Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Identificeren, diagnosticeren en beoordelen van kwaadaardige perifere zenuwschedetumoren in genetisch gemanipuleerde muismodellen

3.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65740

⸱

17 mei 2024

 ,  ,  , 
1Department of Pathology and Laboratory Medicine, Medical University of South Carolina, 2Hollings Cancer Center, Medical University of South Carolina

In dit artikel

Samenvatting

We hebben een methodologie ontwikkeld om te beoordelen of neoplasmata van het zenuwstelsel in genetisch gemanipuleerde muizen de pathologie van hun menselijke tegenhangers nauwkeurig samenvatten. Hier passen we deze histologische technieken, gedefinieerde pathologische criteria en kweekmethodologieën toe op neurofibromen en kwaadaardige perifere zenuwschedetumoren die ontstaan in het P 0-GGFβ3 muismodel.

Samenvatting

Patiënten met het autosomaal dominante tumorgevoeligheidssyndroom neurofibromatose type 1 (NF1) ontwikkelen vaak plexiforme neurofibromen (PN's) die vervolgens transformeren in zeer agressieve kwaadaardige perifere zenuwschedetumoren (MPNST's). Het begrijpen van het proces waarmee een PN transformeert in een MPNST zou worden vergemakkelijkt door de beschikbaarheid van genetisch gemanipuleerde muismodellen (GEM) die de PN-MPNST-progressie die bij mensen met NF1 wordt gezien, nauwkeurig repliceren. Helaas geven GEM-modellen met Nf1-ablatie dit proces niet volledig weer. Dit bracht ons ertoe om P 0-GGFβ3-muizen te ontwikkelen, een GEM-model waarin overexpressie van het Schwann-celmitogeen neureguline-1 (NRG1) in Schwann-cellen resulteert in de ontwikkeling van PN's die zich ontwikkelen tot MPNST's met hoge frequentie. Om echter te bepalen of tumorigenese en neoplastische progressie bij P 0-GGFβ3-muizen de processen die worden gezien bij NF1-patiënten nauwkeurig modelleren, moesten we eerst bewijzen dat de pathologie van P0-GGFβ3-tumoren in de perifere zenuwschede de pathologie van hun menselijke tegenhangers recapituleert.

Hier beschrijven we de gespecialiseerde methodologieën die worden gebruikt om neoplasmata van het perifere zenuwstelsel nauwkeurig te diagnosticeren en te beoordelen in GEM-modellen, met behulp van P 0-GGFβ3 en P0-GGFβ3; Trp53+/- muizen als voorbeeld. We beschrijven de histologische, immunohistochemische en histochemische methoden die worden gebruikt om PN's en MPNST's te diagnosticeren, hoe deze neoplasmata te onderscheiden van andere tumortypes die hun pathologie nabootsen, en hoe deze neoplasmata te beoordelen. We bespreken de oprichting van vroege passageculturen van GEM MPNST's, hoe deze culturen kunnen worden gekarakteriseerd met behulp van immunocytochemie en hoe hun tumorigeniciteit kan worden geverifieerd door allotransplantaten vast te stellen. Gezamenlijk karakteriseren deze technieken de pathologie van PN's en MPNST's die zich voordoen in GEM-modellen en vergelijken ze kritisch de pathologie van deze muizentumoren met hun menselijke tegenhangers.

Inleiding

In de afgelopen drie decennia hebben talloze laboratoria geprobeerd muismodellen van menselijke kankers te maken door menselijke kanker-geassocieerde mutaties in het muizengenoom te introduceren of door een genproduct tot overexpressie te brengen dat tot overexpressie wordt gebracht in menselijke kankers. De resulterende genetisch gemanipuleerde muismodellen (GEM) kunnen voor verschillende doeleinden worden gebruikt, zoals het vaststellen dat de nieuw geïntroduceerde genomische modificatie tumorigenese initieert, het identificeren van andere later optredende genetische of epigenetische veranderingen die bijdragen aan tumorprogressie, en het definiëren van de belangrijkste signaalroutes die tumorinitiatie en -progressie stimuleren. In tegenstelling tot orthotope xenotransplantaatmodellen, die afhankelijk zijn van het gebruik van immunodeficiënte muizen, hebben GEM-kankermodellen een volledig functioneel immuunsysteem en modelleren ze dus nauwkeuriger reacties op kandidaat-therapeutische middelen. Bij het gebruik van GEM-kankermodellen voor doeleinden als deze, is het echter essentieel dat onderzoekers bevestigen dat waarnemingen met GEM-neoplasmata relevant zijn voor hun menselijke tegenhangers. Deze validatie moet een grondige beoordeling van de pathologie van de GEM-neoplasmata omvatten en een bepaling of de pathologische kenmerken van de GEM-neoplasmata de pathologie van het overeenkomstige menselijke tumortype recapituleren.

Het tumorgevoeligheidssyndroom neurofibromatose type 1 (NF1) is de meest voorkomende genetische ziekte die het menselijk zenuwstelsel aantast en voorkomt bij ongeveer 1 op de 3.000-3.500 levendgeborenen 1,2,3. Personen die lijden aan NF1 ontwikkelen meerdere goedaardige perifere zenuwschedetumoren die bekend staan als neurofibromen in hun huid (dermale neurofibromen) en in grote zenuwen en zenuwplexussen (plexiforme neurofibromen). Hoewel zowel dermale als plexiforme neurofibromen de kwaliteit van leven van de patiënt verslechteren door fysieke, gedrags- en/of sociale beperkingen te veroorzaken, zijn plexiforme neurofibromen (PN's) bijzonder gevaarlijk 4,5. Dit komt omdat PN's vaak veranderen in kwaadaardige perifere zenuwschedetumoren (MPNST's), dit zijn agressieve spindelcelneoplasmata met een uitzonderlijk laag overlevingspercentage 1,2. Voor een groot deel is dit lage overlevingspercentage te wijten aan het feit dat de radio- en chemotherapeutische regimes die momenteel worden gebruikt om MPNST's te behandelen, niet effectief zijn. Het ontwikkelen van nieuwe, effectievere therapieën was echter een uitdaging. Dit komt omdat, ondanks hoe vaak MPNST's voorkomen bij NF1-patiënten, het nog steeds zeldzame neoplasmata zijn. Als gevolg hiervan is het erg moeilijk om grote aantallen menselijke tumoren voor onderzoek te verkrijgen; het is ook een uitdaging om voldoende patiënten met MPNST's te rekruteren voor klinische onderzoeken. Om deze beperkingen te overwinnen, zijn verschillende GEM-modellen gegenereerd met als doel meer inzicht te krijgen in de afwijkingen die de pathogenese van neurofibroom en de progressie van PN-MPNST aansturen en om preklinische proeven met kandidaat-therapeutische middelen te vergemakkelijken.

NF1-patiënten hebben inactiverende mutaties in één kopie van het NF1-gen. De pathogenese van neurofibroom wordt geactiveerd wanneer een inactiverende mutatie in het resterende functionele NF1-gen optreedt in een cel in de Schwann-cellijn. Verrassend genoeg echter, toen muizen werden gegenereerd met kiembaaninactiverende Nf1-mutaties, ontwikkelden ze geen neurofibromen 6,7. De daaropvolgende demonstratie dat muizen met Nf1-null Schwann-cellen en Nf1 haplo-insufficiëntie in alle andere celtypen (Krox20-Cre;Nf1flox/- muizen) ontwikkelde plexiforme neurofibromen suggereerden dat een verlaagde dosering van het Nf1-gen in extra celtypen vereist was voor de pathogenese van neurofibroom8. Zelfs dan, de plexiforme neurofibromen in Krox20-Cre; Nf1flox/- muizen ontwikkelden zich niet tot MPNST's en bootsten dus slechts gedeeltelijk de biologie van hun menselijke tegenhangers na. MPNST-pathogenese trad op wanneer Nf1-mutaties gepaard gingen met mutaties in aanvullende tumorsuppressorgenen zoals Trp539 of Cdkn2a10, maar MPNST's in deze GEM-modellen ontwikkelden zich de novo of uit atypische neurofibromateuze neoplasmata van onzeker biologisch potentieel (ANNUBP's)11,12, in plaats van uit reeds bestaande goedaardige plexiforme neurofibromen (zie13,14 voor uitstekende beoordelingen van deze modellen en andere modellen die aanvullende MPNST-geassocieerde mutaties met functieverlies introduceren in genen zoals Suz12 en Pten15).

