetische standaardNarishigeGJ-13.3
Glazen capillairen (4 inch, OD 1 mm, gloeidraad)World Precision Instruments1B100F-43.1.11
Glazen petrischaalbodems (voor dechorioneren)Pyrex08-748A3.3.2
Glazen pipetten (5 3/4" met brede punt)Kimble-Chase63A53WT3.1.9
InjectiebordvormenAdaptive Science Toolstu13.1.3
IP ijzeren plaatNarishigeIP3.3
M-152 micromanipulatorNarishigeM-1523.3
Micrometer kit (microinjectie rig component)Applied Scientific Instrumentation (ASI)MIMPH-MPIP-Kit3.3
MicrometersMeiji Techno AmericaMA2853.3
MPPI-2 drukinjector (microinjectie rig component)Applied Scientific Instrumentation (ASI)MPPI-33.3
NadeltrekkerWorld Precision InstrumentsPUL-10003.1.11
Petrischalen (100 mm x 15 mm, doos van 500)Falcon08-757-100D3.1.2
Pipettor (10 ml, groen)Bel-ArtF37898-00003.3
PronaseRoche114596430013.3.2
Spuitflessen (500 ml)Nalgene / Thermo Scientific2402-05003.3

Referenties

  1. Jones, W. D., Mullins, M. C. Cell signaling pathways controlling an axis organizing center in the zebrafish. Current Topics in Developmental Biology. 150, 149-209 (2022).
  2. Hill, C. S. Establishment and interpretation of NODAL and BMP signaling gradients in early vertebrate development. Current Topics in Developmental Biology. 149, 311-340 (2022).
  3. Zinski, J., Tajer, B., Mullins, M. C. TGF-β Family Signaling in Early Vertebrate Development. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 10 (6), a033274(2018).
  4. Shore, E. M., Kaplan, F. S. Inherited human diseases of heterotopic bone formation. Nature Reviews. Rheumatology. 6 (9), 518-527 (2010).
  5. Hebron, K. E., Hernandez, E. R., Yohe, M. E. The RASopathies: from pathogenetics to therapeutics. Disease Models & Mechanisms. 15 (2), dmm049107(2022).
  6. Grant, M. G., Patterson, V. L., Grimes, D. T., Burdine, R. D. Modeling Syndromic Congenital Heart Defects in Zebrafish. Current Topics in Developmental Biology. 124, 1-40 (2017).
  7. Nusse, R., Clevers, H. Wnt/beta-Catenin Signaling, Disease, and Emerging Therapeutic Modalities. Cell. 169 (6), 985-999 (2017).
  8. Farahani, P. E., Reed, E. H., Underhill, E. J., Aoki, K., Toettcher, J. E. Signaling, Deconstructed: Using Optogenetics to Dissect and Direct Information Flow in Biological Systems. Annual Review of Biomedical Engineering. 23, 61-87 (2021).
  9. Purvis, J. E., Lahav, G. Encoding and decoding cellular information through signaling dynamics. Cell. 152 (5), 945-956 (2013).
  10. Wibisana, J. N., Okada, M. Encoding and decoding NF-kappaB nuclear dynamics. Current Opinion in Cell Biology. 77, 102103(2022).
  11. Friedel, L., Loewer, A. The guardian's choice: how p53 enables context-specific decision-making in individual cells. TheFEBS Journal. 289 (1), 40-52 (2022).
  12. Rogers, K. W., Müller, P. Optogenetic approaches to investigate spatiotemporal signaling during development. Current Topics in Developmental Biology. 137, 37-77 (2020).
  13. Johnson, H. E., Toettcher, J. E. Illuminating developmental biology with cellular optogenetics. Current Opinion in Biotechnology. 52, 42-48 (2018).
  14. Bosman, S. L., Sonnen, K. F. Signaling oscillations in embryonic development. Current Topics in Developmental Biology. 149, 341-372 (2022).
  15. Li, P., Elowitz, M. B. Communication codes in developmental signaling pathways. Development. 146 (12), dev170977(2019).
  16. Tucker, J. A., Mintzer, K. A., Mullins, M. C. The BMP signaling gradient patterns dorsoventral tissues in a temporally progressive manner along the anteroposterior axis. Developmental Cell. 14 (1), 108-119 (2008).
  17. van Boxtel, A. L., et al. A temporal window for signal activation dictates the dimensions of a Nodal signaling domain. Developmental Cell. 35 (2), 175-185 (2015).
  18. Sorre, B., Warmflash, A., Brivanlou, A. H., Siggia, E. D. Encoding of temporal signals by the TGF-β pathway and implications for embryonic patterning. Developmental Cell. 30 (3), 334-342 (2014).
  19. Economou, A. D., Hill, C. S. Temporal dynamics in the formation and interpretation of Nodal and BMP morphogen gradients. Current Topics in Developmental Biology. 137, 363-389 (2020).
  20. Rogers, K. W., Schier, A. F. Morphogen gradients: from generation to interpretation. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 27, 377-407 (2011).
  21. Barkai, N., Shilo, B. Z. Robust generation and decoding of morphogen gradients. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 1 (5), a001990(2009).
