Beoordeling van het zuurstofverbruik levert integrale informatie op over de mitochondriale functie. Met behulp van een fosforescerende sonde met een fluorescerende plaatlezer kunnen nauwkeurige en reproduceerbare gegevens eenvoudig worden verkregen zonder gespecialiseerde apparatuur. Met deze test kan elk laboratorium het zuurstofverbruik van geïsoleerde mitochondriën meten en de ademhalingscontroleratio's berekenen.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Beoordeling van mitochondriaal zuurstofverbruik met behulp van een op plaatlezers gebaseerde fluorescerende test
In dit artikel
Erratum-melding
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Samenvatting
Samenvatting
Mitochondriën hebben veel belangrijke functies, waaronder cellulaire ademhaling, ATP-productie, het beheersen van apoptose en het fungeren als een centraal knooppunt van metabole routes. Daarom kan het experimenteel beoordelen van de mitochondriale functionaliteit inzicht geven in variaties tussen verschillende populaties of ziektetoestanden. Daarnaast is het waardevol om te beoordelen of geïsoleerde mitochondriën gezond genoeg zijn om door te gaan met experimenten. Een kenmerk dat vaak wordt gebruikt om de mitochondriale functie in verschillende monsters te vergelijken, is de snelheid van het zuurstofverbruik. Zuurstofverbruik en de daaropvolgende berekening van de ademhalingscontroleverhouding in intacte cellen of mitochondriën geïsoleerd uit weefsel kunnen alle drie de doelen dienen. Met behulp van mitochondriën geïsoleerd uit de levers van borstelhagedissen in combinatie met een fosforescerende sonde die gevoelig is voor de fluctuaties in de zuurstofconcentratie van een oplossing, hebben we het zuurstofverbruik gemeten met behulp van een fluorescerende plaatlezer. Deze methode is niet alleen snel en efficiënt, maar kan ook worden uitgevoerd met een kleine hoeveelheid mitochondriën en zonder dat er gespecialiseerde apparatuur nodig is. Het hier beschreven stap-voor-stap protocol vergroot de toegankelijkheid van mitochondriale functionele beoordeling voor onderzoekers.
Inleiding
Mitochondriën zijn organellen, ongeveer zo groot als bacteriën, die worden aangetroffen in eukaryote cellen. Het zijn unieke organellen omdat ze DNA bevatten en twee membranen hebben, een buitenste en een binnenste. De buitenste en binnenste membranen van mitochondriën worden gescheiden door een intermembraanruimte en het binnenste membraan vouwt zich in structuren die cristae worden genoemd rond het binnenste compartiment, de matrix genaamd. Deze cristae vergroten het oppervlak van het binnenmembraan, zodat meerdere processen die de cristae gebruiken tegelijkertijd kunnen plaatsvinden. Hoewel mitochondriën betrokken zijn bij veel cellulaire functies, zoals het beheersen van apoptose en het huisvesten van meerdere metabole routes, is hun vitale rol bij de productie van ATP essentieel voor het overleven van cellen. In feite is 90% van de energie van een cel afkomstig van mitochondriën1. ATP-productie omvat het genereren van een elektrochemisch verschil tussen de buitenste en binnenste membranen, het mitochondriale membraanpotentiaal (Δψ) genoemd, dat ontstaat wanneer H+- ionen uit de matrix in de intermembraanruimte worden gepompt. ATP-productie wordt uiteindelijk benut tijdens de oxidatie van reducerende equivalenten via elektronenbeweging door de mitochondriale ademhalingsketen (ETC). De uiteindelijke elektronenacceptor is moleculaire zuurstof (O2). Naarmate zuurstof wordt verbruikt, bouwt het H+ -concentratieverschil zich op tot zijn maximum, waarna H+ -ionen hun concentratiegradiënt van de intermembraanruimte naar de matrix afdalen door door het ATP-synthasecomplex te gaan. De beweging van H+- ionen veroorzaakt een conformationele verandering in ATP-synthase en ADP wordt in de buurt van anorganisch fosfaat gebracht om te reageren en ATP te genereren. Ten slotte wordt ATP uit de mitochondriale matrix naar het cytosol getransloceerd en kan het worden opgeslagen of gebruikt om reacties te vergemakkelijken vanwege de grote hoeveelheid vrije energie die vrijkomt tijdens de hydrolyse van de fosfaten. Dit hele proces wordt oxidatieve fosforylering genoemd, en aangezien zuurstof wordt verbruikt, wordt gezegd dat mitochondriën2 ademen.
