Methodenartikel

Een thermoplasmonische benadering voor het onderzoeken van plasmamembraanherstel in levende cellen en modelmembranen

2.4K weergaven

⸱

DOI:

10.3791/65776

⸱

19 januari 2024

 ,  ,  , 
1The Niels Bohr Institute, University of Copenhagen, 2Department of Plant and Environmental Sciences, University of Copenhagen

In dit artikel

Samenvatting

De thermoplasmonische punctiemethode integreert confocale microscopie, optische pincetten en gouden nanodeeltjes om eiwitreacties te bestuderen tijdens plasmamembraanherstel in cellen en gigantische unilamellaire blaasjes. De techniek maakt een snelle en gelokaliseerde membraanpunctie mogelijk, waardoor de belangrijkste eiwitten en hun functionele rol in de ingewikkelde plasmamembraanreparatiemachines kunnen worden geïdentificeerd.

Samenvatting

Het celmembraan is cruciaal voor het overleven van de cel, en het waarborgen van de integriteit ervan is essentieel omdat de cel gedurende zijn hele levenscyclus verwondingen oploopt. Om schade aan het membraan te voorkomen, hebben cellen efficiënte plasmamembraanreparatiemechanismen ontwikkeld. Deze reparatiemechanismen kunnen worden bestudeerd door confocale microscopie en thermoplasmonics op nanoschaal te combineren om de rol van sleuteleiwitten, zoals bijlagen, die betrokken zijn bij oppervlakteherstel in levende cellen en membraanmodelsystemen, te identificeren en te onderzoeken.

De punctuurmethode maakt gebruik van een laser om zeer plaatselijke verwarming te induceren bij bestraling van nanodeeltjes. Het gebruik van nabij-infrarood licht minimaliseert de fototoxiciteit in het biologische monster, terwijl het grootste deel van de absorptie plaatsvindt in het nabij-infrarood resonante plasmonische nanodeeltje. Deze thermoplasmonische methode is gebruikt voor potentieel fotothermisch en biofysisch onderzoek om het begrip van intracellulaire mechanismen en cellulaire reacties te vergroten door middel van blaasjes- en celfusiestudies. De aanpak is complementair gebleken aan bestaande methoden voor membraanverstoring, zoals mechanisch, chemisch of optisch geïnduceerd letsel, en biedt een hoge mate van controle door het toebrengen van extreem gelokaliseerde verwondingen. De omvang van de verwonding is beperkt tot de nabijheid van het bolvormige nanodeeltje en er treedt geen nadelige schade op langs het straalpad in tegenstelling tot gepulseerde lasers die verschillende golflengten gebruiken. Ondanks bepaalde beperkingen, zoals de vorming van nanobellen, biedt de thermoplasmonische methode een uniek hulpmiddel voor het onderzoeken van cellulaire reacties bij plasmamembraanherstel in een bijna oorspronkelijke omgeving zonder de levensvatbaarheid van de cel in gevaar te brengen.

Wanneer de punctiemethode wordt geïntegreerd met confocale microscopie, kan deze een mechanistisch inzicht verschaffen in de membraandynamica in modelmembraansystemen, evenals kwantitatieve informatie over eiwitreacties op membraanschade, inclusief eiwitrekrutering en hun biofysische functie. Over het algemeen kan de toepassing van deze methode op gereduceerde modelsystemen ons begrip van de ingewikkelde plasmamembraanreparatiemachines in levende cellen vergroten.

Inleiding

Het celmembraan, dat zowel als fysieke barrière als als signaalplatform dient, is van vitaal belang voor het overleven vancellen1. Gedurende de gehele celcyclus wordt het plasmamembraan (PM) blootgesteld aan schade, zoals mechanische 2,3,4,5 en chemische6 stress-geïnduceerde verwondingen. Om de integriteit van het membraan te behouden en de overleving van de cel te garanderen, heeft de cel robuuste mechanismen voor plasmamembraanreparatie (PMR) ontwikkeld. Deze mechanismen zijn afhankelijk van verschillende strategieën, zoals reorganisatie van het cytoskelet, membraanfusie en membraanvervangingsstrategieën 7,8,9,10,11, die allemaal afhankelijk zijn van de rekrutering van specifieke eiwitten. Met name leden van de annexine-eiwitfamilie zijn geïdentificeerd als sleuteleiwitten die geassocieerd zijn met de processen van PMR 1,9,12,13,14,15,16. Na PM-letsel ervaart de cel een instroom van calciumionen (Ca2+), wat een onmiddellijke bedreiging vormt voor het voortbestaan van de cel17. Als reactie op de instroom van Ca2+ binden annexine-eiwitten, die zich voornamelijk in het cytosol bevinden, zich aan het binnenste blaadje van het beschadigde plasmamembraan als onderdeel van de PMR-strategieën18. Annexine A2 (ANXA2) was een van de eerste leden van de annexinefamilie die in verband werd gebracht met PMR bij dysferline-deficiënte spierdystrofie en er werd gesuggereerd dat het herstel bemiddelde door intracellulaire blaasjes te fuseren met de PM in de buurt van de plaats van de verwonding 5,19,20,21. Vervolgens zijn verschillende functies toegeschreven aan annexins22, en hun rol in PMR heeft de afgelopen 20 jaar steeds meer aandacht gekregen. De exacte rol van annexinen in PMR wordt echter nog niet volledig begrepen 15,18,21,22.

Dit artikel stelt een methode voor om eiwit-membraaninteractie en membraandynamica op een gecontroleerde en sterk gelokaliseerde manier te onderzoeken, met behulp van een combinatie van confocale microscopie, optisch pincet en gouden nanodeeltjes (AuNP's). Deze methode maakt de kwantitatieve studie mogelijk van eiwit-, lipide- en kleine molecuulinteracties als reactie op membraanbeschadiging en Ca2+ instroom. Ondanks de complexiteit en veelheid aan componenten die betrokken zijn bij het proces van membraanreparatie, zijn vereenvoudigde membraansystemen die het plasmamembraan nabootsen gebruikt om een dieper mechanistisch begrip te krijgen van de membraandynamica en de reactie van annexine-eiwitten op membraanverstoring16. Gigantische unilamellaire lipideblaasjes (GUV's) werden gekozen als het modelmembraansysteem met een gespecificeerde lipidesamenstelling. De GUV's werden gegenereerd met behulp van de gel-ondersteunde hydratatiemethode, met name polyvinylalcoholgelhydratatie, zoals beschreven door Weinberger et al.23, die een efficiënte inkapseling van annexines in GUV's mogelijk maakte.