  22. Johnson, H. E., Djabrayan, N. J. V., Shvartsman, S. Y., Toettcher, J. E. Optogenetic Rescue of a Patterning Mutant. Current Biology. 30 (17), 3414-3424 (2020).
  23. Imayoshi, I., et al. Oscillatory control of factors determining multipotency and fate in mouse neural progenitors. Science. 342 (6163), 1203-1208 (2013).
  24. Lin, B., et al. Synthetic spatially graded Rac activation drives cell polarization and movement. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (52), E3668-E3677 (2012).
  25. Cui, K. W., et al. Spatially controlled stem cell differentiation via morphogen gradients: A comparison of static and dynamic microfluidic platforms. Journal of Vacuum Science & Technology. A, Vaccum, Surfaces, and Films. 38 (3), 033205(2020).
  26. Faden, F., Mielke, S., Lange, D., Dissmeyer, N. Generic tools for conditionally altering protein abundance and phenotypes on demand. Biological Chemistry. 395 (7-8), 737-762 (2014).
  27. Shoji, W., Sato-Maeda, M. Application of heat shock promoter in transgenic zebrafish. Development, Growth & Differentiation. 50 (6), 401-406 (2008).
  28. Kolar, K., Knobloch, C., Stork, H., Znidaric, M., Weber, W. OptoBase: A web platform for molecular optogenetics. ACS Synthetic Biology. 7 (7), 1825-1828 (2018).
  29. Benedetti, L., et al. Light-activated protein interaction with high spatial subcellular confinement. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (10), E2238-E2245 (2018).
  30. Krueger, D., De Renzis, S. Optogenetic Methods to Control Tissue Mechanics in Drosophila. Methods in Molecular Biology. 2540, 269-283 (2022).
  31. Buckley, C. E. Optogenetic Control of Subcellular Protein Location and Signaling in Vertebrate Embryos. Methods in Molecular Biology. 1920, 143-162 (2019).
  32. Čapek, D., et al. Light-activated Frizzled7 reveals a permissive role of non-canonical wnt signaling in mesendoderm cell migration. Elife. 8, e42093(2019).
  33. Krishnamurthy, V. V., et al. Reversible optogenetic control of kinase activity during differentiation and embryonic development. Development. 143 (21), 4085-4094 (2016).
  34. Huang, A., Amourda, C., Zhang, S., Tolwinski, N. S., Saunders, T. E. Decoding temporal interpretation of the morphogen Bicoid in the early Drosophila embryo. Elife. 6, e26258(2017).
  35. Johnson, H. E., Toettcher, J. E. Signaling dynamics control cell fate in the early Drosophila embryo. Developmental Cell. 48 (3), 361.e3-370.e3 (2019).
  36. Aoki, K., et al. Stochastic ERK activation induced by noise and cell-to-cell propagation regulates cell density-dependent proliferation. Molecular Cell. 52 (4), 529-540 (2013).
  37. Chow, R. W., Vermot, J. The rise of photoresponsive protein technologies applications in vivo: a spotlight on zebrafish developmental and cell biology. F1000Research. , (2017).
  38. Rogers, K. W., ElGamacy, M., Jordan, B. M., Müller, P. Optogenetic investigation of BMP target gene expression diversity. Elife. 9, e58641(2020).
  39. Sako, K., et al. Optogenetic control of Nodal signaling reveals a temporal pattern of Nodal signaling regulating cell fate specification during gastrulation. Cell Reports. 16 (3), 866-877 (2016).
  40. Grusch, M., et al. Spatio-temporally precise activation of engineered receptor tyrosine kinases by light. The EMBO Journal. 33 (15), 1713-1726 (2014).
  41. Crossman, S. H., Janovjak, H. Light-activated receptor tyrosine kinases: Designs and applications. Current Opinion in Pharmacology. 63, 102197(2022).
  42. Kainrath, S., Janovjak, H. Design and Application of Light-Regulated Receptor Tyrosine Kinases. Methods in Molecular Biology. 2173, 233-246 (2020).
  43. Takahashi, F., et al. AUREOCHROME, a photoreceptor required for photomorphogenesis in stramenopiles. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (49), 19625-19630 (2007).
  44. Toyooka, T., Hisatomi, O., Takahashi, F., Kataoka, H., Terazima, M. Photoreactions of aureochrome-1. Biophysical Journal. 100 (11), 2801-2809 (2011).
  45. Vopalensky, P., Pralow, S., Vastenhouw, N. L. Reduced expression of the Nodal co-receptor Oep causes loss of mesendodermal competence in zebrafish. Development. 145 (5), dev.158832(2018).
  46. Kishimoto, Y., Lee, K. H., Zon, L., Hammerschmidt, M., Schulte-Merker, S. The molecular nature of zebrafish swirl: BMP2 function is essential during early dorsoventral patterning. Development. 124 (22), 4457-4466 (1997).