Deze muismodellen zijn van onschatbare waarde geweest voor het vaststellen van de rol die genen zoals NF1, TP53 en CDKN2A spelen in de pathogenese van NF1-geassocieerde neoplasmata van het perifere zenuwstelsel en voor preklinische onderzoeken die kandidaat-therapeutische middelen testen. We hebben echter nog steeds een onvolledig begrip van het proces waardoor plexiforme neurofibromen zich ontwikkelen tot atypische neurofibromateuze neoplasmata met een onzeker biologisch potentieel (ANNUBP's16) en vervolgens MPNST's. Er is onlangs enige vooruitgang geboekt in het begrijpen van dit proces met het recente rapport dat muizen met deleties in Nf1 en Arf ANNUBP's ontwikkelen die evolueren naar MPNST's11. Er bestaan echter nog geen op Nf1-mutatie gebaseerde muismodellen die het proces van plexiforme neurofibroom-MPNST-progressie bij mensen volledig samenvatten. Bovendien is het niet duidelijk of er meerdere verschillende routes zijn die leiden tot de ontwikkeling van MPNST's. Daarom is het mogelijk dat de hierboven beschreven GEM's slechts een subset van verschillende routes modelleren die leiden tot neurofibroom-MPNST-progressie en MPNST-pathogenese. Dit punt wordt benadrukt door het feit dat MPNST's ook sporadisch voorkomen en dat sommige sporadische MPNST's blijkbaar geen NF1-mutaties hebben17,18.

Hoewel dit laatste punt is aangevochten door de recente suggestie van Magollon-Lorenz et al. dat ten minste enkele sporadische MPNST's zonder NF1-mutaties melanomen of een ander type sarcoomzijn 19, hebben we onlangs een sporadische MPNST en een cellijn afgeleid van deze tumor (2XSB-cellen) gerapporteerd die NF1 wildtype20 was. Tijdens de karakterisering van de moedertumor en de 2XSB-cellijn hebben we systematisch alternatieve diagnostische mogelijkheden uitgesloten, waaronder melanoom en de vele andere sarcoomtypes die routinematig worden overwogen in de differentiële diagnose van een sporadische kwaadaardige perifere zenuwschedetumor20. Bovendien merken we op dat Magollon-Lorenz et al. erkenden dat hun bevindingen in de drie sporadische MPNST-cellijnen die ze bestudeerden niet konden worden gegeneraliseerd om aan te geven dat alle tumoren die als sporadische MPNST's worden geïdentificeerd, geen MPNST's zijn.

Om een GEM-model te construeren waarin neurofibroom en MPNST-pathogenese niet noodzakelijkerwijs afhankelijk waren van specifieke tumorsuppressorgenmutaties, genereerden we transgene muizen waarin overexpressie van het krachtige Schwann-celmitogeen neureguline-1 (NRG1) werd aangedreven door de Schwann-celspecifieke myeline-eiwit nul (P0) promotor (P 0-GGFβ3-muizen)21. We hebben eerder aangetoond dat menselijke neurofibromen, MPNST's en MPNST-cellijnen verschillende NRG1-isovormen tot expressie brengen, samen met de erbB-receptortyrosinekinasen (erbB2, erbB3 en erbB4) die NRG1-signalering mediëren en dat deze erbB-receptoren constitutief worden geactiveerd22. We hebben ook aangetoond dat farmacologische remmers van de erbB-kinasen de proliferatie van MPNST22, overleving23 en migratie24 krachtig remmen. In overeenstemming met onze waarnemingen bij mensen, ontwikkelen P 0-GGFβ3-muizen plexiforme neurofibromen25 die zich ontwikkelen tot MPNST's met een hoge frequentie21,25. We hebben aangetoond dat P 0-GGFβ3 MPNST's, net als hun menselijke tegenhangers, vaak mutaties van Trp53 en Cdkn2a ontwikkelen, evenals tal van andere genomische afwijkingen die mogelijk bijdragen aan tumorigenese25. MPNST's die voorkomen in P 0-GGFβ3-muizen hebben geen inactiverende Nf1-mutaties. Met behulp van genetische complementatie toonden we echter aan dat NRG1 tumorigenese bevordert bij P 0-GGFβ3-muizen, voornamelijk via dezelfde signaalcascades die worden veranderd door Nf1-verlies 26; deze conclusie is gebaseerd op onze bevinding dat het vervangen van NRG1-overexpressie door Nf1-verlies in aanwezigheid van Trp53-haplo-insufficiëntie (P 0-GGFβ3;Trp53+/- muizen) produceert dieren waarin MPNST's zich de novo ontwikkelen, zoals te zien is in cis-Nf1+/-; Trp53+/- muizen27.

Om deze en andere informatie te verkrijgen die aantoont dat P 0-GGFβ3-muizen nauwkeurig de processen van pathogenese van neurofibroom en progressie van neurofibroom-MPNST modelleren die worden gezien bij mensen met NF1, hebben we gespecialiseerde methodologieën ontwikkeld voor het verwerken van weefsels van deze dieren, het nauwkeurig diagnosticeren van hun tumoren, het beoordelen van de MPNST's die bij deze muizen ontstaan, het vaststellen en karakteriseren van vroege passage P0-GGFβ3 en P0-GGFβ3; Trp53+/- MPNST-culturen en kritische vergelijking van de pathologie van P 0-GGFβ3 PN's en MPNST's en P0-GGFβ3; Trp53+/- MPNST's aan die van hun menselijke tegenhangers. Veel van deze methodologieën zijn generaliseerbaar naar andere GEM-modellen van neoplasie van het zenuwstelsel. Bovendien zijn verschillende van deze methodologieën breder toepasbaar op GEM-modellen waarin neoplasmata ontstaan in andere orgaansites. Daarom geven we hier een gedetailleerde beschrijving van deze methodologieën.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

De hier beschreven procedures zijn goedgekeurd door de IACUC van de Medical University of South Carolina en werden uitgevoerd door goed opgeleid personeel in overeenstemming met de NIH-gids voor de verzorging en het gebruik van proefdieren en de richtlijnen voor institutionele dierenverzorging van MUSC.

