Identificeren, diagnosticeren en beoordelen van kwaadaardige perifere zenuwschedetumoren in genetisch gemanipuleerde muismodellen

Summary

We hebben een methodologie ontwikkeld om te beoordelen of neoplasmata van het zenuwstelsel in genetisch gemanipuleerde muizen de pathologie van hun menselijke tegenhangers nauwkeurig samenvatten. Hier passen we deze histologische technieken, gedefinieerde pathologische criteria en kweekmethodologieën toe op neurofibromen en kwaadaardige perifere zenuwschedetumoren die ontstaan in het P 0-GGFβ3 muismodel.

Abstract

Patiënten met het autosomaal dominante tumorgevoeligheidssyndroom neurofibromatose type 1 (NF1) ontwikkelen vaak plexiforme neurofibromen (PN's) die vervolgens transformeren in zeer agressieve kwaadaardige perifere zenuwschedetumoren (MPNST's). Het begrijpen van het proces waarmee een PN transformeert in een MPNST zou worden vergemakkelijkt door de beschikbaarheid van genetisch gemanipuleerde muismodellen (GEM) die de PN-MPNST-progressie die bij mensen met NF1 wordt gezien, nauwkeurig repliceren. Helaas geven GEM-modellen met Nf1-ablatie dit proces niet volledig weer. Dit bracht ons ertoe om P 0-GGFβ3-muizen te ontwikkelen, een GEM-model waarin overexpressie van het Schwann-celmitogeen neureguline-1 (NRG1) in Schwann-cellen resulteert in de ontwikkeling van PN's die zich ontwikkelen tot MPNST's met hoge frequentie. Om echter te bepalen of tumorigenese en neoplastische progressie bij P 0-GGFβ3-muizen de processen die worden gezien bij NF1-patiënten nauwkeurig modelleren, moesten we eerst bewijzen dat de pathologie van P_{0-GGFβ3-tumoren} in de perifere zenuwschede de pathologie van hun menselijke tegenhangers recapituleert.

Hier beschrijven we de gespecialiseerde methodologieën die worden gebruikt om neoplasmata van het perifere zenuwstelsel nauwkeurig te diagnosticeren en te beoordelen in GEM-modellen, met behulp van P 0-GGFβ3 en P_0-GGFβ3; Trp53^+/- muizen als voorbeeld. We beschrijven de histologische, immunohistochemische en histochemische methoden die worden gebruikt om PN's en MPNST's te diagnosticeren, hoe deze neoplasmata te onderscheiden van andere tumortypes die hun pathologie nabootsen, en hoe deze neoplasmata te beoordelen. We bespreken de oprichting van vroege passageculturen van GEM MPNST's, hoe deze culturen kunnen worden gekarakteriseerd met behulp van immunocytochemie en hoe hun tumorigeniciteit kan worden geverifieerd door allotransplantaten vast te stellen. Gezamenlijk karakteriseren deze technieken de pathologie van PN's en MPNST's die zich voordoen in GEM-modellen en vergelijken ze kritisch de pathologie van deze muizentumoren met hun menselijke tegenhangers.

Introduction

In de afgelopen drie decennia hebben talloze laboratoria geprobeerd muismodellen van menselijke kankers te maken door menselijke kanker-geassocieerde mutaties in het muizengenoom te introduceren of door een genproduct tot overexpressie te brengen dat tot overexpressie wordt gebracht in menselijke kankers. De resulterende genetisch gemanipuleerde muismodellen (GEM) kunnen voor verschillende doeleinden worden gebruikt, zoals het vaststellen dat de nieuw geïntroduceerde genomische modificatie tumorigenese initieert, het identificeren van andere later optredende genetische of epigenetische veranderingen die bijdragen aan tumorprogressie, en het definiëren van de belangrijkste signaalroutes die tumorinitiatie en -progressie stimuleren. In tegenstelling tot orthotope xenotransplantaatmodellen, die afhankelijk zijn van het gebruik van immunodeficiënte muizen, hebben GEM-kankermodellen een volledig functioneel immuunsysteem en modelleren ze dus nauwkeuriger reacties op kandidaat-therapeutische middelen. Bij het gebruik van GEM-kankermodellen voor doeleinden als deze, is het echter essentieel dat onderzoekers bevestigen dat waarnemingen met GEM-neoplasmata relevant zijn voor hun menselijke tegenhangers. Deze validatie moet een grondige beoordeling van de pathologie van de GEM-neoplasmata omvatten en een bepaling of de pathologische kenmerken van de GEM-neoplasmata de pathologie van het overeenkomstige menselijke tumortype recapituleren.

Het tumorgevoeligheidssyndroom neurofibromatose type 1 (NF1) is de meest voorkomende genetische ziekte die het menselijk zenuwstelsel aantast en voorkomt bij ongeveer 1 op de 3.000-3.500 levendgeborenen ^1,2,3. Personen die lijden aan NF1 ontwikkelen meerdere goedaardige perifere zenuwschedetumoren die bekend staan als neurofibromen in hun huid (dermale neurofibromen) en in grote zenuwen en zenuwplexussen (plexiforme neurofibromen). Hoewel zowel dermale als plexiforme neurofibromen de kwaliteit van leven van de patiënt verslechteren door fysieke, gedrags- en/of sociale beperkingen te veroorzaken, zijn plexiforme neurofibromen (PN's) bijzonder gevaarlijk ^4,5. Dit komt omdat PN's vaak veranderen in kwaadaardige perifere zenuwschedetumoren (MPNST's), dit zijn agressieve spindelcelneoplasmata met een uitzonderlijk laag overlevingspercentage ^1,2. Voor een groot deel is dit lage overlevingspercentage te wijten aan het feit dat de radio- en chemotherapeutische regimes die momenteel worden gebruikt om MPNST's te behandelen, niet effectief zijn. Het ontwikkelen van nieuwe, effectievere therapieën was echter een uitdaging. Dit komt omdat, ondanks hoe vaak MPNST's voorkomen bij NF1-patiënten, het nog steeds zeldzame neoplasmata zijn. Als gevolg hiervan is het erg moeilijk om grote aantallen menselijke tumoren voor onderzoek te verkrijgen; het is ook een uitdaging om voldoende patiënten met MPNST's te rekruteren voor klinische onderzoeken. Om deze beperkingen te overwinnen, zijn verschillende GEM-modellen gegenereerd met als doel meer inzicht te krijgen in de afwijkingen die de pathogenese van neurofibroom en de progressie van PN-MPNST aansturen en om preklinische proeven met kandidaat-therapeutische middelen te vergemakkelijken.

NF1-patiënten hebben inactiverende mutaties in één kopie van het NF1-gen. De pathogenese van neurofibroom wordt geactiveerd wanneer een inactiverende mutatie in het resterende functionele NF1-gen optreedt in een cel in de Schwann-cellijn. Verrassend genoeg echter, toen muizen werden gegenereerd met kiembaaninactiverende Nf1-mutaties, ontwikkelden ze geen neurofibromen ^6,7. De daaropvolgende demonstratie dat muizen met Nf1-null Schwann-cellen en Nf1 haplo-insufficiëntie in alle andere celtypen (Krox20-Cre;Nf1^flox/- muizen) ontwikkelde plexiforme neurofibromen suggereerden dat een verlaagde dosering van het Nf1-gen in extra celtypen vereist was voor de pathogenese van neurofibroom⁸. Zelfs dan, de plexiforme neurofibromen in Krox20-Cre; Nf1^flox/- muizen ontwikkelden zich niet tot MPNST's en bootsten dus slechts gedeeltelijk de biologie van hun menselijke tegenhangers na. MPNST-pathogenese trad op wanneer Nf1-mutaties gepaard gingen met mutaties in aanvullende tumorsuppressorgenen zoals Trp53⁹ of Cdkn2a¹⁰, maar MPNST's in deze GEM-modellen ontwikkelden zich de novo of uit atypische neurofibromateuze neoplasmata van onzeker biologisch potentieel (ANNUBP's)^11,12, in plaats van uit reeds bestaande goedaardige plexiforme neurofibromen (zie^13,14 voor uitstekende beoordelingen van deze modellen en andere modellen die aanvullende MPNST-geassocieerde mutaties met functieverlies introduceren in genen zoals Suz12 en Pten¹⁵).

Deze muismodellen zijn van onschatbare waarde geweest voor het vaststellen van de rol die genen zoals NF1, TP53 en CDKN2A spelen in de pathogenese van NF1-geassocieerde neoplasmata van het perifere zenuwstelsel en voor preklinische onderzoeken die kandidaat-therapeutische middelen testen. We hebben echter nog steeds een onvolledig begrip van het proces waardoor plexiforme neurofibromen zich ontwikkelen tot atypische neurofibromateuze neoplasmata met een onzeker biologisch potentieel (ANNUBP's¹⁶) en vervolgens MPNST's. Er is onlangs enige vooruitgang geboekt in het begrijpen van dit proces met het recente rapport dat muizen met deleties in Nf1 en Arf ANNUBP's ontwikkelen die evolueren naar MPNST's¹¹. Er bestaan echter nog geen op Nf1-mutatie gebaseerde muismodellen die het proces van plexiforme neurofibroom-MPNST-progressie bij mensen volledig samenvatten. Bovendien is het niet duidelijk of er meerdere verschillende routes zijn die leiden tot de ontwikkeling van MPNST's. Daarom is het mogelijk dat de hierboven beschreven GEM's slechts een subset van verschillende routes modelleren die leiden tot neurofibroom-MPNST-progressie en MPNST-pathogenese. Dit punt wordt benadrukt door het feit dat MPNST's ook sporadisch voorkomen en dat sommige sporadische MPNST's blijkbaar geen NF1-mutaties hebben^17,18.

Hoewel dit laatste punt is aangevochten door de recente suggestie van Magollon-Lorenz et al. dat ten minste enkele sporadische MPNST's zonder NF1-mutaties melanomen of een ander type sarcoom^{zijn 19}, hebben we onlangs een sporadische MPNST en een cellijn afgeleid van deze tumor (2XSB-cellen) gerapporteerd die NF1 wildtype²⁰ was. Tijdens de karakterisering van de moedertumor en de 2XSB-cellijn hebben we systematisch alternatieve diagnostische mogelijkheden uitgesloten, waaronder melanoom en de vele andere sarcoomtypes die routinematig worden overwogen in de differentiële diagnose van een sporadische kwaadaardige perifere zenuwschedetumor²⁰. Bovendien merken we op dat Magollon-Lorenz et al. erkenden dat hun bevindingen in de drie sporadische MPNST-cellijnen die ze bestudeerden niet konden worden gegeneraliseerd om aan te geven dat alle tumoren die als sporadische MPNST's worden geïdentificeerd, geen MPNST's zijn.

