Beoordeling van mitochondriaal zuurstofverbruik met behulp van een op plaatlezers gebaseerde fluorescerende test

Summary

Beoordeling van het zuurstofverbruik levert integrale informatie op over de mitochondriale functie. Met behulp van een fosforescerende sonde met een fluorescerende plaatlezer kunnen nauwkeurige en reproduceerbare gegevens eenvoudig worden verkregen zonder gespecialiseerde apparatuur. Met deze test kan elk laboratorium het zuurstofverbruik van geïsoleerde mitochondriën meten en de ademhalingscontroleratio's berekenen.

Abstract

Mitochondriën hebben veel belangrijke functies, waaronder cellulaire ademhaling, ATP-productie, het beheersen van apoptose en het fungeren als een centraal knooppunt van metabole routes. Daarom kan het experimenteel beoordelen van de mitochondriale functionaliteit inzicht geven in variaties tussen verschillende populaties of ziektetoestanden. Daarnaast is het waardevol om te beoordelen of geïsoleerde mitochondriën gezond genoeg zijn om door te gaan met experimenten. Een kenmerk dat vaak wordt gebruikt om de mitochondriale functie in verschillende monsters te vergelijken, is de snelheid van het zuurstofverbruik. Zuurstofverbruik en de daaropvolgende berekening van de ademhalingscontroleverhouding in intacte cellen of mitochondriën geïsoleerd uit weefsel kunnen alle drie de doelen dienen. Met behulp van mitochondriën geïsoleerd uit de levers van borstelhagedissen in combinatie met een fosforescerende sonde die gevoelig is voor de fluctuaties in de zuurstofconcentratie van een oplossing, hebben we het zuurstofverbruik gemeten met behulp van een fluorescerende plaatlezer. Deze methode is niet alleen snel en efficiënt, maar kan ook worden uitgevoerd met een kleine hoeveelheid mitochondriën en zonder dat er gespecialiseerde apparatuur nodig is. Het hier beschreven stap-voor-stap protocol vergroot de toegankelijkheid van mitochondriale functionele beoordeling voor onderzoekers.

Introduction

Mitochondriën zijn organellen, ongeveer zo groot als bacteriën, die worden aangetroffen in eukaryote cellen. Het zijn unieke organellen omdat ze DNA bevatten en twee membranen hebben, een buitenste en een binnenste. De buitenste en binnenste membranen van mitochondriën worden gescheiden door een intermembraanruimte en het binnenste membraan vouwt zich in structuren die cristae worden genoemd rond het binnenste compartiment, de matrix genaamd. Deze cristae vergroten het oppervlak van het binnenmembraan, zodat meerdere processen die de cristae gebruiken tegelijkertijd kunnen plaatsvinden. Hoewel mitochondriën betrokken zijn bij veel cellulaire functies, zoals het beheersen van apoptose en het huisvesten van meerdere metabole routes, is hun vitale rol bij de productie van ATP essentieel voor het overleven van cellen. In feite is 90% van de energie van een cel afkomstig van mitochondriën¹. ATP-productie omvat het genereren van een elektrochemisch verschil tussen de buitenste en binnenste membranen, het mitochondriale membraanpotentiaal (Δψ) genoemd, dat ontstaat wanneer H^+- ionen uit de matrix in de intermembraanruimte worden gepompt. ATP-productie wordt uiteindelijk benut tijdens de oxidatie van reducerende equivalenten via elektronenbeweging door de mitochondriale ademhalingsketen (ETC). De uiteindelijke elektronenacceptor is moleculaire zuurstof (O₂). Naarmate zuurstof wordt verbruikt, bouwt het H⁺ -concentratieverschil zich op tot zijn maximum, waarna H⁺ -ionen hun concentratiegradiënt van de intermembraanruimte naar de matrix afdalen door door het ATP-synthasecomplex te gaan. De beweging van H^+- ionen veroorzaakt een conformationele verandering in ATP-synthase en ADP wordt in de buurt van anorganisch fosfaat gebracht om te reageren en ATP te genereren. Ten slotte wordt ATP uit de mitochondriale matrix naar het cytosol getransloceerd en kan het worden opgeslagen of gebruikt om reacties te vergemakkelijken vanwege de grote hoeveelheid vrije energie die vrijkomt tijdens de hydrolyse van de fosfaten. Dit hele proces wordt oxidatieve fosforylering genoemd, en aangezien zuurstof wordt verbruikt, wordt gezegd dat mitochondriën² ademen.