1. Bepaling van tumorpenetrantie en overleving in P 0-GGFβ3 muizen en identificatie van tumoren bij deze dieren voor verdere karakterisering

  1. Genereer het cohort muizen dat zal worden beoordeeld op tumorigenese. Het aantal benodigde muizen hangt af van de penetrantie van het tumorfenotype. Om dergelijke verliezen te compenseren, begin je met een cohort dat 10-15% hoger is dan het gewenste eindaantal dieren.
    OPMERKING: We bepaalden de tumorpenetrantie in P 0-GGFβ3-muizen empirisch in een eerste cohort van 50 muizen (waarvan er zes verloren gingen om redenen die geen verband hielden met neoplasie (bijv. vechten))25.
  2. Beoordeel de gezondheid van dieren drie keer per week en noteer de scores voor de lichaamsconditie, inclusief gewicht en gedragsveranderingen bij elk onderzoek. Beëindig tumordragende of stervende muizen (zie opmerking hieronder) met behulp van kooldioxide-euthanasie gevolgd door cervicale dislocatie. Registreer de leeftijd bij overlijden in dagen. Als tumoren uitwendig zichtbaar zijn, noteer dan de afmetingen van de tumor (lengte, breedte en hoogte).
    OPMERKING: Het is van essentieel belang dat dieren niet verder mogen gaan dan de door de IACUC goedgekeurde maximaal toegestane tumorgrootte en/of humaan eindpunt.
  3. Stel met behulp van de leeftijd bij overlijden een Kaplan-Meier-overlevingscurve vast om de gemiddelde leeftijd bij overlijden en het overlevingsbereik te bepalen.
    OPMERKING: P 0-GGFβ3-muizen hadden een gemiddelde leeftijd bij overlijden van 261,5 dagen, met een bereik van 74-533 dagen; 91% van ons cohort had meerdere neurofibromen en 71% had MPNST's21.
  4. Bepaal of er grof zichtbare tumoren aanwezig zijn en, als dat zo is, ontleed ze dan onder steriele omstandigheden om vast te stellen of de tumor geassocieerd is met een perifere zenuw en snijd vervolgens de tumor weg. in P 0-GGFβ3 en P0-GGFβ3; Trp53+/- muizen, perifere zenuwschedetumoren worden het meest aangetroffen in de trigeminus- en heupzenuwen. Zelfs als er geen grof zichtbare tumoren worden gezien in verband met deze zenuwen, fixeer en veranker deze zenuwen zoals hieronder beschreven, zodat ze kunnen worden onderzocht op de aanwezigheid van microtumoren. Microtumoren komen meestal voor in de ganglia die met deze zenuwen zijn geassocieerd.
  5. Snijd duidelijk zichtbare tumoren in drie stukken (Figuur 1A). Gebruik stuk 1 voor histologie (paraffinesecties, immunohistochemie en histochemie). Gebruik deel 2 om vroege passageculturen vast te stellen. Snap-freeze stuk 3 (met behulp van vloeibare stikstof) voor mogelijke toekomstige experimenten (bijv. immunoblots, RNA en DNA-isolatie).
  6. Fixeer stuk 1 in 4% paraformaldehyde in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) 's nachts bij 4 °C. Fixeer de rest van het lichaam van het dier door onderdompeling in 4% paraformaldehyde gedurende een nacht bij 4 °C.

2. Paraffine-inbedding van grof zichtbare tumoren en voorbereiding van met hematoxyline en eosine gekleurde secties voor initiële diagnostische beoordeling

  1. Paraffine-inbedding van grofzichtbaar tumoren
    1. Nadat u tumorstuk 1 's nachts in 4% paraformaldehyde hebt gefixeerd, spoelt u het weefsel door het gedurende 15 minuten in een volume PBS te plaatsen dat minstens 10x groter is dan het volume van het weefsel; Gebruik hetzelfde volume voor alle volgende spoelbeurten. Herhaal nog twee PBS-spoelingen van 15 minuten, waarbij u voor elke spoelbeurt een vers volume PBS gebruikt.
    2. Breng tumorstuk 1 over naar 70% ethanol. Houd het weefsel 24 uur bij 4 °C in 70% ethanol. Bewaar het weefsel desgewenst langdurig onder deze omstandigheden.
      OPMERKING: De stappen 2.1.1 tot en met 2.1.7 zijn bedoeld voor onderzoekers die geen toegang hebben tot een in de handel verkrijgbare weefselverwerkingsmachine. Als de onderzoeker toegang heeft tot een weefselprocessor, wordt het weefsel verwerkt door middel van gesorteerde ethanolen en xylenen volgens het geprogrammeerde instrumentprotocol.
    3. Breng tumorstuk 1 over naar 80% ethanol gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal de incubatie nog eens 30 minuten in een vers volume van 80% ethanol.
    4. Breng tumorstuk 1 over naar 95% ethanol gedurende 75 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal de incubatie nog twee keer, telkens gedurende nog eens 75 minuten in een vers volume van 95% ethanol.
    5. Breng tumorstuk 1 over naar 100% ethanol en incubeer gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal de incubatie van 60 minuten nog twee keer, telkens met een vers volume van 100% ethanol.
    6. Breng tumorstuk 1 over in een oplosmiddel op basis van d-limoneen en incubeer gedurende 30-60 minuten bij kamertemperatuur. Breng tumorstuk 1 over in een vers volume van het oplosmiddel op basis van d-limoneen en incubeer nog eens 30-60 minuten bij kamertemperatuur.
    7. Breng tumorstuk 1 over in 1:1 paraffine/d-limoneen-oplosmiddel gedurende 1 uur bij 60 °C. Gooi het 1:1 paraffine/d-limoneenoplosmiddel weg en breng tumorstuk 1 over naar 60 °C paraffine en incubeer gedurende 20 minuten bij 60 °C. Herhaal de incubatie in een nieuw volume van 60 °C paraffine nogmaals gedurende 20 minuten. Incubeer tumorstuk 1 's nachts in paraffine bij 60 °C.
    8. Giet een basislaag paraffine in een stalen histologiemal en laat het stollen. Breng tumorstuk 1 over op het oppervlak van de basisparaffine en bedek het weefsel onmiddellijk na het positioneren met 60 °C paraffine en plaats de weefselcassette bovenop en in contact met de gesmolten paraffine. Breng de mal over naar de koude kant van het inbeddingsstation en laat deze 10-15 minuten stollen.
    9. Haal het paraffineblok met de bijgevoegde tissuecassette uit de mal. Gebruik de bijgevoegde weefselcassette om het blok tijdens het doorsnijden in de microtoom te klemmen.
      OPMERKING: Het paraffineblok kan nu voor onbepaalde tijd bij kamertemperatuur worden bewaard.
  2. Bereid met hematoxyline en eosine gekleurde secties van grof zichtbare tumoren voor.
    1. Snijd met behulp van een microtoom secties van 4-5 μm tumorweefsel en monteer ze op positief geladen glasplaatjes.
    2. Om hematoxyline- en eosinekleuring (H&E) uit te voeren, deparaffiniseert u de weefselsecties door de objectglaasjes gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur te incuberen in een oplosmiddel op basis van d-limoneen. Herhaal de incubatie in een nieuw volume oplosmiddel op basis van d-limoneen gedurende 10 minuten.
    3. Breng de objectglaasjes over op 100% ethanol en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Breng de objectglaasjes over in een vers volume van 100% ethanol en incubeer nog 5 minuten bij kamertemperatuur.
    4. Breng de objectglaasjes over naar 95% ethanol en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Breng de objectglaasjes over in een vers volume van 95% ethanol en incubeer nog 5 minuten bij kamertemperatuur.
    5. Breng de objectglaasjes over op 70% ethanol en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Breng vervolgens over naar 50% ethanol en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
    6. Breng de objectglaasjes over in gedestilleerd water en incubeer ze 5 minuten bij kamertemperatuur.
    7. Kleur de objectglaasjes door ze 5 minuten bij kamertemperatuur onder te dompelen in hematoxyline. Spoel af met stromend kraanwater gedurende 1-2 min. Differentieer door objectglaasjes 2-5x te dompelen in 0,5% zoutzuur in 70% ethanol. Spoel af in een stromend kraanwaterbad gedurende 1-2 min. Leg de glaasjes gedurende 10 s in 95% ethanol met 0,5% azijnzuur.
    8. Kleurstof de objectglaasjes gedurende 30 s bij kamertemperatuur met eosine-Y en breng de objectglaasjes vervolgens gedurende 5 minuten over op 100% ethanol. Verwijder de monsters gedurende 5 minuten in een oplosmiddel op basis van d-limoneen.
    9. Monteer dekglaasjes met behulp van een montagemedium op xyleenbasis terwijl het glaasje nog nat is met het oplosmiddel op basis van d-limoneen. Laat het montagemedium een nacht opstijven.
      NOTITIE: Gebruik geen montagemedium op waterbasis.
  3. Bereid weefsels voor zonder grof zichtbare tumoren om plexiforme neurofibromen en micro-MPNST's te identificeren. Veranker de weefsels in paraffine, bereid histologische secties voor en kleur deze secties met hematoxyline en eosine.
    1. Verwijder de inwendige organen en plaats representatieve delen van elk orgaan in paraffine om H&E-gekleurde secties voor te bereiden die zullen worden onderzocht op microscopisch bewijs van tumoren (Figuur 1B). Verwijder het hoofd, de voorpoten, de achterpoten en de staart (Figuur 1C). Om het ruggenmerg en de zenuwwortels in situ te onderzoeken op tekenen van zenuwworteltumoren, de wervelkolom en de bijbehorende ribben en zacht weefsel te ontkalken door onderdompeling in 0,3 M EDTA/4% paraformaldehye (pH 8,0) gedurende 48-72 uur bij 4 oC; spoel de monsters vervolgens af met 1x PBS. Zorg er aan het einde van de ontkalking voor dat de ontkalking is voltooid door te proberen de wervelkolom met een naald te doorboren. Ontkalking is succesvol als de naald gemakkelijk in het bot dringt zonder te knarsen.
    2. Snijd de ontkalkte wervelkolom en bijbehorende structuren in blokken die in een weefselcassette passen. Dehydrateren door middel van gedifferentieerde ethanolen, gevolgd door een oplosmiddel op basis van d-limoneen zoals beschreven in de stappen 2.1.2-2.1.7. Veranker in paraffine en bereid secties van 4-5 μm voor zoals beschreven in de stappen 2.1.7-2.2.1. Voer H&E-beitsingen uit zoals beschreven in de stappen 2.2.2-2.2.9; Laat het montagemedium een nacht opstijven.