Het gebruik van nabij-infrarood (NIR) laserbestraling op metalen nanodeeltjes (NP's) induceert een aanzienlijke opwarming van de NP, waardoor het een effectieve methode is om een lokale warmtebron tot stand te brengen die wordt geëxploiteerd in biomedische toepassingen24. De methode werd aanvankelijk gebruikt om de temperatuur rond een enkele AuNP direct te meten in zowel 2D- als 3D-biomimetische tests. In deze assays 25,26 werden de plasmonische nanodeeltjes bestraald op een ondersteunde lipide dubbellaag of optisch gevangen in de buurt van GUV's die een lokale thermische faseovergang ondergingen bij lokale verhitting, waardoor kwantificering en controle van het exacte temperatuurprofiel rond het deeltje mogelijk werd. Dit referentietemperatuurprofiel is gebruikt bij het onderzoeken of manipuleren van biologische monsters. Verdere vooruitgang in de methode heeft de inductie van nanoscopische poriën in membranenvergemakkelijkt 27, waardoor blaasjes- en celfusie mogelijk is28,29. Andere studies hebben het gedrag van perifere membraaneiwitten in GUV's29 en transmembraaneiwitten30 onderzocht door nieuwe hybride blaasjes te creëren, terwijl celspecifieke medicijnafgifte ook is onderzocht om cellulaire reacties of genexpressie te controleren en te bestuderen 28,29,31,32,33. Onlangs is de methode gebruikt om eiwitreacties op membraanbeschadiging te onderzoeken 32,34,35.

Er bestaan verschillende methoden om het plasmamembraan te verstoren om cellulaire reacties en membraanherstel te onderzoeken. Deze omvatten micronaaldpuncties, het schudden van microbeads en celschrapen, die allemaal het celmembraan mechanisch kunnen verstoren 14,36,37. Chemisch geïnduceerde schade kan worden bereikt door wasmiddelen 5,38 of bacteriële toxines39,40 toe te voegen die de lipidedubbellaag destabiliseren en membraanporiën over het plasmamembraan genereren. Bovendien zijn optisch geïnduceerde verwondingen door continue golf en gepulseerde lasers gebruikt om PMR-componenten te bestuderen, zoals annexine-eiwitten 5,14,21,41, in combinatie met plasmonische nanodeeltjes 42,43,44,45. Ondanks de efficiëntie van krachtige gepulseerde lasers, kunnen ze aanzienlijke verwondingen en schade aan het inwendige van de cel veroorzaken langs het straalpad. Bovendien moeten de gedetailleerde veranderingen die optreden in de biologische materie bij gepulseerde laserbestraling en of het een goed gedefinieerde porie creëert, nog verder worden onderzocht. In dit artikel wordt een alternatieve methode gepresenteerd, waarbij gebruik wordt gemaakt van thermoplasmonica om op een gecontroleerde manier nanoscopische gaatjes in de PM te induceren34,35 zonder significante schade aan de interne structuren te veroorzaken. Dit wordt bereikt door plasmonische NP's bloot te stellen aan een zeer gefocuste NIR-laser, wat resulteert in een extreem gelokaliseerde temperatuurstijging die gemakkelijk temperaturen van meer dan 200 °C kan bereiken, wat kan leiden tot kleine nanoscopische explosies 25,46,47. Dit proces kan worden gecontroleerd door de laserintensiteit en de grootte, vorm en samenstelling van de NP's48 aan te passen. Door deze techniek te gebruiken, kunnen onderzoekers de rol van eiwitten in PM-reparatie in levende cellen onderzoeken, wat zou kunnen helpen bij het beantwoorden van enkele van de onbeantwoorde vragen over de betrokkenheid van annexine-eiwitten bij membraanherstel zonder de levensvatbaarheid van de cel in gevaar te brengen.

De optische vangst van plasmonische nanodeeltjes is goed vastgesteld door eerdere studies 25,49,50,51,52; Aanvullende inzichten met betrekking tot de thermoplasmonische eigenschappen van de nanodeeltjes 53,54,55 kunnen echter worden verkregen in de aanvullende materialen (Aanvullend Dossier 1). De thermoplasmonische methode kan worden gebruikt om nanoscopisch kleine gaatjes in de PM te maken met het oog op het bestuderen van de cellulaire respons- en reparatiemechanismen. Om precies te zijn, de punctie kan worden bereikt door de optische verwarming van AuNP's in de nabijheid van het membraan, zoals weergegeven in figuren 1A en B. Deze gelokaliseerde punctie zorgt voor een instroom van Ca2+, die werd geverifieerd door een calciumsensor, waardoor de PMR-machinerie werd geactiveerd. Voor experimenten met levende cellen werden AuNP's met een diameter van 200 nm geïmmobiliseerd op het oppervlak onder de cel om de rol van ANXA2 in PMR te volgen via confocale microscopie. De NIR-laser (Figuur 1A,B), met een golflengte van 1064 nm, bestraalt de AuNP en maakt gebruik van zijn plasmonische eigenschappen (Figuur 1C), wat resulteert in substantiële lokale verwarming (Figuur 1D) in het biologische transparantievenster49 terwijl de cel zelf minimale schade wordt toegebracht. Het gebied met hoge temperaturen rond de AuNP neemt snel af met 30-40% op een afstand die overeenkomt met de straal van de NP, zoals weergegeven in figuur 1E, waardoor een extreem beperkt letsel in alle drie de dimensies mogelijk is.

Aanvullend dossier 1. Klik hier om dit bestand te downloaden.

figure-introduction-1
Figuur 1: Schematische schets van de experimentele methode. (A) ANXA-getransfecteerde cellen bevinden zich bovenop geïmmobiliseerde gouden nanodeeltjes (AuNP's) op het oppervlak, of (B) gigantische unilamellaire blaasjes (GUV's) met ingekapselde ANXA zijn gesuspendeerd in een medium dat AuNP's bevat. (C) Een enkele AuNP wordt bestraald door de optische NIR-val, waarbij de interactie tussen het inkomende elektromagnetische veld en de geleidingselektronen leidt tot de collectieve oscillatie van elektronen binnen de NP. (D) Dit proces resulteert in een zeer beperkte, maar significante temperatuurstijging. Om de temperatuur aan het NP-oppervlak te schatten, wordt de Mie-theorie gebruikt en wordt een (E) temperatuurprofiel berekend voor een AuNP met een diameter van 200 nm en laserintensiteit I = 6,36 x 108 W/cm2. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Om het thermische effect op het celmembraan te minimaliseren, worden de AuNP's slechts ~1 seconde bestraald. Dit veroorzaakt een voorbijgaande en lokale uitbarsting van verhitting, waardoor de schade aan eiwitten die doorgaans meer tijd nodig hebben om zich te ontvouwen, wordt verminderd. Bij het doorboren van het membraan worden annexine-eiwitten in een fractie van een seconde gerekruteerd en binnen enkele seconden wordt een annexineringachtige steiger gevormd rond de plaats van verwonding (Figuur 2). Deze benadering is ook toegepast om de betrokkenheid van ANXA5 in zowel levende cellen als modelmembranen16 te onderzoeken in een poging licht te werpen op het volledige schema van de reparatieprocessen. Hoewel de primaire focus lag op de correlerende rekrutering van verschillende annexine-eiwitten, moeten de biofysische aspecten van het reparatiemechanisme nog worden opgehelderd.