De opbouw en sterkte van Δψ, de verminderde hoeveelheid O₂ (zuurstofverbruik genoemd) en het genereren van ATP kunnen allemaal worden gebruikt als indicaties voor de gezondheid van de cellen. Mitochondriale functionele studies, zoals het meten van Δψ, het totale ATP-gehalte en de totale ATP-productie, en het zuurstofverbruik, kunnen worden gekwantificeerd met behulp van traditionele biochemische methoden of fluorescentie en luminescentie in plaatgebaseerde testen. Het mitochondriale membraanpotentieel kan bijvoorbeeld worden vergeleken tussen verschillende monsters met behulp van fluorescerende kleurstoffen zoals tetramethylrhodamine-ethylester, dat specifiek aan mitochondriën bindt. ATP-generatie kan worden gecontroleerd door een lichtgevend eiwit toe te voegen aan een reactie waarvan de veranderingen correleren met de ATP-concentratie. Kwantificering van het zuurstofverbruik, of absolute ademhalingsfrequenties, tijdens OXPHOS, kan helpen de oorzaken van verschillen in mitochondriale functie en energiemetabolisme op te helderen. Beoordeling van het zuurstofverbruik kan worden gebruikt om ademhalingscontroleratio's (RCR's) te berekenen. RCR-waarden beschrijven het vermogen van mitochondriën om ATP te maken als reactie op de instroom van ADP, wat de belangrijkste functie van mitochondriën is. RCR-waarden geven de algehele toestand van geïsoleerde mitochondriën aan en maken het mogelijk om de respons op verschillende experimentele behandelingen te vergelijken. Verschillen in RCR-waarden kunnen mitochondriale disfunctie vertegenwoordigen of wijzen op een biologisch verschil tussen verschillende mitochondriën geïsoleerd uit twee of meer bronnen. Een andere belangrijke maatstaf voor de functie in geïsoleerde mitochondriën is de mitochondriale efficiëntie, gedefinieerd als mol ATP gesynthetiseerd per mol van O₂, of de P/O-verhouding³.

Gezien de hoeveelheid informatie die kan worden verzameld door het meten van mitochondriale parameters en verschillende gevallen waarin deze informatie kan worden gebruikt, kan het vermogen om efficiënt functionele gegevens te verzamelen nuttig zijn in veel verschillende onderzoeksgebieden. Mitochondriale zuurstofverbruiksmetingen worden al tientallen jaren uitgevoerd met zeer specifieke instrumenten - met behulp van een Clark-elektrode, die kan worden beperkt door de steekproefomvang die nodig is om metingen uit te voeren, en meer recentelijk, geavanceerde instrumenten die mitochondriale ademhaling en meerdere andere parameters kunnen meten, maar onbetaalbaar kunnen zijn. Dit protocol is een aangepaste alternatieve aanpak waarbij gebruik wordt gemaakt van een zuurstofgevoelige fosforescerende sonde (MitoXpress)^4,5. Het sondesignaal wordt gedetecteerd met een plaatlezer in tijdopgeloste fluorescentiemodus voor continue metingen in de tijd. Fosforescentie heeft een groter energieverschil tussen het geabsorbeerde en uitgezonden foton in vergelijking met fluorescentie en is daarom beter geschikt voor het continu monitoren van signaalveranderingen. Dit stelt bijna elk laboratorium in staat om deze metingen uit te voeren, niet alleen degenen die zich richten op het mitochondriale metabolisme of die zich zeer gespecialiseerde apparatuur kunnen veroorloven. Het modelsysteem dat we gebruiken is geïsoleerde mitochondriën van drie boomhagedissen, twee oudersoorten en één introgressief (met nucleair DNA van de ene oudersoort en mitochondriën van de andere - hybriden). Deze hagedissen werden gekozen omdat we veronderstelden dat er metabolische en energetische gevolgen zijn voor hybriden met verschillende nucleaire en mitochondriale DNA-bronnen. We hebben gebruik gemaakt van een in de handel verkrijgbare testkit met een multi-mode plaatlezer die de toegang tot dit type test voor meer onderzoekers en onderzoeksgebieden kan vergroten.