3. Identificeer potentiële plexiforme neurofibromen en voer speciale kleuringen uit om diagnoses te bevestigen

OPMERKING: We raden ten zeerste aan om een ervaren humane of veterinaire patholoog te betrekken bij de evaluatie van H&E en speciale kleuringen van GEM-tumorsecties.

  1. Bestudeer de H&E-gekleurde objectglaasjes die zijn voorbereid zoals hierboven beschreven met behulp van helderveldmicroscopie om mogelijke tumoren in de perifere zenuwschede te identificeren. Aangezien neurofibromen en MPNST's ontstaan in perifere zenuwen, is het belangrijk om te bepalen of microscopisch kleine tumoren geassocieerd zijn met een perifere zenuw. Identificeer blokkades met mogelijke perifere zenuwschedetumoren, zodat immunokleuringen en andere speciale kleuringen kunnen worden uitgevoerd om diagnoses te bevestigen of te weerleggen.
  2. Onderscheid potentiële PN's van MPNST's/andere hooggradige neoplasmata op basis van histologische kenmerken die worden waargenomen tijdens helderveldonderzoek van H&E-gekleurde secties. Menselijke PN's zijn licht hypercellulaire neoplasmata die voornamelijk bestaan uit cellen met langwerpige, vaak golvende kernen. In veel gebieden zijn de cellen losjes opeengepakt en kunnen ze worden gescheiden door myxoïde extracellulair materiaal; PN's in P 0-GGFβ3-muizen hebben een vergelijkbaar uiterlijk. Mitose is meestal niet aanwezig; als dat het geval is en de tumor matig tot sterk hypercellulair is, is de tumor een MPNST of een ander type hooggradig neoplasma (zie hieronder).
  3. PN's zijn samengesteld uit een mengsel van neoplastische Schwann-cellen en andere niet-neoplastische celtypen zoals mestcellen. Om de identiteit van een PN te bevestigen, voert u immunokleuringen uit voor de Schwann-celmarkers S100β en Sox10 en de mestcelmarker CD117 (c-Kit) op secties van blokken die potentiële PN's bevatten die zijn geïdentificeerd bij H&E-onderzoek (zie rubriek 3.4 voor alternatieve opties voor het kleuren van mestcelmarkers). Voer Ki67-immunokleuringen uit om lage proliferatiesnelheden te bevestigen.
    OPMERKING: Tabel 1 geeft een overzicht van de antigeenmarkers die worden gebruikt voor routinematige identificatie van GEM-plexiforme neurofibromen (S100β, Sox10, CD117, Ki67), de diagnose van MPNST's en voor een volledige beoordeling van andere celtypen die aanwezig zijn in neurofibromen; we kleuren alleen voor deze laatste antigenen wanneer we voor het eerst een nieuw GEM-model beschrijven. Raadpleeg het gegevensblad van de fabrikant van het antilichaam voor aanbevolen omstandigheden. Let op of de bijsluiter van de fabrikant van het antilichaam het ophalen van antigeen aanbeveelt; Niet alle antigenen hoeven te worden opgehaald om detecteerbaar te zijn.
    1. Bereid secties van 4-5 μm voor van de geselecteerde paraffineblokken en monteer ze op positief geladen objectglaasjes. Deparaffiniseer secties zoals beschreven in de stappen 2.2.2-2.2.6.
    2. Spoel secties met 1x PBS gedurende 3-5 min.
    3. Als de fabrikant van het antilichaam antigeenextractie aanbeveelt, bereid dan citraatbuffer voor. Combineer 9 ml citroenzuuroplossing (10,5 g citroenzuur in 500 ml gedestilleerd water) en 41 ml natriumcitraatoplossing (14,7 g natriumcitraat in 500 ml gedestilleerd water).
    4. Voer het ophalen van antigeen uit door objectglaasjes gedurende 20 minuten in citraatbuffer in een verwarmde rijstkoker te plaatsen.
    5. Breng de glaasjes gedurende 10 minuten over in 3% waterstofperoxide/1x PBS om de peroxidase-activiteit in het weefsel te elimineren.
      NOTITIE: Maak deze oplossing elke keer vers en gebruik de standaardoplossing van waterstofperoxide niet als deze ouder is dan 3-4 maanden.
    6. Spoel secties in 1x PBS.
    7. Blokkeer secties met behulp van een blokkeerbuffer (2% BSA, 0,1% Triton X-100 in 1x PBS) gedurende 1 uur. Spoel de glaasjes kort af in 1x PBS.
    8. Voeg primair antilichaam toe aan weefselsecties. Bereid primaire antilichamen voor in verdunde blokkeerbuffer. Incubeer de objectglaasjes gedurende 2 uur bij 37 °C of 's nachts bij 4 °C.
    9. Was de glaasjes in 1x PBS gedurende 5 min. Herhaal 3x.
    10. Incubeer weefsel met gebiotinyleerd secundair antilichaam gedurende 1-2 uur.
    11. Bereid diaminobenzidine (DAB)-oplossing volgens het protocol van de fabrikant en dompel de objectglaasjes gedurende 2-10 minuten onder in de oplossing. Was de glijbanen 5 minuten in water.
    12. Ga stain-secties tegen door ze gedurende 10-15 minuten onder te dompelen in hematoxyline. Stel bloot aan stromend water totdat het helder is. Dompel de glaasjes snel in alcohol en spoel de glaasjes af in water.
    13. Dehydrateer glaasjes in gesorteerde ethanolen door objectglaasjes snel te dompelen, 4-5x per oplossing, in 70% ethanol, 95% ethanol en vervolgens 100% ethanol. Incubeer glaasjes in een oplosmiddel op basis van d-limoneen gedurende 2 minuten. Incubeer objectglaasjes in een tweede batch oplosmiddel op basis van d-limoneen gedurende 2 minuten.
    14. Monteer de geleiders met een montagemedium op basis van xyleen.
    15. Onderzoek objectglaasjes met behulp van helderveldmicroscopie.
    16. Voor immunofluorescentie worden de stappen 3.3.10-3.3.15 overgeslagen. Incubeer in plaats daarvan weefsel met soortspecifiek secundair antilichaam verdund in blokkeerbuffer gedurende 1-2 uur.
    17. Spoel de glaasjes 5x in PBS gedurende 5 min. Herhaal 3x.
    18. Monteer objectglaasjes met 1x PBS/glycerol.
    19. Onderzoek objectglaasjes met behulp van fluorescentiemicroscopie.
  4. Alternatieve methode voor het kleuren van mestcellen: toluïdineblauwkleuring
    1. Bereid toluïdine blauwe bouillon oplossing door 1 g toluïdine blauw O op te lossen in 100 ml 70% ethanol.
    2. Bereid 1% natriumchloride (NaCl)-oplossing door 0,5 g NaCl op te lossen in 50 ml gedestilleerd water. Meng om op te lossen. Pas de pH aan tot ongeveer 2,0-2,5 met HCl.
      NOTITIE: Deze NaCl-oplossing moet elke keer dat vlekken worden aangebracht, vers worden gemaakt.
    3. Bereid de werkoplossing toluïdineblauw voor door 5 ml toluïdineblauwstockoplossing toe te voegen aan 45 ml van de 1% NaCl-oplossing. Meng goed en zorg ervoor dat de pH ongeveer 2,3 is.
      OPMERKING: Een pH hoger dan 2.5 zal resulteren in kleuring met minder metachromasie. Maak deze oplossing elke keer dat er wordt gekleurd vers aan.
    4. Deparaffiniseer secties van 4-5 μm die zijn gemonteerd op positief geladen objectglaasjes, zoals beschreven in de stappen 2.2.2-2.2.6. Was gedeparaffiniseerde secties gedurende 2 minuten in stromend water.
    5. Kleursecties in toluïdineblauwe werkoplossing gedurende 2-3 min. Wassen in gedestilleerd water gedurende 2 min.
    6. Dehydrateer secties door 10x in 95% ethanol te dompelen. Dompel dia's in 100% ethanol 10x. Dompel de glijders nog 10 keer in verse 100% ethanol.
    7. Incubeer glaasjes in een oplosmiddel op basis van d-limoneen gedurende 2 minuten. Incubeer objectglaasjes in een tweede batch oplosmiddel op basis van d-limoneen gedurende 2 minuten.
    8. Monteer dekglaasjes met behulp van een montagemedium op xyleenbasis terwijl het glaasje nog nat is met een oplosmiddel op basis van d-limoneen.
      NOTITIE: Gebruik geen montagemedium op waterbasis.
    9. Onderzoek objectglaasjes met behulp van helderveldmicroscopie. Identificeer mestcellen aan de hand van de aanwezigheid van donkerpaarse korrels in hun cytoplasma. Andere celtypen zijn lichtblauw gekleurd.

