Ontwikkeling en karakterisering van gedecellulariseerde extracellulaire matrixhydrogels voor de longen

Summary

Het protocol verduidelijkt twee verschillende decellularisatiemethodologieën die worden toegepast op inheemse longweefsels van runderen, en geeft een uitgebreid overzicht van hun respectieve karakteriseringen.

Abstract

Het gebruik van extracellulaire matrix (ECM)-afgeleide hydrogels in weefselmanipulatie is steeds populairder geworden, omdat ze de natuurlijke omgeving van cellen in vitro kunnen nabootsen. Het handhaven van de oorspronkelijke biochemische inhoud van de ECM, het bereiken van mechanische stabiliteit en het begrijpen van de impact van het decellularisatieproces op de mechanische eigenschappen van de ECM-hydrogels zijn echter een uitdaging. Hier werd een pijplijn beschreven voor decellularisatie van runderlongweefsel met behulp van twee verschillende protocollen, stroomafwaartse karakterisering van de effectiviteit van decellularisatie, fabricage van gereconstitueerde gedecellulariseerde long-ECM-hydrogels en beoordeling van hun mechanische en cytocompatibiliteitseigenschappen. Decellularisatie van de runderlong werd nagestreefd met behulp van een fysische (vries-dooicycli) of chemische (op wasmiddel gebaseerde) methode. Hematoxyline- en eosinekleuring werd uitgevoerd om de decellularisatie en retentie van belangrijke ECM-componenten te valideren. Voor de evaluatie van het resterende collageen- en sulfaatgehalte aan glycosaminoglycaan (sGAG) in de gedecellulariseerde monsters, werden respectievelijk Sirius-rood- en Alcian-blauwkleuringstechnieken gebruikt. Mechanische eigenschappen van de gedecellulariseerde long-ECM-hydrogels werden gekenmerkt door oscillerende reologie. De resultaten suggereren dat gedecellulariseerde hydrogels van runderlongen een betrouwbaar organotypisch alternatief kunnen bieden voor commerciële ECM-producten door de meeste inheemse ECM-componenten te behouden. Bovendien laten deze bevindingen zien dat de decellularisatiemethode naar keuze een aanzienlijke invloed heeft op de kinetiek van de gelering, evenals op de stijfheid en visco-elastische eigenschappen van de resulterende hydrogels.

Introduction

Conventionele monolaagkweekomstandigheden bieden geen getrouwe weergave van inheemse weefselmicro-omgevingen en missen het vermogen om een driedimensionale (3D) steiger te bieden met instructieve liganden die cel-matrix en cel-cel interacties mogelijk maken¹. De samenstelling van de extracellulaire matrix (ECM) en mechanische eigenschappen zijn zeer weefselspecifiek, tijdsafhankelijk en ondergaan veranderingen in pathologische omstandigheden. Daarom is er behoefte aan biomimetische 3D-weefselmodellen die het mogelijk maken dergelijke kenmerken af te stemmen, cellulair gedrag te moduleren en de gewenste weefselfunctionaliteit te bereiken. Inheem....

Protocol

Verse inheemse longen van jonge (1-2 jaar oude) runderdonoren werden verkregen uit een plaatselijk slachthuis en vervoerd in een verzegelde plastic container op ijs naar het laboratorium. Dierenoffers worden uitgevoerd voor algemene vleesconsumptie (longen weggegooid als afval) en zijn niet gerelateerd aan of vanwege het onderzoek. Wij bevestigen dat het slachthuis voldoet aan de nationale wet- en regelgeving voor het offeren van dieren. Verder bevestigen we dat we alleen afvalmateriaal hebben gebruikt en dat het onderzoeksproject geen effect heeft gehad op het aantal geofferde dieren.

1. Oogst van organen en weefselvoorbereiding

Results

Decellularisatie
Decellularisatie van runderlongweefsel om dECM-hydrogels te produceren die de oorspronkelijke micro-omgeving van de longen zouden recapituleren, is bereikt door zowel fysieke (vries-dooi) als chemische (Triton-X-100) methoden. Na dissectie werden weefselstukken gewassen in dH₂O-bevattende antibiotica om ziekteverwekkers te verwijderen die later de steriliteit van de dECM-hydrogels kunnen beïnvloeden. In totaal werden vijf cycli toegepast, afwisselend tussen vloeibare stikst.......

Discussion

Van organen afgeleide hydrogels zijn veelbelovende modellen geworden die de ECM van het natuurlijke weefsel recapituleren en de organotypische cellulaire functie nabootsen. Hoewel gedecellulariseerde long-ECM vaak is gebruikt in weefselmanipulatie, zal een grondige karakterisering van de samenstelling en mechanische eigenschappen van biomaterialen bijdragen aan een beter begrip van hoe cel-ECM-interacties kunnen worden gemoduleerd voor het modelleren van biologische processen tijdens homeostase of ziekte. Met name de beo.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Absolute ethanol	ISOLAB	64-17-5
Acetic acid	ISOLAB	64-19-7
Alcian blue solution	Sigma-Aldrich	B8438
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas	Sigma-Aldrich	DN25
Discovery HR-2 rheometer	TA Instruments
Entellan mounting medium	Merck	107960
Eosin solution	Bright-slide	2.BS01-105-1000
Formaldehyde	Electron Microscopy Sciences	50-980-485
Hydrochloric acid	Merck	100317
Iodine	Sigma-Aldrich	3002
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	7786-30-3
Mayer's haematoxylin staining solution	Merck	2.BS01-103-1000
O.C.T compound	Tissue-Tek	4583
Penicillin/Streptomycin	Biowest	L0018-100
Pepsin from porcine gastric mucosa	Sigma-Aldrich	P6887
Picric acid	Polysciences	88-89-1
Sirius Red	Polysciences	09400-25
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	S5881
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Triton-X-100	Merck	112298