Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Vezeltype-identificatie van menselijke skeletspieren

3.8K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65750

⸱

22 september 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Chemistry, La Trobe Institute for Molecular Science, School of Agriculture, Biomedicine and Environment, La Trobe University

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol demonstreert isolatie van één vezel uit gevriesdroogde menselijke skeletspier- en vezeltypeclassificatie volgens Myosin heavy chain (MHC) isovorm met behulp van de dot blotting-techniek. Geïdentificeerde MHC I- en II-vezelmonsters kunnen vervolgens verder worden geanalyseerd op vezeltype-specifieke verschillen in eiwitexpressie met behulp van western blotting.

Samenvatting

De hier beschreven techniek kan worden gebruikt om specifieke myosine heavy chain (MHC) isovormen in segmenten van individuele spiervezels te identificeren met behulp van dot blotting, hierna aangeduid als Myosin heavy chain detection by Dot Blotting for IDentification of muscle fiber type (MyDoBID). Dit protocol beschrijft het proces van het vriesdrogen van menselijke skeletspieren en het isoleren van segmenten van afzonderlijke spiervezels. Met behulp van MyDoBID worden type I- en II-vezels geclassificeerd met respectievelijk MHCI- en IIa-specifieke antilichamen. Geclassificeerde vezels worden vervolgens gecombineerd tot vezeltypespecifieke monsters voor elke biopsie.

Het totale eiwit in elk monster wordt bepaald door natriumdodecylsulfaatpolyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) en UV-geactiveerde geltechnologie. Het vezeltype van monsters wordt gevalideerd met behulp van western blotting. Het belang van het uitvoeren van normalisatie van de eiwitbelasting om de detectie van doeleiwitten in meerdere westernvlekken te verbeteren, wordt ook beschreven. De voordelen van het consolideren van geclassificeerde vezels in vezeltypespecifieke monsters in vergelijking met westernblots met één vezel, zijn onder meer de veelzijdigheid van monsters, een grotere doorvoer van monsters, een kortere tijdsinvestering en kostenbesparende maatregelen, en dat alles met behoud van waardevolle vezeltypespecifieke informatie die vaak over het hoofd wordt gezien met behulp van gehomogeniseerde spiermonsters. Het doel van het protocol is om nauwkeurige en efficiënte identificatie te bereiken van type I- en type II-vezels geïsoleerd uit gevriesdroogde menselijke skeletspiermonsters.

Deze individuele vezels worden vervolgens gecombineerd om type I en type II vezeltype-specifieke monsters te creëren. Bovendien wordt het protocol uitgebreid met de identificatie van type IIx-vezels, waarbij actine wordt gebruikt als marker voor vezels die negatief waren voor MHCI en MHCIIa, die worden bevestigd als IIx-vezels door western blotting. Elk vezeltype-specifiek monster wordt vervolgens gebruikt om de expressie van verschillende doeleiwitten te kwantificeren met behulp van western blotting-technieken.

Inleiding

Skeletspieren zijn een heterogeen weefsel, met verschillende cellulaire metabole en contractiele eigenschappen die afhankelijk zijn van het feit of de cel (vezel) langzame spiertrekkingen (type I) of snelle spiertrekkingen (type II) is. Het vezeltype kan worden geïdentificeerd door de myosine zware keten (MHC) isovormen te onderzoeken, die op verschillende manieren van elkaar verschillen, waaronder contractietijd, snelheid van verkorting en vermoeidheidsweerstand1. De belangrijkste MHC-isovormen zijn type I, type IIa, type IIb en type IIx en hun metabole profielen zijn oxidatief (type I en IIa) of glycolytisch (IIx, IIb)1. Het aandeel van deze vezeltypes varieert in spiertype en tussen soorten. Type IIb wordt veel aangetroffen in de spier van knaagdieren. Menselijke spieren bevatten geen type IIb-vezels en bestaan voornamelijk uit MHC-isovormen type I- en IIa-vezels, met een klein aandeel IIx-vezels2. Eiwitexpressieprofielen variëren tussen verschillende vezeltypes en kunnen worden gewijzigd bij veroudering3, lichaamsbeweging 4,5 en ziekte6.

Het meten van cellulaire responsen in verschillende skeletspiervezeltypes wordt vaak over het hoofd gezien of is niet mogelijk vanwege het onderzoek van spierhomogenaten (een mix van alle vezeltypes). Single-fiber western blot maakt het mogelijk om meerdere eiwitten in individuele spiervezels te onderzoeken7. Deze methodologie is eerder gebruikt om nieuwe en informatieve eigenschappen van één vezel te produceren die niet mogelijk waren om te verkrijgen met homogenaatpreparaten. Er zijn echter enkele beperkingen van de oorspronkelijke single-fiber western blot-methodologie, waaronder de tijdrovende aard, het onvermogen om monsterreplicaten te genereren en het gebruik van dure, gevoelige verbeterde chemiluminescentie (ECL)-reagentia. Als vers weefsel wordt gebruikt, is deze methode verder beperkt vanwege de tijdsdruk van het moeten isoleren van individuele vezels binnen een beperkt tijdsbestek (d.w.z. 1-2 uur). Gelukkig wordt deze beperking verzacht door segmenten van één vezel te isoleren van gevriesdroogd weefsel8. Het verzamelen van vezels uit gevriesdroogde monsters wordt echter beperkt door de grootte en kwaliteit van het biopsieweefsel.