Om een GEM-model te construeren waarin neurofibroom en MPNST-pathogenese niet noodzakelijkerwijs afhankelijk waren van specifieke tumorsuppressorgenmutaties, genereerden we transgene muizen waarin overexpressie van het krachtige Schwann-celmitogeen neureguline-1 (NRG1) werd aangedreven door de Schwann-celspecifieke myeline-eiwit nul (P₀) promotor (P 0-GGFβ3-muizen)²¹. We hebben eerder aangetoond dat menselijke neurofibromen, MPNST's en MPNST-cellijnen verschillende NRG1-isovormen tot expressie brengen, samen met de erbB-receptortyrosinekinasen (erbB2, erbB3 en erbB4) die NRG1-signalering mediëren en dat deze erbB-receptoren constitutief worden geactiveerd²². We hebben ook aangetoond dat farmacologische remmers van de erbB-kinasen de proliferatie van MPNST²², overleving²³ en migratie²⁴ krachtig remmen. In overeenstemming met onze waarnemingen bij mensen, ontwikkelen P 0-GGFβ3-muizen plexiforme neurofibromen²⁵ die zich ontwikkelen tot MPNST's met een hoge frequentie^21,25. We hebben aangetoond dat P 0-GGFβ3 MPNST's, net als hun menselijke tegenhangers, vaak mutaties van Trp53 en Cdkn2a ontwikkelen, evenals tal van andere genomische afwijkingen die mogelijk bijdragen aan tumorigenese²⁵. MPNST's die voorkomen in P 0-GGFβ3-muizen hebben geen inactiverende Nf1-mutaties. Met behulp van genetische complementatie toonden we echter aan dat NRG1 tumorigenese bevordert bij P 0-GGFβ3-muizen, voornamelijk via dezelfde signaalcascades die worden veranderd door Nf1-verlies ²⁶; deze conclusie is gebaseerd op onze bevinding dat het vervangen van NRG1-overexpressie door Nf1-verlies in aanwezigheid van Trp53-haplo-insufficiëntie (P 0-GGFβ3;Trp53^+/- muizen) produceert dieren waarin MPNST's zich de novo ontwikkelen, zoals te zien is in cis-Nf1^+/-; Trp53^+/- muizen²⁷.

Om deze en andere informatie te verkrijgen die aantoont dat P 0-GGFβ3-muizen nauwkeurig de processen van pathogenese van neurofibroom en progressie van neurofibroom-MPNST modelleren die worden gezien bij mensen met NF1, hebben we gespecialiseerde methodologieën ontwikkeld voor het verwerken van weefsels van deze dieren, het nauwkeurig diagnosticeren van hun tumoren, het beoordelen van de MPNST's die bij deze muizen ontstaan, het vaststellen en karakteriseren van vroege passage P_0-GGFβ3 en P_0-GGFβ3; Trp53^+/- MPNST-culturen en kritische vergelijking van de pathologie van P 0-GGFβ3 PN's en MPNST's en P_0-GGFβ3; Trp53^+/- MPNST's aan die van hun menselijke tegenhangers. Veel van deze methodologieën zijn generaliseerbaar naar andere GEM-modellen van neoplasie van het zenuwstelsel. Bovendien zijn verschillende van deze methodologieën breder toepasbaar op GEM-modellen waarin neoplasmata ontstaan in andere orgaansites. Daarom geven we hier een gedetailleerde beschrijving van deze methodologieën.

Protocol

De hier beschreven procedures zijn goedgekeurd door de IACUC van de Medical University of South Carolina en werden uitgevoerd door goed opgeleid personeel in overeenstemming met de NIH-gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en de richtlijnen voor institutionele dierenverzorging van MUSC.

1. Bepaling van tumorpenetrantie en overleving in P 0-GGFβ3 muizen en identificatie van tumoren bij deze dieren voor verdere karakterisering

1. Genereer het cohort muizen dat zal worden beoordeeld op tumorigenese. Het aantal benodigde muizen hangt af van de penetrantie van het tumorfenotype. Om dergelijke verliezen te compenseren, begin je met een cohort dat 10-15% hoger is dan het gewenste eindaantal dieren.
   OPMERKING: We bepaalden de tumorpenetrantie in P 0-GGFβ3-muizen empirisch in een eerste cohort van 50 muizen (waarvan er zes verloren gingen om redenen die geen verband hielden met neoplasie (bijv. vechten)⁾²⁵.
2. Beoordeel de gezondheid van dieren drie keer per week en noteer de scores voor de lichaamsconditie, inclusief gewicht en gedragsveranderingen bij elk onderzoek. Beëindig tumordragende of stervende muizen (zie opmerking hieronder) met behulp van kooldioxide-euthanasie gevolgd door cervicale dislocatie. Registreer de leeftijd bij overlijden in dagen. Als tumoren uitwendig zichtbaar zijn, noteer dan de afmetingen van de tumor (lengte, breedte en hoogte).
   OPMERKING: Het is van essentieel belang dat dieren niet verder mogen gaan dan de door de IACUC goedgekeurde maximaal toegestane tumorgrootte en/of humaan eindpunt.
3. Stel met behulp van de leeftijd bij overlijden een Kaplan-Meier-overlevingscurve vast om de gemiddelde leeftijd bij overlijden en het overlevingsbereik te bepalen.
   OPMERKING: P 0-GGFβ3-muizen hadden een gemiddelde leeftijd bij overlijden van 261,5 dagen, met een bereik van 74-533 dagen; 91% van ons cohort had meerdere neurofibromen en 71% had MPNST's²¹.
4. Bepaal of er grof zichtbare tumoren aanwezig zijn en, als dat zo is, ontleed ze dan onder steriele omstandigheden om vast te stellen of de tumor geassocieerd is met een perifere zenuw en snijd vervolgens de tumor weg. in P 0-GGFβ3 en P_0-GGFβ3; Trp53^+/- muizen, perifere zenuwschedetumoren worden het meest aangetroffen in de trigeminus- en heupzenuwen. Zelfs als er geen grof zichtbare tumoren worden gezien in verband met deze zenuwen, fixeer en veranker deze zenuwen zoals hieronder beschreven, zodat ze kunnen worden onderzocht op de aanwezigheid van microtumoren. Microtumoren komen meestal voor in de ganglia die met deze zenuwen zijn geassocieerd.
5. Snijd duidelijk zichtbare tumoren in drie stukken (Figuur 1A). Gebruik stuk 1 voor histologie (paraffinesecties, immunohistochemie en histochemie). Gebruik deel 2 om vroege passageculturen vast te stellen. Snap-freeze stuk 3 (met behulp van vloeibare stikstof) voor mogelijke toekomstige experimenten (bijv. immunoblots, RNA en DNA-isolatie).
6. Fixeer stuk 1 in 4% paraformaldehyde in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) 's nachts bij 4 ^°C. Fixeer de rest van het lichaam van het dier door onderdompeling in 4% paraformaldehyde gedurende een nacht bij 4 °C.

2. Paraffine-inbedding van grof zichtbare tumoren en voorbereiding van met hematoxyline en eosine gekleurde secties voor initiële diagnostische beoordeling

1. Paraffine-inbedding van grofzichtbaar tumoren
   1. Nadat u tumorstuk 1 's nachts in 4% paraformaldehyde hebt gefixeerd, spoelt u het weefsel door het gedurende 15 minuten in een volume PBS te plaatsen dat minstens 10x groter is dan het volume van het weefsel; Gebruik hetzelfde volume voor alle volgende spoelbeurten. Herhaal nog twee PBS-spoelingen van 15 minuten, waarbij u voor elke spoelbeurt een vers volume PBS gebruikt.
   2. Breng tumorstuk 1 over naar 70% ethanol. Houd het weefsel 24 uur bij 4 °C in 70% ethanol. Bewaar het weefsel desgewenst langdurig onder deze omstandigheden.
      OPMERKING: De stappen 2.1.1 tot en met 2.1.7 zijn bedoeld voor onderzoekers die geen toegang hebben tot een in de handel verkrijgbare weefselverwerkingsmachine. Als de onderzoeker toegang heeft tot een weefselprocessor, wordt het weefsel verwerkt door middel van gesorteerde ethanolen en xylenen volgens het geprogrammeerde instrumentprotocol.
   3. Breng tumorstuk 1 over naar 80% ethanol gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal de incubatie nog eens 30 minuten in een vers volume van 80% ethanol.
   4. Breng tumorstuk 1 over naar 95% ethanol gedurende 75 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal de incubatie nog twee keer, telkens gedurende nog eens 75 minuten in een vers volume van 95% ethanol.
   5. Breng tumorstuk 1 over naar 100% ethanol en incubeer gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal de incubatie van 60 minuten nog twee keer, telkens met een vers volume van 100% ethanol.
   6. Breng tumorstuk 1 over in een oplosmiddel op basis van d-limoneen en incubeer gedurende 30-60 minuten bij kamertemperatuur. Breng tumorstuk 1 over in een vers volume van het oplosmiddel op basis van d-limoneen en incubeer nog eens 30-60 minuten bij kamertemperatuur.
   7. Breng tumorstuk 1 over in 1:1 paraffine/d-limoneen-oplosmiddel gedurende 1 uur bij 60 ^°C. Gooi het 1:1 paraffine/d-limoneenoplosmiddel weg en breng tumorstuk 1 over naar 60 ^°C paraffine en incubeer gedurende 20 minuten bij 60 ^°C. Herhaal de incubatie in een nieuw volume van 60 ^°C paraffine nogmaals gedurende 20 minuten. Incubeer tumorstuk 1 's nachts in paraffine bij 60 ^°C.
   8. Giet een basislaag paraffine in een stalen histologiemal en laat het stollen. Breng tumorstuk 1 over op het oppervlak van de basisparaffine en bedek het weefsel onmiddellijk na het positioneren met 60 ^°C paraffine en plaats de weefselcassette bovenop en in contact met de gesmolten paraffine. Breng de mal over naar de koude kant van het inbeddingsstation en laat deze 10-15 minuten stollen.
   9. Haal het paraffineblok met de bijgevoegde tissuecassette uit de mal. Gebruik de bijgevoegde weefselcassette om het blok tijdens het doorsnijden in de microtoom te klemmen.
      OPMERKING: Het paraffineblok kan nu voor onbepaalde tijd bij kamertemperatuur worden bewaard.
2. Bereid met hematoxyline en eosine gekleurde secties van grof zichtbare tumoren voor.
   1. Snijd met behulp van een microtoom secties van 4-5 μm tumorweefsel en monteer ze op positief geladen glasplaatjes.
   2. Om hematoxyline- en eosinekleuring (H&E) uit te voeren, deparaffiniseert u de weefselsecties door de objectglaasjes gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur te incuberen in een oplosmiddel op basis van d-limoneen. Herhaal de incubatie in een nieuw volume oplosmiddel op basis van d-limoneen gedurende 10 minuten.
   3. Breng de objectglaasjes over op 100% ethanol en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Breng de objectglaasjes over in een vers volume van 100% ethanol en incubeer nog 5 minuten bij kamertemperatuur.
   4. Breng de objectglaasjes over naar 95% ethanol en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Breng de objectglaasjes over in een vers volume van 95% ethanol en incubeer nog 5 minuten bij kamertemperatuur.
   5. Breng de objectglaasjes over op 70% ethanol en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Breng vervolgens over naar 50% ethanol en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
   6. Breng de objectglaasjes over in gedestilleerd water en incubeer ze 5 minuten bij kamertemperatuur.
   7. Kleur de objectglaasjes door ze 5 minuten bij kamertemperatuur onder te dompelen in hematoxyline. Spoel af met stromend kraanwater gedurende 1-2 min. Differentieer door objectglaasjes 2-5x te dompelen in 0,5% zoutzuur in 70% ethanol. Spoel af in een stromend kraanwaterbad gedurende 1-2 min. Leg de glaasjes gedurende 10 s in 95% ethanol met 0,5% azijnzuur.
   8. Kleurstof de objectglaasjes gedurende 30 s bij kamertemperatuur met eosine-Y en breng de objectglaasjes vervolgens gedurende 5 minuten over op 100% ethanol. Verwijder de monsters gedurende 5 minuten in een oplosmiddel op basis van d-limoneen.
   9. Monteer dekglaasjes met behulp van een montagemedium op xyleenbasis terwijl het glaasje nog nat is met het oplosmiddel op basis van d-limoneen. Laat het montagemedium een nacht opstijven.
      NOTITIE: Gebruik geen montagemedium op waterbasis.
3. Bereid weefsels voor zonder grof zichtbare tumoren om plexiforme neurofibromen en micro-MPNST's te identificeren. Veranker de weefsels in paraffine, bereid histologische secties voor en kleur deze secties met hematoxyline en eosine.
   1. Verwijder de inwendige organen en plaats representatieve delen van elk orgaan in paraffine om H&E-gekleurde secties voor te bereiden die zullen worden onderzocht op microscopisch bewijs van tumoren (Figuur 1B). Verwijder het hoofd, de voorpoten, de achterpoten en de staart (Figuur 1C). Om het ruggenmerg en de zenuwwortels in situ te onderzoeken op tekenen van zenuwworteltumoren, de wervelkolom en de bijbehorende ribben en zacht weefsel te ontkalken door onderdompeling in 0,3 M EDTA/4% paraformaldehye (pH 8,0) gedurende 48-72 uur bij 4 ^oC; spoel de monsters vervolgens af met 1x PBS. Zorg er aan het einde van de ontkalking voor dat de ontkalking is voltooid door te proberen de wervelkolom met een naald te doorboren. Ontkalking is succesvol als de naald gemakkelijk in het bot dringt zonder te knarsen.
   2. Snijd de ontkalkte wervelkolom en bijbehorende structuren in blokken die in een weefselcassette passen. Dehydrateren door middel van gedifferentieerde ethanolen, gevolgd door een oplosmiddel op basis van d-limoneen zoals beschreven in de stappen 2.1.2-2.1.7. Veranker in paraffine en bereid secties van 4-5 μm voor zoals beschreven in de stappen 2.1.7-2.2.1. Voer H&E-beitsingen uit zoals beschreven in de stappen 2.2.2-2.2.9; Laat het montagemedium een nacht opstijven.

