Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Isolatie, cultuur en karakterisering van stamcellen van tandpulp uit menselijke loof- en permanente tanden

4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65767

⸱

17 mei 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Dentistry, Oral Health Institute, Hamad Medical Corporation, 2Pushpagiri Institute of Medical Sciences and Research Centre, 3Saveetha Dental College, Saveetha Institute of Medical and Technical Sciences, 4College of Applied Medical Sciences, King Saud University

In dit artikel

Samenvatting

Dit protocol legt de nadruk op de extractie, kweek en conservering van multipotente stamcellen uit tandpulp door middel van enzymatische vergisting. Bovendien toont het hun potentieel aan om te differentiëren in osteoblasten, adipocyten en chondrocyten, wat het belang van precisie en consistentie in het proces benadrukt.

Samenvatting

Op het gebied van regeneratieve geneeskunde en therapeutische toepassingen wint stamcelonderzoek snel aan kracht. Tandpulpstamcellen (DPSC's), die aanwezig zijn in zowel melktanden als permanente tanden, zijn naar voren gekomen als een essentiële stamcelbron vanwege hun toegankelijkheid, aanpassingsvermogen en aangeboren differentiatievermogen. DPSC's bieden een direct beschikbaar en overvloedig reservoir van mesenchymale stamcellen, met een indrukwekkende veelzijdigheid en potentieel, met name voor regeneratieve doeleinden. Ondanks hun belofte ligt de belangrijkste hindernis in het effectief isoleren en karakteriseren van DPSC's, aangezien hun vertegenwoordiging als een minuscule fractie in tandpulpacellen. Even cruciaal is het juiste behoud van deze onschatbare cellulaire hulpbron. De twee overheersende methoden voor DPSC-isolatie zijn enzymatische vertering (ED) en uitgroei van weefselexplantaten (OG), vaak aangeduid als spontane groei. Dit protocol concentreert zich voornamelijk op de enzymatische vergistingsbenadering voor DPSC-isolatie, waarbij de stappen voor extractie, verwerking in het laboratorium en celbehoud ingewikkeld worden beschreven. Naast extractie en conservering gaat het protocol in op het differentiatievermogen van DPSC's. In het bijzonder schetst het de procedures die worden gebruikt om deze stamcellen te laten differentiëren in adipocyten, osteoblasten en chondrocyten, waarbij hun multipotente eigenschappen worden getoond. Het daaropvolgende gebruik van colorimetrische kleuringstechnieken vergemakkelijkt nauwkeurige visualisatie en bevestiging van succesvolle differentiatie, waardoor het kaliber en de functionaliteit van de geïsoleerde DPSC's worden gevalideerd. Dit uitgebreide protocol fungeert als een blauwdruk die het hele spectrum van extractie, teelt, conservering en karakterisering van tandpulpstamcellen omvat. Het onderstreept het substantiële potentieel van DPSC's, het voortstuwen van de exploratie van stamcellen en veelbelovend voor toekomstige regeneratieve en therapeutische doorbraken.

Inleiding

Stamcelonderzoek is tot bloei gekomen in de biomedische wetenschap vanwege de veelbelovende toepassingen in regeneratieve geneeskunde en weefselmanipulatie. Tandpulpstamcellen (DPSC's), afgeleid van het pulpaweefsel van zowel menselijke melktanden als permanente tanden, hebben veel belangstelling getrokken als bron van stamcellen vanwege hun gemakkelijke beschikbaarheid en multipotente capaciteit 1,2. Deze cellen hebben het potentieel om te differentiëren in verschillende celtypen, waaronder adipocyten, osteoblasten en chondrocyten, zoals bevestigd door talrijke onderzoeken3.

In de afgelopen decennia zijn het onderzoek en de therapeutische toepassingen van stamcellen enorm toegenomen. Het uitgebreide potentieel van stamcellen vereist een diversificatie van de bronnen waaruit ze worden verkregen. Verschillende factoren zijn van invloed op de efficiëntie, levensvatbaarheid en stambaarheid van de gekozen cellen. Ondanks het bestaan van verschillende bekende stamcelreservoirs, zoals beenmerg en vetweefsel, beperken de invasieve procedures, de morbiditeit op de plaats en de ethische bezwaren in verband met deze bronnen vaak hun exploratie 4,5. Onder de verschillende stamcelbronnen hebben tandheelkundige stamcellen aandacht gekregen vanwege hun gemakkelijke toegankelijkheid, hoge plasticiteit en diverse mogelijke toepassingen. Met name stamcellen van menselijke tandpulpa zijn uitgebreid onderzocht op hun therapeutische vooruitzichten6. Tanden, die vaak worden weggegooid als medisch afval, bevatten een schat aan mesenchymale stamcellen7. Het beschermen van deze waardevolle stamcelpool vereist collectieve inspanningen van patiënten, tandartsen en artsen om ervoor te zorgen dat deze middelen niet worden verspild, waardoor elke stamcel van tandpulp beschikbaar komt voor toekomstige regeneratieve behoeften.