De opbouw en sterkte van Δψ, de verminderde hoeveelheid O2 (zuurstofverbruik genoemd) en het genereren van ATP kunnen allemaal worden gebruikt als indicaties voor de gezondheid van de cellen. Mitochondriale functionele studies, zoals het meten van Δψ, het totale ATP-gehalte en de totale ATP-productie, en het zuurstofverbruik, kunnen worden gekwantificeerd met behulp van traditionele biochemische methoden of fluorescentie en luminescentie in plaatgebaseerde testen. Het mitochondriale membraanpotentieel kan bijvoorbeeld worden vergeleken tussen verschillende monsters met behulp van fluorescerende kleurstoffen zoals tetramethylrhodamine-ethylester, dat specifiek aan mitochondriën bindt. ATP-generatie kan worden gecontroleerd door een lichtgevend eiwit toe te voegen aan een reactie waarvan de veranderingen correleren met de ATP-concentratie. Kwantificering van het zuurstofverbruik, of absolute ademhalingsfrequenties, tijdens OXPHOS, kan helpen de oorzaken van verschillen in mitochondriale functie en energiemetabolisme op te helderen. Beoordeling van het zuurstofverbruik kan worden gebruikt om ademhalingscontroleratio's (RCR's) te berekenen. RCR-waarden beschrijven het vermogen van mitochondriën om ATP te maken als reactie op de instroom van ADP, wat de belangrijkste functie van mitochondriën is. RCR-waarden geven de algehele toestand van geïsoleerde mitochondriën aan en maken het mogelijk om de respons op verschillende experimentele behandelingen te vergelijken. Verschillen in RCR-waarden kunnen mitochondriale disfunctie vertegenwoordigen of wijzen op een biologisch verschil tussen verschillende mitochondriën geïsoleerd uit twee of meer bronnen. Een andere belangrijke maatstaf voor de functie in geïsoleerde mitochondriën is de mitochondriale efficiëntie, gedefinieerd als mol ATP gesynthetiseerd per mol van O2, of de P/O-verhouding3.
Gezien de hoeveelheid informatie die kan worden verzameld door het meten van mitochondriale parameters en verschillende gevallen waarin deze informatie kan worden gebruikt, kan het vermogen om efficiënt functionele gegevens te verzamelen nuttig zijn in veel verschillende onderzoeksgebieden. Mitochondriale zuurstofverbruiksmetingen worden al tientallen jaren uitgevoerd met zeer specifieke instrumenten - met behulp van een Clark-elektrode, die kan worden beperkt door de steekproefomvang die nodig is om metingen uit te voeren, en meer recentelijk, geavanceerde instrumenten die mitochondriale ademhaling en meerdere andere parameters kunnen meten, maar onbetaalbaar kunnen zijn. Dit protocol is een aangepaste alternatieve aanpak waarbij gebruik wordt gemaakt van een zuurstofgevoelige fosforescerende sonde (MitoXpress)4,5. Het sondesignaal wordt gedetecteerd met een plaatlezer in tijdopgeloste fluorescentiemodus voor continue metingen in de tijd. Fosforescentie heeft een groter energieverschil tussen het geabsorbeerde en uitgezonden foton in vergelijking met fluorescentie en is daarom beter geschikt voor het continu monitoren van signaalveranderingen. Dit stelt bijna elk laboratorium in staat om deze metingen uit te voeren, niet alleen degenen die zich richten op het mitochondriale metabolisme of die zich zeer gespecialiseerde apparatuur kunnen veroorloven. Het modelsysteem dat we gebruiken is geïsoleerde mitochondriën van drie boomhagedissen, twee oudersoorten en één introgressief (met nucleair DNA van de ene oudersoort en mitochondriën van de andere - hybriden). Deze hagedissen werden gekozen omdat we veronderstelden dat er metabolische en energetische gevolgen zijn voor hybriden met verschillende nucleaire en mitochondriale DNA-bronnen. We hebben gebruik gemaakt van een in de handel verkrijgbare testkit met een multi-mode plaatlezer die de toegang tot dit type test voor meer onderzoekers en onderzoeksgebieden kan vergroten.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Hagedissen werden geëuthanaseerd door CO2 -verstikking, gevolgd door onmiddellijke onthoofding in overeenstemming met het beleid van het Office of Animal Laboratory Welfare en de richtlijnen van Elon's Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Isolatie van mitochondriën6
NOTITIE: Houd alle oplossingen koud (tabel 1) en monsters op ijs tijdens deze stappen.