Protocol

Hagedissen werden geëuthanaseerd door CO₂ -verstikking, gevolgd door onmiddellijke onthoofding in overeenstemming met het beleid van het Office of Animal Laboratory Welfare en de richtlijnen van Elon's Institutional Animal Care and Use Committee.

1. Isolatie van mitochondriën⁶

NOTITIE: Houd alle oplossingen koud (tabel 1) en monsters op ijs tijdens deze stappen.

1. Verwijder de lever, weeg deze en spoel deze vervolgens af met ~3 ml ijskoude fosfaatgebufferde zoutoplossing (1x, -/-).
2. Hak de lever fijn in 1 ml L-MIB met een vers scheermesje.
3. Breng het totale volume weefsel plus L-MIB op 2 ml en verstoor de levercellen mechanisch gedurende vier passages met een Dounce-homogenisator.
4. Centrifugeer het homogenaat op 300 × g (37 °C, 10 min).
5. Breng het bovenstaande over in een nieuwe buis en plaats het op ijs.
6. Resuspendeer de pellet in 2 ml L-MIB, homogeniseer opnieuw en draai opnieuw bij 300 × g (37 °C, 10 minuten).
7. Combineer de supernatanten van zowel centrifugeren als centrifugeren bij 10.000 × g (37 °C, 10 min).
8. Resuspendeer de pellet in ~0,350 ml L-MIB.
9. Bepaal de hoeveelheid totaal eiwit (mg mitochondriën/ml L-MIB) die moet worden gebruikt als benadering voor het mitochondriale gehalte ^4,5,6.

2. Zuurstofverbruik

1. Verwarm alle gebruikte oplossingen (tabel 1) in de volgende stappen voor tot 30 °C in een waterbad.
2. Verdun de mitochondriën in LEB tot 6 mg/ml op basis van de resultaten van de eiwitconcentratietest in stap 1.9.
3. Stel de test op in een steriele zwartwandige, doorzichtige bodemplaat met 96 putjes (tabel 2).
   1. Voeg 50 μl van het monster (L-EB-buffer of mitochondriënmonster) toe aan de desbetreffende putjes.
   2. Voeg 50 μL behandeling toe (L-EB, Glutamaat/Malaat of Glutamaat/Malaat w/ADP).
   3. Verdun de sondevoorraad 1:10 in L-EB en voeg vervolgens 100 μL van de fluorescerende sonde toe aan elk putje.
   4. Voeg voorzichtig 50 μL zware minerale olie toe aan elk putje om zuurstof uit de omgeving uit te sluiten.
4. Lees fluorescerende metingen af vanaf de onderkant van de plaat bij 380/650 nm excitatie/emissie elke 1,5 minuut gedurende 45 minuten. Gebruik de kinetische modus met een vertraging van 30.000 μs en een meetvenster van 100 μs.

