Hier presenteren we succesvolle onderhouds- en gifextractieprotocollen voor grootschalige Tityus serrulatus Lutz en Mello, 1922 (Braziliaanse gele schorpioen) veehouderij, met als doel gif te leveren voor de daaropvolgende productie van schorpioenantigif om aan de vraag van het Braziliaanse gezondheidssysteem te voldoen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Onderhoud in gevangenschap en gifextractie van Tityus serrulatus (Braziliaanse gele schorpioen) voor de productie van antigif
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Schorpioenenvergiftiging is een probleem voor de volksgezondheid in verschillende tropische en subtropische landen. Serrulatus van Tityus Lutz en Mello, 1922 (Braziliaanse gele schorpioen) zijn verantwoordelijk voor ongeveer 150.000 vergiftigingsgevallen per jaar in Brazilië, waarvan 10% een antigifbehandeling nodig heeft om levensbedreigende gifeffecten om te keren. Daarom worden duizenden T. serrulatus-individuen onder gecontroleerde gevangenschapsomstandigheden gehouden voor gifextractie, die vervolgens worden gebruikt bij de productie van de nationale voorraad schorpioenenantigif. Instituto Butantan is het belangrijkste laboratorium voor de productie van antigif in Brazilië en levert ongeveer 70.000 flacons schorpioenenantigif voor het Braziliaanse gezondheidssysteem. De houderijprotocollen en methoden voor de extractie van gif zijn dus sleutelpunten voor het succes van grootschalige, gestandaardiseerde gifproductie. Het doel van dit artikel is om de gevangenschapsprotocollen van de T. serrulatus-veehouderij te beschrijven, met inbegrip van de houderijroutine en de procedures voor het extraheren van gif, het volgen van goede productiepraktijken en het waarborgen van dierenwelzijn. Deze praktijken maken het mogelijk om tot 20.000 dieren in gevangenschap te houden, met een routine van 3.000 tot 5.000 schorpioenen die maandelijks worden gemolken volgens de vraag naar de productie van antigif, waarbij een gemiddelde van 90% positieve extractie wordt bereikt.
Inleiding
Schorpioenen zijn geleedpotigen die behoren tot de klasse Arachnida, orde Schorpioenen, die ongeveer 2.621 soorten 1,2 omvat. Deze dieren hebben een groot geografisch verspreidingsgebied en zijn aanwezig op alle continenten behalve Antarctica1. Vergiftiging veroorzaakt door schorpioenen resulteert in de morbiditeit of dood van duizenden mensen per jaar wereldwijd3. In 2019 waren er naar schatting meer dan 1,2 miljoen ongevallen en 3.500 sterfgevallen per jaar veroorzaakt door deze dieren. In Brazilië is het aantal gevallen exponentieel toegenomen en bereikt het sinds 2017 meer dan 100,000 gevallen per jaar 4,5,6. De ongecontroleerde verstedelijking die de afgelopen decennia in Brazilië is waargenomen, zonder adequate rioolwaterzuivering en regelmatige inzameling en verwijdering van afval, in verband met aantasting van het milieu en klimaatveranderingen, heeft voorwaarden geschapen voor de verspreiding van invasieve schorpioenen, zoals T. serrulatus, waardoor het contact met mensen toeneemt en dusschadelijke ongevallen tot gevolg hebben 4,7,8 . Er zijn ongeveer 178 soorten schorpioenen in Brazilië, maar steken van medisch belang worden veroorzaakt door het geslacht Tityus, waarbij vier soorten (T. serrulatus, T. bahiensis, T. stigmurus en T. obscurus) van medisch belang zijn, waarbij Tityus serrulatus verantwoordelijk is voor de ernstigste gevallen en sterfgevallen 7,9.