Identificatie van het vezeltype met behulp van de dot blotting-methode9 is in dit uitgebreide protocol aanzienlijk uitgewerkt en uitgebreid. Eerder is aangetoond dat slechts ~2-10 mg spierweefsel met nat gewicht voldoende is voor vriesdrogen en MHC-isovormeiwitanalyse met één vezel9. Christensen et al.9 gebruikten 30% van een ~1 mm vezelsegment om de MHC-isovorm te detecteren die aanwezig was door dot-blotting, wat werd bevestigd door western blotting. Dit werk toonde aan dat door western blotting te vervangen door dot blotting, de totale kosten met ~40-voudig werden verlaagd (voor 50 vezelsegmenten). Vezels werden vervolgens "gepoold" in type I- en type II-monsters, wat experimentele replicatie mogelijk maakte9. Een beperking was echter dat er slechts twee vezeltypespecifieke monsters werden verkregen: type I (MHCI-positief) en type II (MHCII-positieve vezels), waarbij type II-monsters een mengsel van MHCIIa en MHCIIx 6,10 bevatten. Het huidige protocol laat met name zien hoe zuivere type IIx-vezels kunnen worden geïdentificeerd en biedt een zeer gedetailleerde workflow (samengevat in figuur 1), inclusief strategieën voor het oplossen van problemen met veelvoorkomende protocolproblemen.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Menselijke spiermonsters werden verkregen uit de vastus lateralis van n = 3 (2 mannen, 1 vrouw), in de leeftijd van 70-74 jaar oud onder steriele omstandigheden met behulp van lokale anesthesie (xylocaïne) en een Bergstrom-naald aangepast voor handmatige afzuiging11,12. De monsters waren een subset van een eerdere studie die was goedgekeurd door de Victoria University Human Research Ethics Committee (HRETH11/221) en uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki13. Deelnemers gaven schriftelijke, geïnformeerde toestemming om deel te nemen aan dit onderzoek. Volledige details van alle materialen die nodig zijn voor dit protocol worden weergegeven in de Tabel met materialen. Daarnaast vindt u in tabel 1 een lijst met strategieën voor het oplossen van veelvoorkomende protocolproblemen.

1. Vriesdrogen

  1. Terwijl u de biopsie-spiermonsters bevroren houdt op droogijs, weegt en tarraleert u een lege bevroren buis op de weegschaal.
  2. Weeg snel minimaal 10 mg bevroren weefsel met nat gewicht af. Noteer het gewicht tot op één decimaal.
  3. Deponeer het weefsel in de voorgekoelde microcentrifugebuis waarvan 3-4 gaatjes in het deksel zijn gestoken en plaats het in een klein bekerglas met 2-3 pellets droogijs.
  4. Volg de gebruiksaanwijzing van de fabrikant van de vriesdroger.
  5. Zorg ervoor dat alle kleppen op de vriesdroger gesloten zijn en schakel de vriesdroger in.
  6. Gebruik het bedieningspaneel om te controleren of het vacuüminstelpunt is geprogrammeerd voor optimale vriesdroogomstandigheden voor menselijk weefsel, 0.12 millibar (mBar) (Figuur 2).
  7. Druk handmatig op de vriesdroger en wacht tot de kamer is afgekoeld tot -40 °C.
  8. Zodra de kamer die temperatuur heeft bereikt, verwijdert u het deksel, vervolgens de glazen kamer en plaatst u het bekerglas (met spiermonster) op de metalen tafel.
  9. Plaats de glazen kamer en het deksel terug. Sluit de vacuümontlastklep op het deksel en wacht tot het lampje van de vacuümweegschaal groen wordt om ervoor te zorgen dat de droger vacuüm is verzegeld.
  10. Vriesdroog de spiermonsters gedurende 48 uur. Zodra het vriesdrogen is voltooid, schakelt u de vacuümpomp uit door op de vacuümknop te drukken en opent u het vacuümontlastventiel op het deksel.
  11. Verwijder het deksel van de kamer en vang het gevriesdroogde monster op. Weeg het weefsel en noteer het gewicht tot op één decimaal.
  12. Bereken het procentuele gewichtsverlies; ~75% gewichtsafname geeft aan dat het weefsel met succes is gevriesdroogd (in dit werk, gemiddelde ± SD, 76 ± 9%, n = 11 spiermonsters).
  13. Druk op AUTO om de vacuümpomp en vriezer uit te schakelen. Laat het apparaat op kamertemperatuur komen.
  14. Reinig de koelspiralen volgens de instructies van de fabrikant en laat de opgehoopte vloeistof uit de opvangbak lopen.
    OPMERKING: De inzameling van vezels kan onmiddellijk beginnen. Wanneer weefsel niet wordt gebruikt voor vezelisolatie, bewaar het gevriesdroogde monster dan bij -80 °C in een afgesloten container met adsiccatorparels.  LET OP: Droogijs is gevaarlijk (klasse 9); raadpleeg het MSDS voor aanbevolen veilige hantering.