- Verwijder de lever, weeg deze en spoel deze vervolgens af met ~3 ml ijskoude fosfaatgebufferde zoutoplossing (1x, -/-).
- Hak de lever fijn in 1 ml L-MIB met een vers scheermesje.
- Breng het totale volume weefsel plus L-MIB op 2 ml en verstoor de levercellen mechanisch gedurende vier passages met een Dounce-homogenisator.
- Centrifugeer het homogenaat op 300 × g (37 °C, 10 min).
- Breng het bovenstaande over in een nieuwe buis en plaats het op ijs.
- Resuspendeer de pellet in 2 ml L-MIB, homogeniseer opnieuw en draai opnieuw bij 300 × g (37 °C, 10 minuten).
- Combineer de supernatanten van zowel centrifugeren als centrifugeren bij 10.000 × g (37 °C, 10 min).
- Resuspendeer de pellet in ~0,350 ml L-MIB.
- Bepaal de hoeveelheid totaal eiwit (mg mitochondriën/ml L-MIB) die moet worden gebruikt als benadering voor het mitochondriale gehalte 4,5,6.
2. Zuurstofverbruik
- Verwarm alle gebruikte oplossingen (tabel 1) in de volgende stappen voor tot 30 °C in een waterbad.
- Verdun de mitochondriën in LEB tot 6 mg/ml op basis van de resultaten van de eiwitconcentratietest in stap 1.9.
- Stel de test op in een steriele zwartwandige, doorzichtige bodemplaat met 96 putjes (tabel 2).
- Voeg 50 μl van het monster (L-EB-buffer of mitochondriënmonster) toe aan de desbetreffende putjes.
- Voeg 50 μL behandeling toe (L-EB, Glutamaat/Malaat of Glutamaat/Malaat w/ADP).
- Verdun de sondevoorraad 1:10 in L-EB en voeg vervolgens 100 μL van de fluorescerende sonde toe aan elk putje.
- Voeg voorzichtig 50 μL zware minerale olie toe aan elk putje om zuurstof uit de omgeving uit te sluiten.
- Lees fluorescerende metingen af vanaf de onderkant van de plaat bij 380/650 nm excitatie/emissie elke 1,5 minuut gedurende 45 minuten. Gebruik de kinetische modus met een vertraging van 30.000 μs en een meetvenster van 100 μs.
3. Gegevensanalyse
- Exporteer het bestand met onbewerkte gegevens van de plaatlezer als een .xls bestand.
- Open het bestand, kopieer en plak de onbewerkte gegevens in een nieuw tabblad en label de rijen en kolommen op de juiste manier.
- Zet de L-EB-buffer alleen uit op het controlemonster en L-EB + G/M als relatieve fluorescerende eenheden (RFU) versus tijd.
OPMERKING: Deze lijnen moeten relatief vlak zijn omdat er geen mitochondriën aanwezig zijn en daarom mag er geen verandering in de zuurstofconcentratie worden gedetecteerd. - Zet de L-EB + G/M-voorbeeldwaarden uit als RFU versus tijd.
- Bepaal waar de metingen consistenter worden en afvlakken voor de bedieningselementen.
