De voedselbron voor Caenorhabditis elegans in het lab is levende Escherichia coli. Omdat bacteriën metabolisch actief zijn, vormen ze een verstorende variabele in metabole en geneesmiddelstudies bij C. elegans. Een gedetailleerd protocol om bacteriën metabolisch te inactiveren met behulp van paraformaldehyde wordt hier beschreven.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Methodologie om bacteriën metabolisch te inactiveren voor Caenorhabditis elegans-onderzoek
* These authors contributed equally
In dit artikel
Samenvatting
Samenvatting
Caenorhabditis elegans is een veelgebruikt modelorganisme voor onderzoek op het gebied van genetica, ontwikkeling, veroudering, metabolisme en gedrag. Omdat C. elegans een dieet van levende bacteriën consumeert, kan de metabolische activiteit van hun voedselbron experimenten verwarren die op zoek zijn naar de directe effecten van verschillende interventies op de worm. Om de verstorende effecten van bacterieel metabolisme te voorkomen, hebben C. elegans-onderzoekers meerdere methoden gebruikt om bacteriën metabolisch te inactiveren, waaronder ultraviolette (UV)-bestraling, warmtedodend en antibiotica. UV-behandeling heeft een relatief lage doorvoer en kan niet worden gebruikt in vloeibare cultuur omdat elke plaat moet worden onderzocht op succesvolle bacteriële doding. Een tweede behandelingsmethode, hittedodend, heeft een negatieve invloed op de textuur en voedingskwaliteit van de bacteriën, wat leidt tot de ontwikkelingsstop van C. elegans. Ten slotte kan behandeling met antibiotica de fysiologie van C. elegans direct veranderen, naast het voorkomen van bacteriegroei. Dit manuscript beschrijft een alternatieve methode om bacteriën metabolisch te inactiveren met behulp van paraformaldehyde (PFA). PFA-behandeling verknoopt eiwitten in bacteriële cellen om metabolische activiteit te voorkomen met behoud van de celstructuur en voedingswaarde. Deze methode heeft een hoge doorvoer en kan worden gebruikt in vloeibare cultuur of vaste platen, omdat het testen van één plaat met PFA-behandelde bacteriën op groei de hele batch valideert. Metabole inactivatie door middel van PFA-behandeling kan worden gebruikt om de verstorende effecten van bacterieel metabolisme op onderzoeken naar suppletie met geneesmiddelen of metabolieten, stressbestendigheid, metabolomics en gedrag bij C. elegans te elimineren.
Inleiding
Caenorhabditis elegans werd oorspronkelijk voorgesteld als een modelorganisme in 19651 en is sindsdien op grote schaal toegepast in studies naar genetica, ontwikkeling, gedrag, veroudering en metabolisme2. Door hun grote broedgrootte en transparante cuticula is C. elegans bijzonder geschikt voor high-throughput screening met fluorescerende reporters3. Hun korte levenscyclus, hermafrodiete voortplanting en genetische homologie met mensen maken C. elegans ook tot een waardevol modelsysteem voor studies over ontwikkeling4 en verouderingsbiologie
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
1. Inenting tegen bacteriën
- Bereid Luria-bouillon (LB) door 10 g trypton, 5 g gistextract en 10 g natriumchloride (NaCl) op te lossen in 950 ml gedestilleerd water.
- Pas de pH van de LB aan naar 7.0 door 5M natriumhydroxide (NaOH) toe te voegen. Hiervoor is slechts ongeveer 0,2 ml NaOH nodig.
- Autoclaaf de pH-aangepaste LB-media op een vloeistofcyclus gedurende 45 minuten bij 15 psi. Laat de oplossing afkoelen en bewaar op kamertemperatuur.
- Inoculeer een enkele kolonie bacteriën in 100 ml LB in een erlenmeyer van 500 ml. Kweek de bacteriën een nacht in een 37 °C schudincubator.
- Afhankelijk van de gezondh....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
Een gedetailleerde workflow van het protocol wordt weergegeven in figuur 1. Er werd een high-throughput-methode ontwikkeld en geoptimaliseerd om bacteriële replicatie (Figuur 2A) en metabolisme (Figuur 2B) consistent te inactiveren voor metabole en geneesmiddelenstudies in C. elegans-onderzoek met behulp van paraformaldehyde16. Het doel was om de laagste concentratie PFA te bepalen die nodig was en d.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
Voordelen van PFA-dodend ten opzichte van andere bacteriedodende methoden
PFA-behandeling is een high-throughput methode om bacterieel metabolisme te voorkomen en tegelijkertijd een voedzame voedselbron voor C. elegans te behouden. Het doden van bacteriën via PFA-behandeling heeft meerdere voordelen ten opzichte van andere methoden. In tegenstelling tot UV-behandeling, waarbij elke plaat moet worden getest op succesvolle doding, kan een enkele plaat van een batch PFA-behandelde bacteriën word.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Dit werk werd gefinancierd door NIH R21AG059117 en de Paul F. Glenn Laboratories for Biology of Aging Research aan de Universiteit van Michigan. SB werd gefinancierd door T32AG000114. ESK werd gefinancierd door NSF DGE 1841052.
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Aluminum Foil | Staples | 2549291 | |
| Bunsen burner | VWR | 470121-700 | |
| Cell Density Meter | Denville | 80-3000-45 | |
| Centrifuge | Eppendorg | 5430 | |
| Chemical fume hood | Labcono | 975050411384RG | |
| Conincal tubes (50 mL) | Fisher | 339652 | |
| Cuvettes | Fisher | 14-955-127 | |
| E. coli OP50 | CGC | OP50 | |
| Erlenmyer flasks | Fisher | 250 mL: FB501250 500 mL: FB501500 1000 mL: FB5011000 | |
| Inoculation loop | Fisher | 22-363-605 | |
| LB Agar | Fisher | BP1425500 | |
| Liquid waste collection bottle | Thomas Scientific | 1230G50 | |
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Sigma | M7506 | |
| Paraformaldehyde (32%) | Electron Microscopy Sciences | 15714-S | Paraformaldehyde – methanolvrije oplossing |
| Pipettor | Eppendorf | Eppendorf Easypet 3 | |
| Plastic dishes (100 mm) | Fisher | FB0875712 | |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Fisher | P2853 | |
| Seahorse XF Calibrant | Agilent | 100840-000 | |
| Seahorse XFe96 Extracellular Flux Assay Kit and Cell Culture Microplate | Agilent | 101085-004 | |
| Serological pipettes (50 mL) | Genesee Scientific | 12-107 | |
| Shaker incubator | Thermo | 11 676 083 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher | S640-3 | |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Fisher | S318500 | |
| Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4) | Sigma | S374-500 | |
| Solid waste collection bucket | M&M Industries | 5.0 Gallon M1 Traditional Pail | |
| Tryptone | Genesee Scientific | 20-251 | |
| Vortex | Thermo | 11676331 | |
| Weighing balance | C Goldenwall | HZ10K6B | |
| Yeast Extract | Genesee Scientific | 20-255 |
Referenties
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. C. Elegans II. 33, Cold Spring Harbor Laboratory Press. New York, USA. (1997).
- Corsi, A. K., Wightman, B., Chalfie, M. A transparent window into biology: A primer on caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
- Kaletta, T., Hengartner, M. O.
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