2. Vezel inzameling

  1. Voorbereiding van de vezelverzameling
    1. Etiketteer minimaal 50 microfugebuisjes (vezel 1 tot 50) en pipetteer 10 μL denatureringsbuffer op elk buisje.
    2. Bereid het verzamelgebied voor met twee paar fijne weefselontledende pincetten, pluisvrij weefsel, een tafellamp, een stereomicroscoop (met de zwarte trap omhoog), een draaikolk en een tafelcentrifuge.
    3. Plaats het gevriesdroogde spiermonster op het deksel van een petrischaal. Plaats het deksel op de tafel van de ontleedmicroscoop.
    4. Bekijk de video van dissectie met één vezel. Oefen het volledige protocol, van vezelverzameling tot identificatie van het type enkele vezel, ten minste twee keer voordat u met een onderzoek begint.
    5. Bereken voorafgaand aan de vezelverzameling het totale volume dat nodig is voor een vezeltypemonster van elke biopsie als volgt. Bijvoorbeeld, als het startvolume van 1 vezel = 10 μL en het resterende volume na MyDoBID (1 vezel × 10 μL) - 1 μL gebruikt voor dot blotting = 9 μL (monstervolume) is, bereken dan het totale benodigde monstervolume door het monstervolume (μL) te vermenigvuldigen met het totale aantal western blots dat zal worden uitgevoerd en verdubbel dit bedrag om rekening te houden met redundantie: (9 μL × 4 western blots) × 2 = 72 μL. Bereken het aantal benodigde vezels per getypt monster door het uiteindelijke benodigde monstervolume (μL) te delen door het monstervolume per vezeltypespecifiek monster (bijv. 72 μL ÷ 9 μL = 8 vezels per vezeltypespecifiek monster). Om dit te bereiken, verzamelt u in totaal 50 vezels.
      OPMERKING: Het vereiste monstervolume is de minimale eiwitconcentratie die nodig is om zowel MyDoBID als western blotting uit te voeren als de hoeveelheid geladen eiwit gelijk is aan een vezel van ~3 mm (~12 μg nat gewicht) voor elk monster (zie aanvullend bestand 1 voor details). Dit volume houdt echter geen rekening met de vraag of herhaalde gels nodig zijn voor een bepaald eiwit.  LET OP: Pincetten zijn scherp; Ga er voorzichtig mee om om het risico van een lekke band te voorkomen.
  2. Isolatie met één vezel
    1. Gebruik een liniaal op een klein stukje papier van 5 cm x 1 cm om een lijn van 1 cm te trekken. Markeer elke 1 mm op die lijn.
    2. Steek dit onder het deksel van de petrischaal als richtlijn om de lengte van de verzamelde vezels in te schatten.
    3. Plaats het gevriesdroogde spiermonster onder de stereomicroscoop met een lage vergroting (x 7,5). Gebruik een pincet voor het ontleden van fijn weefsel om de gevriesdroogde spier op zijn plaats te houden en begin met de andere kleine bundels vezels te scheiden (zoals te zien is in de video).
    4. Isoleer een bundel vezels en blijf uit elkaar plagen totdat enkele vezelsegmenten van de bundel zijn geïsoleerd.
    5. Verzamel minimaal 50 vezels die minimaal ~1 mm lang zijn.
    6. Verplaats de vezel naar een lege ruimte op de petrischaal. Inspecteer segmenten met één vezel bij een hogere vergroting (x 50). Zorg ervoor dat het een enkele vezel is door de vezel aan het einde verder te scheiden. Als de vezel breekt in plaats van te scheiden, is het een enkele vezel.
  3. Denaturatie van vezels
    1. Verzamel de vezel voorzichtig met een pincet en plaats deze rechtstreeks in de gealiquoteerde denatureringsbuffer (laat de pincet de buffer niet raken).
    2. Controleer de pincet onder de microscoop om er zeker van te zijn dat de vezel met succes is verwijderd. Sluit de buis en tik drie keer stevig met de onderkant van de buis op de bank om ervoor te zorgen dat de vezel in de buffer beweegt.
    3. Veeg de pincet schoon met een pluisvrije tissue voordat u verder gaat met de volgende vezel. Herhaal dit proces totdat alle vezels zijn verzameld.
    4. Draai de vezelmonsters en centrifugeer kort gedurende 5 s bij 2.500 × g om het monster naar de bodem van de buis te trekken.
      NOTITIE: De centrifugatieduur (5 s) wordt getimed vanaf het begin (0 × g) totdat de snelheid ~2,500 × g bereikt.
    5. Laat de monsters 1 uur op kamertemperatuur staan. Bewaren bij -80 °C voor toekomstig gebruik. Vries de monsters in en ontdooi ze voor gebruik.

