Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.

Methodenartikel

Methodologie om bacteriën metabolisch te inactiveren voor Caenorhabditis elegans-onderzoek

3.7K weergaven

DOI:

10.3791/65775

28 juli 2023

* These authors contributed equally

In dit artikel

Samenvatting

De voedselbron voor Caenorhabditis elegans in het lab is levende Escherichia coli. Omdat bacteriën metabolisch actief zijn, vormen ze een verstorende variabele in metabole en geneesmiddelstudies bij C. elegans. Een gedetailleerd protocol om bacteriën metabolisch te inactiveren met behulp van paraformaldehyde wordt hier beschreven.

Samenvatting

Caenorhabditis elegans is een veelgebruikt modelorganisme voor onderzoek op het gebied van genetica, ontwikkeling, veroudering, metabolisme en gedrag. Omdat C. elegans een dieet van levende bacteriën consumeert, kan de metabolische activiteit van hun voedselbron experimenten verwarren die op zoek zijn naar de directe effecten van verschillende interventies op de worm. Om de verstorende effecten van bacterieel metabolisme te voorkomen, hebben C. elegans-onderzoekers meerdere methoden gebruikt om bacteriën metabolisch te inactiveren, waaronder ultraviolette (UV)-bestraling, warmtedodend en antibiotica. UV-behandeling heeft een relatief lage doorvoer en kan niet worden gebruikt in vloeibare cultuur omdat elke plaat moet worden onderzocht op succesvolle bacteriële doding. Een tweede behandelingsmethode, hittedodend, heeft een negatieve invloed op de textuur en voedingskwaliteit van de bacteriën, wat leidt tot de ontwikkelingsstop van C. elegans. Ten slotte kan behandeling met antibiotica de fysiologie van C. elegans direct veranderen, naast het voorkomen van bacteriegroei. Dit manuscript beschrijft een alternatieve methode om bacteriën metabolisch te inactiveren met behulp van paraformaldehyde (PFA). PFA-behandeling verknoopt eiwitten in bacteriële cellen om metabolische activiteit te voorkomen met behoud van de celstructuur en voedingswaarde. Deze methode heeft een hoge doorvoer en kan worden gebruikt in vloeibare cultuur of vaste platen, omdat het testen van één plaat met PFA-behandelde bacteriën op groei de hele batch valideert. Metabole inactivatie door middel van PFA-behandeling kan worden gebruikt om de verstorende effecten van bacterieel metabolisme op onderzoeken naar suppletie met geneesmiddelen of metabolieten, stressbestendigheid, metabolomics en gedrag bij C. elegans te elimineren.

Inleiding

Caenorhabditis elegans werd oorspronkelijk voorgesteld als een modelorganisme in 19651 en is sindsdien op grote schaal toegepast in studies naar genetica, ontwikkeling, gedrag, veroudering en metabolisme2. Door hun grote broedgrootte en transparante cuticula is C. elegans bijzonder geschikt voor high-throughput screening met fluorescerende reporters3. Hun korte levenscyclus, hermafrodiete voortplanting en genetische homologie met mensen maken C. elegans ook tot een waardevol modelsysteem voor studies over ontwikkeling4 en verouderingsbiologie

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Protocol

1. Inenting tegen bacteriën

  1. Bereid Luria-bouillon (LB) door 10 g trypton, 5 g gistextract en 10 g natriumchloride (NaCl) op te lossen in 950 ml gedestilleerd water.
  2. Pas de pH van de LB aan naar 7.0 door 5M natriumhydroxide (NaOH) toe te voegen. Hiervoor is slechts ongeveer 0,2 ml NaOH nodig.
  3. Autoclaaf de pH-aangepaste LB-media op een vloeistofcyclus gedurende 45 minuten bij 15 psi. Laat de oplossing afkoelen en bewaar op kamertemperatuur.
  4. Inoculeer een enkele kolonie bacteriën in 100 ml LB in een erlenmeyer van 500 ml. Kweek de bacteriën een nacht in een 37 °C schudincubator.
  5. Afhankelijk van de gezondh....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Resultaten

Een gedetailleerde workflow van het protocol wordt weergegeven in figuur 1. Er werd een high-throughput-methode ontwikkeld en geoptimaliseerd om bacteriële replicatie (Figuur 2A) en metabolisme (Figuur 2B) consistent te inactiveren voor metabole en geneesmiddelenstudies in C. elegans-onderzoek met behulp van paraformaldehyde16. Het doel was om de laagste concentratie PFA te bepalen die nodig was en d.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Discussie

Voordelen van PFA-dodend ten opzichte van andere bacteriedodende methoden
PFA-behandeling is een high-throughput methode om bacterieel metabolisme te voorkomen en tegelijkertijd een voedzame voedselbron voor C. elegans te behouden. Het doden van bacteriën via PFA-behandeling heeft meerdere voordelen ten opzichte van andere methoden. In tegenstelling tot UV-behandeling, waarbij elke plaat moet worden getest op succesvolle doding, kan een enkele plaat van een batch PFA-behandelde bacteriën word.......

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

Dit werk werd gefinancierd door NIH R21AG059117 en de Paul F. Glenn Laboratories for Biology of Aging Research aan de Universiteit van Michigan. SB werd gefinancierd door T32AG000114. ESK werd gefinancierd door NSF DGE 1841052.

....

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
Aluminum FoilStaples2549291
Bunsen burnerVWR470121-700 
Cell Density MeterDenville80-3000-45 
CentrifugeEppendorg5430
Chemical fume hoodLabcono975050411384RG
Conincal tubes (50 mL)Fisher339652
Cuvettes Fisher14-955-127
E. coli OP50CGCOP50
Erlenmyer flasksFisher250 mL: FB501250
500 mL: FB501500
1000 mL: FB5011000
Inoculation loopFisher22-363-605
LB AgarFisherBP1425500
Liquid waste collection bottleThomas Scientific1230G50
Magnesium Sulfate (MgSO4)SigmaM7506
Paraformaldehyde (32%)Electron Microscopy Sciences15714-SParaformaldehyde – methanolvrije oplossing
PipettorEppendorfEppendorf Easypet 3
Plastic dishes (100 mm)FisherFB0875712
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4)FisherP2853
Seahorse XF CalibrantAgilent100840-000
Seahorse XFe96 Extracellular Flux Assay Kit and Cell Culture MicroplateAgilent101085-004
Serological pipettes (50 mL)Genesee Scientific12-107
Shaker incubatorThermo11 676 083
Sodium Chloride (NaCl)FisherS640-3
Sodium Hydroxide (NaOH)FisherS318500
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4)SigmaS374-500
Solid waste collection bucketM&M Industries 5.0 Gallon M1 Traditional Pail
TryptoneGenesee Scientific20-251
VortexThermo11676331
Weighing balanceC GoldenwallHZ10K6B
Yeast ExtractGenesee Scientific20-255

Referenties

  1. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. Elegans II. 33, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, USA. (1997).
  2. Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A primer on caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
  3. Kaletta, T., Hengartner, M. O.

Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.

Herprints en machtigingen

Trefwoorden

Metabole inactivatiebehandeling met paraformaldehydebacteri le inactivatielevensduurassaysbacterieel metabolismewormgedragrespirometerassayhitte ge nactiveerde bacteri nantibioticabehandeling