Van tandpulp afgeleide stamcellen, zoals menselijke volwassen tandpulpstamcellen (DPSC's) en stamcellen van geëxfolieerde menselijke melktanden (SHED), bevinden zich in de perivasculaire nis van de tandpulpa. Aangenomen wordt dat deze cellen afkomstig zijn van craniale neurale topcellen en vroege markers vertonen voor zowel mesenchymale stamcellen (MSC's) als neuro-ectodermale stamcellen. DPSC's en SHED's hebben multipotentie aangetoond en het vermogen om verschillende weefseltypes te regenereren8.

Mogelijke bronnen van tandstamcellen omvatten gezonde melktanden en permanente tanden. Stamcellen vormen slechts ongeveer 1% van de totale celpopulatie in de pulpa, wat het belang van effectieve isolatie- en expansietechnieken benadrukt9. Bijgevolg zijn de extractie en expansie van deze stamcellen cruciale stappen in DPSC-isolatie10. Geëxtraheerde of geëxfolieerde tanden moeten worden bewaard in een voedingsrijk transportmedium, zoals fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) of Hanks-gebufferde zoutoplossing (HBSS).

Het verkrijgen van tandpulp kan op verschillende manieren worden bereikt, afhankelijk van het tandtype 7,11. Voor melktanden met geresorbeerde wortels kan extractie worden uitgevoerd via de worteltop. Evenzo kunnen steriele broches met weerhaken worden gebruikt om pulp te verkrijgen van permanente tanden met een onrijpe open top. In het geval van blijvende tanden met volledig ontwikkelde wortels, omvat toegang tot de pulpakamer het scheiden van de tandkroon van de wortel. Dit wordt bereikt door de tand door te snijden met behulp van een diamantschijf bij de cementemailverbinding. Deze incisie legt de pulpakamer bloot, waardoor het pulpaweefsel kan worden opgehaald 12,13,14.

Tandpulpstamcellen (DPSC's) kunnen worden geïsoleerd door enzymatische vertering (ED) of uitgroei uit weefselexplantaten (OG), ook wel spontane groei genoemd. De ED-methode maakt gebruik van enzymen, voornamelijk collagenase I en dispase, om het weefsel af te breken tot eencellige suspensies15,16. De OG-methode, eenvoudiger en sneller, houdt in dat de pulpfragmenten worden gehakt en direct in een kweekplaat worden geplaatst, waardoor cellen uit de weefselexplantaten kunnen groeien17. Onderzoekers hebben beide technieken gebruikt en vergeleken om de celproliferatiesnelheid, het behoud van geïsoleerde stamceleigenschappen, differentiatie en de expressie van oppervlaktemarkers tebeoordelen18. Het opstellen en standaardiseren van protocollen voor het verwerven van DPSC's met een hoge efficiëntie en stamkracht kan de weg vrijmaken voor effectieve en veilige therapieën19. Dit protocol omvat het extraheren van DPSC's met behulp van enzymatische vergisting, laboratoriumverwerking, conservering en celdifferentiatie met colorimetrische kleuring voor adipogenese, osteogenese en chondrogenese.

Het protocol dat in dit artikel wordt beschreven, presenteert een stapsgewijze procedure, te beginnen met de eerste isolatie van tandpulp uit de tand, gevolgd door de kweek en het onderhoud van DPSC's in het laboratorium, en eindigend met hun karakterisering met behulp van specifieke stamcelmarkers (Figuur 1). De technieken voor het induceren van deze stamcellen in verschillende cellijnen, waarbij hun multipotentie wordt benadrukt, worden ook beschreven.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

Het hierin beschreven protocol is in overeenstemming met de richtlijnen van de institutionele ethische commissie voor menselijk onderzoek (IRB, Pushpagiri Research Center, Kerala). Het gebruik van geëxtraheerde tanden werd uitgevoerd volgens ethische normen om de integriteit, waardigheid en rechten van de deelnemers te waarborgen. De deelnemers die voor deze studie werden geselecteerd, waren gezonde personen jonger dan 30 jaar die tandextractie nodig hadden voor een orthodontische behandeling. Degenen met uitgebreide tandcariës of ernstige parodontitis werden uitgesloten van het onderzoek. Bladverliezende tanden werden verzameld van kinderen die de extractie van achtergebleven tanden nodig hadden. Er werd ook geïnformeerde schriftelijke toestemming verkregen van de proefpersonen die bij dit onderzoek betrokken waren.