3. Stippen blotting

  1. Membraanvoorbereiding en -activering
    1. Meet, label en snijd één polyvinylideendifluoride (PVDF)-membraan (0,2 μm poriegrootte) op maat om in 50 monsters (~10,5 cm x 5,5 cm) te passen.
    2. Markeer de linkerrand numeriek van boven naar beneden (1 tot 10) en de bovenrand alfabetisch van links naar rechts (A tot E) op een afstand van 1 cm van elkaar.
    3. Leg vier vellen filtreerpapier klaar met de afmetingen van 12,5 cm x 7,5 cm.
    4. Stapel twee vellen op elkaar om een stapel te vormen. Week de stapel filtreerpapier voor in 1x transferbuffer.
    5. Plaats het membraan in een bakje. Giet 95% ethanol over het membraan, met voldoende volume om het membraan volledig onder te dompelen (10-15 ml). Schud 1 minuut op de wip.
    6. Vang de ethanol op, dompel het membraan onder in 1x overdrachtsbuffer (~15 ml) en schud nog eens 2 minuten.
      OPMERKING: Zowel ethanol als overdrachtsbuffer kunnen worden hergebruikt voor toekomstige dot-blotting-experimenten totdat sedimentatie ontstaat (verandering na zes keer gebruiken).
    7. Leg de stapel met transferbuffer doordrenkt filtreerpapier op een vlakke, beweegbare ondergrond, zoals een groot deksel, en druk plat met de roller. Plaats het PVDF-membraan op de stapel met behulp van een gelontgrendeler of een pincet.
    8. Leg een enkel vel droog filterpapier op het membraan en beweeg de roller over het filtreerpapier om overtollige buffer op het membraanoppervlak op te nemen. Verwijder het bovenste filterpapier zonder over het membraan te wrijven.
      LET OP: Methanol (klasse 3, subrisico 6.1) en ethanol (klasse 3) zijn gevaarlijk. Raadpleeg het veiligheidsinformatieblad (MSDS) voor aanbevelingen voor veilig gebruik.
  2. Monsterabsorptie naar het membraan
    1. Ontdooi de vezelmonsters, voer een korte centrifuge (5 s) uit bij kamertemperatuur zoals in stap 2.3.4 en meng het monster grondig.
    2. Zonder het membraan met de pipetpunt aan te raken, deponeert u langzaam een druppel van ~1 μL van elk monster op het membraan in het daarvoor bestemde gebied. De afmetingen van het aangewezen gebied per vezelmonster zijn ~1 cm x 1 cm. Probeer het monster in het midden van dit gebied te vinden.
    3. Laat de monsterdruppels minimaal 15 minuten door het membraan trekken. Zorg ervoor dat er geen monsterbuffer achterblijft en volledig wordt geabsorbeerd.
    4. Til het membraan met een plastic pincet voorzichtig van de vochtige stapel filterpapier, plaats het op een enkel droog vel filterpapier en dehydrateer het membraan gedurende ten minste 5 minuten.
    5. Zodra de monstervlekken helemaal wit worden, activeert u het membraan opnieuw.
  3. Reactivering en blokkering van het membraan
    1. Activeer het membraan opnieuw door stap 3.1.5 en 3.1.6 te herhalen.
    2. Plaats het membraan in de wasbuffer en spoel gedurende 5 minuten af met schommelen. Gooi de wasbuffer weg.
    3. Incubeer het membraan in de blokkeerbuffer gedurende 30 minuten tijdens het schommelen.
    4. Spoel het membraan 3x af met wasbuffer totdat de buffer niet meer troebel is.
    5. Laat het membraan in de laatste wasbeurt op de rocker.