Instituto Butantan is het belangrijkste laboratorium voor de productie van antigif in Brazilië en levert ongeveer 70.000 flacons schorpioenenantigif voor het Braziliaanse gezondheidssysteem. In het kort omvatten de stappen die betrokken zijn bij de productie van antigif de inoculatie van van gif afgeleide antigenen bij paardachtigen, het verzamelen en zuiveren van plasma met rijke antilichamen, wat resulteert in injectieflacons van 5 ml schorpioenenantigif. Elke injectieflacon is in staat om ten minste 1 mg schorpioenengif per ml antigif te neutraliseren. Het Arthropods Bioterium is een integraal onderdeel van het industriële centrum, verantwoordelijk voor het leveren van het bronmateriaal voor het schorpioenentegengif.
Het Arthropods Bioterium van het Instituto Butantan heette oorspronkelijk het Laboratorium van Geleedpotigen en werd opgericht in 1967. Het was echter pas in 1995 dat het laboratorium verhuisde naar een exclusieve faciliteit die zich toelegt op het huisvesten van giftige geleedpotigen10,11. In die tijd werden de schorpioenen gehouden in een ruimte van 12m2 zonder gecontroleerde temperatuur en verdeeld over ongeveer 13 verblijven, elk met maximaal 300 dieren10. Door de toenemende vraag naar gif door de jaren heen en de daaruit voortvloeiende noodzaak om het aantal dieren te vergroten, samen met verbeteringen in het gifextractieproces, vond er in 2016 een grote verandering plaats. Het laboratorium werd geïntegreerd in het industriële centrum van Instituto Butantan en werd omgedoopt tot het Arthropods Bioterium. Bovendien verhuisde het Bioterium in 2016 naar een nieuwe, speciaal gebouwde faciliteit. De nieuwe schorpioenenkamer heeft een oppervlakte van 24m2 en bevat ongeveer 48 polypropyleen leefruimten, die elk tot 300 dieren huisvesten, zoals weergegeven in figuur 1. Dit resulteert in een totaal van 10.000 tot 20.000 individuen die onder gecontroleerde omstandigheden in gevangenschap worden gehouden, met variaties gedurende het jaar. De schorpioenen worden zorgvuldig beheerd volgens strikte houderijprotocollen om hun welzijn te garanderen en tegelijkertijd te voldoen aan de hoge productie-eisen en zich te houden aan goede praktijken en ethische normen voor dierenverzorging. Voor de afzuiging van gif werd een specifieke ruimte ontworpen en gebouwd, met twee luchtstroomkasten zoals weergegeven in figuur 2A. Deze kasten dienen als veiligheidsmaatregelen om te voorkomen dat technici tijdens de extractieprocedure gifdeeltjes inademen. Persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM's) zijn verplicht voor de technici, inclusief synthetische schorten en FFP2-maskers, om besmetting te voorkomen en hun veiligheid te garanderen.
Figuur 1: Algemeen beeld van de kamer van de schorpioen van het Arthropods Bioterium. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Werkgebied . (A) Algemeen beeld van de gifextractieruimte van het geleedpotige bioterium. (B) Het werkoppervlak van de luchtstroomkast. Alle materialen en apparatuur worden voorbereid en gerangschikt op de bovenkant van het werkblad van de luchtstroomkast. De zwarte pijl geeft het elektrostimulatorapparaat aan en de rode pijl geeft de pincet aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Ongeveer 90% van de T. serrulatus-schorpioenen in het Arthropods Bioterium is afkomstig van verschillende locaties, verzameld door gemeentelijke gezondheidsagenten als onderdeel van een bewakings- en controleprogramma voor deze dieren . De schorpioenen worden gevangen in stedelijke gebieden en vervolgens naar Instituto Butantan gestuurd als onderdeel van een samenwerkingsprogramma. T. serrulatus schorpioenen zijn parthenogenetisch, wat betekent dat de geboorte plaatsvindt als gevolg van de ontwikkeling van nakomelingen uit onbevruchte eieren, zonder de aanwezigheid van een individu van het andere geslacht12. Vanwege dit type voortplanting worden sommige dieren in gevangenschap geboren in onze faciliteit en worden ze onderhouden totdat ze de volwassen fase bereiken, volgens een soortgelijk houderijprotocol als hieronder beschreven. Zodra ze het volwassen stadium hebben bereikt, worden ze toegevoegd aan de routine voor het extraheren van gif. Bij aankomst ondergaan de schorpioenen een eerste screening en degenen die in goede gezondheidsomstandigheden verkeren, worden gehouden in collectieve verblijven met maximaal 350 individuen, gescheiden door hun herkomst. Voor elk verblijf wordt dagelijks een controleformulier ingevuld met gegevens over de datum van voederen en het type prooi dat wordt aangeboden (krekel of kakkerlak), watervoorziening, reinigingsprocedures, het aantal dode dieren en het aantal resterende levende dieren in het verblijf.