3. Gegevensanalyse

1. Exporteer het bestand met onbewerkte gegevens van de plaatlezer als een .xls bestand.
2. Open het bestand, kopieer en plak de onbewerkte gegevens in een nieuw tabblad en label de rijen en kolommen op de juiste manier.
3. Zet de L-EB-buffer alleen uit op het controlemonster en L-EB + G/M als relatieve fluorescerende eenheden (RFU) versus tijd.
   OPMERKING: Deze lijnen moeten relatief vlak zijn omdat er geen mitochondriën aanwezig zijn en daarom mag er geen verandering in de zuurstofconcentratie worden gedetecteerd.
4. Zet de L-EB + G/M-voorbeeldwaarden uit als RFU versus tijd.
5. Bepaal waar de metingen consistenter worden en afvlakken voor de bedieningselementen.
   OPMERKING: Dit is waar de gegevensanalyse voor experimentele monsters moet beginnen (gemarkeerd met pijlen in figuur 1A). Het kan 10-15 minuten duren voordat reacties zijn afgevlakt en hun maximum hebben bereikt.
6. Maak een nieuwe grafiek die alleen de gegevens bevat na het tijdstip dat is vastgesteld in stap 3.5 (de zogenaamde "bijgesneden" gegevens) en voeg de best passende lijn toe om de onbewerkte gegevens te visualiseren die moeten worden geanalyseerd.
7. Bereken de gemiddelde RFU-waarde van de bijgesneden gegevens van de besturingsbuffer (geel gemarkeerd). Deze waarde wordt gebruikt als de minimale RFU-waarde als basislijn in de zuurstofberekening hieronder.
8. Berekening van het zuurstofverbruik (μM O₂/min)
   1. Kopieer en plak het lineaire gebied van de onbewerkte gegevens uit stap 3.6 (d.w.z. de bijgesneden gegevens) om de zuurstofconcentratie in de mitochondriale monsters te bepalen in G/M + ADP-behandeling op elk tijdstip 7,8,9,10.
   2. Gebruik vergelijking (1)⁵ om de zuurstofconcentratie op elk tijdstip te bepalen. [O₂]_a is de zuurstofconcentratie in met lucht verzadigde buffer (235 mM bij 30 °C). I(t), Ia en Io zijn respectievelijk het fluorescerende signaal van het monster + sonde op tijdstip t (bijv. monster + G/M + ADP), het gemiddelde signaal van de sonde in met lucht verzadigde buffer berekend in stap 3.7, en het maximale signaal in zuurstofarme buffer (ingesteld op het maximaal haalbare signaal).
      (1)
   3. Zet de [O₂]_t-waarden berekend in stap 3.8.2 uit tegen de tijd en voeg een lineaire trendlijn toe samen met de vergelijking van de best passende lijn.
      OPMERKING: Gebruik de helling van elke lijn als het zuurstofverbruik. Duplicaten of drievouden voor elke steekproef kunnen worden samengevoegd en gebruikt voor de vergelijking van de consumptiesnelheid.
9. Bereken de RCR door de mitochondriale ademhaling met en zonder ADP te delen, die respectievelijk de toestanden 3 en 2 vertegenwoordigen.

Results

Het zuurstofverbruik en de mitochondriale RCR werden bepaald aan de hand van de mitochondriën van drie verschillende hagedissen met behulp van een testkit met een fosforescerende zuurstofgevoelige sonde en een standaard fluorescentieplaatlezer. Eerder onderzoek heeft aangetoond dat de sonde in deze kit rechtstreeks correleert met zuurstofverbruik, waarbij fosforescentie wordt geblust door moleculaire zuurstof en het fluorescerende signaal toeneemt naarmate het zuurstofgehalte daalt als gevolg van mitochondriale ademhaling ^7,11. RFU-waarden worden in de loop van de tijd geregistreerd voor zowel controle- als experimentele monsters en vervolgens geanalyseerd. De RFU-waarden voor controleputjes (alleen buffer, buffer behandeld met glutamaat/malaat en buffer behandeld met glutamaat/malaat + ADP) werden uitgezet tegen de tijd om vast te stellen dat eventuele veranderingen in fluorescentie in experimentele monsterputjes te wijten zijn aan de aanwezigheid van mitochondriën. Bovendien zorgt de glutamaat/malaat + ADP-controle voor de basishoeveelheid zuurstof tijdens het verzamelen van gegevens. Experimentele monsters met geïsoleerde mitochondriën werden ook uitgezet op dezelfde grafiek als de controles.