3. Identificeer potentiële plexiforme neurofibromen en voer speciale kleuringen uit om diagnoses te bevestigen

OPMERKING: We raden ten zeerste aan om een ervaren humane of veterinaire patholoog te betrekken bij de evaluatie van H&E en speciale kleuringen van GEM-tumorsecties.

1. Bestudeer de H&E-gekleurde objectglaasjes die zijn voorbereid zoals hierboven beschreven met behulp van helderveldmicroscopie om mogelijke tumoren in de perifere zenuwschede te identificeren. Aangezien neurofibromen en MPNST's ontstaan in perifere zenuwen, is het belangrijk om te bepalen of microscopisch kleine tumoren geassocieerd zijn met een perifere zenuw. Identificeer blokkades met mogelijke perifere zenuwschedetumoren, zodat immunokleuringen en andere speciale kleuringen kunnen worden uitgevoerd om diagnoses te bevestigen of te weerleggen.
2. Onderscheid potentiële PN's van MPNST's/andere hooggradige neoplasmata op basis van histologische kenmerken die worden waargenomen tijdens helderveldonderzoek van H&E-gekleurde secties. Menselijke PN's zijn licht hypercellulaire neoplasmata die voornamelijk bestaan uit cellen met langwerpige, vaak golvende kernen. In veel gebieden zijn de cellen losjes opeengepakt en kunnen ze worden gescheiden door myxoïde extracellulair materiaal; PN's in P 0-GGFβ3-muizen hebben een vergelijkbaar uiterlijk. Mitose is meestal niet aanwezig; als dat het geval is en de tumor matig tot sterk hypercellulair is, is de tumor een MPNST of een ander type hooggradig neoplasma (zie hieronder).
3. PN's zijn samengesteld uit een mengsel van neoplastische Schwann-cellen en andere niet-neoplastische celtypen zoals mestcellen. Om de identiteit van een PN te bevestigen, voert u immunokleuringen uit voor de Schwann-celmarkers S100β en Sox10 en de mestcelmarker CD117 (c-Kit) op secties van blokken die potentiële PN's bevatten die zijn geïdentificeerd bij H&E-onderzoek (zie rubriek 3.4 voor alternatieve opties voor het kleuren van mestcelmarkers). Voer Ki67-immunokleuringen uit om lage proliferatiesnelheden te bevestigen.
   OPMERKING: Tabel 1 geeft een overzicht van de antigeenmarkers die worden gebruikt voor routinematige identificatie van GEM-plexiforme neurofibromen (S100β, Sox10, CD117, Ki67), de diagnose van MPNST's en voor een volledige beoordeling van andere celtypen die aanwezig zijn in neurofibromen; we kleuren alleen voor deze laatste antigenen wanneer we voor het eerst een nieuw GEM-model beschrijven. Raadpleeg het gegevensblad van de fabrikant van het antilichaam voor aanbevolen omstandigheden. Let op of de bijsluiter van de fabrikant van het antilichaam het ophalen van antigeen aanbeveelt; Niet alle antigenen hoeven te worden opgehaald om detecteerbaar te zijn.
   1. Bereid secties van 4-5 μm voor van de geselecteerde paraffineblokken en monteer ze op positief geladen objectglaasjes. Deparaffiniseer secties zoals beschreven in de stappen 2.2.2-2.2.6.
   2. Spoel secties met 1x PBS gedurende 3-5 min.
   3. Als de fabrikant van het antilichaam antigeenextractie aanbeveelt, bereid dan citraatbuffer voor. Combineer 9 ml citroenzuuroplossing (10,5 g citroenzuur in 500 ml gedestilleerd water) en 41 ml natriumcitraatoplossing (14,7 g natriumcitraat in 500 ml gedestilleerd water).
   4. Voer het ophalen van antigeen uit door objectglaasjes gedurende 20 minuten in citraatbuffer in een verwarmde rijstkoker te plaatsen.
   5. Breng de glaasjes gedurende 10 minuten over in 3% waterstofperoxide/1x PBS om de peroxidase-activiteit in het weefsel te elimineren.
      NOTITIE: Maak deze oplossing elke keer vers en gebruik de standaardoplossing van waterstofperoxide niet als deze ouder is dan 3-4 maanden.
   6. Spoel secties in 1x PBS.
   7. Blokkeer secties met behulp van een blokkeerbuffer (2% BSA, 0,1% Triton X-100 in 1x PBS) gedurende 1 uur. Spoel de glaasjes kort af in 1x PBS.
   8. Voeg primair antilichaam toe aan weefselsecties. Bereid primaire antilichamen voor in verdunde blokkeerbuffer. Incubeer de objectglaasjes gedurende 2 uur bij 37 ^°C of 's nachts bij 4 ^°C.
   9. Was de glaasjes in 1x PBS gedurende 5 min. Herhaal 3x.
   10. Incubeer weefsel met gebiotinyleerd secundair antilichaam gedurende 1-2 uur.
   11. Bereid diaminobenzidine (DAB)-oplossing volgens het protocol van de fabrikant en dompel de objectglaasjes gedurende 2-10 minuten onder in de oplossing. Was de glijbanen 5 minuten in water.
   12. Ga stain-secties tegen door ze gedurende 10-15 minuten onder te dompelen in hematoxyline. Stel bloot aan stromend water totdat het helder is. Dompel de glaasjes snel in alcohol en spoel de glaasjes af in water.
   13. Dehydrateer glaasjes in gesorteerde ethanolen door objectglaasjes snel te dompelen, 4-5x per oplossing, in 70% ethanol, 95% ethanol en vervolgens 100% ethanol. Incubeer glaasjes in een oplosmiddel op basis van d-limoneen gedurende 2 minuten. Incubeer objectglaasjes in een tweede batch oplosmiddel op basis van d-limoneen gedurende 2 minuten.
   14. Monteer de geleiders met een montagemedium op basis van xyleen.
   15. Onderzoek objectglaasjes met behulp van helderveldmicroscopie.
   16. Voor immunofluorescentie worden de stappen 3.3.10-3.3.15 overgeslagen. Incubeer in plaats daarvan weefsel met soortspecifiek secundair antilichaam verdund in blokkeerbuffer gedurende 1-2 uur.
   17. Spoel de glaasjes 5x in PBS gedurende 5 min. Herhaal 3x.
   18. Monteer objectglaasjes met 1x PBS/glycerol.
   19. Onderzoek objectglaasjes met behulp van fluorescentiemicroscopie.
4. Alternatieve methode voor het kleuren van mestcellen: toluïdineblauwkleuring
   1. Bereid toluïdine blauwe bouillon oplossing door 1 g toluïdine blauw O op te lossen in 100 ml 70% ethanol.
   2. Bereid 1% natriumchloride (NaCl)-oplossing door 0,5 g NaCl op te lossen in 50 ml gedestilleerd water. Meng om op te lossen. Pas de pH aan tot ongeveer 2,0-2,5 met HCl.
      NOTITIE: Deze NaCl-oplossing moet elke keer dat vlekken worden aangebracht, vers worden gemaakt.
   3. Bereid de werkoplossing toluïdineblauw voor door 5 ml toluïdineblauwstockoplossing toe te voegen aan 45 ml van de 1% NaCl-oplossing. Meng goed en zorg ervoor dat de pH ongeveer 2,3 is.
      OPMERKING: Een pH hoger dan 2.5 zal resulteren in kleuring met minder metachromasie. Maak deze oplossing elke keer dat er wordt gekleurd vers aan.
   4. Deparaffiniseer secties van 4-5 μm die zijn gemonteerd op positief geladen objectglaasjes, zoals beschreven in de stappen 2.2.2-2.2.6. Was gedeparaffiniseerde secties gedurende 2 minuten in stromend water.
   5. Kleursecties in toluïdineblauwe werkoplossing gedurende 2-3 min. Wassen in gedestilleerd water gedurende 2 min.
   6. Dehydrateer secties door 10x in 95% ethanol te dompelen. Dompel dia's in 100% ethanol 10x. Dompel de glijders nog 10 keer in verse 100% ethanol.
   7. Incubeer glaasjes in een oplosmiddel op basis van d-limoneen gedurende 2 minuten. Incubeer objectglaasjes in een tweede batch oplosmiddel op basis van d-limoneen gedurende 2 minuten.
   8. Monteer dekglaasjes met behulp van een montagemedium op xyleenbasis terwijl het glaasje nog nat is met een oplosmiddel op basis van d-limoneen.
      NOTITIE: Gebruik geen montagemedium op waterbasis.
   9. Onderzoek objectglaasjes met behulp van helderveldmicroscopie. Identificeer mestcellen aan de hand van de aanwezigheid van donkerpaarse korrels in hun cytoplasma. Andere celtypen zijn lichtblauw gekleurd.