Om de voorgestelde methode volledig te implementeren, zijn drie belangrijke componenten nodig: confocale microscopie, optisch pincet en metalen nanodeeltjes. Optische pincetten worden gebruikt om AuNP's op te vangen en hun constructie kan worden bereikt door de procedure te volgen die is beschreven door Neuman et al.49. Als het bouwen van een optisch pincet echter te uitdagend blijkt te zijn, kan een strak gefocusseerde NIR-laser worden gebruikt om AuNP's te bestralen die onder de cellen zijn geïmmobiliseerd. Hoewel voor dit protocol sferische AuNP's werden gekozen, kon een verscheidenheid aan plasmonische deeltjes met afstembare absorptiespectra ook worden gebruikt om een sterk gelokaliseerde temperatuurgradiënt binnen het NIR-gebied48 te bereiken.

Fluorescentiebeeldvorming is noodzakelijk voor het observeren van de rol van de fluorescerend gelabelde eiwitten, en daarom kan totale interne reflectiemicroscopie (TIRF)56 worden beschouwd als een alternatief voor confocale beeldvorming. Deze techniek maakt echter alleen beeldvorming van het oppervlak mogelijk en zou niet compatibel zijn met de experimenten met modelmembraanblaasjes. Bijgevolg zijn zowel het optische pincet als de confocale microscoop essentieel voor de nauwkeurige lokalisatie van het nanodeeltje en gedetailleerd onderzoek van het lokale gebied rond de celbeschadiging. Om het nanodeeltje effectief te bestralen met een diffractiebeperkte laserfocus, is het noodzakelijk om het nanodeeltje te visualiseren. Dit kan optimaal worden bereikt door reflectiemicroscopie, een standaard beeldvormingsfunctie van Leica confocale microscopen. Als reflectie- of verstrooiingsbeeldvorming echter niet beschikbaar is, kunnen alternatieve methoden, zoals de minder efficiënte fluorescerende AuNP-etikettering, worden overwogen.

Samenvattend heeft de zeer controleerbare en gelokaliseerde thermoplasmonische methode die in deze studie wordt gepresenteerd, het potentieel om te dienen als een uitstekend platform voor het onderzoeken van de moleculaire componenten die betrokken zijn bij cellulaire reacties en PM-herstelmechanismen in levende cellen. Naast het bestuderen van de eiwitrespons op PM-schade, kan deze benadering ook worden gebruikt voor het lokaal doorboren van blaasjes, waardoor een onderzoek van de eiwitrespons in zowel eiwit-eiwit- als eiwit-membraandynamiek mogelijk wordt. Bovendien maakt deze methode een kwantitatieve analyse mogelijk van de interacties tussen eiwitten, lipiden en kleine moleculen wanneer membranen worden verstoord. Gezamenlijk hebben deze vorderingen het potentieel om licht te werpen op enkele van de onopgeloste vragen met betrekking tot de ingewikkelde en complexe plasmamembraanreparatiemachines.

Protocol

1. Voorbereiding van de celmembraanpunctie

  1. Cel zaaien (dag 1)
    1. Kweek menselijke embryonale niercellen (HEK293T) in kweekmedium bij 37 °C in een 5% CO2 -luchtbevochtigerincubator totdat ze 70% confluentie bereiken.
    2. Maak de cellen los van het oppervlak met 500 μL trypsine, tel 200.000 HEK293T cellen en zaai ze in een kweekschaal met een totaal volume van 3 ml kweekmedium. Incubeer de cellen bij 37 °C in een incubator van 5% CO2 -luchtbevochtiger gedurende 24 uur.
      NOTITIE: Om celclustering in het midden van de schaal te voorkomen, verdeelt u de cellen gelijkmatig en vermijdt u het ronddraaien van de schaal, omdat dit de transfectie-efficiëntie kan verminderen.
  2. Celtransfectie (dag 2)
    OPMERKING: De getransfecteerde cellen kunnen tot 48 uur na transfectie worden gebruikt.
    1. Pipetteer het plasmide van belang en het transfectiereagens gedurende 5 s voor gebruik.
    2. Meng in een steriel buisje van 2 ml het volgende in de specifieke volgorde: 500 μL gereduceerd serummedium, 5 μL transfectiereagens (4 keer meer dan het plasmide) en 1,25 μL plasmide (1 μg/μL).
      OPMERKING: Om de calciuminstroom bij membraanbreuk te onderzoeken, volgt u dezelfde procedure, maar gebruikt u de membraangebonden calciumsensorsonde GCaMP6-CAAX (1 μg/μL).
    3. Spuit het transfectiemengsel voorzichtig maar grondig en incubeer het gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur (RT) voordat u het druppelsgewijs aan de cellen toevoegt.
    4. Voordat u het transfectiemengsel toevoegt, verwijdert u het medium uit de kweekschaal, wast u de cellen voorzichtig met 2 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing en voegt u 2000 μL gereduceerd serummedium toe aan het gerecht.
    5. Incubeer de cellen samen met het transfectiemengsel bij 37 °C in een 5% CO2 -luchtbevochtigerincubator gedurende 2 uur en 45 minuten voordat u het medium verandert in 3 ml kweekmedium.
  3. Bereiding van een oplossing van gouden nanodeeltjes (AuNP) (dag 2)
    1. Vortex de 200 nm AuNP voorraadoplossing gedurende 10 s op niveau 10 (zie Materiaaltabel voor verdere specificatie van apparatuur), sonicaat gedurende 5 min (max. amplitude) en weer vortex gedurende 10 s.
    2. Meng 150 μL AuNP's met 850 μL gedestilleerd water tot een totaal volume van 1 ml.
      NOTITIE: De verdunde AuNP-oplossing kan in de koelkast worden bewaard en maximaal 1 maand worden hergebruikt.
  4. Bereiding van het experimentele gerecht (dag 2)
    1. Smeer de microtiterschaal in met 150 μL 0,01%-0,1% celbevestigingsoplossing en incubeer gedurende 15 minuten bij RT.
    2. Was het glasoppervlak twee keer met 500 μL gedestilleerd water en laat het ~10 minuten aan de lucht drogen.
    3. Voeg druppelsgewijs 80 μL AuNP-oplossing toe aan het droge oppervlak.
      NOTITIE: Vortex (10 s), sonicaat (5 min) en vortex (10 s) de verdunde AuNP-oplossing voordat u deze toevoegt aan het gecoate glasoppervlak om AuNP-aggregaten te minimaliseren.
    4. Wacht ~10 minuten voordat u 1,5 ml kweekmedium inbrengt. Laat het gerecht een nacht incuberen bij 37 °C.
  5. Voorbereiding van de experimentele kamer (dag 3)
    OPMERKING: De proefkamer kan op dag 3 of 4 worden voorbereid; Zorg er echter voor dat de volgende voorbereidingen op dezelfde dag als het experiment worden uitgevoerd.
    1. Verwijder het medium uit de cellen in de kweekschaal en was de cellen met 2 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing.
      NOTITIE: Deze stap is essentieel om achtergebleven medium en vuil te verwijderen dat de volgende stappen zou kunnen verstoren.
    2. Voeg 500 μL op enzymen gebaseerde celloslatingsoplossing toe aan het putje en incubeer gedurende 1-3 minuten totdat de cellen zijn losgekomen van de kweekschaal.
    3. Voeg 1,5 ml vers kweekmedium toe en pipetteer de celoplossing om een homogene celoplossing te krijgen om de kans op celclusters te minimaliseren.
    4. Verwijder voorzichtig het medium uit de AuNP's in de experimentele microwell.
    5. Voeg de celoplossing (2 ml) toe aan de microwell en laat deze ten minste 5 uur incuberen voordat u het experiment uitvoert.
      NOTITIE: Vermijd voor optimale experimentele omstandigheden het ronddraaien van de kamer, omdat dit ertoe kan leiden dat cellen in het midden van de kamer clusteren.