1. Extractie en transport van tanden en kiezen

  1. Verzameling van melk- en blijvende tanden
    1. Leg aan de deelnemers het doel van de procedure uit en het mogelijke gebruik van de getrokken tanden voor onderzoeksdoeleinden.
    2. Voer tandextractie uit onder plaatselijke verdoving door een verdovingsmiddel toe te dienen in de buurt van de te trekken tand. In het bijzonder werd voor dit onderzoek 1,75 ml lidocaïne gemengd met epinefrine (zie materiaaltabel) in een verhouding van 1:200.000 geïnjecteerd. Het heeft de voorkeur om tanden te selecteren die geen ernstige tandcariës of parodontitis vertonen20,21.
  2. Transport van de geëxtraheerde tanden
    OPMERKING: Werken onder aseptische omstandigheden wordt aanbevolen om besmetting te voorkomen. Dit omvat het dragen van persoonlijke beschermingsmiddelen, zoals handschoenen en een laboratoriumjas, en werken in een steriele omgeving, zoals een biohazard laminaire flowkap.
    1. Nadat de tand is getrokken, spoelt u deze af met een steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om het bloed en ander vuil te verwijderen. Verwijder met een steriele tang en scalpel voorzichtig alle vastzittende resten van zacht weefsel van het tandoppervlak (Figuur 2A).
    2. Dompel de tand onder in een desinfecterende oplossing, zoals 70% ethanol, gedurende 10 s. Spoel de tand na de desinfectie af met steriel PBS om eventuele resten van het desinfectiemiddel weg te spoelen.
    3. Plaats de tand in een steriele container met het transportmedium.
      OPMERKING: Het transportmedium bestond uit Alpha-MEM, een commercieel kweekmedium aangevuld met antibiotica: 100 E/ml penicilline/streptomycine (zie Materiaaltabel). Dit medium leverde essentiële voedingsstoffen aan de cellen in de geëxtraheerde tand, waardoor hun overleving tot laboratoriumverwerking werd gegarandeerd. De antibiotica dienden om de groei van bacteriën te remmen.
    4. Houd tijdens het transport een temperatuur van 4 °C aan om de cellulaire metabolische activiteiten te vertragen en de celdood te vertragen. Transporteer de tand naar het laboratorium voor de volgende stappen, waaronder het verwerken en isoleren van de stamcellen van de tandpulpa.

2. Verzameling van pulpaweefsel

  1. Zet de tand vast met een tandtang om ervoor te zorgen dat deze tijdens de procedure op zijn plaats blijft. Gebruik een diamantschijf om de tand in een tandheelkundig handstuk te snijden (zie Tabel met materialen) dat is aangesloten op een waterkoelmiddel (Figuur 2B).
    OPMERKING: Het doel is om de pulpakamer bloot te leggen zonder onnodige schade aan het pulpaweefsel binnenin te veroorzaken.
  2. Gebruik een tandheelkundig graafwerktuig (zie Materiaaltabel) om het pulpweefsel te verwijderen. Dit instrument maakt het mogelijk om pulpa te extraheren zonder schade aan te richten, waardoor de levensvatbaarheid van de stamcellen van de tandpulpa behouden blijft (Figuur 2C).
  3. Leg het verkregen zakdoekje op een glazen petrischaaltje. Was het pulpaweefsel met fosfaatgebufferde zoutoplossing.

3. Vertering van pulpaweefsel en celisolatie

  1. Weefselverminking en spijsvertering
    1. Hak met een steriel chirurgisch mes het pulpaweefsel voorzichtig in kleine stukjes (Figuur 2D) en plaats het in een mini-weefselvermaler met PBS om een fijn gehomogeniseerd mengsel te verkrijgen. Dit proces vergroot het oppervlak van het weefsel, waardoor een efficiëntere enzymwerking tijdens de spijsvertering mogelijk wordt.
    2. Breng de gehakte homogene weefselfragmenten over in een buisje van 15 ml en verteer enzymatisch met een mengsel van 3 mg/ml collagenase type I en 4 mg/ml dispase (zie Materiaaltabel). Deze enzymen werden opgelost in Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) om de gewenste concentraties te bereiken.
    3. Incubeer het pulpaweefsel in het enzymmengsel (stap 3.1.2) gedurende ongeveer 2 uur bij 37 °C. Na incubatie neutraliseert u de enzymen en verzamelt u de cellen door centrifugatie (stap 3.2.1) voor verdere kweek.
  2. Centrifugeren en resuspensie
    1. Breng het verteerde weefsel na incubatie over in een centrifugebuis van 15 ml en draai het 5 minuten bij kamertemperatuur op 300 x g om de cellen te pelleteren. Deze stap scheidt de cellen van de resterende onverteerde weefselfragmenten en enzymen. Gooi het bovendrijvende medium voorzichtig weg en zorg ervoor dat u de celkorrel op de bodem van de buis niet verstoort.
    2. Resuspendeer de celpellet in een vers kweekmedium. Dit medium biedt de nodige voedingsstoffen en omgeving voor de geïsoleerde cellen om te overleven en zich te vermenigvuldigen.

