Vezeltype-identificatie van menselijke skeletspieren

Samenvatting

Dit protocol demonstreert isolatie van één vezel uit gevriesdroogde menselijke skeletspier- en vezeltypeclassificatie volgens Myosin heavy chain (MHC) isovorm met behulp van de dot blotting-techniek. Geïdentificeerde MHC I- en II-vezelmonsters kunnen vervolgens verder worden geanalyseerd op vezeltype-specifieke verschillen in eiwitexpressie met behulp van western blotting.

Samenvatting

De hier beschreven techniek kan worden gebruikt om specifieke myosine heavy chain (MHC) isovormen in segmenten van individuele spiervezels te identificeren met behulp van dot blotting, hierna aangeduid als Myosin heavy chain detection by Dot Blotting for IDentification of muscle fiber type (MyDoBID). Dit protocol beschrijft het proces van het vriesdrogen van menselijke skeletspieren en het isoleren van segmenten van afzonderlijke spiervezels. Met behulp van MyDoBID worden type I- en II-vezels geclassificeerd met respectievelijk MHCI- en IIa-specifieke antilichamen. Geclassificeerde vezels worden vervolgens gecombineerd tot vezeltypespecifieke monsters voor elke biopsie.

Het totale eiwit in elk monster wordt bepaald door natriumdodecylsulfaatpolyacrylamidegelelektroforese (SDS-PAGE) en UV-geactiveerde geltechnologie. Het vezeltype van monsters wordt gevalideerd met behulp van western blotting. Het belang van het uitvoeren van normalisatie van de eiwitbelasting om de detectie van doeleiwitten in meerdere westernvlekken te verbeteren, wordt ook beschreven. De voordelen van het consolideren van geclassificeerde vezels in vezeltypespecifieke monsters in vergelijking met westernblots met één vezel, zijn onder meer de veelzijdigheid van monsters, een grotere doorvoer van monsters, een kortere tijdsinvestering en kostenbesparende maatregelen, en dat alles met behoud van waardevolle vezeltypespecifieke informatie die vaak over het hoofd wordt gezien met behulp van gehomogeniseerde spiermonsters. Het doel van het protocol is om nauwkeurige en efficiënte identificatie te bereiken van type I- en type II-vezels geïsoleerd uit gevriesdroogde menselijke skeletspiermonsters.

Deze individuele vezels worden vervolgens gecombineerd om type I en type II vezeltype-specifieke monsters te creëren. Bovendien wordt het protocol uitgebreid met de identificatie van type IIx-vezels, waarbij actine wordt gebruikt als marker voor vezels die negatief waren voor MHCI en MHCIIa, die worden bevestigd als IIx-vezels door western blotting. Elk vezeltype-specifiek monster wordt vervolgens gebruikt om de expressie van verschillende doeleiwitten te kwantificeren met behulp van western blotting-technieken.

Inleiding

Skeletspieren zijn een heterogeen weefsel, met verschillende cellulaire metabole en contractiele eigenschappen die afhankelijk zijn van het feit of de cel (vezel) langzame spiertrekkingen (type I) of snelle spiertrekkingen (type II) is. Het vezeltype kan worden geïdentificeerd door de myosine zware keten (MHC) isovormen te onderzoeken, die op verschillende manieren van elkaar verschillen, waaronder contractietijd, snelheid van verkorting en vermoeidheidsweerstand¹. De belangrijkste MHC-isovormen zijn type I, type IIa, type IIb en type IIx en hun metabole profielen zijn oxidatief (type I en IIa) of glycolytisch (IIx, IIb)¹

Protocol

Menselijke spiermonsters werden verkregen uit de vastus lateralis van n = 3 (2 mannen, 1 vrouw), in de leeftijd van 70-74 jaar oud onder steriele omstandigheden met behulp van lokale anesthesie (xylocaïne) en een Bergstrom-naald aangepast voor handmatige afzuiging^11,12. De monsters waren een subset van een eerdere studie die was goedgekeurd door de Victoria University Human Research Ethics Committee (HRETH11/221) en uitgevoerd in overeenstemming met de Verklaring van Helsinki¹³. Deelnemers gaven schriftelijke, geïnformeerde toestemming om deel te nemen aan dit onderzoek. Volled....

Resultaten

Identificatie van individuele MHCI-, MHCIIa- en MHCIIx-spiervezels met behulp van dot blotting
Een kenmerk van MyDoBID is de categorisering van de variërende MHC- en Actine-signaalintensiteitssterkte in een bepaalde vezel (Figuur 4A). Het vezeltype werd geïdentificeerd door de aan- of afwezigheid van MHCI- en IIa-isovormen (Figuur 4B). Zes vezels vertoonden geen MHC- of actinedetectie, wat aangeeft dat er geen vezels waren verzameld. De resul.......

Discussie

Vezel inzameling
Op basis van enkele jaren ervaring kunnen de meeste onderzoekers deze techniek onder de knie krijgen; De praktijk leidt echter tot een snellere en efficiëntere vezelinzameling voor stroomafwaartse analyses. Om 30 enkelvoudige vezelsegmenten van een kwaliteit voor pooling te kunnen isoleren, wordt aanbevolen om 50 vezelsegmenten per monster te verzamelen. Het wordt aanbevolen om de video over het verzamelen van vezels zorgvuldig te bestuderen en na het uitvoeren van twee oefensessies (.......