4. Immuno-etikettering

  1. Detectie van MHCIIa
    1. Verdun het primaire MHCIIa-antilichaam met 1 op 200 in 10 ml Bovine Serum Albumine (BSA)-buffer.
    2. Gooi de wasbuffer van het membraan weg en giet vervolgens het verdunde MHCIIa-antilichaam op het membraan.
    3. Plaats de container (met het membraan in MHCIIa) op de wip bij kamertemperatuur gedurende 2 uur of bij 4 °C 's nachts.
    4. Verzamel het MHCIIa-antilichaam en bewaar het bij 4 °C. Was het membraan met blokkeerbuffer gedurende 2 minuten op de wip.
      OPMERKING: Alle primaire antilichamen kunnen tot vijf keer worden hergebruikt, zolang de buffer helder blijft.
    5. Spoel nog twee keer; 5 min per keer; Drie wasbeurten in totaal.
    6. Verdun het secundaire antilichaam van muizenimmunoglobuline G Mierikswortelperoxidase (IgG-HRP) met 1 op 20.000 in 10 ml blokkeerbuffer en voeg toe aan het membraan.
    7. Gooi de wasbuffer weg en incubeer het membraan in muis IgG-HRP secundair met schommelen gedurende 1 uur.
    8. Gooi de secundaire weg en was het membraan in de wasbuffer (2, 5, 5 min).
    9. Laat het membraan weken in de laatste wasbeurt tot het klaar is voor beeldvorming.
    10. Schakel de gelimager in, wacht 15 minuten totdat de imager de gewenste bedrijfstemperatuur heeft bereikt en open vervolgens de beeldvormingssoftware (zie Materiaaltabel).
    11. Klik in het softwarevenster op New Single Channel Protocol (Afbeelding 3A). Voor een witlichtbeeld van het membraan, onder Toepassingen | Vlekken | klik op Colorimetrisch (Figuur 3B).
    12. Klik op het gelgebied; Elke optie is geprogrammeerd voor specifieke afmetingen om te passen bij de grootte van verschillende geltypes. Selecteer de juiste optie die het beste past bij de afmetingen van het membraan (Figuur 3C).
    13. Bereid de ECL voor door luminol- en peroxidasereagentia te combineren in een verhouding van 1:1. Maak een voldoende volume ECL-mengsel om het hele membraan te bedekken, meestal is een totaal volume van 800-1.000 μL vereist.
    14. Plaats het membraan op een grote doorzichtige plastic bak en verdeel het ECL-mengsel over het membraan.
    15. Plaats het membraan op de beeldplaat.
    16. Klik op Position Gel (gele knop) voor een live cameraweergave. Klik op vasthouden en sleep de zoomknop om het beeldgebied van het membraan te maximaliseren. Maak nu indien nodig de positie van het membraan recht.
    17. Klik op Protocol uitvoeren (groene knop) en wacht tot een colorimetrisch beeld van het membraan is geproduceerd. Sla deze afbeelding op om te helpen bij het matchen van de punten met het bijbehorende vezelmonster.
    18. Zonder het membraan te verplaatsen, wijzigt u de toepassing op de software door op de optie voor een 2 x 2 binning (Chemi High Resolution) te klikken (Figuur 3D).
    19. Klik onder Beeldbelichting en software de belichtingstijd optimaliseren op Faint Bands (Figuur 3E) | Signaalaccumulatiemodus.
    20. Typ onder Setup 1 s voor de eerste afbeelding, 30 s voor de laatste afbeelding en 30 totale afbeeldingen (Afbeelding 3F).
    21. Klik op Protocol uitvoeren.
    22. Sla een afbeelding op in de volgende fasen: vóór signaalverzadiging (alle zichtbare stippen zijn zwart), initiële signaalverzadiging (sommige stippen beginnen te verzadigen) en oververzadigde vlekken (alle plekken met een sterk signaal gedetecteerd zijn verzadigd).
    23. Sla alle vereiste afbeeldingen op voordat u de signaalaccumulatie beëindigt. Haal het membraan uit de imager.
    24. Plaats het membraan met behulp van de gelvrijmaker terug in de container met de wasbuffer.
  2. Detectie van MHCI
    1. Giet de wasbuffer uit en behandel het membraan met stripbuffer gedurende 30 min op 37 °C (zorg ervoor dat het membraan volledig is ondergedompeld).
    2. Verzamel de stripbuffer en spoel het membraan in de wasbuffer gedurende 5 minuten met schommelen.
      NOTITIE: Stripbuffer kan 10x worden hergebruikt voordat deze wordt weggegooid.
    3. Giet de wasbuffer uit en breng deze keer MHCI primair antilichaam verdund aan met een startconcentratie van 1 op 200 (bereik: 1 op 200 tot 1 op 500). Schud het membraan gedurende 1 uur op kamertemperatuur.
    4. Na incubatie in het primaire MHCI-antilichaam, het antilichaam verzamelen en het membraan wassen zoals in de stappen 4.1.4 en 4.1.5.
    5. Verdun het secundaire IgM HRP-antilichaam van muizen in de blokkeerbuffer bij 1 op 20.000. Giet de blokkeerbuffer uit het membraan en incubeer in de muis IgM secundair zoals in stap 4.1.7.
    6. Wassen en vastleggen van beelden detecteerde MHCI zoals in de stappen 4.1.8 tot en met 4.1.24.
      LET OP: Stripbuffer bevat organofosfine 3-5% (klasse 8). Raadpleeg het MSDS voor aanbevelingen voor veilig gebruik.
  3. Detectie van potentiële MHCIIx met behulp van Actine
    1. Strip het membraan nogmaals (stappen 4.2.1 en 4.2.2).
    2. Herhaal rubriek 4.1, dit keer met het primaire antilichaam van Actine, verdund met 1 op 500 in de BSA-buffer en vervolgens het secundaire HRP-antilichaam van konijnen, verdund met 1 op 20.000 in de blokkeerbuffer.