In een vooraf geplande agenda worden dieren onderworpen aan elektrische stimulatie en het resulterende gif van honderden individuen wordt vervolgens gevriesdroogd, wat resulteert in batches gevriesdroogd gif. Het gestandaardiseerde gif dat uit dit proces wordt verkregen, is bestemd voor paardenimmunisatie als onderdeel van het productieproces, en om referentiemateriaal te leveren voor kwaliteitscontrole van de werkzame stof en het eindproduct.
Er zijn maar weinig faciliteiten in de wereld die in staat zijn om zo'n groot aantal schorpioenen te houden en het volume van gifextracties uit te voeren in overeenstemming met goede productiepraktijken en ethisch gebruik van de dieren, zoals gedaan in het Arthropods Bioterium van Instituto Butantan. Daarom is ons doel om de onderhoudsprotocollen voor schorpioenen en gifextractieprocedures te beschrijven die worden gebruikt in de veehouderij van T. serrulatus , die met succes de benodigde hoeveelheid gif leveren voor de productie van schorpioenenantigif.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Protocollen met betrekking tot ongewervelde dieren zijn vrijgesteld van de goedkeuring van het Comité voor het gebruik en de verzorging van dieren van het Instituto Butantan. Het onderhoud van schorpioenen dat hier wordt beschreven, volgt echter ethische parameters en het dierenwelzijn wordt gerespecteerd in overeenstemming met de behoeften van de soort.
1. Huisvesting
- Bewaar de schorpioenen in gemeenschappelijke polypropyleen containers als omheining (hoogte 35 cm, breedte 35,5 cm, lengte 72 cm) met maximaal 350 dieren.
- Houd de ruimte waar de dierenverblijven zijn gehuisvest onder een gecontroleerde temperatuur van 24 °C (±0,5 °C) in een lichtcyclus van 10 uur met de lichten aan en 14 uur met de lichten uit.
- Bekleed de bodem (onderkant) van elke container met kraftpapier dat aan alle kanten met plakband aan de randen is bevestigd, zodat de dieren niet onder het papier kunnen komen (figuur 3A).
- Gebruik vier kartonnen trays (eiertrays) als verticale substraten, gestapeld aan één kant van de container, met een stevig kartonnen vel tussen elke tray (Figuur 3B,C).
- Plaats aan de andere kant van de leefruimte een ondiepe polypropyleen bak (waterbak) met daarin gedrenkt katoen als waterbron voor de dieren (figuur 3B).
- Bewaar de containers zonder deksel om de luchtstroom te vergroten. Breng een strook van ongeveer 10 cm zelfklevende plastic tape aan op de bovenkant van het binnenoppervlak van de leefruimte en op de bovenste hoeken om de wanden glad genoeg te maken om te voorkomen dat de dieren uit de container ontsnappen (figuur 3A).