4. Speciale vlekken om MPNST's te diagnosticeren en alternatieve diagnoses uit te sluiten

  1. Het histologische uiterlijk van menselijke MPNST's is zeer variabel en verschillende tumortypes hebben een uiterlijk dat vergelijkbaar is met dat van MPNST's28. Aangezien MPNST's zijn afgeleid van de Schwann-cellijn, moet u bepalen of de tumor voortkomt uit een perifere zenuw of in een bestaande goedaardige PN door grof onderzoek of helderveldmicroscopisch onderzoek van H&E-gekleurde secties. Hoewel MPNST's af en toe niet geassocieerd worden gevonden met een perifere zenuw of PN (meestal vanwege onbedoelde scheiding van de zenuw tijdens dissectie, vernietiging van de reeds bestaande PN via MPNST-overgroei, of omdat de laesie gemetastaseerd is), zoek naar de associatie van de tumor met een zenuw of PN, aangezien de diagnose minder waarschijnlijk is als de tumor niet geassocieerd is met een zenuw of PN.
  2. Maak secties van 4-5 μm van paraffineblokken die potentiële MPNST's bevatten en monteer ze op positief geladen objectglaasjes zoals beschreven in stap 2.2.1. Deparaffiniseer secties zoals beschreven in de stappen 2.2.2-2.2.6.
  3. Voer immunohistochemie uit met het in tabel 2 aangegeven panel van antilichamen, zoals beschreven in de stappen 3.3.1-3.3.15.
  4. Onderzoek de immunokleuringen met behulp van helderveldmicroscopie. Aangezien MPNST's schwanniaanse differentiatie vertonen, moet u zoeken naar uniforme of fragmentarische immunoreactiviteit voor S100β, nestine en Sox10. Als de tumoren niet positief zijn voor deze drie markers, raadpleeg dan Tabel 2 om de diagnose vast te stellen.
    OPMERKING: MPNST's bij mensen en muizen kunnen divergente differentiatie aantonen. Sommige menselijke MPNST's vertonen bijvoorbeeld focale rhabdomyoblastische differentiatie (deze varianten staan bekend als kwaadaardige Triton-tumoren); hoewel deze neoplasmata de Schwanniaanse markers zullen kleuren, brengen ze ook spiermarkers tot expressie zoals desmine, MyoD1 en myogenine. Immunoreactiviteit voor deze laatste markers mag onderzoekers er niet van weerhouden de tumor als een MPNST te diagnosticeren. Hoewel er meerdere muismodellen zijn vastgesteld die het SS18-SSX-fusiegen voorwaardelijk tot expressie brengen om de pathogenese van synoviaal sarcoom29 te modelleren, zijn er voor zover wij weten geen synoviale sarcoommodellen bekend die spontaan het equivalente fusietranscript genereren. Daarom zoeken we niet naar SS18-SSX-fusietranscripten in GEM-tumoren en vertrouwen we in plaats daarvan op immunohistochemische profielen.

5. Beoordeling van de MPNST's

  1. Bepaal of tumornecrose, een kenmerk van WHO graad IV MPNST's, aanwezig is. Zoek voor MPNST's van graad IV naar prominente hypercellulariteit, stevige mitotische activiteit (≥4 mitosen per 10 velden met hoog vermogen (40x) en cytologische atypie.
    1. Als necrose niet aanwezig is, beoordeel dan de tumor om te bepalen of hypercellulariteit, stevige mitotische activiteit en cytologische atypie aanwezig zijn. Als deze kenmerken allemaal aanwezig zijn in afwezigheid van necrose, beoordeel de tumor dan als een WHO graad III MPNST.
    2. WHO graad II tumoren worden gekenmerkt door cellulariteit die verhoogd is, maar in mindere mate dan WHO graad III en IV MPNST's. De kernen van tumorcellen in een WHO graad II MPNST vertonen een grotere omvang (meer dan 3x de grootte van de tumorcelkernen in neurofibromen) en hyperchromasie. Verhoogde mitotische activiteit (<4 mitosen per 10 velden met hoog vermogen) wordt geassocieerd met, maar is geen vereiste voor, WHO graad II tumoren.
      OPMERKING: Aangezien tumoren van een hogere graad doorgaans vorderen van lagere graden, kunnen laaggradige en hooggradige regio's aanwezig zijn in dezelfde MPNST. In dit geval wordt de graad van de tumor bepaald door het hoogst aanwezige gebied.
      OPMERKING: Er is controverse onder menselijke pathologen over de vraag of het hierboven beschreven WHO-beoordelingssysteem voorspellend is voor patiëntuitkomsten en sommige van deze pathologen geven er de voorkeur aan om MPNST's eenvoudigweg te classificeren als laaggradig of hooggradig. Volgens dit schema hebben hooggradige MPNST's prominente cytologische atypie, stevige mitotische activiteit (>5 mitosen per 10 velden met hoog vermogen) en duidelijke hypercellulariteit met of zonder necrose. Laaggradige MPNST's hebben geen necrose, maar vertonen mitotische activiteit, cytologische atypie en cellulariteit die het midden houdt tussen een hooggradig MPNST en een atypisch neurofibromateus neoplasma met onbekend biologisch potentieel (ANNUBP). We geven de voorkeur aan het hierboven beschreven systeem omdat het onderscheid tussen een ANNUBP en een laaggradige MPNST een uitdaging kan zijn voor onderzoekers die geen lange ervaring hebben met deze entiteiten.