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
1x Denaturing buffer	Maak volgens recept	De bestanddelen kunnen worden verkregen bij Sigma-Aldrich of andere chemische distributeurs	1x denaturing buffer wordt gemaakt door 3x denaturing buffer 1 op 3 v/v te verdunnen met 1X Tris-HCl (pH 6.8). Bewaar bij -20 °C.
3x Denaturing buffer	Maak volgens recept	De bestanddelen kunnen worden verkregen bij Sigma-Aldrich of andere chemische distributeurs	3x denaturing buffer bevat: 0.125M Tris-HCI, 10% glycerol, 4% SDS, 4 M ureum, 10% 2-mercaptoethanol en 0.001% broomfenolblauw, pH 6.8.  Bewaar bij -20 °C.
95% Ethanol	N/A	100% ethanol kan bij elk bedrijf worden verkregen	Verdund tot 95% met ultra-puur H2O.
Actine konijn polyklonaal antilichaam	Sigma-Aldrich	A2066	Verdun 1 op 1.000 met BSA-buffer.
Analytische weegschalen	Mettler Toledo	Modelnummer: MSZ042101
Antilichaamversterker	Thermo Fischer Scientific	32110	Productnaam is Miser Antibody Extender Solution NC.
Beker (100 mL)	N/A	N/A
Centrifuge op tafel	Eppendorf	5452	Modelnaam: Mini Spin.
Blocking buffer: 5% Skim milk in Wash buffer.	Diploma	In de winkel gekocht
BSA-buffer: 1 % BSA/PBST, 0.02 % NaN3	BSA: Sigma-Aldrich              PBS: Bio-Rad Laboratories. NaN3 : Sigma-Aldrich	BSA: A6003-25G                         10x PBS: 1610780                       NaN3: S2002	Rundserumalbumine (BSA), fosfaatgebufferd zoutoplossing (PBS) en natriumazid (NaN3). Bewaar bij 4 °C.
Hefboom voor cassetteopening	Bio-Rad Laboratories	4560000	Wordt gebruikt om de cassettes van de voorgegoten gel te openen.
Chemidoc MP Imager	Bio-Rad Laboratories	Modelnummer: Universal hood III	Elk beeldvormingssysteem met Stain-Free gelbeeldvormingsmogelijkheden.
Criterion blotter	Bio-Rad Laboratories	1704070	Inclusief ijspack, overdrachtsschaal, roller, 2 cassettehouders, filterpapier, schuimkussens en deksel met kabels.
Criterion Cell (Bio-Rad)	Bio-Rad Laboratories	1656001
ECL (verbeterde chemiluminescentie)	Bio-Rad Laboratories	1705062	Productnaam: Clarity Max Western ECL Substrate.
Elektroforesebuffer 1x Tris Glycine SDS (TGS)	Bio-Rad Laboratories	1610772	Verdun 10x TGS 1 op 10 met ultra-puur H2O.
Filterpapier, 0.34 mm dik	Whatmann	3030917	Bulkgrootte 3 MM, pak 100 vellen, 315 x 335 mm.
Fijne weefselsessers	Dumont	F6521-1EA	Juwelierstang nr. 5.
Vlakke plastic schaal/deksel	N/A	N/A	Groot genoeg om de membraan op te plaatsen. Zorg ervoor dat het oppervlak volledig vlak is.
Vriesdroger	Labconco	7750030	Freezone 4.5 L met glazen kamermonsterstap.
Vriezer -80 oC	N/A	N/A	Elke vriezer met een constante temperatuur van -80 °C is geschikt.
Gelontspanners	1653320	Bio-Rad	Schuif onder de membraan om de membraan te verzamelen of te verplaatsen.
Grijze potlood	N/A	N/A
Image lab software	Bio-Rad Laboratories	N/A	Figuren verwijzen naar softwareversie 5.2.1, maar andere versies kunnen worden gebruikt.
Incubator	Bio-Rad Laboratories	1660521	Elke incubator die op 37 °C kan worden ingesteld, zou voldoende zijn.
Lamp	N/A	N/A
Magneetschuimer met vlooien	N/A	N/A
Membraanroller	Bio-Rad Laboratories	1651279	Kan worden gekocht in het Transfer-bundelpakket. Als dit product echter niet beschikbaar is, zou elke gladde oppervlakte cilindrische buis die lang genoeg is om over de membraan te rollen, voldoende zijn.
Microcentrifugebuisjes  (0.6 mL)	N/A	N/A
Muis IgG HRP secundair	Thermo Fisher Scientific	31430	Geit anti-muis IgG (H+L), RRID AB_228341. Verdun op 1 op 20.000 in blokkeerbuffer.
Muis IgM HRP secundair	Abcam	ab97230	Geit Anti-Muis IgM mu-keten. Gebruik bij dezelfde verdunning als muis IgG.
Myosine Heavy Chain I (MHCI) primaire antilichaam	DSHB	A4.840	Verdunningsbereik: 1 op 200 tot 1 op 500 in BSA-buffer.
Myosine Heavy Chain IIa (MHCIIa) primaire antilichaam	DSHB	A4.74	Verdunningsbereik: 1 op 200 tot 1 op 500 in BSA-buffer.
Myosine Heavy Chain IIx (MHCII