4. Speciale vlekken om MPNST's te diagnosticeren en alternatieve diagnoses uit te sluiten

1. Het histologische uiterlijk van menselijke MPNST's is zeer variabel en verschillende tumortypes hebben een uiterlijk dat vergelijkbaar is met dat van MPNST's²⁸. Aangezien MPNST's zijn afgeleid van de Schwann-cellijn, moet u bepalen of de tumor voortkomt uit een perifere zenuw of in een bestaande goedaardige PN door grof onderzoek of helderveldmicroscopisch onderzoek van H&E-gekleurde secties. Hoewel MPNST's af en toe niet geassocieerd worden gevonden met een perifere zenuw of PN (meestal vanwege onbedoelde scheiding van de zenuw tijdens dissectie, vernietiging van de reeds bestaande PN via MPNST-overgroei, of omdat de laesie gemetastaseerd is), zoek naar de associatie van de tumor met een zenuw of PN, aangezien de diagnose minder waarschijnlijk is als de tumor niet geassocieerd is met een zenuw of PN.
2. Maak secties van 4-5 μm van paraffineblokken die potentiële MPNST's bevatten en monteer ze op positief geladen objectglaasjes zoals beschreven in stap 2.2.1. Deparaffiniseer secties zoals beschreven in de stappen 2.2.2-2.2.6.
3. Voer immunohistochemie uit met het in tabel 2 aangegeven panel van antilichamen, zoals beschreven in de stappen 3.3.1-3.3.15.
4. Onderzoek de immunokleuringen met behulp van helderveldmicroscopie. Aangezien MPNST's schwanniaanse differentiatie vertonen, moet u zoeken naar uniforme of fragmentarische immunoreactiviteit voor S100β, nestine en Sox10. Als de tumoren niet positief zijn voor deze drie markers, raadpleeg dan Tabel 2 om de diagnose vast te stellen.
   OPMERKING: MPNST's bij mensen en muizen kunnen divergente differentiatie aantonen. Sommige menselijke MPNST's vertonen bijvoorbeeld focale rhabdomyoblastische differentiatie (deze varianten staan bekend als kwaadaardige Triton-tumoren); hoewel deze neoplasmata de Schwanniaanse markers zullen kleuren, brengen ze ook spiermarkers tot expressie zoals desmine, MyoD1 en myogenine. Immunoreactiviteit voor deze laatste markers mag onderzoekers er niet van weerhouden de tumor als een MPNST te diagnosticeren. Hoewel er meerdere muismodellen zijn vastgesteld die het SS18-SSX-fusiegen voorwaardelijk tot expressie brengen om de pathogenese van synoviaal sarcoom²⁹ te modelleren, zijn er voor zover wij weten geen synoviale sarcoommodellen bekend die spontaan het equivalente fusietranscript genereren. Daarom zoeken we niet naar SS18-SSX-fusietranscripten in GEM-tumoren en vertrouwen we in plaats daarvan op immunohistochemische profielen.

5. Beoordeling van de MPNST's

1. Bepaal of tumornecrose, een kenmerk van WHO graad IV MPNST's, aanwezig is. Zoek voor MPNST's van graad IV naar prominente hypercellulariteit, stevige mitotische activiteit (≥4 mitosen per 10 velden met hoog vermogen (40x) en cytologische atypie.
   1. Als necrose niet aanwezig is, beoordeel dan de tumor om te bepalen of hypercellulariteit, stevige mitotische activiteit en cytologische atypie aanwezig zijn. Als deze kenmerken allemaal aanwezig zijn in afwezigheid van necrose, beoordeel de tumor dan als een WHO graad III MPNST.
   2. WHO graad II tumoren worden gekenmerkt door cellulariteit die verhoogd is, maar in mindere mate dan WHO graad III en IV MPNST's. De kernen van tumorcellen in een WHO graad II MPNST vertonen een grotere omvang (meer dan 3x de grootte van de tumorcelkernen in neurofibromen) en hyperchromasie. Verhoogde mitotische activiteit (<4 mitosen per 10 velden met hoog vermogen) wordt geassocieerd met, maar is geen vereiste voor, WHO graad II tumoren.
      OPMERKING: Aangezien tumoren van een hogere graad doorgaans vorderen van lagere graden, kunnen laaggradige en hooggradige regio's aanwezig zijn in dezelfde MPNST. In dit geval wordt de graad van de tumor bepaald door het hoogst aanwezige gebied.
      OPMERKING: Er is controverse onder menselijke pathologen over de vraag of het hierboven beschreven WHO-beoordelingssysteem voorspellend is voor patiëntuitkomsten en sommige van deze pathologen geven er de voorkeur aan om MPNST's eenvoudigweg te classificeren als laaggradig of hooggradig. Volgens dit schema hebben hooggradige MPNST's prominente cytologische atypie, stevige mitotische activiteit (>5 mitosen per 10 velden met hoog vermogen) en duidelijke hypercellulariteit met of zonder necrose. Laaggradige MPNST's hebben geen necrose, maar vertonen mitotische activiteit, cytologische atypie en cellulariteit die het midden houdt tussen een hooggradig MPNST en een atypisch neurofibromateus neoplasma met onbekend biologisch potentieel (ANNUBP). We geven de voorkeur aan het hierboven beschreven systeem omdat het onderscheid tussen een ANNUBP en een laaggradige MPNST een uitdaging kan zijn voor onderzoekers die geen lange ervaring hebben met deze entiteiten.

6. Bereiding van culturen van vroege passage P 0-GGFβ3 MPNST-cellen

1. Kweek vroege passage P 0-GGFβ3 tumorcellen uit vers tumorstuk 2 (stap 1.5, figuur 1A). Handhaaf vanaf dit punt steriele omstandigheden.
   1. Dissocieer de tumor door deze in kleine (2-4 mm) stukjes te snijden en in DMEM10 (Dulbecco's minimale essentiële medium) te hakken met 10% foetaal kalfsserum, 2 μmol/L forskoline en 10 nmol/L neureguline 1β (NRG1β) in weefselkweekschaaltjes van 100 mm.
   2. Laat cellen uit de gehakte weefselfragmenten groeien bij 37 ^°C in 5% CO₂ totdat de platen samenvloeien. Wissel elke 3-4 dagen van media.
   3. Splits de celcultuur. Verwijder de media uit de schaal van 100 mm en was de cellen met PBS; Verwijder gehakt weefsel en gooi het weg. Verwijder PBS en voeg 1 ml 0,25% trypsine toe gedurende 2-5 minuten bij kamertemperatuur. Om celloslating te bevorderen, tikt u zachtjes op de plaat en controleert u op loslating met een lichtmicroscoop; verleng de trypsine-incubatie indien nodig.
   4. Neutraliseer trypsine door 2 ml DMEM10 toe te voegen. Breng de celsuspensie gedurende 5 minuten over in een centrifugebuis en pelletcellen bij 500 × g . Verwijder het medium en voeg 5 ml verse DMEM10 toe aan de pellet.
   5. Verdeel de celsuspensie over twee tot vier schalen van 100 mm die DMEM10 bevatten. Splits de cellen niet langer dan vijf passages (stappen 6.1.3 en 6.1.4) en houd ze in DMEM zonder forskoline en NRG1β. Vergeet niet om cellen bij doorgang 2 in te vriezen voor toekomstig gebruik.

7. Verificatie van de identiteit van MPNST-cellen met vroege passage door middel van immunocytochemie

1. Plaats steriele 18 mm #1.5 ronde glazen dekglaasjes in de putjes van steriele weefselkweekschaaltjes met 6 putjes.
   1. Breng poly-L-lysine/laminine-oplossing in de putjes in een volume dat voldoende is om het dekglaasje te bedekken. Sluit de plaat af met plasticfolie om verdamping tot een minimum te beperken. Incubeer gedurende een nacht bij 4 °C. Was de volgende ochtend de dekglaasjes 3x met steriele PBS.
      OPMERKING: We hebben geprobeerd MPNST-cellen met vroege doorgang op niet-gecoate dekglaasjes te plaatsen en hebben geconstateerd dat de cellen niet goed hechten bij afwezigheid van poly-L-lysine/lamininecoating.
   2. Plaats 10.000 cellen op het dekglaasje door voorzichtig 2 ml van de celsuspensie in groeimedia toe te voegen aan elk putje met het dekglaasje. Incubeer de platen een nacht bij 37 °C met 5% CO₂ in een weefselkweekincubator.
   3. Spoel de dekglaasjes de volgende ochtend 2 x 5 minuten uit met PBS.
   4. Fixeer cellen met 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 18 minuten bij kamertemperatuur.
   5. Spoel de dekglaasjes 3 x 5 min af met PBS. Sluit de plaat desgewenst af met plastic folie en bewaar deze op dit punt bij 4 °C.
   6. Maak vers 50 mM NH₄Cl in PBS. Blus aldehyden door dekglaasjes in 50 mM NH₄Cl gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in PBS te incuberen.
   7. Permeabiliseer de cellen door dekglaasjes in 0,3% Triton X-100 in PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur te incuberen. Was dekglaasjes 3 x 5 min met PBS.
   8. Blokkeer niet-specifieke binding door dekglaasjes te incuberen in blokkeerbuffer (1x PBS met 1% runderserumalbumine, 0,2% magere droge melk en 0,3% Triton X-100) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
   9. Verwijder de blokkerende buffer en voeg primaire antilichamen toe die de MPNST-markers herkennen die aanwezig zijn in de moedertumor (meestal S100β, Nestin en Sox10) verdund tot de vooraf bepaalde optimale verdunning in de blokkerende buffer. Wikkel de plaat in plastic folie en incubeer een nacht bij 4 °C in een bevochtigde kamer.
   10. Was 3 x 5 min met PBS om ongebonden primaire antilichamen te verwijderen. Voeg fluorescerend gelabeld secundair antilichaam verdund in blokkeerbuffer toe en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Beschermen tegen licht.
   11. Was 3 x 5 min met PBS. Incubeer dekglaasjes in 1-5 μg Hoechst-kleurstof gedurende 10 min. Blijf beschermen tegen licht.
   12. Was dekglaasjes met PBS gedurende 5 min. Monteer dia's met 1:1 1x PBS/glycerol. Afbeelding met een fluorescentiemicroscoop.