5. Identificatie van het vezeltype

  1. MHCI-, MHCIIa- en Actine-signaalanalyse
    1. Raak vertrouwd met het signaalintensiteitspaneel (Figuur 4A). Noteer de stappen 5.1.2 tot en met 5.1.4.
    2. Een verzadigde signaalintensiteit geeft kwalitatief aan dat de eiwitdetectie sterk is.
    3. Een matig geeft aan dat het doeleiwit op een gemiddeld niveau aanwezig is.
    4. Een zwak signaal geeft aan dat er weinig doeleiwit aanwezig is.
    5. Gebruik het paneel met signaalintensiteit om vezels te categoriseren met een signaalintensiteit 'verzadigd', 'matig' of 'zwak' (Afbeelding 4A).
    6. Voer de identificatie van het vezeltype uit door eerst de MHCIIa- en MHCI-resultaten te vergelijken (Figuur 4B, linker en middelste vlekken).
    7. Neem vezels op met een verzadigde of matige signaalintensiteit van slechts één MHC-isovorm.
    8. Als het MHC-isovormsignaal 'zwak' is, laat de vezel dan ongemarkeerd (zie figuur 4B).
    9. Ten slotte, wanneer actine wordt waargenomen (matige of verzadigde signaalintensiteit) in de vezels zonder MHCI of IIa gedetecteerd, registreer het dan als een potentiële type IIx-vezel (Figuur 4B, rechter vlek).
    10. Registreer vezels met een zwak MHC-isovormsignaal, maar gedetecteerd actine (matige of verzadigde intensiteit) als niet-geïdentificeerd.
    11. Gooi monsters weg met zwakke of geen detectie (geen vezels verzameld) voor alle drie de doeleiwitten (Figuur 4C).
    12. Neem elke vezel op waar zowel MHCI- als MHCII-signalen worden gedetecteerd met een 'verzadigd' of matig signaal. Deze monsters zijn niet bedoeld voor gebruik in vezeltypespecifieke bereidingen.
  2. Bereiding van vezeltypespecifieke monsters
    1. Maak voor elke biopsie een afzonderlijk type I- en type II-monster. Combineer voor een type II-monster het minimaal vereiste aantal vezels (berekend in stap 2.1.5) waarin MHCIIa wordt gedetecteerd op verzadigde of matige niveaus.
    2. Herhaal dit proces in een aparte buis met het label type I voor vezels waarin MHCI wordt gedetecteerd (Figuur 4D).
    3. Gebruik vezels met een matige signaalintensiteit als er niet genoeg vezels zijn met verzadigde signalen.
    4. Combineer alle mogelijke IIx-vezels.
    5. Gebruik onmiddellijk vezeltypespecifieke monsters voor western blotting of bewaar ze bij -80 °C voor toekomstig gebruik.

6. Bevestiging van het type Western Blot-vezel

  1. Gebruik 10 μL van elk vezeltypespecifiek monster (het minimaal vereiste monstervolume, zie stap 2.1.5).
  2. Scheid monsters met behulp van de gespecificeerde prefab-gel via SDS-PAGE volgens het protocol van de fabrikant.
  3. Gebruik een gelimager om het eiwit in de gel te detecteren volgens het protocol van de fabrikant.
  4. Plaats de gel in een koude 1x transferbuffer gedurende 10 min.
  5. Breng de eiwitten nat over op een nitrocellulosemembraan van 0,45 μm (9,5 cm x 13,5 cm) volgens het protocol van de fabrikant.
  6. Spoel het membraan na het overbrengen kort af met ultrapuur H2O in een bakje. Giet het ultrapure water eruit.
  7. Voeg 10 ml antilichaamsignaalversterkeroplossing toe aan het membraan en rock bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten.
  8. Verzamel de antilichaamsignaalversterkeroplossing en was 5x (5 s per wasbeurt) met ultrapure H2O.
    OPMERKING: Antilichaamsignaalversterkeroplossing kan 5x worden gebruikt voordat deze wordt weggegooid.
  9. Giet de laatste was uit, voeg blokkeeroplossing toe en rock gedurende 1 uur op kamertemperatuur.
  10. Gebruik een schoon scalpelmesje of een schaar om horizontaal over het membraan te snijden met een molecuulgewicht dat ervoor zorgt dat eiwitten van 180 kDa en hoger zich op het bovenste gedeelte van het membraan bevinden.
  11. Gebruik dit bovenste gedeelte voor verdere bevestiging van het vezeltype.
  12. Gebruik de portie onder 180 kDa om verschillende doeleiwitten te detecteren.
  13. Volg rubriek 4.1 op het bovenste gedeelte van het membraan met MHCIIx primair en muizen immunoglobuline M (IgM) HRP-secundair antilichaam.
  14. Strip het membraan (zoals beschreven in de rubrieken 4.2.1 en 4.2.2) voordat u het proces herhaalt met MHCIIa IgG primair en muizen IgG HRP secundair antilichaam.
  15. Strip nogmaals en breng ten slotte MHCI IgM primair en muis IgM HRP secundair antilichaam aan.
    OPMERKING: Deze stap is kwalitatief en dus is eiwitverlies als gevolg van membraanstripping geen probleem.
  16. Vergelijk het signaal dat is gedetecteerd tussen de verschillende MHC-isovormen (zoals te zien is in figuur 5B). Wanneer de signaalintensiteit wordt gedetecteerd op matige tot verzadigde niveaus in het verwachte monster (MHCI - type I, MHCIIa - type II en MHCIIx - type IIx), zullen de vezeltype-specifieke monsters als betrouwbaar worden geregistreerd voor gebruik in toekomstige studies.
  17. Registreer het monster als onbetrouwbaar wanneer er meer dan één MHC-isovorm in gelijke mate in een monster wordt gedetecteerd.
    LET OP: Antilichaamversterkende oplossing bevat 50% natriumhydroxide. Raadpleeg MSDS voor aanbevelingen voor veilig gebruik.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Identificatie van individuele MHCI-, MHCIIa- en MHCIIx-spiervezels met behulp van dot blotting
Een kenmerk van MyDoBID is de categorisering van de variërende MHC- en Actine-signaalintensiteitssterkte in een bepaalde vezel (Figuur 4A). Het vezeltype werd geïdentificeerd door de aan- of afwezigheid van MHCI- en IIa-isovormen (Figuur 4B). Zes vezels vertoonden geen MHC- of actinedetectie, wat aangeeft dat er geen vezels waren verzameld. De resul...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Vezel inzameling
Op basis van enkele jaren ervaring kunnen de meeste onderzoekers deze techniek onder de knie krijgen; De praktijk leidt echter tot een snellere en efficiëntere vezelinzameling voor stroomafwaartse analyses. Om 30 enkelvoudige vezelsegmenten van een kwaliteit voor pooling te kunnen isoleren, wordt aanbevolen om 50 vezelsegmenten per monster te verzamelen. Het wordt aanbevolen om de video over het verzamelen van vezels zorgvuldig te bestuderen en na het uitvoeren van twee oefensessies (...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.