Figuur 1A laat zien dat RFU's in de loop van de tijd toenemen uit een steekproef van geïsoleerde mitochondriën, in tegenstelling tot de relatief vlakke RFU-waarden van de controles. Aangezien de reacties tijd nodig hebben om in evenwicht te komen, worden de eerste 10 of zo metingen, totdat de metingen van de controlesteekproef niet meer zo luidruchtig zijn en afvlakken, uit de dataset verwijderd (aanvullende tabel S1 en aanvullende figuur S1). Vervolgens worden de resterende waarden van het mitochondriënmonster dat is behandeld met glutamaat/malaat + ADP omgezet in de zuurstofconcentratie op elk tijdstip met behulp van vergelijking (1) (zie protocolstap 3.2) en vervolgens uitgezet tegen de tijd. Figuur 1B toont de uitkomst van de experimentele steekproef die te zien is in figuur 1A (kruisen), waarbij de R^2-waarde zeer dicht bij 1 ligt en de helling van de lijn kan worden berekend. De helling van de lijn is negatief omdat naarmate zuurstof wordt verbruikt, de totale zuurstofconcentratie in dat monster afneemt. Ditzelfde proces wordt herhaald voor dezelfde mitochondriale monsters die zijn behandeld met glutamaat/malaat zonder ADP om zuurstofverbruikspercentages te verkrijgen (aanvullende tabel S2 en aanvullende figuur S2). Vervolgens kan mitochondriale ademhaling met en zonder ADP, die respectievelijk de toestanden 3 en 2 vertegenwoordigen, worden gebruikt om de RCR voor elk monstertype te berekenen (aanvullende figuur S2). Bij vergelijking naast elkaar en geeft de gemiddelde RCR tussen de drie verschillende soorten boomhagedissen aan dat de RCR van de hybride met ingeënte mitochondriën significant lager is dan die van beide oudertypen (Figuur 1C). Hybride hagedismitochondriën hadden een zuurstofverbruik dat gemiddeld was voor de twee oudertypen (Figuur 2).

Figuur 1: Voorbeeld van een zuurstofverbruikstest. (A) Ruwe gegevens van controlereacties met alleen buffers en reacties inclusief geïsoleerde mitochondriën die werden behandeld met glutamaat en malaat (G/M), met of zonder toevoeging van ADP. Fluorescentie werd in de loop van de tijd gecontroleerd. Naarmate zuurstof wordt verbruikt, neemt de fluorescentie toe. Reacties met alleen buffer (G/M, aangegeven door cirkels, en G/M + ADP, aangegeven door driehoeken) en mitochondriën met G/M-behandeling (aangegeven met vierkanten) vertoonden geen verandering. Mitochondriën behandeld met G/M + ADP (aangegeven door plustekens) verbruikten zuurstof. (B) Veranderingen in de zuurstofconcentratie in de loop van de tijd, berekend op basis van de ruwe gegevens voor mitochondriën die zijn behandeld met G/M + ADP, weergegeven in A. (C) RCR-waarden voor mitochondriën van drie verschillende soorten hagedissen, gemeten bij kamertemperatuur. Deze figuur is gereproduceerd uit Haenel en Del Gaizo Moore¹². Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van ANOVA's in R. Afkortingen: G = glutamaat; M = malaat; RCR = respiratoire controleratio. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2: Zuurstofverbruik van mitochondriën van drie soorten hagedissen. Boxplots tonen het mediane zuurstofverbruik als een balk en de gemiddelde als een stip. De oudertypen, Urosaurus graciosus en Urosaurus ornatus, verschilden significant van elkaar. De introgressieve vorm (hybride) was intermediair voor de ouderlijke typen en verschilde niet significant van beide. Deze figuur is gereproduceerd uit Haenel en Del Gaizo Moore¹². Afkortingen: Ug= Urosaurus graciosus; Uo = Urosaurus ornatus. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Tabel 1: Samenstelling van de in het protocol gebruikte oplossingen. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Tabel 2: Plaatkaart voor zuurstofverbruikstest. Houd voor elk monster ten minste 6 putjes apart (3 controleputjes: alleen L-EB, L-EB met G/M-behandeling, L-EB met G/M + ADP-behandeling; 3 experimentele putjes/monster: mitochondriën met L-EB-behandeling, L-EB + G/M en L-EB G/M + ADP-behandeling). Voer indien mogelijk elke experimentele steekproef in tweevoud of drievoud uit. Afkortingen: G = glutamaat; M = malaat; L-EB = hagedisspecifieke experimentele buffer. Klik hier om deze tabel te downloaden.