8. Allograft van tumorcellen met vroege passage om tumorigeniciteit aan te tonen

1. Kweek vroege passage P 0-GGFβ3 MPNST-cellen in DMEM10 tot 80% confluentie. Spoel de cellen één keer met de uitgebalanceerde zoutoplossing (HBSS) van Hanks op kamertemperatuur. Behandel cellen gedurende 30 s tot 1 minuut met een niet-enzymatische celdissociatieoplossing om ze van het substraat te verwijderen. Voeg 5 ml DMEM10 toe per 1 ml van een niet-enzymatisch celdissociatiereagens.
   OPMERKING: Cellulaire dissociatie kan veel langer duren, tot 10-20 minuten. Raadpleeg het protocol van de fabrikant.
   OPMERKING: Kweek geen cellen tot samenvloeiing, omdat dit de effectiviteit van het transplantaat zal verminderen.
   1. Tel cellen met behulp van een hemocytometer. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 5 × g en resuspendeer ze in een concentratie van 1-2 × 10⁶ cellen per 100 μL DMEM10. Bewaar de cellen op ijs totdat ze klaar zijn voor injectie.
   2. Verdoof NOD-SCIDγ (NOD.Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1wjl/SzJ) muizen in de inductiekamer van een isofluraanverdamper. Leg het dier op zijn buik en steriliseer de injectieplaats met 70% ethanol. Laat de plaats aan de lucht drogen voordat u gaat injecteren. Laat de cellen vóór de injectie op kamertemperatuur komen.
   3. Injecteer 1-2 x 10⁶ cellen subcutaan in de rechterflank. Plaats de muis alleen in een kooi zonder bodembedekking en laat hem herstellen. Zorg ervoor dat slechts een deel van de kooi op een verwarmingskussen staat om onderkoeling te voorkomen. Dit biedt een zone waar de muis naartoe kan bewegen als deze oververhit raakt.
      OPMERKING: We enten minimaal drie muizen met elke vroege passagecultuur, omdat sommige transplantaten mogelijk niet nemen.
   4. Laat het transplantaat 15-60 dagen groeien; Beoordeel de diergezondheid 3x per week en noteer de scores van de lichaamsconditie, inclusief gewicht en gedragsveranderingen bij elk onderzoek. Beëindig muizen die de maximaal toegestane transplantaatgrootte hebben bereikt of stervende muizen met behulp van kooldioxide-euthanasie gevolgd door cervicale dislocatie. Registreer de leeftijd bij overlijden in dagen. Als tumoren uitwendig zichtbaar worden, noteer dan de afmetingen van de tumor (lengte, breedte en hoogte).
      OPMERKING: Onze ervaring is dat verschillende MPNST-culturen met vroege passage met verschillende efficiëntie worden getransplanteerd en verschillen in de tijd die nodig is voor de groei van het transplantaat. Dieren mogen niet verder gaan dan de door de IACUC goedgekeurde maximaal toegestane tumorgrootte en/of humaan eindpunt.
2. Oogst de tumor, fixeer deze in 4% paraformaldehyde, bedin deze in paraffine en voer H&E-kleuringen uit zoals beschreven in rubrieken 2.1-2.2.9 om te verifiëren dat het allotransplantaat een tumor is in plaats van een reactief weefsel. Immunokleuring van het transplantaat indien nodig voor de markers die aanwezig waren in de oudertumor.

Results

Figuur 2 illustreert voorbeelden van duidelijk voorkomende neoplasmata die ontstaan bij P 0-GGFβ3-muizen. Tumoren die gemakkelijk met het blote oog kunnen worden geïdentificeerd, kunnen worden gezien als massa's die lichaamsdelen uitzetten, zoals weergegeven in figuur 2A (pijl). Bij het bepalen of het neoplasma mogelijk een perifere zenuwschedetumor is, is het essentieel om vast te stellen dat de tumor geassocieerd is met een perifere zenuw. In dit geval toont een MRI-scan (figuur 2B) aan dat de tumor geassocieerd is met de heupzenuw (pijlpunt); Deze associatie werd bevestigd na het euthanaseren van de muis en het ontleden van de tumor. Opgemerkt moet worden dat een grote omvang niet noodzakelijkerwijs aangeeft dat de tumor kwaadaardig is. In dit geval toonde een histologisch onderzoek van de tumor (figuur 2C) aan dat het om een neurofibroom ging. Meestal worden echter grove tumoren niet geïdentificeerd na het uitvoeren van de autopsie van de muis. Figuur 2D illustreert een grote, vlezige MPNST die ontstond in de plexus brachialis van dit dier.

Figuur 3 illustreert representatieve voorbeelden van MPNST's en neurofibromen van P 0-GGFβ3-muizen bereid volgens de procedures beschreven in protocolsectie 1. Figuur 3A-J illustreert tien voorbeelden van onafhankelijk ontstane MPNST's uit onze P_0-GGFβ3 muizenkolonie. Merk op dat het histologische uiterlijk van MPNST's zeer variabel kan zijn, zelfs tussen MPNST's die onafhankelijk van elkaar in hetzelfde dier voorkomen. Deze histologische variabiliteit illustreert waarom we routinematig de diagnose van P 0-GGFβ3 MPNST's bevestigen met immunohistochemische kleuringen. We willen er ook op wijzen dat andere, ogenschijnlijk niet-verwante tumortypes sporadisch en met een lage frequentie voorkomen in sommige ingeteelde muizenstammen (we zijn bijvoorbeeld verschillende keren lymfomen tegengekomen bij P 0-GGFβ3-muizen die het transgen dragen op een C57BL/6J-achtergrond), wat verder het belang benadrukt van het gebruik van immunohistochemie om tumordiagnoses te bevestigen. Ondanks de variabiliteit van hun histologische verschijning, waren alle tien tumoren geïllustreerd in figuur 3A-J immunoreactief voor S100β en nestine en negatief voor markers van andere tumortypes. Figuur 3K illustreert een representatief beeld van een goed ontkalkte wervelkolom en bijbehorende weefsels. Merk op dat het ruggenmerg, de zenuwwortels, het wervellichaam en de skeletspieren allemaal hun juiste anatomische relatie met elkaar onderhouden. Figuur 3L is een afbeelding met een hoger vermogen van het wervellichaam en het bovenliggende ruggenmerg. Omdat dit weefsel goed is ontkalkt, is het bot gemakkelijk gesneden zonder te versnipperen of te vouwen, en is het beenmerg gemakkelijk herkenbaar in de mergruimten. Als het weefsel niet goed was ontkalkt, zou het aan het microtoomblad zijn blijven haken en uit de sectie zijn gescheurd, waardoor aanzienlijke schade zou zijn toegebracht aan aangrenzende weefsels (ruggenmerg, spinale zenuwwortels en skeletspieren). Figuur 3M toont een representatief beeld van een neurofibroom dat ontstaat in een dorsale zenuwwortel in een P 0-GGFβ3-muis. Merk op dat deze tumor minder cellulair is dan de MPNST's die worden weergegeven in figuur 3A-J. De belangrijkste diagnose voor neurofibromen is dat ze zijn samengesteld uit een complex mengsel van neoplastische Schwann-cellen en niet-neoplastische mestcellen, macrofagen, fibroblasten en perineuriaalachtige elementen die de zenuw infiltreren en axonen uit elkaar verspreiden.

Figuur 4 illustreert voorbeelden van de kleuringen die het nuttigst zijn voor de eerste identificatie van een plexiform neurofibroom en het onderscheid tussen een plexiform neurofibroom en een MPNST. Figuur 4A illustreert de immunoreactiviteit van S100β in een P 0-GGFβ3 plexiform neurofibroom. Merk op dat S100β-immunoreactiviteit alleen zichtbaar is in een subpopulatie van cellen, wat in overeenstemming is met het feit dat neurofibromen zijn samengesteld uit een mengsel van neoplastische Schwann-cellen en andere niet-neoplastische elementen (fibroblasten, mestcellen, macrofagen, perineuriaalachtige cellen, een slecht gedefinieerde CD34-immunoreactieve cellulaire populatie en vasculatuur). Helaas maakt fragmentarische S100β-kleuring geen onderscheid tussen plexiforme neurofibromen en MPNST's, aangezien S100β-kleuring fragmentarisch kan zijn in MPNST's (H&E-kleuring is echter nuttig voor dit doel; aangezien MPNST's doorgaans meer cellulair zijn dan plexiforme neurofibromen [zie figuur 3]). Neoplastische Schwann-cellen zijn ook immunoreactief voor het intermediaire filamentnestine, zoals aangetoond in de P 0-GGFβ3 MPNST gepresenteerd in figuur 4B. Neoplastische Schwann-cellen vertonen ook vaak nucleaire immunoreactiviteit voor de transcriptiefactor Sox10, zoals weergegeven in een MPNST in figuur 4C. Kenmerken die nuttig zijn om onderscheid te maken tussen plexiforme neurofibromen en MPNST's zijn de aanwezigheid van mestcellen en prominente immunoreactiviteit voor de Ki67-proliferatiemarker. Figuur 4D illustreert een Unna-kleuring uitgevoerd op een P 0-GGFβ3 plexiform neurofibroom om de aanwezigheid van mestcellen te benadrukken, die gemakkelijk te herkennen zijn aan de prominente metachromatische violette kleuring van hun cytoplasmatische korrels. Mestcellen zijn niet aanwezig in MPNST's. Daarentegen is de immunoreactiviteit van Ki67 vrijwel onbestaande in plexiforme neurofibromen, zoals te zien is in de P 0-GGFβ3-tumor weergegeven in figuur 4E. Nucleaire Ki67-labeling is typisch aanwezig in een zeer hoge fractie tumorcellen, zoals te zien is in de microscopische MPNST die ontstaat in het trigeminusganglion van een P 0-GGFβ3-muis (Figuur 4F).

Figuur 5 illustreert voorbeelden van de kleuringen die we uitvoeren om de cellulaire samenstelling van neurofibromen volledig te karakteriseren in een nieuw ontwikkeld GEM-model. Hoewel de vlekken in deze figuur zijn verkregen in menselijke dermale neurofibromen, zijn ze qua uiterlijk identiek aan wat we hebben gezien bij GEM-tumoren. Immunoreactiviteit voor CD117 (c-Kit) is aanwezig in mestcellen in neurofibromen en heeft dus een verdeling die sterk lijkt op wat wordt gezien bij Unna-kleuringen (zie figuur 3A). Macrofagen zijn ook verspreid over neurofibromen aanwezig, zoals te zien is bij de pan-macrofaagmarker Iba1 (zie figuur 5D); dit omvat subklassen van macrofagen die immunoreactief zijn voor CD163 en CD86 (zie respectievelijk figuur 5B en figuur 5C). Een fractie van het Schwanniaanse element in neurofibromen vertoont ook nucleaire immunoreactiviteit voor Sox10. Fibroblasten kunnen worden gemarkeerd door hun immunoreactiviteit voor TCF4. In figuur 5G labelt CD31 de vasculaire elementen in het neurofibroom, terwijl CD34, gedemonstreerd in figuur 5H, een raadselachtige dendritische populatie van cellen labelt waarvan is gesuggereerd dat ze ofwel een subpopulatie zijn van residente weefselmacrofagen³⁰ of een nieuwe populatie van zenuwschedecellen die geen Schwann-cellen of fibroblasten zijn³¹.