OPMERKING: Dit is waar de gegevensanalyse voor experimentele monsters moet beginnen (gemarkeerd met pijlen in figuur 1A). Het kan 10-15 minuten duren voordat reacties zijn afgevlakt en hun maximum hebben bereikt. - Maak een nieuwe grafiek die alleen de gegevens bevat na het tijdstip dat is vastgesteld in stap 3.5 (de zogenaamde "bijgesneden" gegevens) en voeg de best passende lijn toe om de onbewerkte gegevens te visualiseren die moeten worden geanalyseerd.
- Bereken de gemiddelde RFU-waarde van de bijgesneden gegevens van de besturingsbuffer (geel gemarkeerd). Deze waarde wordt gebruikt als de minimale RFU-waarde als basislijn in de zuurstofberekening hieronder.
- Berekening van het zuurstofverbruik (μM O2/min)
- Kopieer en plak het lineaire gebied van de onbewerkte gegevens uit stap 3.6 (d.w.z. de bijgesneden gegevens) om de zuurstofconcentratie in de mitochondriale monsters te bepalen in G/M + ADP-behandeling op elk tijdstip 7,8,9,10.
- Gebruik vergelijking (1)5 om de zuurstofconcentratie op elk tijdstip te bepalen. [O2]a is de zuurstofconcentratie in met lucht verzadigde buffer (235 mM bij 30 °C). I(t), Ia en Io zijn respectievelijk het fluorescerende signaal van het monster + sonde op tijdstip t (bijv. monster + G/M + ADP), het gemiddelde signaal van de sonde in met lucht verzadigde buffer berekend in stap 3.7, en het maximale signaal in zuurstofarme buffer (ingesteld op het maximaal haalbare signaal).
(1) - Zet de [O2]t-waarden berekend in stap 3.8.2 uit tegen de tijd en voeg een lineaire trendlijn toe samen met de vergelijking van de best passende lijn.
OPMERKING: Gebruik de helling van elke lijn als het zuurstofverbruik. Duplicaten of drievouden voor elke steekproef kunnen worden samengevoegd en gebruikt voor de vergelijking van de consumptiesnelheid.
- Bereken de RCR door de mitochondriale ademhaling met en zonder ADP te delen, die respectievelijk de toestanden 3 en 2 vertegenwoordigen.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Het zuurstofverbruik en de mitochondriale RCR werden bepaald aan de hand van de mitochondriën van drie verschillende hagedissen met behulp van een testkit met een fosforescerende zuurstofgevoelige sonde en een standaard fluorescentieplaatlezer. Eerder onderzoek heeft aangetoond dat de sonde in deze kit rechtstreeks correleert met zuurstofverbruik, waarbij fosforescentie wordt geblust door moleculaire zuurstof en het fluorescerende signaal toeneemt naarmate het zuurstofgehalte daalt als g...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Het meten van de mitochondriale functie is nuttig bij het vergelijken van verschillende monsters, zoals ziekte- versus niet-ziektetoestanden, verschillende weefseltypen van hetzelfde dier of tussen verschillende monstertypen. We gebruikten de latere vergelijking om onze hypothese te testen dat er een metabolisch gevolg is voor hybride boomhagedissen die mitochondriën hebben geïntroduceerd. Er zijn verschillende manieren om de mitochondriënfunctie experimenteel vast te stellen, waaronder ...
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben geen belangenconflicten te melden.