Dankbetuigingen

De antilichamen tegen MHC I (A4.840) en MHCIIa (A4.74) die in deze studie zijn gebruikt, zijn ontwikkeld door Dr. H. M. Blau en het antilichaam tegen MHCIIx (6H1) is ontwikkeld door Dr. C. A. Lucas en verkregen van de Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB), dankzij de auspiciën van het National Institute of Child Health and Human Development en onderhouden door de Universiteit van Iowa, Afdeling Biologische Wetenschappen (Iowa City, IA). We danken Victoria L. Wyckelsma voor het beschikbaar stellen van de menselijke spiermonsters voor dit onderzoek. Het merendeel van de afbeeldingen in figuur 1 is afkomstig van BioRender.com.

Financiering:
Deze studie ontving geen externe financiering.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1x Denaturing bufferMaak volgens receptDe bestanddelen kunnen worden verkregen bij Sigma-Aldrich of andere chemische distributeurs 1x denaturing buffer wordt gemaakt door 3x denaturing buffer 1 op 3 v/v te verdunnen met 1X Tris-HCl (pH 6.8). Bewaar bij -20 °C.
3x Denaturing bufferMaak volgens receptDe bestanddelen kunnen worden verkregen bij Sigma-Aldrich of andere chemische distributeurs3x denaturing buffer bevat: 0.125M Tris-HCI, 10% glycerol, 4% SDS, 4 M ureum, 10% 2-mercaptoethanol en 0.001% broomfenolblauw, pH 6.8.  Bewaar bij -20 °C.
95% EthanolN/A100% ethanol kan bij elk bedrijf worden verkregenVerdund tot 95% met ultra-puur H2O.
Actine konijn polyklonaal antilichaamSigma-Aldrich  A2066Verdun 1 op 1.000 met BSA-buffer.
Analytische weegschalenMettler ToledoModelnummer: MSZ042101
AntilichaamversterkerThermo Fischer Scientific32110Productnaam is Miser Antibody Extender Solution NC.
Beker (100 mL)N/AN/A
Centrifuge op tafelEppendorf5452Modelnaam: Mini Spin.
Blocking buffer: 5% Skim milk in Wash buffer.DiplomaIn de winkel gekocht
BSA-buffer: 1 % BSA/PBST, 0.02 % NaN3BSA: Sigma-Aldrich              PBS: Bio-Rad Laboratories. NaN3 : Sigma-Aldrich BSA: A6003-25G                         10x PBS: 1610780                       NaN3: S2002Rundserumalbumine (BSA), fosfaatgebufferd zoutoplossing (PBS) en natriumazid (NaN3). Bewaar bij 4 °C.
Hefboom voor cassetteopening Bio-Rad Laboratories4560000Wordt gebruikt om de cassettes van de voorgegoten gel te openen.
Chemidoc MP Imager Bio-Rad LaboratoriesModelnummer: Universal hood IIIElk beeldvormingssysteem met Stain-Free gelbeeldvormingsmogelijkheden.
Criterion blotterBio-Rad Laboratories1704070Inclusief ijspack, overdrachtsschaal, roller, 2 cassettehouders, filterpapier, schuimkussens en deksel met kabels.
Criterion Cell (Bio-Rad)Bio-Rad Laboratories1656001
ECL (verbeterde chemiluminescentie)Bio-Rad Laboratories1705062Productnaam: Clarity Max Western ECL Substrate.
Elektroforesebuffer 1x Tris Glycine SDS (TGS)Bio-Rad Laboratories1610772Verdun 10x TGS 1 op 10 met ultra-puur H2O.
Filterpapier, 0.34 mm dikWhatmann3030917Bulkgrootte 3 MM, pak 100 vellen, 315 x 335 mm.
Fijne weefselsessersDumontF6521-1EAJuwelierstang nr. 5.
Vlakke plastic schaal/deksel  N/AN/AGroot genoeg om de membraan op te plaatsen. Zorg ervoor dat het oppervlak volledig vlak is.
VriesdrogerLabconco7750030Freezone 4.5 L met glazen kamermonsterstap.
Vriezer -80 oC N/AN/AElke vriezer met een constante temperatuur van -80 °C is geschikt.
Gelontspanners1653320Bio-RadSchuif onder de membraan om de membraan te verzamelen of te verplaatsen.
Grijze potloodN/AN/A
 Image lab software Bio-Rad LaboratoriesN/AFiguren verwijzen naar softwareversie 5.2.1, maar andere versies kunnen worden gebruikt.
IncubatorBio-Rad Laboratories1660521Elke incubator die op 37 °C kan worden ingesteld, zou voldoende zijn.
LampN/AN/A
Magneetschuimer met vlooienN/AN/A
Membraanroller Bio-Rad Laboratories1651279Kan worden gekocht in het Transfer-bundelpakket. Als dit product echter niet beschikbaar is, zou elke gladde oppervlakte cilindrische buis die lang genoeg is om over de membraan te rollen, voldoende zijn. 
Microcentrifugebuisjes  (0.6 mL)N/AN/A
Muis IgG HRP secundairThermo Fisher Scientific31430Geit anti-muis IgG (H+L), RRID AB_228341. Verdun op 1 op 20.000 in blokkeerbuffer.
Muis IgM HRP secundairAbcamab97230Geit Anti-Muis IgM mu-keten. Gebruik bij dezelfde verdunning als muis IgG.
Myosine Heavy Chain I (MHCI) primaire antilichaamDSHBA4.840 Verdunningsbereik: 1 op 200 tot 1 op 500 in BSA-buffer.
Myosine Heavy Chain IIa (MHCIIa) primaire antilichaamDSHBA4.74 Verdunningsbereik: 1 op 200 tot 1 op 500 in BSA-buffer.
Myosine Heavy Chain IIx (MHCII