Figuur 6 is opgenomen om de vergelijking van menselijke plexiforme neurofibromen en MPNST's met de tumoren die worden gezien in P 0-GGFβ3-muizen mogelijk te maken en om representatieve voorbeelden te geven van enkele van de menselijke tumortypen die kunnen worden verward met MPNST's. Figuur 6A illustreert een plexiform neurofibroom dat ontstond in de plexus brachialis van een NF1-patiënt, terwijl figuur 6B de WHO graad IV MPNST weergeeft die ontstond binnen ditzelfde plexiforme neurofibroom. Figuur 6B toont enkele van de karakteristieke kenmerken van een WHO graad IV MPNST, waaronder duidelijke hypercellulariteit en cellulaire atypie, stevige mitotische activiteit en tumornecrose. Ter vergelijking: figuur 6C toont een WHO graad II MPNST die significante cellulaire atypie heeft, maar minder hypercellulair is dan de graad IV MPNST en, hoewel er mitosen aanwezig zijn, minder mitotische activiteit vertoont. Figuur 6D illustreert een fibrosarcoom met zijn karakteristieke "visgraat"-patroon van verweven omhulsels van tumorcellen. Dit patroon maakt echter niet noodzakelijkerwijs onderscheid tussen fibrosarcomen en MPNST's, omdat sommige MPNST's een vergelijkbaar patroon hebben. Verder toont de weergave met een hoger vermogen in figuur 6E een cellulaire morfologie die vergelijkbaar is met die in de WHO graad IV MPNST gepresenteerd in figuur 6B. Figuur 6F illustreert een leiomyosarcoom. In tegenstelling tot de meeste MPNST's zijn leiomyosarcomen immunoreactief voor spiermarkers zoals gladde spieractine en desmine. De immunoreactiviteit van actine in gladde spieren kan echter variëren van tumor tot tumor, waarbij sommige tumoren intense uniforme immunoreactiviteit vertonen (Figuur 6G) en andere immunoreactiviteit vertonen die cellulaire variabiliteit binnen de tumor vertoont (Figuur 6H). De immunoreactiviteit van desmine kan ook fragmentarisch zijn bij leiomyosarcomen (Figuur 6I). Melanomen zijn zeer variabel in morfologie, waarbij sommige tumoren zijn samengesteld uit veelhoekige cellen (Figuur 6J) en andere zijn samengesteld uit spoelcellen die de morfologie van MPNST-cellen kunnen nabootsen. Melanomen kunnen worden onderscheiden van MPNST's door immunoreactiviteit voor melanosoommarkers zoals MART1 (Figuur 6K). Melanomen, zoals MPNST's, zijn echter vaak positief voor S100β en Sox10 (Figuur 6L).

Figuur 7 illustreert de pathologische kenmerken van WHO graad II, III en IV MPNST's geïsoleerd uit P0-GGFβ3-muizen. Figuur 8 toont representatieve beelden van P 0-GGFβ3 MPNST-cellen met een vroege passage bij een laag (Figuur 7A) en hoog (Figuur 7B) vermogen. De tumorigeniciteit van deze cellen wordt aangetoond door zowel hun vermogen om kolonies te vormen wanneer ze in zachte agar worden gesuspendeerd (Figuur 7C) als om transplantaten te vormen wanneer ze subcutaan worden getransplanteerd bij immunodeficiënte muizen (Figuur 7D).

Figuur 1: Workflow gebruikt voor het verwerken van tumor- en andere weefsels van P 0-GGFβ3-muizen. (A) Grof zichtbare tumoren worden geoogst en gesegmenteerd in drie porties voor 1) fixatie in 4% paraformaldehyde gevolgd door immunohistochemie en histochemie, 2) vaststelling van tumorcelkweek met vroege passage en/of genomische analyses, en 3) snap-freezing met behulp van vloeibare stikstof voor eiwit-, DNA- of RNA-isolatie. (B) Na de excisie van de tumor wordt het lichaam van de muis gefixeerd in 4% paraformaldehyde en worden de inwendige organen verwijderd. Deze organen worden bemonsterd voor histologisch onderzoek dat wordt uitgevoerd om microscopisch bewijs van neoplasma en andere pathologische processen te identificeren. (C) Na verwijdering van de inwendige organen worden de ledematen (kop, ledematen, staart) en de huid van het karkas verwijderd. De wervelkolom, aangrenzende ribben en aangrenzende skeletspieren worden ontkalkt met 0,3 M EDTA/4% paraformaldehyde (pH 8,0). De ontkalkte weefsels worden vervolgens in paraffine ingebed en delen van de weefsels worden voorbereid voor immunohistochemisch en histochemisch onderzoek. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Representatieve beelden van overduidelijke neurofibromen en MPNST's bij P 0-GGFβ3 muizen. (A) P 0-GGFβ3 muis met een grote grove tumor op de rechterflank (pijl). (B) Een MRI-scan van deze muis laat zien dat de tumor verbonden is met de heupzenuw (pijlpunt) en dat deze door de bovenliggende fascia is gegroeid om zich uit te breiden in het onderhuidse (pijl, bulktumormassa). (C) Microscopisch onderzoek van deze tumor toont aan dat, ondanks zijn grote omvang, de tumor een neurofibroom is. (D) Grote vlezige MPNST die ontstond in de plexus brachialis van een P 0-GGFβ3-muis. Schaalbalk = 100 μm. (C). Afkortingen: MPNST's = maligne perifere zenuwschedetumoren; MRI = magnetische resonantie beeldvorming. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3: Representatieve beelden van MPNST's, ontkalkte wervelkolom en neurofibromen bereid zoals beschreven in protocolsectie 1. (A-J) Uitgesneden en H&E-gekleurde P 0-GGFβ3 MPNST's vertonen histologische variabiliteit. Alle beelden zijn onafhankelijk ontstane MPNST's. Ondanks deze histologische variabiliteit vertoonden deze tumoren allemaal de juiste etikettering voor de MPNST-markers die in tabel 1 zijn aangegeven. Schaalbalken = 200 μm. (K) Representatief beeld van een H&E-gekleurde dwarsdoorsnede van de ontkalkte wervelkolom. In deze afbeelding zijn de volgende structuren gemakkelijk te visualiseren: het ruggenmerg; wervelbeen; de ganglia van de dorsale wortel op de dorsale spinale zenuwwortel; en paravertebrale skeletspieren. Vergroting 4x. (L) Een afbeelding met een hoger vermogen van het ruggenmerg en de wervel die in K wordt getoond, toont het juiste uiterlijk van bot na ontkalking met deze methodologie. Vergroting 10x. (M) Representatief beeld van een neurofibroom van de dorsale zenuwwortel in een P_{0-GGFβ3-muis}. Vergroting 40x. Schaalbalken = 100 μm. Afkortingen: MPNST's = maligne perifere zenuwschedetumoren; H&E = hematoxyline en eosine. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4: Diagnostische kleuring gebruikt voor de initiële identificatie van plexiforme neurofibromen en hun onderscheid met MPNST's. (A) Immunokleuring voor S100β in een P 0-GGFβ3 plexiform neurofibroom. Merk op dat intense bruine kleuring voor dit antigeen alleen aanwezig is in een subset van cellen in deze tumor, in overeenstemming met het feit dat neurofibromen zijn samengesteld uit neoplastische Schwann-cellen en meerdere andere niet-neoplastische celtypen. (B) Immunofluorescentiebeeld van een P 0-GGFβ3 MPNST gekleurd voor het intermediaire filament nestine (rood) en tegengekleurd met bisbenzimide (blauw, nucleaire kleuring). (C) MPNST gekleurd voor de transcriptiefactor Sox10. Intense immunoreactiviteit (bruin) is duidelijk zichtbaar in de kernen van een subset van tumorcellen. (D) High-power weergave van een P 0-GGFβ3 plexiform neurofibroom na een Unna-kleuring. Deze kleuring veroorzaakt metachromatische (violette) kleuring van de korrels in mestcellen. Plexiforme neurofibromen kunnen worden onderscheiden van MPNST's omdat deze laatste geen mestcellen hebben. (E,F) Ki67 immunohistochemie in (E) een P 0-GGFβ3 plexiform neurofibroom en (F) een P_0-GGFβ3 MPNST. Beide secties zijn tegengekleurd met hematoxyline (blauwe nucleaire kleuring), waarbij Ki67-immunoreactiviteit duidelijk zichtbaar is als bruine nucleaire kleuring in deze immunoperoxidasekleuringen. Merk op dat er geen bruine nucleaire kleuring zichtbaar is in het plexiforme neurofibroom, terwijl de meeste tumorcelkernen positief zijn in de MPNST. Schaalbalken = 100 μm. Afkorting: MPNST = maligne perifere zenuwschedetumor. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5: Representatieve beelden van immunokleuringen die worden gebruikt om de subpopulaties van cellen waaruit neurofibromen bestaan te identificeren. Deze immunofluorescerende beelden van een humaan dermaal neurofibroom zijn gekleurd voor (A) CD117 (c-Kit; een marker van mestcellen), (B) CD163 (M2-macrofagen), (C) CD86 (M1-macrofagen), (D) Iba1 (pan-macrofaagmarker), (E) Sox10 (Schwann-celmarker), (F) TCF4 (fibroblastmarker), (G) CD31 (marker van vasculatuur) en (H) CD34 (markeert een afzonderlijke, slecht begrepen subpopulatie van cellen in neurofibromen). Vergroting 60x, schaalbalken = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6: Representatieve beelden van plexiforme neurofibromen, MPNST's en enkele andere menselijke tumortypes die worden overwogen in de differentiële diagnose van een MPNST. (A) Plexiform neurofibroom ontstaan in de plexus brachialis van een NF1-patiënt, met de algehele lagere cellulariteit en het goedaardige uiterlijk van dit neoplasma. Hoewel niet gemakkelijk te visualiseren in H&E-gekleurde secties, is er een complexe mix van celtypen aanwezig. Mitozen worden niet gezien. Vergroting: 40x. (B) Een WHO graad IV MPNST die voortkwam uit het plexiforme neurofibroom geïllustreerd in A. Let op de veel hogere mate van cellulariteit. De pijl geeft een mitotische figuur aan en het sterretje geeft een gebied van tumornecrose aan in de rechterbovenhoek van dit microscopische veld. Vergroting: 40x. (C) Een WHO graad II MPNST. Deze tumor heeft een lagere mate van cellulariteit dan de WHO graad IV MPNST geïllustreerd in B. Er is echter meer nucleaire atypie en hyperchromasie dan duidelijk is in het plexiforme neurofibroom dat in A wordt geïllustreerd. De pijl geeft een van de occasionele mitotische figuren aan die in dit neoplasma werden aangetroffen. Vergroting: 63x. (D) Een low-power weergave van een fibrosarcoom van het volwassen type dat het "visgraatpatroon" (de verweven omhulsels van tumorcellen) illustreert dat typisch wordt gezien bij dit tumortype. Helaas wordt visgraatarchitectuur ook aangetroffen in sommige menselijke MPNST's en kan dus niet worden gebruikt om onderscheid te maken tussen fibrosarcomen en MPNST's. Vergroting: 20x. (E) Een krachtiger beeld van het fibrosarcoom geïllustreerd in D. Let op de gelijkenis tussen de cellulaire morfologie in dit fibrosarcoom en de cellulaire morfologie die duidelijk is in de WHO graad IV MPNST weergegeven in B. Vergroting: 40x. (F) High-power beeld van een leiomyosarcoom, dat de cellulaire morfologie demonstreert die binnen het bereik van variatie valt dat wordt gezien in MPNST's. Vergroting: 40x. (G) Immunokleuring voor gladde spieractine in het leiomyosarcoom geïllustreerd in F. Merk op dat de tumorcellen uniforme intense immunoreactiviteit vertonen voor dit antigeen. Vergroting: 40x. (H) Immunokleuringen voor gladde spieractine in een ander leiomyosarcoom. Bij deze tumor is er een grotere variabiliteit in de mate van immunoreactiviteit, waarbij sommige cellen intenser kleuren dan andere. Het is niet ongebruikelijk dat immunoreactiviteit voor hetzelfde antigeen uniform aanwezig is in één tumor en alleen aanwezig is in een subset van tumorcellen in een ander neoplasma. Vergroting: 40x. (I) Immunokleuring voor desmine in een derde leiomyosarcoom. In deze tumor is slechts een subset van tumorcellen intens immunoreactief voor dit antigeen. (J) Gemetastaseerd melanoom. Melanomen zijn berucht omdat ze een zeer variabele morfologie hebben die kan variëren van kubusvormig tot spoelvormig; tumoren met de laatste morfologie worden hoogstwaarschijnlijk verward met MPNST's, vooral gezien het feit dat zowel melanomen als MPNST's S100β- en Sox10-immunoreactiviteit kunnen aantonen. Vergroting: 40x. (K) Immunoreactiviteit voor de melanoommarker MART1 in de tumor geïllustreerd in J. Vergroting: 40x. (L) Nucleaire immunoreactiviteit voor de transcriptiefactor Sox10 in het melanoom getoond in J. Vergroting: 40x, schaalbalken = 100 μm. Afkorting: MPNST = maligne perifere zenuwschedetumor. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7: Representatieve beelden van WHO graad II-IV P 0-GGFβ3 MPNST's. (A) Low- en (B) high-power microfoto's van een WHO grade II MPNST. Merk op dat de cellulariteit lager is dan de WHO graad III MPNST geïllustreerd in panel C en dat de kernen van de tumorcellen in D meer hyperchromatisch (donkerder) zijn dan die in panel B. (C) Low- en (D) high-power microfoto's van een WHO grade III MPNST. Deze tumor vertoonde >4 mitotische cijfers per 10 krachtige velden, met cellen die dichter opeengepakt waren en meer hyperchromatische, atypische kernen. (E) Low- en (F) high-power views van een WHO grade IV MPNST. Let op de focus van necrose in het onderste middengedeelte van paneel F. Laag vermogen = 20x. Hoog vermogen = 40x, schaalbalken = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 8: Representatieve beelden van P 0-GGFβ3 MPNST-cellen met vroege passage en hun tumorigeniciteit zoals aangetoond door groei in zachte agar en hun vermogen om te groeien als allotransplantaten. (A) Laag- en (B) hoogvermogen-fasecontrastbeelden van P_0-GGFβ3 MPNST-cellen met vroege passage. (C) P 0-GGFβ3 MPNST-cellen gekweekt in zachte agar en gekleurd met Soedanzwart; De kolonies zijn duidelijk zichtbaar als zwarte puncta in de agar. (D) Hematoxyline- en eosine-gekleurd beeld van een tumor die werd gevormd nadat P 0-GGFβ3 MPNST-cellen subcutaan waren geallotransplanteerd in een immunodeficiënte muis zoals beschreven in het protocol. (E) Proliferatie van vroege passage P 0-GGFβ3 MPNST-cellen gedurende een periode van 5 dagen, zoals bepaald door een Celigo Image Cytometer. Laag vermogen = 10x, hoog vermogen = 40x; schaalbalk = 100 μm voor alle panelen Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Naam	Gebruik	Reactiviteit/klasse van soorten
CD117	Voorverdund	konijn monoklonaal
CD163	1:200	muis monoclonl
CD31	1:50	konijn polyklonaal
CD34	1:2000	konijn monoklonaal
CD86	1:1000	konijn monoklonaal
Cytokeratine	1 μg/ml	muis monoklonaal
Mijnen	1:50	muis monoklonaal
Iba1 zei:	1:500	polyklonaal konijn
Ki-67	1:50	konijn monoklonaal
MART1	1 μg/ml	muis monoklonaal
Nestijn	1:1,000	muis monoklonaal
PMEL	1:100	Rabbot monoklonaal
S100B	1:200	konijn polyklonaal
SMA	1:100	muis monoklonaal
Sox10 zei:	1:10	muis monoklonaal
TCF4/TCFL2	1:100	konijn monoklonaal