4. Celcultuur

  1. Plateren en incubatie van cellen
    1. Breng de geresuspendeerde cellen voorzichtig over in een kweekkolf van 25 cm².
      OPMERKING: Al het materiaal van een enkele pulp wordt overgebracht in een enkele 25 cm2-cellige cultuurkolf. Een mediavolume van 5-7 ml zorgt voor voldoende dekking en beschikbaarheid van voedingsstoffen voor de cellen. Zorg ervoor dat het kweekmedium voor DPSC's Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) is, aangevuld met 10%-20% foetaal runderserum (FBS) (zie materiaaltabel) om de nodige groeifactoren te leveren. Vul het medium verder aan met 1% penicilline/streptomycine om bacteriële besmetting te voorkomen. Zorg ervoor dat de cellen gelijkmatig over de kolf zijn verdeeld om een homogene groei te bevorderen.
    2. Incubeer de kolf bij 37 °C in een atmosfeer met 5% CO2 .
  2. Gemiddelde verandering en monitoring van confluency
    1. Vervang het kweekmedium elke 2-3 dagen om verse voedingsstoffen te leveren en metabolisch afval te verwijderen. Om dit te doen, zuigt u het oude medium voorzichtig op met een steriele serologische pipet en vervangt u het door een nieuw medium.
    2. Controleer de celcultuur regelmatig onder een microscoop om de groei van de cellen te volgen en controleer op tekenen van besmetting.
    3. Ga door met dit proces totdat de cellen 80%-90% confluentie bereiken, het punt waarop de cellen het grootste deel van het oppervlak van de kolf bedekken, maar niet te druk zijn.
  3. Celtrypsinisatie en passaging of bevriezing
    1. Zodra de cellen 80%-90% confluentie bereiken, verwijdert u het kweekmedium en wast u de cellen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) om het resterende medium en niet-aanhangende cellen te verwijderen.
    2. Voeg een oplossing van 0,25% trypsine-EDTA toe aan de kolf om de cellen los te maken van het oppervlak van de kolf. Incubeer gedurende 2-5 minuten bij 37 °C tot de cellen loskomen.
    3. Neutraliseer de trypsine door een gelijk volume kweekmedium toe te voegen en pipetteer de celsuspensie vervolgens voorzichtig op en neer om volledige celloslating te garanderen.
    4. Centrifugeer de celsuspensie bij 300 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om de cellen te pelleteren.
    5. Resuspendeer de cellen in een vers kweekmedium en leg ze opnieuw op de plaat (passage) voor verdere groei of vries ze in voor toekomstig gebruik. Gebruik bij het invriezen een invriesmedium dat een cryoprotectant bevat, zoals DMSO, om de cellen te beschermen tegen schade tijdens het invriezen.

5. Karakterisering van DPSC's

  1. Analyse van flowcytometrie
    1. Om de mesenchymale stamcelaard van de geïsoleerde cellen te bevestigen, voert u flowcytometrieanalyseuit 22,23. Probeer in eerste instantie cellen te trypsiniseren en te verzamelen zoals beschreven in stap 4.3.
    2. Bepaal de levensvatbaarheid van de cel met behulp van de trypankleurstofuitsluitingstechniek. Voer de analyse uit met behulp van een cellevensvatbaarheidsanalysator (zie Materiaaltabel) tijdens de2e en 8epassage. Voer fenotypische analyse uit via een flowcytometer tijdens de 3een 7epassage.
    3. Was de cellen na incubatie in een flowcytometriebuffer om overtollige antilichamen te verwijderen en analyseer de cellen met behulp van een flowcytometer.
      OPMERKING: De flowcytometriebuffer is samengesteld uit fosfaatgebufferde zoutoplossing (1x PBS), 1%-2% foetaal runderserum (FBS) en 0,1% natriumazide (NaN3). De FBS of BSA blokkeert de niet-specifieke binding van antilichamen, terwijl het natriumazide als conserveermiddel werkt. Een hoog percentage cellen moet de mesenchymale stamcelmarkers tot expressie brengen en de hematopoëtische markers missen, wat hun identiteit als DPSC's bevestigt24.
    4. Maak de DPSC's los en kleur ze met immunofluorescentie-antilichamen voor flowcytometrieanalyse.
      OPMERKING: De selectie van markers voor flowcytometrie-analyse van mesenchymale stamcellen (MSC's) is gebaseerd op de consensus die is vastgesteld door de International Society for Cellular Therapy (ISCT), die stelt dat MSC's CD105, CD73 en CD90 tot expressie moeten brengen en niet tot expressie moeten komen van CD45, CD34, CD14 of CD11b, CD79a of CD19 en HLA klasse II25. Deze markers worden vaak gebruikt in onderzoeken naar stamcellen van tandpulpa26. De concentraties van antilichamen voor kleuring kunnen variëren afhankelijk van het specifieke antilichaam dat wordt gebruikt, en het wordt aanbevolen om de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel) te volgen voor antilichaamverdunningen en incubatieomstandigheden25.
    5. Stel de classificatiecriteria27,28 vast voor de expressie van CD-markers zoals vermeld: minder dan 10%, geen expressie; tussen 11% en 40%, lage expressie; een bereik van 41% tot 70%, matige expressie; boven de 71%, hoge expressie.
    6. Bevestig bovendien de afwezigheid van hematopoëtische markers door een afzonderlijk celaliquot met antilichamen tegen CD34 en CD45 te incuberen.