Referenties

  1. Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).
  2. Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), e35273(2012).
  3. Wyckelsma, V. L., et al. Cell specific differences in the protein abundances of GAPDH and Na(+),K(+)-ATPase in skeletal muscle from aged individuals. Experimental Gerontology. 75, 8-15 (2016).
  4. Morales-Scholz, M. G., et al. Muscle fiber type-specific autophagy responses following an overnight fast and mixed meal ingestion in human skeletal muscle. American Journal of Physiology Endocrinology and Metabolism. 323 (3), e242-e253 (2022).
  5. Tripp, T. R., et al. Time course and fibre type-dependent nature of calcium-handling protein responses to sprint interval exercise in human skeletal muscle. The Journal of Physiology. 600 (12), 2897-2917 (2022).
  6. Frankenberg, N. T., Mason, S. A., Wadley, G. D., Murphy, R. M. Skeletal muscle cell-specific differences in type 2 diabetes. Cellular and Molecular Life Sciences. 79 (5), 256(2022).
  7. Murphy, R. M., et al. Activation of skeletal muscle calpain-3 by eccentric exercise in humans does not result in its translocation to the nucleus or cytosol. Journal of Applied Physiology. 111 (5), 1448-1458 (2011).
  8. Murphy, R. M. Enhanced technique to measure proteins in single segments of human skeletal muscle fibers: fiber-type dependence of AMPK-alpha1 and -beta1. Journal of Applied Physiology. 110 (3), 820-825 (2011).
  9. Christiansen, D., et al. A fast, reliable and sample-sparing method to identify fibre types of single muscle fibres. Scientific Reports. 9 (1), 6473(2019).
  10. Skelly, L. E., et al. Human skeletal muscle fiber type-specific responses to sprint interval and moderate-intensity continuous exercise: acute and training-induced changes. Journal of Applied Physiology. 130 (4), 1001-1014 (2021).
  11. Bergstrom, J. Muscle electrolytes in man. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation. (SUPPL. 68), 1-110 (1962).
  12. Evans, W. J., Phinney, S. D., Young, V. R. Suction applied to a muscle biopsy maximizes sample size. Medicine & Science in Sports & Exercise. 14 (1), 101-102 (1982).
  13. Wyckelsma, V. L., et al. Preservation of skeletal muscle mitochondrial content in older adults: relationship between mitochondria, fibre type and high-intensity exercise training. The Journal of Physiology. 595 (11), 3345-3359 (2017).
  14. Bortolotto, S. K., Stephenson, D. G., Stephenson, G. M. Fiber type populations and Ca2+-activation properties of single fibers in soleus muscles from SHR and WKY rats. American Journal of Physiology Cell Physiology. 276 (3), C628-C637 (1999).
  15. Murphy, R. M., Lamb, G. D. Important considerations for protein analyses using antibody based techniques: down-sizing Western blotting up-sizes outcomes. The Journal of Physiology. 591 (23), 5823-5831 (2013).
  16. Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains. Biochemical and Biophysical Research Communications. 272 (1), 303-308 (2000).
  17. MacInnis, M. J., et al. Superior mitochondrial adaptations in human skeletal muscle after interval compared to continuous single-leg cycling matched for total work. The Journal of Physiology. 595 (9), 2955-2968 (2017).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Tags

SkeletspiervezelsMyosine zware ketenDot blottingType I-vezelsType II-vezelsType IIx-vezelsWestern blottingSDS-PAGEIsolatie van spiervezels
Vezeltype-identificatie van menselijke skeletspieren
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.