Figuur 3: Behuizing en voorbereiding van de behuizing . (A) Pijlen geven het kraftpapier aan de onderkant aan, bevestigd met plakband aan de randen. Stippellijnen geven de zelfklevende plastic tape aan die op de bovenkant van het binnenoppervlak van de behuizing is aangebracht. (B) Verticaal substraat (eiertrays opgestapeld aan de ene kant van de container) en een ondiepe polypropyleen tray (watertray) aan de andere kant. (C) Verticaal substraatdetail: eiertrays gepild met een stijf kartonnen vel tussen twee trays. (D) Kartonnen vellen en eiertrays die in lagen zijn geplaatst, waardoor de natuurlijke donkere en vochtige habitat van T. serrulatus wordt nagebootst. (E) Dieren die in het substraat zijn ondergebracht. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
2. Hygiëne routine
NOTITIE: De hygiëneroutine is verdeeld in twee onderhoudsprocedures: volledig en gedeeltelijk onderhoud. De eerste wordt uitgevoerd 2 dagen na het voederen van de dieren of wanneer de leefruimte wordt geselecteerd voor gifextractie. Gedeeltelijk onderhoud wordt uitgevoerd wanneer de dieren niet worden gevoerd.
- Compleet onderhoud
- Bereid een schone behuizing voor met nieuw substraat (eiertrays, karton en kraftpapier) en een bak met schoon water, zoals beschreven in sectie 1.
- Verwijder met een lange tang de waterbak uit de behuizing. Als er schorpioenen op de waterbak zitten, verwijder ze dan en plaats ze in de schone behuizing.
- Herhaal dezelfde procedure als beschreven in stap 2.1.2 met alle eiertrays en kartonnen vellen, verwijder alle schorpioenen en plaats ze in de schone behuizing.
- Verwijder na het verwijderen van de trays alle schorpioenen die op de bodem van de behuizing zijn achtergebleven en plaats ze in de schone behuizing. Zorg ervoor dat u rekening houdt met eventuele karkassen en gooi ze op de juiste manier weg. Verzamel alle resterende levende prooien (insecten) en verwijder ze uit het verblijf.
- Verwijder alle wegwerpsubstraten uit de behuizing (eiertrays, kartonnen vellen en kraftpapier) en gooi ze op de juiste manier weg. Stuur de herbruikbare artikelen (waterbak en polypropyleen container) op voor sanitaire voorzieningen.
NOTITIE: De ontsmetting van de herbruikbare artikelen wordt uitgevoerd met 0,5% hypochloriet in combinatie met een neutraal reinigingsmiddel. Het is verplicht dat de materialen grondig en overvloedig worden gespoeld met stromend water na gebruik van een ontsmettingsproduct of -oplossing.
- Gedeeltelijk onderhoud
OPMERKING: Gedeeltelijk onderhoud bestaat uit het inspecteren van alle substraten (eiertrays en kraftpapier) met als doel dode schorpioenkarkassen en ander ongewenst vuil te verwijderen, maar zonder de substraten weg te gooien of de behuizing te vervangen.- Voer de inspectie uit met een lange pincet om elke eiertray voorzichtig op te tillen en het afval te verwijderen.
- Vervang indien nodig een of meer eiertrays door een schone.
- Vervang de waterbak volledig door een schone met een lange pincet. Breng eventuele schorpioenen op de waterbak over naar de eierbak in een ander deel van de behuizing.
3. Voeding
- Voer de dieren om de 15 dagen volgens het gifextractieschema. Voer dieren die 7 dagen voor en 7 dagen na de gifextractie worden gemolken.
- Voor het voeren afwisselend kakkerlakken (Phoetalia pallida) en krekels (Gryllus sp.) leveren.
- Bereken de hoeveelheid voer op basis van de energie-inname van de dieren; Bied 1 prooi aan voor elke 3 of 5 schorpioenen in het verblijf.
- Tel de berekende hoeveelheid prooidieren en plaats ze levend in de omheining, laat ze 2 dagen staan voordat het volledige onderhoud plaatsvindt (paragraaf 2.1).
- Breng bij het aanbieden van kakkerlakken een calciumcarbonaat met alcoholoplossing aan rond de bovenkant van de behuizingen. De oplossing zorgt ervoor dat de kakkerlakken uitglijden en niet in staat zijn om het zijoppervlak van de behuizing te beklimmen, waardoor de insecten niet kunnen ontsnappen.
