Een geoptimaliseerde op embryonale stamcellen gebaseerde omgekeerde polytransfectietechniek voor snelle verkenning van nucleïnezuurverhoudingen

Summary

Dit protocol beschrijft een methode voor omgekeerde polytransfectie van embryonale stamcellen van muizen tijdens kweek met 2i- en LIF-media. Deze methode levert een hogere levensvatbaarheid en efficiëntie op dan traditionele voorwaartse transfectieprotocollen, terwijl het ook een optimalisatie van plasmideverhoudingen in één pot mogelijk maakt.

Abstract

Vanwege de relatieve eenvoud en het gebruiksgemak is transiënte transfectie van zoogdiercellijnen met nucleïnezuren een steunpilaar geworden in biomedisch onderzoek. Hoewel de meest gebruikte cellijnen robuuste protocollen hebben voor transfectie in aanhangende tweedimensionale cultuur, vertalen deze protocollen zich vaak niet goed naar minder bestudeerde lijnen of lijnen met atypische, moeilijk te transfecte morfologieën. Met behulp van pluripotente stamcellen van muizen gekweekt in 2i/LIF-media, een veelgebruikt kweekmodel voor regeneratieve geneeskunde, schetst deze methode een geoptimaliseerd, snel omgekeerd transfectieprotocol dat in staat is om een hogere transfectie-efficiëntie te bereiken. Door gebruik te maken van dit protocol wordt een polytransfectie van drie plasmide uitgevoerd, waarbij gebruik wordt gemaakt van de hoger dan normale efficiëntie bij de afgifte van plasmiden om een uitgebreid bereik van plasmide-stoichiometrie te bestuderen. Dit omgekeerde poly-transfectieprotocol maakt een experimentele methode met één pot mogelijk, waardoor gebruikers de plasmideverhoudingen in een enkele put kunnen optimaliseren, in plaats van over verschillende co-transfecties. Door de snelle verkenning van het effect van DNA-stoichiometrie op de algehele functie van afgeleverde genetische circuits te vergemakkelijken, minimaliseert dit protocol de tijd en kosten van embryonale stamceltransfectie.

Introduction

Levering van DNA en RNA aan zoogdiercellen dient als een kernpijler van biomedisch onderzoek¹. Een veelgebruikte methode voor het introduceren van exogene nucleïnezuren (NA) in zoogdiercellen is door middel van transiënte transfectie ^2,3. Deze techniek is gebaseerd op het mengen van NA met in de handel verkrijgbare transfectiereagentia die in staat zijn om ze in de ontvangende cellen af te leveren. Meestal wordt NA afgeleverd via voorwaartse transfectie, waarbij cellen die zich aan een tweedimensionaal oppervlak hechten, het transfectiecomplex ontvangen. Hoewel voo....

Protocol

1. Bereiding van reagentia voor mPSC-cultuur

1. Bereid N2-supplement voor.
   1. Bereid in niet-steriele omstandigheden de volgende stockoplossingen (stap 1.1.1.1) in een chemische veiligheidszuurkast. Voeg het vaste poeder van elke chemische stof toe aan een vooraf gewogen conische buis van 50 ml. Weeg elke buis na het toevoegen van het poeder en voeg een geschikte hoeveelheid oplosmiddel toe om de onderstaande concentraties te bereiken. Bereid voor één batch media de vermelde minimumhoeveelheid voor.
      NOTITIE: De volgende reagentia zijn gevaarlijk en moeten worden behandeld in overeenstemming met de plaatselijke chemische veiligheidsrichtl....

Results

Zowel voorwaartse als omgekeerde transfecties zijn afhankelijk van de interactie tussen het celmembraan en inkomende transfectiereagens-DNA-complexen, waardoor de afgifte van NA aan de ontvangende cellen mogelijk is. Waar deze technieken verschillen, is de toestand van de cel bij levering - terwijl DNA meestal wordt afgeleverd aan aanhangende celmonolagen in traditionele voorwaartse transfectie, vertrouwt omgekeerde transfectie in plaats daarvan op het feit dat het reagens-DNA-complex de cellen ontmoet terwijl het zich i.......

Discussion

Een belangrijke reden voor de wijdverbreide acceptatie van transfectieprotocollen is hun reproduceerbaarheid en toegankelijkheid; Deze protocollen vereisen echter wel optimalisatie in experimentele contexten. Hierboven zijn de standaardtests niet genoemd die nodig zijn wanneer u voor het eerst een nieuwe cellijn probeert te transfecteren. Ten eerste is de keuze van het transfectiereagens van cruciaal belang, aangezien in de handel verkrijgbare reagentia niet voor iedereen geschikt zijn en zullen variëren in de efficiënti.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Accutase	MilliporeSigma	SCR005
Apotransferrin	MilliporeSigma	T1147-500MG
B27 supplement	ThermoFisher Scientific	17504044
Beta-mercaptoethanol	ThermoFisher Scientific	21985023
BSA fraction V (7.5%)	Gibco	15260-037
CHIR99021	MilliporeSigma	SML1046-25MG
DMEM-F12	MilliporeSigma	D6421-24X500ML
Flow cytometry standardization beads	Spherotech	URCP-38-2K
Gelatin	MilliporeSigma	G1890
GlutaMAX supplement	ThermoFisher Scientific	35050061
Insulin	Gibco	12585-0014
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668-019	Transfection reagent
Neurobasal media	ThermoFisher Scientific	21103049
OptiMEM	Invitrogen	31985-070
PD0325901	MilliporeSigma	PZ0162-25MG
Progesterone	MilliporeSigma	P8783	Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Putrescine	MilliporeSigma	P6780	Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Recombinant mLIF	BioTechne	8878-LF-500/CF
Sodium selenite	MilliporeSigma	S5261-25G	Chemical hazard - consult local safety guidelines, ensure proper PPE is worn, and work with the solid powder form only in a chemical fume hood
Trypsin-EDTA	ThermoFisher Scientific	25200056