Tabel 1: Antilichamen gebruikt voor de diagnose van plexiform neurofibroom en kwaadaardige perifere zenuwschedetumoren. Antilichamen die worden gebruikt voor routinematige identificatie van GEM-plexiforme neurofibromen (S100β, Sox10, CD117, Ki67), de diagnose van MPNST's en een volledige beoordeling van andere celtypen die aanwezig zijn in neurofibromen. Afkorting: MPNST = maligne perifere zenuwschedetumor.

		S100β	Nestijn	Sox10 zei:	MART1	PMEL	Mijnen	Gladde spier actine	Cytokeratine	SS18-SSX Fusie
Artikelnummer MPNST		50-90%, meestal brandpuntsafstand	Positief1	~30%	Negatief	Negatief	Negatief	Negatief	Negatief	Negatief
Fibrosarcoom		Negatief	Negatief	Negatief	Negatief	Negatief	Negatief	Negatief	Negatief	Negatief
Leiomyosarcoom		Zeldzaam	Negatief	Negatief	Negatief	Negatief	50-100%	Positief	~40%	Negatief
Epiteloïde sarcoom		Negatief	Negatief	Negatief	Negatief	Negatief	Negatief	Negatief	Positief	Negatief
Melanoom		Positief	Positief	85%	Positief	Positief	Negatief	Negatief	Negatief	Negatief
Monofasisch synoviaal sarcoom		~30%	Negatief	Negatief	Negatief	Negatief	Negatief	Negatief	Positief	Positief

Tabel 2: Markers die worden gebruikt om tumoridentiteit bij mensen vast te stellen. Deze immunohistochemische en histochemische markers, samen met een beoordeling van de microscopische morfologie van tumoren, worden gebruikt om MPNST's te onderscheiden van andere neoplasmata die ze nabootsen. De differentiële diagnose die doorgaans wordt overwogen voor humane MPNST's omvat fibrosarcoom van het volwassen type, epitheloïde sarcoom, leiomyosarcoom, monofasisch synoviaal sarcoom, en melanoom. Fibrosarcomen van het volwassen type hebben microscopisch een visgraatpatroon en kleuren voor vimentine, maar niet voor S100β. Leiomyosarcomen, maar geen MPNST's, zijn immunoreactief voor desmine; Leiomyossarcomen hebben ook kernen met een opmerkelijk stompe morfologie. Epithloïde sarcomen, maar geen MPNST's, zijn immunoreactief voor cytokeratine. Melanomen kunnen, net als MPNST's, S100β-positief zijn, maar zijn ook immunoreactief voor MART-1 en PMEL. Afkorting: MPNST = maligne perifere zenuwschedetumor. ¹Combinatie van S100β en nestine zeer voorspellend voor MPNST.

Discussion

De histologische en biochemische methoden die hier worden gepresenteerd, bieden een kader voor het diagnosticeren en karakteriseren van GEM-modellen van neurofibroom en MPNST-pathogenese. In de loop der jaren hebben we ontdekt dat deze methodologieën zeer nuttig zijn voor het beoordelen van de pathologie van perifere zenuwschedetumoren die zich voordoen in GEM-modellen 21,25,26. Hoewel de hier geschetste protocollen nuttig zijn om te bepalen hoe nauwkeurig tumoren in de GEM-modellen de pathologie van hun menselijke tegenhangers recapituleren, zijn er enkele beperkingen aan deze strategieën die moeten worden gewaardeerd. Om te beginnen vertonen P 0-GGFβ3-muizen bijna volledige penetrantie van hun tumorfenotype, waardoor het relatief eenvoudig is om grote aantallen muizen met neurofibromen en MPNST's 21,25,26 te verkrijgen die kunnen worden gebruikt voor genomische studies en shRNA-screenings op genoomschaal. De hoge penetrantie van het fenotype in dit model maakt P 0-GGFβ3-muizen ook zeer nuttig voor preklinische onderzoeken. Er moet echter worden erkend dat dit niet het geval zal zijn voor alle GEM-kankermodellen. Daarom hebben we het belang benadrukt van het bepalen van de fractie van dieren waarvan kan worden voorspeld dat ze tumoren ontwikkelen. Bij het werken met een diermodel dat minder vaak tumoren ontwikkelt, hebben we het voordelig gevonden om beeldvormingsmodaliteiten zoals magnetische resonantiebeeldvorming of positronemissietomografie te gebruiken om dieren met tumoren definitief te identificeren die kunnen worden opgenomen in preklinische onderzoeken of andere studies. Deze aanpak kan echter onbetaalbaar zijn als herhaalde scans nodig zijn. Daarom benadrukten we ook het belang van het vaststellen van de gemiddelde overlevingstijd van het GEM-model^{van belang 26} - begrijpen wanneer een dier naar verwachting een tumor zal ontwikkelen, vermindert het aantal scans dat nodig is om dieren met het gewenste fenotype en de bijbehorende kosten te identificeren.