6. Differentiatie van meerdere afstammingslijnen

OPMERKING: De volgende stappen schetsen protocollen voor osteogene, adipogene en chondrogene differentiatie van tandheelkundige stamcellen. Begin met het zaaien van culturen met een dichtheid van 1 x 10,5 cellen per putje in een met fibronectine beklede weefselkweekplaat met volledig medium (CM). Bewaak de celgroei totdat 80%-90% confluentie is bereikt voordat het gewenste differentiatieprotocol wordt gestart. Om het differentiatiepotentieel van de DPSC's in meerdere afstammingslijnen te evalueren, start u het differentiatieproces naar osteoblasten, adipocyten en chondrocyten door cellen in platen met 24 putjes te zaaien en ze te kweken in geschikte differentiatiemedia.

  1. Osteogene differentiatie
    1. Begin met het kweken van DPSC's in een regulier groeimedium onder standaardomstandigheden totdat ze 70%-80% samenvloeiing bereiken.
    2. Verwijder het groeimedium van de cellen en was de cellen vervolgens één keer met 1x PBS. Voeg het Osteogenic Differentiation Medium (ODM) toe aan de cellen.
      OPMERKING: De ODM bestaat uit Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM) aangevuld met 10% FBS, 100 eenheden/ml penicilline, 100 μg/ml streptomycine, 0,25 μg/ml amfotericine B, 50 μg/ml ascorbinezuur, 10 mM bèta-glycerofosfaat en 100 nM dexamethason (zie Materiaaltabel).
    3. Incubeer de cellen in het osteogene medium bij 37 °C met 5% CO2 . Vervang het osteogene medium elke 2-3 dagen.
      OPMERKING: Na 14 tot 21 dagen zouden de DPSC's gedifferentieerd moeten zijn tot osteoblastachtige cellen. Dit kan worden bevestigd door te controleren op een toename van de expressie van osteoblast-specifieke markers, zoals alkalische fosfatase, of door kleuringstechnieken te gebruiken om gemineraliseerde matrix te detecteren, zoals Alizarin Red S-kleuring.
    4. Fixeer de cellen door ze gedurende 1 uur bij -20 °C te incuberen met 70% ijskoude ethanol.
    5. Kleuring van de vaste cellen met 40 nM Alizarin Red S (pH 4,2) kleuroplossing bij kamertemperatuur in het donker gedurende 10-15 min. Visualiseer de kleuring onder een microscoop om osteogene differentiatie te bevestigen (Figuur 3). Bevestig de differentiatie door de cellen te kleuren met Alizarin Red S, dat calciumafzettingen identificeert die wijzen op mineralisatie29,30.
  2. Adipogene differentiatie
    1. Zoals beschreven in het vorige hoofdstuk, kweek DPSC's onder standaardomstandigheden in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2 bij 37 °C. Passage de cellen wanneer ze ongeveer 70%-80% samenvloeiing bereiken.
    2. Zuig het medium op en was de cellen één keer met 1x PBS. Vervang het uitgespoelde medium door adipogeen differentiatiemedium. Dit medium bestaat over het algemeen uit DMEM, 10% FBS, 10 μg/ml insuline, 1 μM dexamethason, 200 μM indomethacine en 0,5 mM IBMX (zie Materiaaltabel).
    3. Verander het differentiatiemedium elke 3-4 dagen. Was na ongeveer 3 weken de adipogeen-gedifferentieerde DPSC's met PBS en fixeer ze met 4% paraformaldehyde (PFA) gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur.
    4. Kleur de vaste cellen met Oil Red O (zie Tabel met materialen) om de ophoping van lipidedruppels te visualiseren (Figuur 4). Om adipogene differentiatie verder te bevestigen, voert u genexpressieanalyse uit van adipogene markers zoals peroxisoom proliferator-geactiveerde receptor gamma (PPARγ) en adiponectine31,32.
  3. Chondrogene differentiatie
    1. DPSC-culturen die worden bewaard in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO2 bij 37 °C worden gebruikt voor chondrogene differentiatie. Passage de cellen wanneer ze ongeveer 70%-80% samenvloeiing bereiken.
    2. Zuig het medium op en was de cellen één keer met 1x PBS. Vervang het vervaagde medium door chondrogenisch differentiatiemedium, dat doorgaans Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), 1% ITS, 100 nM dexamethason, 50 μg/ml ascorbaat-2-fosfaat, 40 μg/ml proline en 10 ng/ml Transforming Growth Factor-beta 3 (TGF-β3) bevat (zie materiaaltabel).
    3. Houd de cellen in het chondrogene differentiatiemedium en verander het medium elke 2-3 dagen. Na ongeveer drie weken zouden de DPSC's gedifferentieerd moeten zijn in chondrocyt-achtige cellen.
    4. Fixeer de cellen door ze 20 minuten bij kamertemperatuur te incuberen met 4% paraformaldehyde (PFA). Kleuring de cellen na fixatie met Alcian Blue (zie Tabel met materialen) en visualiseer ze onder een microscoop om chondrogene differentiatie te bevestigen (Figuur 5).
    5. Bevestig de differentiatie van DPSC's in chondrocyten met behulp van technieken zoals Alcian Blue-kleuring voor proteoglycanen of genexpressieanalyse van chondrogene markers zoals aggrecan, SOX9 en type II collageen33,34.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

De succesvolle uitvoering van het geschetste protocol leverde tandpulpstamcellen (DPSC's) op die in staat zijn tot differentiatie van meerdere afstammingslijnen, wat hun multipotentie aantoont.