2. Experiment met het doorboren van celmembranen

  1. Optische instellingen van het experiment
    1. Voer de experimenten uit met behulp van een confocale scanmicroscoop in combinatie met een 1064 nm vanglaser57.
    2. Voer de optische opvang uit op het brandpuntsvlak met behulp van een 63x wateronderdompelingsobjectief met een numerieke apertuur (NA) van 1.2.
    3. Stel dat de focus zo groot is als een Airy-schijf en dat de brandpuntsstraalbreedte van de bestralingslaser ~540 nm in straal is.
    4. Converteer het laservermogen (P) naar de overeenkomstige laserintensiteit (I) door het laservermogen per gebied (B/cm2) te berekenen.
    5. Gebruik een acousto optische bundelsplitser (AOBS) om meerdere fluorescerende signalen te visualiseren die worden gedetecteerd met behulp van fotomultiplicatorbuizen en gelijktijdige detectie van metalen NP's via hun verstrooiingssignaal.
      OPMERKING: Niet alle confocale systemen zijn uitgerust met AOBS, waarmee reflectiebeeldvorming van metallische NP's mogelijk is. Hier moeten andere vormen van detectie worden geïmplementeerd, of kan een sequentiële scan van de NIR-laser in het gebied onder de cel worden geprobeerd.
    6. Monteer tijdens de experimentele sessies een open kamer met glazen bodem met cellen, moleculaire fluorescerende sondes en gouden nanodeeltjes op de microscoop.
    7. Verplaats de val ten opzichte van de cellen door het monster te vertalen dat op een piëzo-elektrische tafel is gemonteerd, waardoor nanometer-precieze zijwaartse bewegingen mogelijk zijn16.
      NOTITIE: De optische val wordt stationair gehouden.
  2. Experimentele instellingen voor de celmembraanpunctie
    1. Plaats HEK293T cellen, getransfecteerd met annexineplasmiden in combinatie met een fluorescerend eiwit, bovenop geïsoleerde AuNP's die op het glasoppervlak zijn geïmmobiliseerd (Figuur 1A).
    2. Gebruik een Argon 488 nm laser om het GFP-fluorescentiesignaal te visualiseren en een HeNe 633 nm laser voor het observeren van AuNP-reflectie in de confocale scanmicroscoop.
    3. Gebruik het optische pincet, dat werkt met een 1064 nm NIR-laser, om een enkele AuNP gedurende ~1 s te bestralen, waardoor een aanzienlijke lokale temperatuurstijging wordt geïnduceerd die het plasmamembraan verstoort.
    4. Bestraling tussen 200-295 mW toepassen op het gefocusseerde deeltje, resulterend in een substantiële temperatuurstijging.
      NOTITIE: Er is een aanzienlijk vermogensverlies in de optiek, waarbij het laservermogen in het brandpunt ongeveer 20% van de aangegeven milliwatt bereikt, afhankelijk van de specifieke opstelling. De specifieke intensiteit (gemeten in B/cm2) hangt af van de exacte uitlijning van het systeem, met name de brandpuntsafstand. Bovendien is de warmtegeleiding van glas hoger dan die van cel en water, waardoor de hoeveelheid warmte die aan het plasmamembraan wordt afgegeven, wordt verminderd,48,58.
    5. Bereik effectieve en gelokaliseerde PM-verwonding en daaropvolgende eiwitherstelrespons door de lokalisatie van de NIR-laserfocusspot correct te kalibreren. Dit wordt bereikt door een enkele AuNP op te vangen die in hetzelfde beeldvormingsmedium is gesuspendeerd en ervoor te zorgen dat de geselecteerde AuNP scherp is voordat deze wordt bestraald.
      OPMERKING: Het nanodeeltje wordt geacht scherp te zijn wanneer het verstrooiingssignaal het scherpst lijkt, d.w.z. duidelijke randen vertoont en de afwezigheid van een halo rond het deeltje, wanneer het wordt waargenomen in confocale microscopie (Figuur 2C (ii)).
  3. Cel- en AuNP-dichtheidscondities
    1. Kies voor afzonderlijke cellen in plaats van celclusters om overlapping van plasmamembranen te voorkomen.
      OPMERKING: De cellen moeten aan het oppervlak worden gehecht en een afgeplatte morfologie vertonen (aanvullende figuur 1), waardoor de celperiferie kan worden doorboord en schade aan het kernmembraan wordt voorkomen (aanvullende afbeelding 2).
    2. Incubeer de cellen volgens het protocol of totdat ze zijn gesetteld en afgeplat om de cellulaire opname van AuNP te voorkomen. Vermijd overmatige incubatietijd en verminder de kans op AuNP-endocytose met behulp van gePEGyleerde AuNP's.
    3. Zorg ervoor dat de geïmmobiliseerde AuNP's aanwezig zijn als afzonderlijke deeltjes, op voldoende afstand van elkaar om aggregaten te voorkomen. Aggregaten kunnen leiden tot een aanzienlijke toename van de thermische gradiënt, wat resulteert in verhoogde temperaturen die een aanzienlijk deel van de cel kunnen verstoren.
    4. Vervang het monster elke 1-2 uur om de celgezondheid te behouden.
      OPMERKING: Langdurige blootstelling kan leiden tot een verslechtering van de gezondheid van de cellen, waardoor hun vermogen om nauwkeurig te reageren op letsel in termen van membraanherstel in gevaar komt. Deze achteruitgang van de celgezondheid wordt meestal waargenomen door een verandering in celvorm, omdat cellen bolvormiger en stijver lijken, wat uiteindelijk culmineert in celdood.