4. Extractie van gif
OPMERKING: De dieren die worden gebruikt bij het extraheren van gif zijn volwassen of pre-adulten. Vanwege de moeilijkheid om de volledige geslachtsrijpheid van de Braziliaanse gele schorpioen (volwassen fase) te bepalen, werd vastgesteld dat dieren met een totale lichaamslengte van 5 tot 7 cm in aanmerking komen voor de procedure.
- Melk elk dier elke 2-3 maanden.
- Tel op de dag van de extractie van het gif alle levende dieren in de leefruimte en breng ze over in een glazen container met een lange pincet (Figuur 4).
- Bereid alle materialen en apparatuur voor die moeten worden gebruikt op de bovenkant van het werkoppervlak van de luchtstroomkast. Steek de stekker van de elektrostimulator in het stopcontact en zet de elektrostimulator en de luchtstroomkast aan (Figuur 2B).
- Gebruik de volgende instellingen voor de parameters van de elektrostimulator: potentiaal (potentiaalverschil tussen de elektroden): 540 mV, spanning (duur van de elektrische puls): 2 ms, actie (intermittentie om de gebruikte potentie te matigen, wat de verwarming van het telson-organisch weefsel zou verminderen): 70%, cyclus (pas de cyclische herhaling aan): 1 s, en intensiteit (elektrische stroom die door de spier van het dier circuleert): 0,75 mA.
- Zet elk dier handmatig vast op een manier dat het telson stilstaat, door de stappen te volgen:
- Houd de metassoma van het dier vast met een rechte pincet (Figuur 5A).
- Immobiliseer het telson met een gebogen pincet (Figuur 5B).
- Houd het telson vast met de hand (Figuur 5C,D).
- Plaats het telson na fixatie in direct contact met de elektrostimulatorgeleider, zonder dat u een geleidende oplossing hoeft te gebruiken. De elektrische schok veroorzaakt een onwillekeurige spiersamentrekking van de gifklier en de daaruit voortvloeiende uitwerping van het gif.
- Vang de gifdruppels rechtstreeks op in een plastic microbuisje dat dicht bij de geleider van de elektrostimulator is geplaatst (Figuur 6).
- Laat het dier vervolgens terug in de glazen container en volg de stappen:
- Breng het telson van het dier over van de hand naar de gebogen pincet.
- Leg het dier voorzichtig op de bodem van de glazen bak.
- Voer stap 4.4-4.7 uit met elk dier in de glazen recipiënt.
- Nadat alle dieren in de glazen recipiënt zijn gemolken, plaatst u ze terug in de omheining.
- Bewaar het opgevangen gif bij -20 °C tot het vriesdroogproces.
Figuur 4: Schorpioenen in de glazen container. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Fixatieprocedure voor het extraheren van gif. (A) Metassoma vastgezet met een rechte tang (zwarte pijl). (B) Telson geïmmobiliseerd met gebogen pincet (zwarte pijl). (C) Overdracht van het vastgehouden telson van de pincet naar de hand. (D) Telson bij de hand in bedwang gehouden. Het wordt aanbevolen om de dieren met blote handen te hanteren, omdat de schorpioenen bij het gebruik van handschoenen het materiaal met hun klauwen kunnen grijpen, waardoor het moeilijk wordt om ze aan het einde van de procedure los te laten en het risico op ongevallen aanzienlijk toeneemt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Extractie van gif. Een plastic microbuisje (witte pijl) dat dicht bij de elektrostimulator wordt geplaatst (gele pijl). De gifdruppels worden tijdens de procedure rechtstreeks opgevangen in de buis die op kamertemperatuur wordt gehouden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Voor elke procedure werden dertig standaard operationele procedures (SOP's) ontwikkeld, die de herhaalbaarheid van de procedures onder technici en de naleving van kwaliteitsparameters garanderen. Het gemiddelde sterftecijfer na de extractieprocedure ligt rond de 12%, wat als laag kan worden beschouwd, gezien de elektrostimulatieroutine en de omgeving in gevangenschap, waar stressfactoren met succes worden verminderd door de procedures toe te passen.