Dankbetuigingen
Dit onderzoek werd gefinancierd door NSF CHE-1229562 (VDGM) en subsidies van de Facultaire Onderzoeks- en Ontwikkelingscommissie (VDGM en GH) van Elon University en het Undergraduate Research Program (AJ).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| 96-well black/optical bottom plates | Thermo Fisher | 265301 | Onbehandelde zwarte wandplaten met heldere bodems. |
| ADP | Sigma | A2754 | Verdun 100 µM voorraad met EB onmiddellijk voor gebruik. |
| BSA | Thermo Fisher | BP1600-100 | Maak 2 mg/mL voorraad in water voor eiwittest. |
| Dulbeccos 1x PBS (-/-) | Sigma | D8537 | Zorg ervoor dat de PBS vrij is van Mg2+ of Ca2+ ionen. |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| K2HPO4 | Sigma | P3786 | |
| KH2PO4 | Sigma | P0662 | |
| L-glutamic acid | Sigma | G1251 | |
| L-glutamic acid potassium salt | Sigma | S372226 | |
| L-malic acid | Sigma | M8304 | |
| L-malic acid mono-potassium salt | Sigma | 49601 | |
| MitoXpress oxygen consumption kit | Agilent | MX-200-4 | Kit bevat sondevoorraad en HS minerale olie. |
| MOPS | Sigma | M3183 | |
| Protien Assay Dye (5x) | BioRad | 500-0006 | Elke eiwittest kan worden vervangen. |
| R version 3.3 | R Core Development Team 2016 | ||
| Thermomax microplate reader EnSpire Multi-mode Plate reader and software | PerkinElmer | Standaard fluorescerende plate-reader | |
| Trisma base | Sigma | T6066 | Elke versie van Tris base kan worden gebruikt. |
Referenties
- Drew, B., Leeuwenburgh, C. Method for measuring ATP production in isolated mitochondria: ATP production in brain and liver mitochondria of Fischer-344 rats with age and caloric restriction. American Journal of Physiology-Regulatory, Integrative andComparative Physiology. 285 (5), R1259-R1267 (2003).
- Ballard, J. W. O., Pichaud, N. Mitochondrial DNA: more than an evolutionary bystander. Functional Ecology. 28 (1), 218-231 (2014).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 437 (3), 575-575 (2011).
- Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes. Nature Protocols. 1 (6), 2563-2572 (2006).
- Hynes, J., et al. Investigation of drug-induced mitochondrial toxicity using fluorescence-based oxygen-sensitive probes. Toxicological Sciences. 92 (1), 186-200 (2006).
- Lampl, T., Crum, J. A., Davis, T. A., Milligan, C., Del Gaizo Moore, V. Isolation and functional analysis of mitochondria from cultured cells and mouse tissue. Journal of Visualized Experiments. (97), 52076(2015).
- Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle, and cultured fibroblasts. Nature Protocols. 2 (2), 287-295 (2007).
- Dunn, D. A., Pinkert, C. A. Nuclear expression of a mitochondrial DNA gene: mitochondrial targeting of allotopically expressed mutant ATP6 in transgenic mice. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2012, 1-7 (2012).
- Irwin, R. W., et al. Medroxyprogesterone acetate antagonizes estrogen up-regulation of brain mitochondrial function. Endocrinology. 152 (2), 556-567 (2011).
- Ma, D., et al. Cancer cell mitochondria targeting by pancratistatin analogs is dependent on functional complex II and III. Scientific Reports. 7 (1), 42957(2017).
- Lakowicz, J. R. Principles of fluorescence spectroscopy. , Springer. New York. (2006).
- Haenel, G. J., Del Gaizo Moore, V. Functional divergence of mitochondria and coevolution of genomes: cool mitochondria in hot Llzards. Physiological and Biochemical Zoology. 91 (5), 1068-1081 (2018).
- Vinsant, S., et al. Characterization of early pathogenesis in the SOD1 G93A mouse model of ALS: part I, background and methods. Brain and Behavior. 3 (4), 335-350 (2013).
- Del Gaizo Moore, V., et al. Chronic lymphocytic leukemia requires BCL2 to sequester prodeath BIM, explaining sensitivity to BCL2 antagonist ABT-737. Journal of Clinical Investigation. 117 (1), 112-121 (2007).
- Chonghaile, T. N., et al. Pretreatment mitochondrial priming correlates with clinical response to cytotoxic chemotherapy. Science. 334 (6059), 1129-1133 (2011).
- Del Gaizo, V., MacKenzie, J. A., Payne, R. M. Targeting proteins to mitochondria using TAT. Molecular Genetics and Metabolism. 80 (1-2), 170-180 (2003).
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
Erratum
Formal Correction: Erratum: Assessment of Mitochondrial Oxygen Consumption Using a Plate Reader-based Fluorescent Assay
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.
This corrects the article 10.3791/65760
Dit artikel is gepubliceerd
Video binnenkort beschikbaar