Aanvullende informatie. Klik hier om dit bestand te downloaden.

3. Bereiding van gigantische unilamellaire blaasjes (GUV)

  1. Bereiding van het lipidenmengsel
    1. Maak de GUV-lipidensamenstelling door 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (DOPC) en 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfo-L-serine (DOPS) lipiden te combineren in een molaire verhouding van 4:1 (zie tabel 1). Aliquot de lipidenvoorraad in glazen injectieflacons van 1,5 ml volgens de experimentele behoeften en bewaar ze bij -20 °C.
      OPMERKING: Voor een langere bewaring van lipiden en om de oxidatie van onverzadigde lipiden te voorkomen, vervangt u de lucht door argon in de gealiquoteerde flacons.
    2. Voordat u de lipiden mengt, moet u een glazen of metalen spuit van 50 μl en 500 μl vijf keer grondig reinigen met chloroform om er zeker van te zijn dat ze vrij zijn van verontreinigingen voor de in chloroform opgeloste lipiden.
      LET OP: Hanteer chloroform in een zuurkast vanwege de toxiciteit.
      1. Breng het berekende volume chloroform over in een schone injectieflacon van amberkleurig glas, gevolgd door de gespecificeerde hoeveelheid van elk lipide (zie tabel 1).
        OPMERKING: Om kruisbesmetting tussen lipidenvoorraden te voorkomen, moet u ervoor zorgen dat de spuiten worden gereinigd met chloroform.
      2. Voeg als laatste de membraankleurstof toe en meng de lipiden grondig door te pipetteren. Bewaar het bereide lipidenmengsel bij -20 °C voor verder gebruik; Het mengsel blijft 2-3 weken levensvatbaar zonder noemenswaardige lipidenschade.
        NOTITIE: Het mengen moet gebeuren met een metalen of glazen spuit. Bewaar de lipiden altijd op ijs als ze uit de vriezer zijn.
  2. Bereiding van polyvinylalcohol (PVA) gel
    1. Bereid de GUV's voor met behulp van de gel-ondersteunde hydratatiemethode beschreven door Weinberger et al.23met kleine aanpassingen.
      1. Bereid de PVA-gel door 5 g PVA op te lossen in 100 ml van een buffer met 50 mM sucrose, 25 mM NaCl en 25 mM Tris (pH 7,4).
      2. Verwarm de PVA-oplossing tot 85 °C en roer tot deze transparant wordt. Laat het afkoelen tot RT en bewaar het in de koelkast voor verder gebruik.
        OPMERKING: PVA is niet goed opgelost in de buffer en daarom is verwarming tot 85 °C noodzakelijk.
  3. Voorbereiding van glasplaatjes
    1. Reinig glasplaatjes met ethanol en laat ze aan de lucht drogen. Behandel de objectglaasjes vervolgens met een luchtplasmareiniger om eventuele restverontreinigingen van het glasoppervlak te verwijderen.
    2. Voorbereiding van PVA-gecoate glasplaatjes
      1. Verwarm de PVA-gel (5%) gedurende 30 minuten tot 60 °C om de vloeibaarheid te vergroten. Breng 90 μL van de warme PVA aan op het objectglaasje, verdeel gelijkmatig en laat het gedurende 50 minuten drogen in een verwarmingskast bij 50 °C.
      2. Zodra het PVA-glasglaasje klaar is, voegt u 30 μL van het bereide lipidenmengsel toe met behulp van een glazen of metalen spuit en verspreidt u dit met de rand van de naald tot een dunne film.
      3. Droog het lipidenmengsel door het chloroformgehalte onder lichte stikstofdruk te verdampen. Droog de glasglaasjes verder 1,5-2 uur onder vacuüm.
  4. GUV's kweken in een kamer
    1. Monteer de interne kamer, qua ontwerp vergelijkbaar met een eerder gepubliceerd rapport59, met behulp van de voorbereide glasplaat.
    2. Verdun in een apart buisje van 2 ml het betreffende recombinante eiwit (in dit geval ANXA5 of ANXA4) tot een eindconcentratie van 500 nM met een groeibuffer (GB) bestaande uit 80 mM sucrose, 70 mM NaCl en 25 mM Tris-HCl (pH 7,4).
    3. Voeg 400 μL van de verdunde recombinante eiwitoplossing toe aan de kamer. Incubeer de kamer bij RT gedurende 1 uur om GUV's uit de afgezette lipidenlaag te laten groeien. Gebruik dezelfde buffer, exclusief het eiwit, als negatieve controle.
      NOTITIE: Wikkel de kamer in polyolefinefolie om bufferverdamping te voorkomen.
    4. Verzamel de GUV's door 400 μL van de kamerinhoud over te brengen naar een buisje van 2 ml.
    5. Verwijder niet-ingekapselde eiwitten buiten de GUV's door 1 ml observatiebuffer (OB) met 55 mM glucose, 70 mM NaCl en 50 mM Tris-HCl (pH 7,4) toe te voegen aan de verzamelde oplossing. Centrifugeer de oplossing vervolgens gedurende 10 minuten bij 13 °C bij 600 x g .
    6. Vervang na het centrifugeren 1 ml van het supernatans door een gelijk volume waarnemingsbuffer. Verspreid de GUV's door voorzichtig pipetteren en bewaar ze in de koelkast totdat ze worden gebruikt in GUV-experimenten.