Levensvatbaarheidsanalyses
De levensvatbaarheid van de DPSC's werd op verschillende tijdstippen beoordeeld met behulp van een Trypan Blue-uitsluitingstest. De resultaten tonen een consistent hoge levensvatbaarheid (meer dan 95%) gedurende de cultuurperiode, wat de robuustheid van ons...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Het protocol schetst de isolatie, cultuur en karakterisering van tandpulpstamcellen (DPSC's) uit menselijke melktanden en permanente tanden. Het bevat een beschrijving van de opslag en proliferatie van deze cellen, evenals de beoordeling van hun in vitro differentiatiepotentieel tot osteoblasten, adipocyten en chondrocyten35.

Chen et al.36 toonden aan dat tandpulpstamcellen (DPSC's) kunnen worden verkregen uit ver...

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

De auteurs zijn Dr. Mathew Mazhavancheril, directeur en hoofd van het Pushpagiri Research Centre in Thiruvalla, dankbaar voor zijn steun bij het documenteren van de procedures in het Research Centre.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

```html
Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
3-isobuty-l-methyl-xanthine Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAI5879
Azijnzuur Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAAS001
Alcian Blue Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USARM471
Alizarin Red S staining solutionSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAGRM894
Alkaline phosphatase -Staining kitThermo Fisher Scientific,MA 02451,USA
Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM) Thermo Fisher Scientific,MA 02451,USAGibco
Alpha Minimum Essential Medium (α-MEM) Thermo Fisher Scientific,MA 02451,USAGibco
Alpha-MEM, or Alpha Minimum Essential MediumThermo Fisher Scientific,MA 02451,USAGibco
Alpha-MEM, or Alpha Minimum Essential MediumThermo Fisher Scientific,MA 02451,USAGibco
Antibiotic/AntimycoticSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAP4333
Ascorbaat-2-fosfaatSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA012-04802
Beta-glycerofosfaat Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAG9422-10G
Biosafety cabinet-Laminar flow hoodLabconco Corporation,MO 64132-2696,USA
CD90, CD105, CD73, CD34, CD45, en HLA-DRBioLegend, Inc.CA 92121,USA
Cell strainer (70 µm )HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaTCP025Cell strainer
CentrifugeREMI Elektrotechnik Limited (REMI)
CentrifugeHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,India1101 | 1102
CO2 IncubatorThermo Fisher Scientific,MA 02451,USA
Collageenase type IWorthington Biochem. Corp. NJ 08701, USA
Collageenase type IWorthington Biochem. Corp. NJ 08701, USA
Complete Growth MediumHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaAT006DMEM
Conical tubes (15 of 50 )Thermo Fisher Scientific, MA, USA546021P/546041P15 mL en 50 mL
Cryo freezing containerThermo Fisher Scientific,MA 02451,USA15-350-50
CryolabelsLabel India:
Cryovial storage boxes Cryostore Storage Boxes
CryovialsThermo Fisher Scientific,MA 02451,USA
Cryovials (1.8 mL)Thermo Fisher Scientific,MA 02451,USAPW1282Self standing
Culture flask (25 cm²)Corning Inc.NY 14831,USA
Culture flasksHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaTCG4/TCG6T25/T75
Culture PlatesHiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaTCP129/TCP00860 mm/100 mm
Dental Diamond DiscsKomet SC 29730, USAKomet 
Dental Spoon ExcavatorBrasseler,GA 31419,USA5023591U0
DexamethasonSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAD4902-25MG
DexamethosoneSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAD4902-25MG
DexamethosoneSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAD4902-25MG
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATC185
DispaseRoche Diagnostics,Mannheim,Germany.
DispaseRoche Diagnostics GmbH, Mannheim,Germany
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific, MA, USA
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific,MA 02451,USA
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific,MA 02451,USA
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific,MA 02451,USA
Ethanol (70%)HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaMB106
Ethanol -70%Thermo Fisher Scientific,MA 02451,USAFisher Scientific
Extraction forceps Dentsply Sirona, USA
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USAF2442-500ML
Fetal bovine serum (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USAF2442-500ML
Fetal bovine serum (FBS)HiMedia Laboratories  Ltd.Mumbai,IndiaRM9954

Referenties

  1. Bakopoulou, A., About, I. Stem cells of dental origin: current research trends and key milestones towards clinical application. Stem Cells International. 2016, 4209891(2016).