6. Bereiding van culturen van vroege passage P 0-GGFβ3 MPNST-cellen

  1. Kweek vroege passage P 0-GGFβ3 tumorcellen uit vers tumorstuk 2 (stap 1.5, figuur 1A). Handhaaf vanaf dit punt steriele omstandigheden.
    1. Dissocieer de tumor door deze in kleine (2-4 mm) stukjes te snijden en in DMEM10 (Dulbecco's minimale essentiële medium) te hakken met 10% foetaal kalfsserum, 2 μmol/L forskoline en 10 nmol/L neureguline 1β (NRG1β) in weefselkweekschaaltjes van 100 mm.
    2. Laat cellen uit de gehakte weefselfragmenten groeien bij 37 °C in 5% CO2 totdat de platen samenvloeien. Wissel elke 3-4 dagen van media.
    3. Splits de celcultuur. Verwijder de media uit de schaal van 100 mm en was de cellen met PBS; Verwijder gehakt weefsel en gooi het weg. Verwijder PBS en voeg 1 ml 0,25% trypsine toe gedurende 2-5 minuten bij kamertemperatuur. Om celloslating te bevorderen, tikt u zachtjes op de plaat en controleert u op loslating met een lichtmicroscoop; verleng de trypsine-incubatie indien nodig.
    4. Neutraliseer trypsine door 2 ml DMEM10 toe te voegen. Breng de celsuspensie gedurende 5 minuten over in een centrifugebuis en pelletcellen bij 500 × g . Verwijder het medium en voeg 5 ml verse DMEM10 toe aan de pellet.
    5. Verdeel de celsuspensie over twee tot vier schalen van 100 mm die DMEM10 bevatten. Splits de cellen niet langer dan vijf passages (stappen 6.1.3 en 6.1.4) en houd ze in DMEM zonder forskoline en NRG1β. Vergeet niet om cellen bij doorgang 2 in te vriezen voor toekomstig gebruik.

7. Verificatie van de identiteit van MPNST-cellen met vroege passage door middel van immunocytochemie

  1. Plaats steriele 18 mm #1.5 ronde glazen dekglaasjes in de putjes van steriele weefselkweekschaaltjes met 6 putjes.
    1. Breng poly-L-lysine/laminine-oplossing in de putjes in een volume dat voldoende is om het dekglaasje te bedekken. Sluit de plaat af met plasticfolie om verdamping tot een minimum te beperken. Incubeer gedurende een nacht bij 4 °C. Was de volgende ochtend de dekglaasjes 3x met steriele PBS.
      OPMERKING: We hebben geprobeerd MPNST-cellen met vroege doorgang op niet-gecoate dekglaasjes te plaatsen en hebben geconstateerd dat de cellen niet goed hechten bij afwezigheid van poly-L-lysine/lamininecoating.
    2. Plaats 10.000 cellen op het dekglaasje door voorzichtig 2 ml van de celsuspensie in groeimedia toe te voegen aan elk putje met het dekglaasje. Incubeer de platen een nacht bij 37 °C met 5% CO2 in een weefselkweekincubator.
    3. Spoel de dekglaasjes de volgende ochtend 2 x 5 minuten uit met PBS.
    4. Fixeer cellen met 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 18 minuten bij kamertemperatuur.
    5. Spoel de dekglaasjes 3 x 5 min af met PBS. Sluit de plaat desgewenst af met plastic folie en bewaar deze op dit punt bij 4 °C.
    6. Maak vers 50 mM NH4Cl in PBS. Blus aldehyden door dekglaasjes in 50 mM NH4Cl gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in PBS te incuberen.
    7. Permeabiliseer de cellen door dekglaasjes in 0,3% Triton X-100 in PBS gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur te incuberen. Was dekglaasjes 3 x 5 min met PBS.
    8. Blokkeer niet-specifieke binding door dekglaasjes te incuberen in blokkeerbuffer (1x PBS met 1% runderserumalbumine, 0,2% magere droge melk en 0,3% Triton X-100) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
    9. Verwijder de blokkerende buffer en voeg primaire antilichamen toe die de MPNST-markers herkennen die aanwezig zijn in de moedertumor (meestal S100β, Nestin en Sox10) verdund tot de vooraf bepaalde optimale verdunning in de blokkerende buffer. Wikkel de plaat in plastic folie en incubeer een nacht bij 4 °C in een bevochtigde kamer.
    10. Was 3 x 5 min met PBS om ongebonden primaire antilichamen te verwijderen. Voeg fluorescerend gelabeld secundair antilichaam verdund in blokkeerbuffer toe en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Beschermen tegen licht.
    11. Was 3 x 5 min met PBS. Incubeer dekglaasjes in 1-5 μg Hoechst-kleurstof gedurende 10 min. Blijf beschermen tegen licht.
    12. Was dekglaasjes met PBS gedurende 5 min. Monteer dia's met 1:1 1x PBS/glycerol. Afbeelding met een fluorescentiemicroscoop.