Aanvullende figuur S1: Gegevensplots. (A) Plot van alle ruwe gegevens voor de vergelijking van monsters en controles. (B) Plot van de omrande onbewerkte gegevens uit gemarkeerde kolommen in aanvullende tabel S1, waaruit blijkt dat alleen de putten die monsters van mitochondriën bevatten, een aanzienlijke toename van RFU's hadden. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur S2: Zuurstofverbruik en ademhalingscontroleratio's. (A) Plot van de zuurstofverbruiksgegevens uit aanvullende tabel S1 om de waarden van toestand 2 en toestand 3 te bepalen door de vergelijkingen van de best passende lijnen te vinden. (B) Berekening van de RCR-verhouding met behulp van de hellingen van de lijnen in (A), die toestand 2 en toestand 3 vertegenwoordigen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel S1: Representatief voorbeeld van onbewerkte gegevens. Gemarkeerde kolommen zijn gegevens die worden gebruikt voor cijfers en berekeningen (d.w.z. bijgesneden gegevens). Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende tabel S2: Representatief voorbeeld van bijgesneden gegevens en daaropvolgende berekeningen van het zuurstofverbruik. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

Het meten van de mitochondriale functie is nuttig bij het vergelijken van verschillende monsters, zoals ziekte- versus niet-ziektetoestanden, verschillende weefseltypen van hetzelfde dier of tussen verschillende monstertypen. We gebruikten de latere vergelijking om onze hypothese te testen dat er een metabolisch gevolg is voor hybride boomhagedissen die mitochondriën hebben geïntroduceerd. Er zijn verschillende manieren om de mitochondriënfunctie experimenteel vast te stellen, waaronder kwantificering van Δψ, totaal ATP-gehalte, ATP-productie en ademhalingscontrole en snelheid van zuurstofverbruik. Metingen van het zuurstofverbruik van geïsoleerde mitochondriën kunnen worden uitgevoerd met gespecialiseerde apparatuur zoals een Clark-elektrode of de meer geavanceerde Seahorse XF's. Deze methoden kunnen echter beperkend zijn door de steekproefomvang die nodig is om metingen uit te voeren, of onbetaalbaar zijn. Multi-mode plaatlezers die fluorescentie kunnen lezen, zijn een standaardapparaat geworden in laboratoria voor celbiologie en biochemie. Een alternatieve benadering om het mitochondriaal zuurstofverbruik kwantitatief te analyseren, is dus het gebruik van een in de handel verkrijgbare kit met een fluorescerende plaatlezer. In dit stap-voor-stap protocol wordt beschreven hoe het zuurstofverbruik gemeten kan worden en hoe de berekeningen uitgevoerd kunnen worden. en economisch in geïsoleerde mitochondriën. Het nauwkeurig meten van het vermogen van mitochondriën om ATP te maken wanneer ze worden geleverd met ADP, aangeduid als toestand 3-ademhaling, maakt een directe vergelijking van OXPHOS tussen monsters mogelijk en verschillen kunnen functionele verschillen aangeven. Bovendien geeft de ademhaling van toestand 3 ook de kwaliteit aan van de mitochondriën die geïsoleerd waren, wat kan bepalen of een isolatieprocedure heeft gewerkt en/of het monster goed genoeg is om in andere testen te worden gebruikt. RCR-waarden, die worden berekend aan de hand van toestand 2 (alleen glutamaat en malaat, om Δψ op te bouwen) en toestand 3-waarden (glutamaat en malaat plus ADP, om Δψ te kunnen gebruiken voor de productie van ATP), geven nog een ander stuk informatie ter vergelijking en over de gezondheid van de geïsoleerde mitochondriën. De gepresenteerde gegevens tonen aan dat de methode die in dit artikel wordt aangeboden, kan helpen bij het ontcijferen van variaties tussen verschillende soorten monsters en het meten van zuurstofverbruik en RCR-waarden zonder dat er zeer gespecialiseerde apparatuur nodig is, waardoor dit soort metingen toegankelijker wordt.