4. GUV punctie experiment

  1. Voorbereiding van de kamer
    1. Gebruik voor het experiment een schaal met glazen bodem van 35 mm. Om te voorkomen dat GUV's aan het oppervlak blijven kleven en barsten, smeert u het oppervlak gedurende 15-30 minuten in met β-caseïne (5 mg/ml).
      1. Los voor de β-caseïneoplossing 0,1 g van het eiwit op in een buffer van 20 ml van 20 mM Tris (PH 7,5) en 100 mM NaCl. Filtreer de eiwitoplossing, aliquot het in kleine flesjes en vries het in voor verder gebruik.
    2. Was de kamer twee keer met observatiebuffer om overtollige vrije β-caseïne van het oppervlak te verwijderen en laat drogen bij RT.
    3. Meng in een apart buisje van 2 ml de opgevangen GUV's met OB. Voeg CaCl2 toe aan het mengsel voor de gewenste eindconcentratie (in dit geval 200 μM).
    4. Introduceer 150 nm gouden nanoshells (AuNS's) in het mengsel in een verhouding van 1:100. Het uiteindelijke mengsel bestaat uit 250 μL GUV's, 225 μL OB, 20 μL CaCl2 (5 mM) en 5 μL van de gespecificeerde AuNS's.
  2. Experimentele opstelling
    1. Breng het mengsel over naar de kamer en monteer het op de microscooptafel. Voeg afhankelijk van de grootte van de kamer het hele mengsel of een deel van het mengsel toe.
      OPMERKING: Timing is van cruciaal belang omdat calciumionen door het membraan kunnen gaan en de binding van de bijlagen aan het interne blad van het membraan kunnen bemiddelen.
    2. Gebruik dezelfde optische opstelling die wordt gebruikt voor de experimenten met het doorboren van cellen.
    3. Gebruik het optische pincet om een individuele AuNS in de buurt van of op het oppervlak van een GUV te vangen door een laservermogen van ~ 125 mW toe te passen.
    4. Verhoog vervolgens het laservermogen tot ~ 300 mW. Dit veroorzaakt een zeer plaatselijke temperatuurstijging, die het membraan op de doelplaats verstoort en doorboort.
      OPMERKING: AuNS's hebben de voorkeur voor de GUV-experimenten vanwege hun vermogen om een hogere tijdelijke temperatuurstijging te genereren met behoud van een kleinere omvang in vergelijking met vaste AuNP's.

figure-protocol-1
Tabel 1: Tabel voor het bepalen van de GUV-samenstelling. Klik hier om deze tabel te downloaden.

5. Metingen en data-analyse van ANXA-respons in celpunctie-experimenten

  1. Gebruik MATLAB om de beelden te analyseren en om het AuNP-temperatuurprofiel te berekenen en uit te zetten (Figuur 1D, E) op basis van Mie's vergelijkingen60,61.
  2. Verwerk bovendien alle confocale beelden met behulp van de FIJI ImageJ-distributie62,63.
  3. Berekening van de ANXA-ringstraal
    1. Snijd het interessegebied met het doorboorde gebied uit de onbewerkte gegevens voorafgaand aan de analyse van membraanletsel.
    2. Gebruik de interne MATLAB-workflow voor het verwerken van elke afbeelding door handmatig het midden van de ANXA-ring en de buitenomtrek te markeren.
      1. Gebruik deze markeringen om de verwerkingslimieten voor het betreffende gebied in te stellen.
        OPMERKING: Het gebied wordt vervolgens radiaal verwerkt binnen de ingestelde limieten en de fluorescentie-intensiteit op een specifieke afstand tot het centrum is het gemiddelde over de volledige cirkel met dezelfde centrumafstand. Dit nummer wordt opgeslagen voor elke straalstap.
      2. Gebruik de werkstroom om de gemiddelde intensiteiten over het gehele scanbereik aan te passen aan een eendimensionale Gauss-curve om de maxima (Rp) en de volledige breedte op de helft van het maximum (FWHM) te identificeren die overeenkomen met respectievelijk Rext en Rint, zoals weergegeven in afbeelding 3A.
    3. Bepaal ten slotte de straal van de ANXA-ring door de afstand van het midden van de ring tot Rext gegeven door de plot die wordt gegenereerd door de MATLAB-workflow.
  4. Driedimensionale berekening van de ANXA-ringstraal
    1. Volg de verandering in ANXA-ringstraal in de z-richting met behulp van dezelfde MATLAB-analyseworkflow als in stap 5.1. Pas de workflow toe op verschillende confocale z-secties over de membraanwond, zoals geïllustreerd in figuur 3C, E.
    2. Bereken de helling voor elke wond op basis van de verandering in stralen over de z-secties, zoals weergegeven in figuur 3F.
  5. Tijdsevolutie van de ANXA-ringstraal
    1. Volg op dezelfde manier de evolutie van de ANXA-ring van de ANXA-ring na thermoplasmonische membraanpunctie met behulp van de MATLAB-analyseworkflow uit stap 5.1. Analyseer opeenvolgende tijdstippen om veranderingen in de loop van de tijd te volgen, zoals weergegeven in figuur 3D, G, H.

Resultaten

In de huidige studie wordt de thermoplasmonische methode gebruikt om de annexine-eiwitrespons op verstoring van het plasmamembraan te onderzoeken; Elk eiwit dat kan worden gerekruteerd na membraanbeschadiging kan echter worden onderzocht met behulp van deze test, aangezien het betreffende eiwit fluorescerend is geëtiketteerd. Eiwitrekrutering en -functie worden gecontroleerd door confocale beeldvorming in zowel menselijke embryonale niercellen (HEK293T) als gigantische unilamellaire blaasjes (GUV's). Ter verduidelijking illustreert figuur 2 de experimentele omstandigheden waarin een gefocuste NIR-laserstraal van 1064 nm wordt gebruikt om een enkele AuNP te bestralen (figuur 2A), wat resulteert in membraanbeschadiging en een instroom van Ca2+ in de cel, waardoor de PMR-machinerie wordt geactiveerd. Vervolgens worden annexines snel gerekruteerd naar de plaats van de verwonding, waar ze zich binden aan de negatief geladen fosfolipiden aan de wondomtrek en binnen enkele seconden een ringachtige structuur vormen (Figuur 2B, i-iv). De modelmembraanexperimenten, met behulp van GUV's, toonden aan dat membraanpuncties snel opnieuw werden verzegeld in afwezigheid van ANXA, zoals weergegeven in figuur 2C. In aanwezigheid van ANXA werd echter een snelle accumulatie van ANXA waargenomen op de plaats van de verwonding na een membraanpunctie (figuur 2D). Met name ANXA bleef de blootgestelde randen rollen, wat uiteindelijk leidde tot het barsten van de GUV. Aangenomen wordt dat dit rolmechanisme voortkomt uit het vermogen van ANXA om kromming te induceren en lipidemembranen te buigen20.