Om de dieren gezond te houden, wordt aan het...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
De toepassing van de beschreven methoden stelt ons in staat om een groot aantal T. serrulatus-individuen te houden en geeft ons een consistente voorspelbaarheid van het aantal schorpioenen dat nodig is voor de jaarlijkse gifproductie. Op deze manier zijn we in staat om van tevoren voldoende batches gif te leveren om het productieproces van antigif te leveren. Tegelijkertijd is de ontwikkeling van vooraf vastgestelde schema's voor onderhoud, voeding en gifextractie een essentieel onderdeel van de activiteiten en ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Kartonplaat | NA | NA | |
| Eierbak | NA | NA | karton eierbakken 36 plaatsen |
| Elektro stimulator apparaat | Instituto Butantan | ART-FV-01 | Intern ontworpen voor de giftextractie |
| Kraftpapier | NA | NA | regulier kraftpapier |
| Maskeerband | NA | NA | Witte maskeertape (24 mm x 50 m) |
| Polyproplyleen container | NA | NA | 70 L Polypropyleen doos (H – 35 cm, B – 35.5 cm, L - 72 cm) |
| Polyproplyleen bak | NA | NA | Polypropyleen bak (H – 3.0 cm, B – 18.5 cm, L - 30 cm) |
| Zelfklevend plastic | NA | NA |
Referenties
- Polis, G. A. The biology of scorpions. , Stanford University Press. (1990).
- Lacerda, A. B., et al. Scorpion envenomation in the state of São Paulo, Brazil: Spatiotemporal analysis of a growing public health concern. PLoS One. 17 (4), 0266138(2022).
- Reckziegel, G. C., Pinto, V. L. Scorpionism in Brazil in the years 2000 to 2012. Journal of Venomous Animals and Toxins Including Tropical Diseases. 20, 46(2014).
- Guerra-Duarte, C., et al. Scorpion envenomation in Brazil: Current scenario and perspectives for containing an increasing health problem. PLoS Neglected Tropical Diseases. 17 (2), 0011069(2023).
- Pimenta, R. J. G., et al. Selected to survive and kill: Tityus serrulatus, the Brazilian yellow scorpion. PLoS One. 14 (4), e0214075(2019).
- Lacerda, A. B., et al. Detection of areas vulnerable to scorpionism and its association with environmental factors in São Paulo, Brazil. Acta Tropica. 230, 106390(2022).
- Torrez, P. P. Q., Dourado, F. S., Bertani, R., Cupo, P., França, F. O. deS. Scorpionism in Brazil: exponential growth of accidents and deaths from scorpion stings. Journal of the Brazilian Society of Tropical Medicine. 52, 20180350(2019).
- Amado, T. F., et al. Vulnerable areas to accidents with scorpions in Brazil. Tropical Medicine & International Health. 26 (5), 13561(2021).
- Brasil, Ministérioda da Saúde, Fundação Nacional de Saúde. Manual de diagnóstico e tratamento de acidentes por animais peçonhentos. , Ministérioda da Saúde, Fundação Nacional de Saúde. Brasília. (2001).
- Candido, D. M., Lucas, S. Maintenance of scorpions of the genus Tityus Koch (Scorpiones, Buthidae) for venom obtention at Instituto Butantan, São Paulo, Brazil. Journal of Venomous Animals and Toxins including Tropical Diseases. 10 (1), 000100007(2004).
- Lucas, S. O. Laboratório de Artrópodes do Instituto Butantan e os aracnídeos peçonhentos. História Ciências Saúde Manguinhos. 10 (3), 000300011(2003).
- Braga-Pereira, G. F., Santos, A. J. Asexual reproduction in a sexual population of the Brazilian yellow scorpion (Tityus serrulatus, Buthidae) as evidence of facultative parthenogenesis. The Journal of Arachnology. 49 (2), (2021).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