8. Allograft van tumorcellen met vroege passage om tumorigeniciteit aan te tonen

  1. Kweek vroege passage P 0-GGFβ3 MPNST-cellen in DMEM10 tot 80% confluentie. Spoel de cellen één keer met de uitgebalanceerde zoutoplossing (HBSS) van Hanks op kamertemperatuur. Behandel cellen gedurende 30 s tot 1 minuut met een niet-enzymatische celdissociatieoplossing om ze van het substraat te verwijderen. Voeg 5 ml DMEM10 toe per 1 ml van een niet-enzymatisch celdissociatiereagens.
    OPMERKING: Cellulaire dissociatie kan veel langer duren, tot 10-20 minuten. Raadpleeg het protocol van de fabrikant.
    OPMERKING: Kweek geen cellen tot samenvloeiing, omdat dit de effectiviteit van het transplantaat zal verminderen.
    1. Tel cellen met behulp van een hemocytometer. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 5 × g en resuspendeer ze in een concentratie van 1-2 × 106 cellen per 100 μL DMEM10. Bewaar de cellen op ijs totdat ze klaar zijn voor injectie.
    2. Verdoof NOD-SCIDγ (NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1wjl/SzJ) muizen in de inductiekamer van een isofluraanverdamper. Leg het dier op zijn buik en steriliseer de injectieplaats met 70% ethanol. Laat de plaats aan de lucht drogen voordat u gaat injecteren. Laat de cellen vóór de injectie op kamertemperatuur komen.
    3. Injecteer 1-2 x 106 cellen subcutaan in de rechterflank. Plaats de muis alleen in een kooi zonder bodembedekking en laat hem herstellen. Zorg ervoor dat slechts een deel van de kooi op een verwarmingskussen staat om onderkoeling te voorkomen. Dit biedt een zone waar de muis naartoe kan bewegen als deze oververhit raakt.
      OPMERKING: We enten minimaal drie muizen met elke vroege passagecultuur, omdat sommige transplantaten mogelijk niet nemen.
    4. Laat het transplantaat 15-60 dagen groeien; Beoordeel de diergezondheid 3x per week en noteer de scores van de lichaamsconditie, inclusief gewicht en gedragsveranderingen bij elk onderzoek. Beëindig muizen die de maximaal toegestane transplantaatgrootte hebben bereikt of stervende muizen met behulp van kooldioxide-euthanasie gevolgd door cervicale dislocatie. Registreer de leeftijd bij overlijden in dagen. Als tumoren uitwendig zichtbaar worden, noteer dan de afmetingen van de tumor (lengte, breedte en hoogte).
      OPMERKING: Onze ervaring is dat verschillende MPNST-culturen met vroege passage met verschillende efficiëntie worden getransplanteerd en verschillen in de tijd die nodig is voor de groei van het transplantaat. Dieren mogen niet verder gaan dan de door de IACUC goedgekeurde maximaal toegestane tumorgrootte en/of humaan eindpunt.
  2. Oogst de tumor, fixeer deze in 4% paraformaldehyde, bedin deze in paraffine en voer H&E-kleuringen uit zoals beschreven in rubrieken 2.1-2.2.9 om te verifiëren dat het allotransplantaat een tumor is in plaats van een reactief weefsel. Immunokleuring van het transplantaat indien nodig voor de markers die aanwezig waren in de oudertumor.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Figuur 2 illustreert voorbeelden van duidelijk voorkomende neoplasmata die ontstaan bij P 0-GGFβ3-muizen. Tumoren die gemakkelijk met het blote oog kunnen worden geïdentificeerd, kunnen worden gezien als massa's die lichaamsdelen uitzetten, zoals weergegeven in figuur 2A (pijl). Bij het bepalen of het neoplasma mogelijk een perifere zenuwschedetumor is, is het essentieel om vast te stellen dat de tumor geassocieerd is met een perifere zenuw. In dit ge...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

De histologische en biochemische methoden die hier worden gepresenteerd, bieden een kader voor het diagnosticeren en karakteriseren van GEM-modellen van neurofibroom en MPNST-pathogenese. In de loop der jaren hebben we ontdekt dat deze methodologieën zeer nuttig zijn voor het beoordelen van de pathologie van perifere zenuwschedetumoren die zich voordoen in GEM-modellen 21,25,26. Hoewel de hier geschetste protocollen nuttig zijn ...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.

Dankbetuigingen

Dit werk werd ondersteund door subsidies van het National Institute of Neurological Diseases and Stroke (R01 NS048353 en R01 NS109655 aan S.L.C.; R01 NS109655-03S1 aan D.P.J.), het National Cancer Institute (R01 CA122804 aan S.L.C.) en het Ministerie van Defensie (X81XWH-09-1-0086 en W81XWH-12-1-0164 aan S.L.C.).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
100 mm Tissue Culture PlatesCorning Falcon353003
3, 3'- Diaminobensidine (DAB)Vector LaboratoriesSK-400
6- well platesCorning Costar3516
AzijnzuurFisher ScientificA38-212
Alexa Fluor 488 Secondary (Goat Anti-Mouse)InvitrogenA11029
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Mouse)InvitrogenA21043 of A11004
Alexa Fluor 568 Secondary (Goat Anti-Rabbit)InvitrogenA11036
Ammoniumchloride (NH4Cl)Fisher ScientificA661-500
BCA Protein Assay KitThermo Scientific23225
Rundereiwit (BSA)Fisher ScientificBP1600-100
CaldesmonABCAME89, ab32330
CD117Cell Marque117R-18-ASR
CD163LeicaNCL-L-CD163
CD31ABCAMab29364
CD34ABCAMab81289
CD86ABCAMab53004
CelschraperSarstedt83.183
Cell StripperCorning25-056-CI
Circle CoverslipFisher Scientific12-545-100
Citrisolve Hybrid (op d-limoneen gebaseerd oplosmiddel)Decon Laboratories5989-27-5
CitroenzuurFisher ScientificA104-500
CytokeratineABCAMC-11, ab7753
DesmineAgilent Dakoclone D33 (M0760)
Diaminobenzidine (DAB) SolutionVector LaboratoriesSK-4100
DMEMCorning15-013-CV
Eosine YThermo Scientific7111
Ethanol (200 Proof)Decon Laboratories2716
Foetale Kalfs SerumOmega ScientificFB-01
ForskolineSigma-AldrichF6886
GlycerolSigma-AldrichG6279
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)Corning21-022-CV
Harris HematoxylineFisherbrand245-677
HemacytometerBrightline-Hauser Scientific1490
ZoutzuurFisher ScientificA144-212
WaterstofperoxideFisher Scientific327-500
Iba1Wako Chemicals019-19741
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit,Mouse on MouseVector LaboratoriesMP-2400
ImmPRESS HRP (Peroxidase) Polymer Kit, Horse Anti-RabbitVector LaboratoriesMP-7401
IncubatorThermo ScientificHeracell 240i CO2 incubator
IsofluraanPiramalNDC 66794-017-25
IsopropanolFisher ScientificA415
Ki-67Cell Signaling12202
LaminineThermo Fisher Scientific23017015
Vloeibare Stikstof
MART1ABCAMM2-9E3, ab187369
Microtoom
NestinMilliporeHuman: MAD5236 (10C2), Human:MAB353 (Rat-401)
Neureguline 1 betaIn houseGemaakt door S.L.C. (ook verkrijgbaar als 396-HB-050/CF van R&D Systems)
NeurofibromineSanta Cruz Biotechnologysc-67
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ muizenJackson Laboratory5557
Vette Vrije Droge MelkWalmartGreat Value Brand
P0-GGFβ3 muizenIn house
ParafinewasLeicaParaplast 39601006
Parafilm MSigma-AldrichPM-999
Paraformaldehyde (4%)Thermo ScientificJ19943-K2
Permount (Xyleen Mounting Medium)Fisher ScientificSP15-100
pH MeterMettler ToledoSeven Excellence, 8603
Fosfaat gebufferde Saline (Dulbecco's)Corning20-031-CV
PMELABCAMEP4863(2), ab137078
Poly-L-Lysine HydrobromideSigma-AldrichP5899-5MG
Portable Isofluran MachineVetEquip Inhalatieanesthesie Systemen
PVA-DABCO (Aqueous Mounting Medium)Millipore Sigma10981100ML
Rice CookerBeech Hamilton
S100BAgilent DakoZ0311 (nu GA504)
SMAVentana Medical Systemsclone 1A4
NatriumchlorideFisher ScientificS640
Natriumcitraat (Dihydraat)Fisher ScientificBP327-1
Sox10ABCAMab212843
Staal Histologie Mal
Superfrost Plus Microscoop SlidesFisher Scientific12-550-15
TCF4/TCFL2Cell Signaling(CH48H11) #2569
Tissue Cassette
Toluidine BlauwACROS Organics348600050
Triton X-100Fisher ScientificBP151-500
TRIzol