  47. Rogers, K. W., et al. Nodal patterning without Lefty inhibitory feedback is functional but fragile. Elife. 6, e28785(2017).
  48. Dubrulle, J., et al. Response to Nodal morphogen gradient is determined by the kinetics of target gene induction. Elife. 4, e05042(2015).
  49. Harvey, S. A., Smith, J. C. Visualisation and quantification of morphogen gradient formation in the zebrafish. PLoS Biology. 7 (5), e1000101(2009).
  50. Zinski, J., Tuazon, F., Huang, Y., Mullins, M., Umulis, D. Imaging and Quantification of P-Smad1/5 in Zebrafish Blastula and Gastrula Embryos. Methods in Molecular Biology. 1891, 135-154 (2019).
  51. Gerhardt, K. P., Castillo-Hair, S. M., Tabor, J. J. DIY optogenetics: Building, programming, and using the Light Plate Apparatus. Methods in Enzymology. 624, 197-226 (2019).
  52. Bugaj, L. J., Lim, W. A. High-throughput multicolor optogenetics in microwell plates. Nature Protocols. 14 (7), 2205-2228 (2019).
  53. Kumar, S., Khammash, M. Platforms for Optogenetic Stimulation and Feedback Control. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 918917(2022).
  54. Urushibata, H., et al. Control of Developmental Speed in Zebrafish Embryos Using Different Incubation Temperatures. Zebrafish. 18 (5), 316-325 (2021).
  55. Rogers, K. W., Bläßle, A., Schier, A. F., Müller, P. Measuring protein stability in living zebrafish embryos using fluorescence decay after photoconversion (FDAP). Journal of Visualized Experiments. (95), e52266(2015).
  56. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
  57. Feldman, B., et al. Zebrafish organizer development and germ-layer formation require nodal-related signals. Nature. 395 (6698), 181-185 (1998).
  58. Shimizu, T., et al. Cooperative roles of Bozozok/Dharma and Nodal-related proteins in the formation of the dorsal organizer in zebrafish. Mechanisms of Development. 91 (1-2), 293-303 (2000).
  59. Rebagliati, M. R., Toyama, R., Fricke, C., Haffter, P., Dawid, I. B. Zebrafish nodal-related genes are implicated in axial patterning and establishing left-right asymmetry. Developmental Biology. 199 (2), 261-272 (1998).
  60. Gritsman, K., Talbot, W. S., Schier, A. F. Nodal signaling patterns the organizer. Development. 127 (5), 921-932 (2000).
  61. LaBelle, J., et al. TAEL 2.0: An Improved Optogenetic Expression System for Zebrafish. Zebrafish. 18 (1), 20-28 (2021).
  62. Mruk, K., Ciepla, P., Piza, P. A., Alnaqib, M. A., Chen, J. K. Targeted cell ablation in zebrafish using optogenetic transcriptional control. Development. 147 (12), dev183640(2020).
  63. Johnson, H. E., et al. The spatiotemporal limits of developmental Erk signaling. Developmental Cell. 40 (2), 185-192 (2017).
  64. Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).
  65. Patel, A. L., et al. Optimizing photoswitchable MEK. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (51), 25756-25763 (2019).
  66. LaBelle, J., Woo, S. Light-Induced GFP Expression in Zebrafish Embryos using the Optogenetic TAEL/C120 System. Journal of Visualized Experiments. (174), e62818(2021).
  67. Kainrath, S., Stadler, M., Reichhart, E., Distel, M., Janovjak, H. Green-light-induced inactivation of receptor signaling using cobalamin-binding domains. Angewandte Chemie. 56 (16), 4608-4611 (2017).
  68. Benman, W., et al. Temperature-responsive optogenetic probes of cell signaling. Nat Chem Biol. 18 (2), 152-160 (2022).
  69. Reade, A., et al. TAEL: a zebrafish-optimized optogenetic gene expression system with fine spatial and temporal control. Development. 144 (2), 345-355 (2017).
  70. Putri, R. R., Chen, L. Spatiotemporal control of zebrafish (Danio rerio) gene expression using a light-activated CRISPR activation system. Gene. 677, 273-279 (2018).
  71. Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, S., Lin, C. Optogenetic control of transcription in zebrafish. PLoS One. 7 (11), e50738(2012).
  72. Buckley, C. E., et al. Reversible optogenetic control of subcellular protein localization in a live vertebrate embryo. Developmental Cell. 36 (1), 117-126 (2016).

Herprints en machtigingen

Toestemming aanvragen om de tekst of afbeeldingen van dit JoVE-artikel te hergebruiken

Toestemming aanvragen

Trefwoorden

Optogenetische activeringsignaleringspadenblauw lichtactiveringBMP signaleringNodal signaleringimmunofluorescentie assayfenotype assaySmad fosforyleringlichtgevoelige eiwitten

Gerelateerde artikelen