In dit protocol hebben we vers mitochondriën geïsoleerd uit hagedissen, en het zuurstofverbruik werd bepaald met behulp van een MitoXpress Xtra Hs-test volgens het protocol van de fabrikant en aangepast volgens Hynes et ^al.4 en Will et ^al.5 Hagedissen varieerden van 3,3 g tot 5,1 g in totale lichaamsgewicht met een gemiddelde van 0,170 g leverweefsel/hagedis, wat ~ 0.350 ml geconcentreerde, ruwe mitochondriën opleverde. De geïsoleerde mitochondriën werden gebruikt in de zuurstofverbruikstest bij 6 mg/ml eiwit. Als de mitochondriale eiwitconcentratie, zoals bepaald in stap 1.7 van het protocol, laag is, kan het monster opnieuw worden gesponnen bij 10.000 × g en kan de pellet opnieuw worden gesuspendeerd in een kleiner volume L-MIB. Er moet ook worden opgemerkt dat we met succes slechts 4 mg/ml hebben gebruikt voor kleine levermonsters of wanneer de hele lever niet beschikbaar was.

Om ervoor te zorgen dat de gassen en de temperatuur van de monsters aan het begin van de bepaling in evenwicht zijn, moeten alle in deel 2 van het protocol gebruikte oplossingen in een waterbad tot 30 °C worden voorverwarmd. In protocolsectie 3 worden de veranderingssnelheden van opgeloste zuurstof (mM/min) geëxtrapoleerd uit de beginhellingen van de afnemende zuurstofconcentratieprofielen voor elk monster (protocolstap 3.3; Aanvullende tabel S1 en aanvullende figuur S1). De steekproef + G/M-behandelingspercentages vertegenwoordigen de mitochondriale ademhaling in toestand 2, terwijl de steekproef met G/M + ADP-behandelingspercentages de mitochondriale ademhaling in toestand 3 vertegenwoordigen. RCR's worden dus voor elk monster berekend door de waarden van toestand 3 te delen door de waarden van toestand 2 voor elk monster (aanvullende tabel S2).

Het zuurstofverbruik kan worden vergeleken tussen unieke monsters, zoals hier gedemonstreerd, of tussen verschillende behandelingen in één monster. In het laatste geval kunnen aanvullende controles nodig zijn, zoals controle alleen voor voertuigen met en zonder mitochondriën, om uit te sluiten dat de chemische behandeling zelf geen interactie heeft met de fosforescerende sonde. Bovendien kunnen het zuurstofverbruik en de verzamelde RCR-gegevens worden gebruikt in combinatie met gegevens die zijn verzameld uit dezelfde monsters met andere testen. Zodra de mitochondriën zijn geïsoleerd, kunnen ze in meerdere tests worden gebruikt om een completer beeld van hun functie te geven¹². Meting van Δψ, totaal ATP-gehalte en ATP-omloopsnelheid zijn enkele van de tests die zijn gecombineerd. Bovendien geeft het gebruik van ETC-, OXPHOS- en ATP-synthaseremmers bij de tests een nog vollediger begrip van de verschillende mitochondriale monstertypes, waardoor eventuele conclusies uit de gegenereerde gegevens worden versterkt.