Referenties

  1. Carroll, S. L. Molecular mechanisms promoting the pathogenesis of Schwann cell neoplasms. Acta Neuropathologica. 123 (3), 321-348 (2012).
  2. Longo, J. F., Weber, S. M., Turner-Ivey, B. P., Carroll, S. L. Recent advances in the diagnosis and pathogenesis of neurofibromatosis type 1 (NF1)-associated peripheral nervous system neoplasms. Advances in Anatomic Pathology. 25 (5), 353-368 (2018).
  3. Longo, J. F., Carroll, S. L. The RASopathies: Biology, genetics and therapeutic options. Advances in Cancer Research. 153, 305-341 (2022).
  4. Boyd, K. P., Korf, B. R., Theos, A. Neurofibromatosis type 1. Journal of the American Academy of Dermatology. 61 (1), 1-16 (2009).
  5. Rad, E., Tee, A. R. Neurofibromatosis type 1: Fundamental insights into cell signalling and cancer. Seminars in Cell and Developmental Biology. 52, 39-46 (2016).
  6. Brannan, C. I., et al. Targeted disruption of the neurofibromatosis type-1 gene leads to developmental abnormalities in heart and various neural crest-derived tissues. Genes and Development. 8 (9), 1019-1029 (1994).
  7. Jacks, T., et al. Tumour predisposition in mice heterozygous for a targeted mutation in Nf1. Nature Genetics. 7 (3), 353-361 (1994).
  8. Zhu, Y., Ghosh, P., Charnay, P., Burns, D. K., Parada, L. F. Neurofibromas in NF1: Schwann cell origin and role of tumor environment. Science. 296 (5569), 920-922 (2002).
  9. Cichowski, K., et al. Mouse models of tumor development in neurofibromatosis type 1. Science. 286 (5447), 2172-2176 (1999).
  10. Joseph, N. M., et al. The loss of Nf1 transiently promotes self-renewal but not tumorigenesis by neural crest stem cells. Cancer Cell. 13 (2), 129-140 (2008).
  11. Rhodes, S. D., et al. Cdkn2a (Arf) loss drives NF1-associated atypical neurofibroma and malignant transformation. Human Molecular Genetics. 28 (16), 2752-2762 (2019).
  12. Chaney, K. E., et al. Cdkn2a loss in a model of neurofibroma demonstrates stepwise tumor progression to atypical neurofibroma and MPNST. Cancer Research. 80 (21), 4720-4730 (2020).
  13. Mohamad, T., Plante, C., Brosseau, J. P. Toward understanding the mechanisms of malignant peripheral nerve sheath tumor development. International Journal of Molecular Science. 22 (16), 8620(2021).
  14. Somatilaka, B. N., Sadek, A., McKay, R. M., Le, L. Q. Malignant peripheral nerve sheath tumor: models, biology, and translation. Oncogene. 41 (17), 2405-2421 (2022).
  15. Keng, V. W., et al. Conditional inactivation of Pten with EGFR overexpression in Schwann cells models sporadic MPNST. Sarcoma. 2012, 620834(2012).
  16. Miettinen, M. M., et al. Histopathologic evaluation of atypical neurofibromatous tumors and their transformation into malignant peripheral nerve sheath tumor in patients with neurofibromatosis 1-a consensus overview. Human Pathology. 67, 1-10 (2017).
  17. Lee, W., et al. PRC2 is recurrently inactivated through EED or SUZ12 loss in malignant peripheral nerve sheath tumors. Nature Genetics. 46 (11), 1227-1232 (2014).
  18. Zhang, M., et al. Somatic mutations of SUZ12 in malignant peripheral nerve sheath tumors. Nature Genetics. 46 (11), 1170-1172 (2014).
  19. Magallon-Lorenz, M., et al. Deep genomic analysis of malignant peripheral nerve sheath tumor cell lines challenges current malignant peripheral nerve sheath tumor diagnosis. iScience. 26 (2), 106096(2023).
  20. Longo, J. F., et al. Establishment and genomic characterization of a sporadic malignant peripheral nerve sheath tumor cell line. Scientific Reports. 11 (1), 5690(2021).
  21. Huijbregts, R. P., Roth, K. A., Schmidt, R. E., Carroll, S. L. Hypertrophic neuropathies and malignant peripheral nerve sheath tumors in transgenic mice overexpressing glial growth factor beta3 in myelinating Schwann cells. Journal of Neuroscience. 23 (19), 7269-7280 (2003).
  22. Stonecypher, M. S., Byer, S. J., Grizzle, W. E., Carroll, S. L. Activation of the neuregulin-1/ErbB signaling pathway promotes the proliferation of neoplastic Schwann cells in human malignant peripheral nerve sheath tumors. Oncogene. 24 (36), 5589-5605 (2005).
  23. Kohli, L., et al. The pan erbB inhibitor PD168393 enhances lysosomal dysfunction-induced apoptotic death in malignant peripheral nerve sheath tumor cells. Neuro-Oncology. 14 (3), 266-277 (2012).
  24. Eckert, J. M., Byer, S. J., Clodfelder-Miller, B. J., Carroll, S. L. Neuregulin-1 beta and neuregulin-1 alpha differentially affect the migration and invasion of malignant peripheral nerve sheath tumor cells. Glia. 57 (14), 1501-1520 (2009).
  25. Kazmi, S. J., et al. Transgenic mice overexpressing neuregulin-1 model neurofibroma-malignant peripheral nerve sheath tumor progression and implicate specific chromosomal copy number variations in tumorigenesis. American Journal of Pathology. 182 (3), 646-667 (2013).
  26. Brosius, S. N., et al. Neuregulin-1 overexpression and Trp53 haploinsufficiency cooperatively promote de novo malignant peripheral nerve sheath tumor pathogenesis. Acta Neuropathologica. 127 (4), 573-591 (2014).
  27. Vogel, K. S., et al. Mouse tumor model for neurofibromatosis type 1. Science. 286 (5447), 2176-2179 (1999).
  28. Reuss, D. E., et al. Malignant peripheral nerve sheath tumour (MPNST). WHO Classification of Tumours of the Central Nervous System, Revised 4th Edition. Louis, D. N., et al. , International Agency for Research on Cancer (IARC), Lyon, France. 226-229 (2016).
  29. Landuzzi, L., Ruzzi, F., Lollini, P. L., Scotlandi, K. Synovial sarcoma preclinical modeling: integrating transgenic mouse models and patient-derived models for translational research. Cancers. 15 (3), 588(2023).
  30. Cohen, P. R., Rapini, R. P., Farhood, A. I. Expression of the human hematopoietic progenitor cell antigen CD34 in vascular and spindle cell tumors. Journal of Cutaneous Pathology. 20 (1), 15-20 (1993).
  31. Weiss, S. W., Nickoloff, B. J. CD-34 is expressed by a distinctive cell population in peripheral nerve, nerve sheath tumors, and related lesions. American Journal of Surgical Pathology. 17 (10), 1039-1045 (1993).
  32. Longo, J. F., Brosius, S. N., Carroll, S. L. Defining gene functions in tumorigenesis by ex vivo ablation of floxed alleles in malignant peripheral nerve sheath tumor cells. Journal of Visualized Experiments. (174), (2021).
  33. Hoffman, G. E., Murphy, K. J., Sita, L. V. The importance of titrating antibodies for immunocytochemical methods. Current Protocols in Neuroscience. 76, 2.12.1-2.12.37 (2016).
  34. Brossier, N. M., Carroll, S. L. Genetically engineered mouse models shed new light on the pathogenesis of neurofibromatosis type I-related neoplasms of the peripheral nervous system. Brain Research Bulletin. 88 (1), 58-71 (2012).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Plexiforme neurofibromengenetisch gemodificeerde muizenneurofibromatose type 1tumorgradatieimmunohistochemiehistologische analyseSchwann-celmarkersvroege passage-culturentumorallografts
Identificeren, diagnosticeren en beoordelen van kwaadaardige perifere zenuwschedetumoren in genetisch gemanipuleerde muismodellen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.