  2. Yamada, Y., Nakamura-Yamada, S., Konoki, R., Baba, S. Promising advances in clinical trials of dental tissue-derived cell-based regenerative medicine. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 175(2020).
  3. Huang, G. T., Gronthos, S., Shi, S. Mesenchymal stem cells derived from dental tissues vs. those from other sources: their biology and role in regenerative medicine. Journal of Dental Research. 88 (9), 792-806 (2009).
  4. Bissels, U., Diener, Y., Eckardt, D., Bosio, A. Regenerative medicine-from protocol to patient. , Springer International Publishing. Cham, Switzerland. 1-25 (2016).
  5. Hyun, I. The bioethics of stem cell research and therapy. Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 71-75 (2010).
  6. Ledesma-Martinez, E., Mendoza-Nunez, V. M., Santiago-Osorio, E. Mesenchymal Stem Cells Derived from Dental Pulp: A Review. Stem Cells International. 2016, 4709572(2016).
  7. Egusa, H., Sonoyama, W., Nishimura, M., Atsuta, I., Akiyama, K. Stem cells in dentistry--part I: stem cell sources. Journal of Prosthodontic Research. 56 (3), 151-165 (2012).
  8. Galler, K. M., Eidt, A., Schmalz, G. Cell-free approaches for dental pulp tissue engineering. Journal of Endodontics. 40, 41-45 (2014).
  9. Smith, A. J., Patel, M., Graham, L., Sloan, A. J., Cooper, P. R. Dentine regeneration: key roles for stem cells and molecular signalling. Oral Biosciences & Medicine. 2, 127-132 (2005).
  10. Bernardi, L., et al. The isolation of stem cells from human deciduous teeth pulp is related to the physiological process of resorption. Journal of Endodontics. 37 (7), 973-979 (2011).
  11. Saha, R., Tandon, S., Rajendran, R., Nayak, R. Dental pulp stem cells from primary teeth quality analysis: laboratory procedures. Journal of Clinical Pediatric Dentistry. 36 (2), 167-173 (2011).
  12. Miura, M., et al. SHED: stem cells from human exfoliated deciduous teeth. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (10), 5807-5812 (2003).
  13. Ferro, F., Spelat, R., Beltrami, A. P., Cesselli, D., Curcio, F. Isolation and characterization of human dental pulp derived stem cells by using media containing low human serum percentage as clinical grade substitutes for bovine serum. PLoS One. 7 (11), 48945(2012).
  14. Spath, L., et al. Explant-derived human dental pulp stem cells enhance differentiation and proliferation potentials. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 14, 1635-1644 (2010).
  15. Gronthos, S., Mankani, M., Brahim, J., Robey, P. G., Shi, S. Postnatal human dental pulp stem cells (DPSCs) in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (25), 13625-13630 (2000).
  16. Takeda-Kawaguchi, T., et al. Derivation of iPSCs after culture of human dental pulp cells under defined conditions. PLoS One. 9 (12), 115392(2014).
  17. Hilkens, P., et al. Effect of isolation methodology on stem cell properties and multilineage differentiation potential of human dental pulp stem cells. Cell and Tissue Research. 353 (1), 65-78 (2013).
  18. Karamzadeh, R., Eslaminejad, M. B., Aflatoonian, R. Isolation, characterization and comparative differentiation of human dental pulp stem cells derived from permanent teeth by using two different methods. Journal of Visualized Experiments. (69), e4372(2012).
  19. Lucaciu, O., et al. Dental follicle stem cells in bone regeneration on titanium implants. BMC Biotechnology. 15, 114(2015).
  20. Perry, B. C., et al. Collection, cryopreservation, and characterization of human dental pulp-derived mesenchymal stem cells for banking and clinical use. Tissue Engineering Part C: Methods. 14 (2), 149-156 (2008).
  21. Zainuri, M., Putri, R. R., Bachtiar, E. W. Establishing methods for isolation of stem cells from human exfoliated deciduous from carious deciduous teeth. Interventional Medicine & Applied Science. 10 (1), 33-37 (2018).
  22. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  23. Nakayama, H., Iohara, K., Hayashi, Y., Okuwa, Y., Kurita, K., Nakashima, M. Enhanced regeneration potential of mobilized dental pulp stem cells from immature teeth. Oral Diseases. 23 (5), 620-628 (2017).
  24. Cunningham, R. E. Indirect immunofluorescent labeling of fixed cells. Methods in Molecular Biology. 588, 335-339 (2010).
  25. Zimmerlin, L., Donnenberg, V. S., Rubin, J. P., Donnenberg, A. D. Mesenchymal markers on human adipose stem/progenitor cells. Cytometry A. 83 (1), 134-140 (2013).
  26. Alansary, M., Drummond, B., Coates, D. Immunocytochemical characterization of primary teeth pulp stem cells from three stages of resorption in serum-free medium. Dental Traumatology. 37 (1), 90-102 (2021).
  27. Lei, T., Zhang, X., Du, H. Characteristics, classification, and application of stem cells derived from human teeth. Stem Cells International. 2021, 8886854(2021).
  28. Kalina, T., et al. CD Maps-dynamic profiling of CD1-CD100 surface expression on human leukocyte and lymphocyte subsets. Frontiers in Immunology. 10, 2434(2019).