figure-results-1
Figuur 2: Annexinen (ANXA's) respons op thermoplasmonisch geïnduceerde membraanverstoring. Aanvankelijk fungeert (A) het plasmamembraan als een barrière tussen de extracellulaire omgeving met hoge niveaus van Ca2+-ionen en de intracellulaire omgeving met ingekapselde ANXA's. Bij bestraling met een nabij-infrarood (NIR) laser genereert de AuNP aanzienlijke warmte, waardoor het membraan scheurt en er een instroom van Ca2+-ionen ontstaat. Bijgevolg wordt de plasmamembraanreparatiemachine (PMR) geactiveerd, waarbij ANXA's worden gerekruteerd naar de plaats van verwonding, waar ze zich binden aan negatief geladen fosfolipiden. (B-D) Confocale microscopiebeelden van een cel die ANXA2 bevat en een GUV die ANXA4 bevat, demonstreren dit proces. (i) Voorafgaand aan de doorstraling tonen de beelden een intacte cel, of GUV, waarbij de bestralingsplaatsen worden aangeduid met de witte pijlen. (ii) Bij bestraling van nanodeeltjes (B) worden ANXA's snel gerekruteerd naar de plaats van de verwonding en vormen ze een ringachtige structuur rond de membraanwond (B [ii-iv]). Paneel (C) toont een met membraan bevlekte GUV zonder ANXA, die bij punctie snel opnieuw afdicht zonder waarneembare membraanremodellering. Aan de andere kant toont paneel (D) een GUV die recombinant ANXA4 bevat, dat al aan het membraan is gebonden vóór (i) bestraling als gevolg van Ca2+ lekkage over het membraan. (ii) Bij het prikken bindt ANXA4 zich aan de vrije randen, waardoor de GUV instort als het membraan van de rand wegrolt. De schaalbalken meten 10 μm voor figuur (B), 2 μm voor B (i), 10 μm voor (C) en 15 μm voor (D). Deze figuur is gereproduceerd uit Moreno-Pescador et. al16 met toestemming van de Royal Society of Chemistry. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De analyse van volledige ANXA-ringachtige structuren (Figuur 2B en aanvullende Figuur 1) geeft nuttige inzichten in de wondgrootte en morfologie. De straal van de ANXA-ringstructuur kan worden bepaald in tijd en ruimte, zoals beschreven in hoofdstuk 5. Moreno et al.16 analyseerden meer dan 135 plasmamembraanletsels in levende cellen, waarbij de analyse van ANXA5-ringstructuren wordt weergegeven in figuur 3. De straal werd bepaald door de afstand van het midden van de ring tot de buitenstraal van de curve te meten op basis van de volledige breedte-half-maximum van het ingeklapte intensiteitsprofiel (Figuur 3A). De bevindingen illustreerden een heterogene verdeling van ANXA5-ringmaten (Figuur 3B), die constant bleef in de tijd (Figuur 3D, G, H) en ruimte (Figuur 3C, E, F). Deze resultaten suggereren een accumulatie van ANXA5 rond de verwondingsplaatsen, wat wijst op een alternatieve ANXA5-gemedieerde PMR-strategie in levende cellen voor de veronderstelde trechterachtige binnenwaartse ontluiking van het beschadigde membraan5.

figure-results-2
Figuur 3: Analyse van ANXA5-ringstructuren rond een verwondingsplaats in levende cellen. (A) De schematische weergave illustreert de analytische benadering, die is gebaseerd op het maximum over de volledige breedte en de helft van het ANXA-intensiteitslijnprofiel. (B) Het histogram illustreert 135 gemeten ANXA5-ringstralen. (C) Fluorescentie-intensiteitslijnprofielen over een ANXA5-GFP-ring voor elke z-sectie van de z-stack. (D) De confocale beelden illustreren de tijdsevolutie van een wond, waarbij ANXA5-GFP zich ophoopt aan de wondomtrek onmiddellijk na het letsel, gevolgd door wondstabilisatie. De tijdframes met het label 1-6 werden vastgelegd met intervallen van 0,66 s per frame. De schaalbalk is 2 μm. (E) De stralen van de wonden werden bepaald als functie van de wonddiepte op basis van de methode gepresenteerd in paneel A. (F) De helling van de wond werd geanalyseerd als ANXA5-ringstralen als functie van de z-hoogte op basis van de gegevens die werden geëxtraheerd uit paneel E. (G) De lijnprofielen van de fluorescentie-intensiteit werden gemeten over de ANXA5-GFP-ring van paneel D, waarbij elk tijdsinterval 1-6 wordt aangeduid als schijf 1-6. Ten slotte (H) wordt de tijdsevolutie van de ANXA5-GFP-ringstralen voorgesteld als een functie van de tijd berekend op basis van de gegevens in paneel G. Deze figuur is gereproduceerd uit Moreno-Pescador et. al16 met toestemming van de Royal Society of Chemistry. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

In vergelijking met de ringachtige structuren die worden gevormd door alleen de PM te verstoren (aanvullende figuur 1), kunnen verwondingen in de nabijheid van de kern (aanvullende figuur 2A) de evolutie en geometrie van de wond beïnvloeden. Af en toe was slechts een fractie van de ANXA-ringen zichtbaar (aanvullende figuur 2B,C), die ook kan worden geanalyseerd met behulp van de interne MATLAB-analyseworkflow (zie sectie 5), hoewel aanvullende gegevens verloren kunnen gaan. Doorgaans bevinden ANXA-ringformaties die worden waargenomen in niet-hechtende cellen (aanvullende figuur 2C) zich dicht bij zowel de kern als de periferie van de cel. Als gevolg hiervan kan een meer langgerekte ringstructuur worden waargenomen, wat suboptimaal is voor de gepresenteerde data-analyse. Bovendien bleken niet-aanhangende cellen vatbaarder te zijn voor celdood na PM-letsel. Bovendien is het belangrijk op te merken dat bij het overwegen van verwondingen als gevolg van de bestraling van AuNP-aggregaten deze verwondingen ernstiger en minder beheersbaar kunnen zijn. Dit komt door de aanzienlijke toename van plasmonische verhitting, die een groot deel van de cel kan beschadigen. Als gevolg hiervan zijn dergelijke verwondingen niet opgenomen in de ANXA5-ringanalyse.