Het is ook belangrijk om te erkennen dat een grote tumor bij een muis eigenlijk nog steeds een vrij kleine hoeveelheid weefsel is. In dit protocol raden we een proces aan waarbij het tumorweefsel in drieën wordt verdeeld, met delen gewijd aan histologie/immunohistochemie, het opzetten van celculturen met vroege doorgang en isolatie van biomoleculen (eiwitten, RNA, DNA) van belang. De grootte van de tumor zal echter variëren en als de tumor vrij klein is, kan dit voorkomen dat er voldoende weefsel is om zich op deze manier te delen. In dat geval moet de onderzoeker bepalen of tumordiagnose of een ander gebruik van tumorweefsel prioriteit krijgt³². Onder die omstandigheden is onze vooringenomenheid dat we een goede diagnose moeten hebben om te begrijpen waar we mee werken voordat we aan andere experimenten beginnen. We hebben ontdekt dat tumordiagnoses meestal gemakkelijk kunnen worden vastgesteld met behulp van minder dan een derde van het neoplasma. Bij kleine tumoren verwijderen we in plaats daarvan meestal een klein fragment van tumorweefsel, wikkelen het in histologieweefsel en plaatsen het in een weefselcassette om ervoor te zorgen dat het weefsel niet verloren gaat tijdens de verwerking. Het nadeel van deze aanpak is dat het ertoe kan leiden dat de onderzoeker het neoplasma onderbeoordeelt als WHO-classificatie gewenst is; Dit komt omdat lagere en hogere graad regio's vaak naast elkaar bestaan bij kankers en, als er een zeer klein monster wordt genomen, zal de verkregen graad afhangen van waar het tumormonster is genomen.

De protocollen die we beschrijven voor het vaststellen van de identiteit van de tumor van de perifere zenuwschede zijn sterk afhankelijk van immunohistochemie. Hoewel er af en toe alternatieve benaderingen zijn die voor sommige celtypen kunnen worden gebruikt (bijvoorbeeld het uitvoeren van Unna-kleuringen om mestcellen te identificeren), geldt dat niet uniform voor de meeste celtypen die aanwezig zijn in neurofibromen en MPNST's. Daarom moet er goed op worden toegezien dat de immunohistochemische procedures die zullen worden gebruikt, goed zijn geoptimaliseerd. Onze ervaring is dat verschillende problemen de diagnostische immunohistochemie in gevaar kunnen brengen. Het is van cruciaal belang dat de onderzoeker een verdunningsreeks uitvoert met een primair antilichaam dat hij nog niet eerder heeft gebruikt; Bovendien moet een verdunningsreeks worden uitgevoerd bij gebruik van een nieuwe batch van een antilichaam dat eerder is geoptimaliseerd³³. Er moet ook voor worden gezorgd dat er nieuwe partijen reagentia voorhanden zijn. Onze ervaring is dat waterstofperoxide en DAB bij veroudering bijzonder vaak niet goed presteren, wat ertoe kan leiden dat de onderzoeker ten onrechte besluit dat hun vlekken negatief zijn.

De immunohistochemische profielen die we beschrijven voor plexiforme neurofibromen, MPNST's en de diverse soorten neoplasmata die worden overwogen bij de differentiële diagnose van MPNST's, zijn de profielen die we het vaakst zijn tegengekomen 21,25,26,34. Aangezien divergente differentiatie echter niet ongewoon is bij MPNST's en deze andere maligniteiten, kan de onderzoeker kleuringsprofielen tegenkomen die enigszins verschillen van wat we hier beschrijven. Deze nuances zijn de reden waarom we ten zeerste aanbevelen dat het team dat een nieuw GEM-model van tumorigenese karakteriseert, een ervaren menselijke of veterinaire patholoog omvat. In dit protocol hebben we WHO-classificatie toegepast op GEM en menselijke MPNST's. We geven de voorkeur aan dit beoordelingssysteem omdat de beoordelingscriteria relatief goed gedefinieerd zijn en gemakkelijk te vergelijken zijn tussen MPNST's voor mensen en muizen ^2,28. We merken echter op dat de beoordelingscriteria van de WHO niet uniform worden geaccepteerd door pathologen. Dit komt omdat het niet duidelijk is dat de drie WHO-graden die worden toegepast op MPNST's voorspellend zijn voor klinische uitkomsten bij patiënten. Daarom geven veel pathologen er de voorkeur aan om MPNST's simpelweg te classificeren als laaggradige of hooggradige maligniteiten. Met behulp van deze benadering wordt ongeveer 85% van de MPNST's beschouwd als hooggradige maligniteiten die worden gekenmerkt door stevige mitotische activiteit, duidelijke cellulaire atypie en hyperchromasie die gepaard kan gaan met tumornecrose. Laaggradige MPNST's vertonen minder cellulariteit, hyperchromasie en mitotische activiteit.

We hebben ontdekt dat het allogroten van MPNST-cellen met vroege passage een eenvoudige manier is om de tumorigeniciteit van deze culturen te verifiëren. Er moeten echter enkele problemen worden overwogen wanneer de cellen geen allotransplantaat³² tot stand brengen. In onze ervaring, terwijl de overgrote meerderheid van de MPNST-cellen met vroege passage een allotransplantaat zal vormen, zijn we af en toe vroege passageculturen tegengekomen die dat niet doen. Ondanks dit falen toonden array vergelijkende genomische hybridisatie (aCGH) en sequencing van het hele exoom aan dat deze vroege passageculturen meerdere genomische afwijkingen vertoonden die consistent waren met het feit dat ze tumorcellen waren^25,26. We hebben ook vroege passageculturen gevonden die niet gezond zijn, meestal omdat de culturen samenvloeien voordat ze werden geoogst om te enten. Cellen die beschadigd zijn door ruwe behandeling (bijv. te lang geïncubeerd met een niet-enzymatische celdissociatieoplossing die een te groot aantal keren op en neer wordt gepipetteerd) presteren ook slecht wanneer ze worden getransplanteerd. We willen ook opmerken dat de tijden die we hebben aangegeven voor het vestigen van transplantaten een schatting zijn op basis van onze ervaring. Af en toe zijn we culturen met vroege passage tegengekomen die met succes allotransplantaten zullen vestigen, maar er langer over doen om dit te doen.

De hierboven geschetste benaderingen bieden een uitgebreide manier om de belangrijkste aspecten van een nieuw ontwikkeld GEM-model van neoplasie van het perifere zenuwstelsel te karakteriseren en eventuele neurofibromen en MPNST's die deze dieren ontwikkelen correct te diagnosticeren. De methoden die we schetsen voor het vaststellen van MPNST-culturen met vroege passage en het gebruik van deze culturen voor allotransplantatie leveren ook duidelijk bewijs voor de tumorigeniciteit van neoplasmata geïdentificeerd in GEM-modellen. We willen benadrukken dat we niet bezig zijn met de selectie van individuele klonen bij het vestigen van vroege passageculturen. Hoewel we erkennen dat enige selectie onvermijdelijk is bij het plaatsen van tumorcellen in culturen, suggereren deze eerste bevindingen dat de mutaties die zijn geïdentificeerd in GEM MPNST-culturen met vroege passage sterk lijken op die in de oudertumor. Met behulp van aCGH hebben we echter ook ontdekt dat het blijven dragen van deze vroege passageculturen voor langere passages resulteert in genomische veranderingen die beginnen af te wijken van wat wordt gezien in de eerdere passages van deze tumorcellen.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 mm Tissue Culture Plates	Corning Falcon	353003
3, 3'- Diaminobensidine (DAB)	Vector Laboratories	SK-400
6- well plates	Corning Costar	3516
Acetic Acid	Fisher Scientific	A38-212
Alexa Fluor 488 Secondary (Goat Anti-Mouse)	Invitrogen	A11029
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Mouse)	Invitrogen	A21043 or A11004
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Rabbit)	Invitrogen	A11036
Ammonium Chloride (NH4Cl)	Fisher Scientific	A661-500
BCA Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23225
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP1600-100
Caldesmon	ABCAM	E89, ab32330
CD117	Cell Marque	117R-18-ASR
CD163	Leica	NCL-L-CD163
CD31	ABCAM	ab29364
CD34	ABCAM	ab81289
CD86	ABCAM	ab53004
Cell Scraper	Sarstedt	83.183
Cell Stripper	Corning	25-056-CI
Circle Coverslip	Fisher Scientific	12-545-100
Citrisolve Hybrid (d-limonene-based solvent)	Decon Laboratories	5989-27-5
Critic Acid	Fisher Scientific	A104-500
Cytokeratin	ABCAM	C-11, ab7753
Desmin	Agilent Dako	clone D33 (M0760)
Diaminobensizdine (DAB) Solution	Vector Laboratories	SK-4100
DMEM	Corning	15-013-CV
Eosin Y	Thermo Scientific	7111
Ethanol (200 Proof)	Decon Laboratories	2716
Fetal Calf Serum	Omega Scientific	FB-01
Forksolin	Sigma-Aldrich	F6886
Glycerol	Sigma-Aldrich	G6279
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Corning	21-022-CV
Harris Hematoxylin	Fisherbrand	245-677
Hemacytometer	Brightline-Hauser Scientific	1490
Hydrochloric Acid	Fisher Scientific	A144-212
Hydrogen Peroxide	Fisher Scientific	327-500
Iba1	Wako Chemicals	019-19741
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit ,Mouse on Mouse	Vector Laboratories	MP-2400
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit, Horse Anti-Rabbit	Vector Laboratories	MP-7401
Incubator	Thermo Scientific	Heracell 240i CO2 incubator
Isoflurane	Piramal	NDC 66794-017-25
Isopropanol	Fisher Scientific	A415
Ki-67	Cell Signaling	12202
Laminin	Thermo Fisher Scientific	23017015
Liquid Nitrogen
MART1	ABCAM	M2-9E3, ab187369
Microtome
Nestin	Millipore	Human: MAD5236 (10C2), Human:MAB353 (Rat-401)
Neuregulin 1 beta	In house	Made by S.L.C. (also available as 396-HB-050/CF from R&D Systems)
Neurofibromin	Santa Cruz Biotechnology	sc-67
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice	Jackson Laboratory	5557
Nonfat Dry Milk	Walmart	Great Value Brand
P0-GGFβ3 mice	In house
Paraffin Wax	Leica	Paraplast 39601006
Parafilm M	Sigma-Aldrich	PM-999
Paraformaldehyde (4%)	Thermo Scientific	J19943-K2
Permount (Xylene Mounting Medium)	Fisher Scientific	SP15-100
pH Meter	Mettler Toldedo	Seven Excellence, 8603
Phosphate Buffered Saline (Dulbecco's)	Corning	20-031-CV
PMEL	ABCAM	EP4863(2), ab137078
Poly-L-Lysine Hydrobromide	Sigma-Aldrich	P5899-5MG
Portable Isoflurance Machine	VetEquip Inhalation Anesthesia Systems
PVA-DABCO (Aqueous Mounting Medium)	Millipore Sigma	10981100ML
Rice Cooker	Beech Hamilton
S100B	Agilent Dako	Z0311  (now GA504)
SMA	Ventana Medical Systems	clone 1A4
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S640
Sodium Citrate (Dihydrate)	Fisher Scientific	BP327-1
Sox10	ABCAM	ab212843
Steel histology mold
Superfrost Plus Microscope Slides	Fisher Scientific	12-550-15
TCF4/TCFL2	Cell Signaling	(CH48H11) #2569
Tissue Cassette
Toluidine Blue	ACROS Organics	348600050
Triton X-100	Fisher Scientific	BP151-500
TRIzol	Invitrogen	15596026
Trypsin	Corning	25-051-31