Een andere parameter die kan worden gemeten in geïsoleerde mitochondriën is de mitochondriale efficiëntie, die wordt gedefinieerd als de P/O-verhouding van mol ATP gesynthetiseerd per mol van O₂³. P/O-verhoudingen kunnen worden berekend in een uitbreiding van dit protocol door mitochondriën van toestand 3 toe te staan de ADP die in de reactie wordt geleverd uit te putten en vervolgens een aliquot ADP-substraat toe te voegen, gevolgd door remming van het ATP-synthase door de toevoeging van oligomycine. Deze extra stappen maken de berekening mogelijk van toestand 4, die optreedt wanneer mitochondriën zuurstof blijven verbruiken en een sterke Δψ behouden om maximale ATP te maken, geeft informatie over de lekkage van mitochondriën (als H^+-ionen teruggaan naar de matrix zonder het gebruik van het ATP-synthase en daarom Δψ verdrijven), wat uiteindelijk wijst op mitochondriale disfunctie. Bovendien kunnen metingen in toestand 4 ook aantonen of de ADP/ATP-translocator, die nieuw gevormde ATP uit de matrix verplaatst en tegelijkertijd ADP-substraat binnenbrengt, functioneel is en of er enige lekkage van ADP en ATP over de membranen optreedt. De toevoeging van oligomycine, dat ATP-synthase remt, is een controle om te bepalen of de mitochondriën lekken als gevolg van daadwerkelijke disfunctie. Hoewel het meten van toestand 4, zodat de P/O-ratio kon worden berekend, buiten het bereik viel van de informatie die we zochten voor vergelijking tussen de drie mitochondriale monstertypen, is het een ander gegeven over de mitochondriale functie en zou het kunnen worden gedaan als een uitbreiding van dit protocol. Ten slotte is het vermeldenswaard dat mitochondriën kunnen worden geïsoleerd uit cellen in cultuur en verschillende weefsels van onder andere een muis of rat (bijv. lever, hart, ruggenmerg). Aanpassingen aan de MIB- en EB-formuleringen en de isolatieprotocollen kunnen nodig zijn 4,13,14,15,16. Bovendien kan deze test volgens de instructies van de fabrikant worden uitgevoerd met hele, intacte cellen. Daarom is de gepresenteerde methode niet beperkt tot hagedissen of mitochondriën in de lever, waardoor deze geschikt is voor een breed scala aan experimentele modellen in veel verschillende wetenschappelijke subdisciplines.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well black/optical bottom plates	Thermo Fisher	265301	Onbehandelde zwarte wandplaten met heldere bodems.
ADP	Sigma	A2754	Verdun 100 µM voorraad met EB onmiddellijk voor gebruik.
BSA	Thermo Fisher	BP1600-100	Maak 2 mg/mL voorraad in water voor eiwittest.
Dulbeccos 1x PBS (-/-)	Sigma	D8537	Zorg ervoor dat de PBS vrij is van Mg2+ of Ca2+ ionen.
EGTA	Sigma	E3889
K2HPO4	Sigma	P3786
KH2PO4	Sigma	P0662
L-glutamic acid	Sigma	G1251
L-glutamic acid potassium salt	Sigma	S372226
L-malic acid	Sigma	M8304
L-malic acid mono-potassium salt	Sigma	49601
MitoXpress oxygen consumption kit	Agilent	MX-200-4	Kit bevat sondevoorraad en HS minerale olie.
MOPS	Sigma	M3183
Protien Assay Dye (5x)	BioRad	500-0006	Elke eiwittest kan worden vervangen.
R version 3.3	R Core Development Team 2016
Thermomax microplate reader EnSpire Multi-mode Plate reader and software	PerkinElmer		Standaard fluorescerende plate-reader
Trisma base	Sigma	T6066	Elke versie van Tris base kan worden gebruikt.