  29. Luzuriaga, J., et al. Osteogenic differentiation of human dental pulp stem cells in decellularised adipose tissue solid foams. European Cells & Materials eCM. 43, 112-129 (2022).
  30. Volponi, A. A., Gentleman, E., Fatscher, R., Pang, Y. W., Gentleman, M. M., Sharpe, P. T. Composition of Mineral Produced by Dental Mesenchymal Stem Cells. Journal of Dental Research. 94 (11), 1568-1574 (2015).
  31. Nozaki, T., Ohura, K. Gene expression profile of dental pulp cells during differentiation into an adipocyte lineage. Journal of Pharmacological Sciences. 115 (3), 354-363 (2011).
  32. Kobayashi, T., Torii, D., Iwata, T., Izumi, Y., Nasu, M., Tsutsui, T. W. Characterization of proliferation, differentiation potential, and gene expression among clonal cultures of human dental pulp cells. Human Cell. 33 (3), 490-501 (2020).
  33. Westin, C. B., Trinca, R. B., Zuliani, C., Coimbra, I. B., Moraes, A. M. Differentiation of dental pulp stem cells into chondrocytes upon culture on porous chitosan-xanthan scaffolds in the presence of kartogenin. Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications. 80, 594-602 (2017).
  34. Rizk, A., Rabie, A. B. Human dental pulp stem cells expressing transforming growth factor beta3 transgene for cartilage-like tissue engineering. Cytotherapy. 15 (6), 712-725 (2013).
  35. Anil, S., Ramadoss, R., Thomas, N. -G., George, J. -M., Sweety, V. -K. Dental pulp stem cells and banking of teeth as a lifesaving therapeutic vista. Biocell. 47 (1), 71-80 (2023).
  36. Chen, Y. K., Huang, A. H., Chan, A. W., Shieh, T. Y., Lin, L. M. Human dental pulp stem cells derived from different cryopreservation methods of human dental pulp tissues of diseased teeth. Journal of Oral Pathology & Medicine. 40 (10), 793-800 (2011).
  37. Pereira, L. O., et al. Comparison of stem cell properties of cells isolated from normal and inflamed dental pulps. International Endodontic Journal. 45 (12), 1080-1090 (2012).
  38. Malekfar, A., Valli, K. S., Kanafi, M. M., Bhonde, R. R. Isolation and characterization of human dental pulp stem cells from cryopreserved pulp tissues obtained from teeth with irreversible pulpitis. Journal of Endodontics. 42 (1), 76-81 (2016).
  39. Werle, S. B., et al. Carious deciduous teeth are a potential source for dental pulp stem cells. Clinical Oral Investigations. 20 (1), 75-81 (2016).
  40. Tsai, A. I., et al. Isolation of mesenchymal stem cells from human deciduous teeth pulp. Biomed Research International. 2017, 2851906(2017).
  41. Paglia, L. Stem cells, a resource for patients and dentists. European Archives of Paediatric Dentistry. 17 (2), 89(2016).
  42. Kerkis, I., et al. Isolation and characterization of a population of immature dental pulp stem cells expressing OCT-4 and other embryonic stem cell markers. Cells Tissues Organs. 184 (3-4), 105-116 (2006).
  43. Rodas-Junco, B. A., Villicana, C. Dental pulp stem cells: current advances in isolation, expansion and preservation. Tissue Engineering and Regenerative. 14 (4), 333-347 (2017).
  44. Shi, S., Robey, P. G., Gronthos, S. Comparison of human dental pulp and bone marrow stromal stem cells by cDNA microarray analysis. Bone. 29 (6), 532-539 (2001).
  45. Mortada, I., Mortada, R. Dental pulp stem cells and osteogenesis: an update. Cytotechnology. 70 (5), 1479-1486 (2018).
  46. Pagella, P., Neto, E., Lamghari, M., Mitsiadis, T. A. Investigation of orofacial stem cell niches and their innervation through microfluidic devices. European Cells & Materials eCM. 29, 213-223 (2015).
  47. Chalisserry, E. P., Nam, S. Y., Park, S. H., Anil, S. Therapeutic potential of dental stem cells. Journal of Tissue Engineering. 8, 2041731417702531(2017).
  48. Pilbauerova, N., Soukup, T., Suchankova Kleplova, T., Suchanek, J. Enzymatic isolation, amplification and characterization of dental pulp stem cells. Folia Biologica (Praha). 65 (3), 124-133 (2019).
  49. Ebrahimi Dastgurdi, M., Ejeian, F., Nematollahi, A., Motaghi, A., Nasr-Esfahani, M. H. Comparison of two digestion strategies on characteristics and differentiation potential of human dental pulp stem cells. Archives of Oral Biology. 93, 74-79 (2018).
  50. Ducret, M., et al. Manufacturing of dental pulp cell-based products from human third molars: current strategies and future investigations. Frontiers in Physiology. 6, 213(2015).

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Isolatie van DPSCenzymatische digestieweefselexplantaat-uitgroeimesenchymale stamcellenflowcytometrieceldifferentiatieosteogene differentiatieadipogene differentiatiechondrogene differentiatie
Isolatie, cultuur en karakterisering van stamcellen van tandpulp uit menselijke loof- en permanente tanden
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.