Bovendien geven de voorlopige bevindingen aan dat de verstoring van het plasmamembraan met behulp van thermoplasmonics resulteert in verhoogde intracellulaire Ca2+- niveaus. Dit werd zelfs waargenomen bij bestraling met lage intensiteit van enkelvoudige AuNP's, wat wijst op PM-permeabilisatie35, zoals weergegeven in figuur 4. De instroom van Ca2+ werd waargenomen in cellen die een membraangebonden calciumsonde, GCaMP6s-CAAX, tot expressie brengen, die een conformatieverandering ondergaat bij de instroom van Ca2+ , en dus kan een toename van de intensiteit worden waargenomen64. De calciumintensiteit werd gekwantificeerd voor de gehele voetafdruk van de cel in de loop van de tijd. Om achtergrondruis te elimineren, werd het achtergrondniveau Ca2+ afgetrokken voorafgaand aan membraanverstoring en herstel na het membraan. De maximale intensiteit werd bepaald door de gemiddelde Ca2+ intensiteit in de cel te normaliseren, wat resulteerde in een intensiteitscurve die een snelle initiële toename van de Ca2+ intensiteit vertoonde, gevolgd door een langzamere afname, zoals weergegeven in figuur 4B.

De cel bereikte een maximale calciumintensiteit van ~ 6,6 s, wat consistent is met de bevindingen van Klenow et al.64, die suggereerden dat de tijd van de calciumintensiteitspiek (t = tc) overeenkomt met de tijd die nodig is voor het sluiten van de wond. Hoewel verder onderzoek nodig is om het onderliggende mechanisme van membraanherstel en wondgenezing vast te stellen, toonden de voorlopige bevindingen echter aan dat dit Ca2+- proces uitsluitend werd waargenomen in de beschadigde cel en niet in de niet-beschadigde cel die als positieve controle werd gebruikt. Dit bevestigt dat de cel Ca2+- instroom ervoer bij verstoring van het thermoplasmonische membraan, waarbij het overtollige intracellulaire calcium actief wordt weggepompt na succesvolle PMR, aangezien het intracellulaire calciumniveau niet langer concurreert met de Ca2+- instroom, waardoor uiteindelijk celhomeostatse64 wordt bereikt.

figure-results-3
Figuur 4: Calciuminstroom treedt op als het plasmamembraan van een HEK293T cel wordt gescheurd door thermoplasmonica. Een reeks confocale beelden toont twee cellen (de cel van belang en een niet-gewonde cel die als positieve controle wordt gebruikt) die de membraangebonden calciumsonde, GCaMP6s-CAAX, tot expressie brengen. De schaalbalk meet 10 μm. (A) Voorafgaand aan de bestraling, om 00:00 s, wordt de voetafdruk van de twee cellen gevisualiseerd door de grijze stippellijn en de bestralingsplaats wordt aangegeven door de gele cirkel. Bij laserbestraling wordt een snelle instroom van Ca2+ waargenomen, die de maximale intensiteit bereikt bij ~ 6,6 s, aangegeven door de oranje stippellijn, een tijdstip waarvan wordt aangenomen dat het overeenkomt met het tijdstip van wondsluiting64. (B) Het calciumintensiteitsprofiel verkregen uit de GCaMP6s-CAAX-sonde in de gewonde cel (blauwe lijn) werd vergeleken met de Ca2+ -intensiteit in een naburige niet-beschadigde cel (grijze stippellijn), waarbij een duidelijke Ca2+ -instroom uitsluitend bij PM-verstoring werd getoond. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussie

De studie benadrukt de thermoplasmonische benadering als een veelbelovende techniek voor het onderzoeken van eiwitreacties in levende cellen en modelmembranen na membraanverstoring. Deze methode levert niet alleen uitgebreide informatie op over eiwitrekrutering, maar ook over de biofysische functie van eiwitten die betrokken zijn bij de dynamiek van eiwitten en membranen. Bijgevolg vergemakkelijkt het de identificatie van moleculaire componenten die verantwoordelijk zijn voor oppervlakteherstel en bevordert het het begrip van de complexe maar vitale machinerie van plasmamembraanreparatie. Hoewel er verschillende methoden bestaan voor het induceren van membraanverstoring, zoals mechanische, chemische en optische technieken, hebben deze methoden te lijden aan beperkingen, zoals niet-specifiek zijn voor cellen, het veroorzaken van meerdere verwondingen aan het celmembraan of het veroorzaken van aanzienlijke schade aan het membraan en het ablateren van intern cellulair materiaal langs het laserpad bij gebruik van krachtige gepulseerde lasers. Hoewel de integratie van confocale microscopie en een optisch pincet de meest uitgebreide informatie biedt, kunnen ook alternatieve beeldvormingsmodaliteiten worden gebruikt. Bijvoorbeeld, aangezien de beeldvorming van het plasmonische nanodeeltje wordt bereikt met behulp van reflectiemicroscopie, een ingebouwde beeldvormingsmodus in Leica confocale microscopen, kunnen aanvullende beeldvormingstechnieken, zoals donkerveldmicroscopie65,66, andere verstrooiingsmethoden zoals iSCAT67,68, of fluorescerende etikettering van het nanodeeltje, worden gebruikt voor AuNP-visualisatie, hoewel dit de toepasbaarheid van de methode zou kunnen beperken.

De gepresenteerde methode is bovendien in staat om nanoscopisch kleine gaatjes in modelmembranen te induceren, waardoor de synergie-effecten tussen verschillende annexines kunnen worden onderzocht. Dit wordt bereikt door verschillend gelabelde recombinante annexines in te kapselen, bijvoorbeeld RFP en GFP, respectievelijk, gevolgd door thermoplasmonische punctie. Dit modelsysteem geeft inzicht in de interactie tussen annexines en membranen in de buurt van vrije randen, zoals te zien is in figuur 2D. In tegenstelling tot in cellen blijven de gaten die aan GUV's worden toegebracht echter uitzetten, gevolgd door destabilisatie van het blaasje. Het in beeld brengen van de evolutie van het gat met behulp van confocale microscopie kan een uitdaging zijn vanwege de snelle uitbreiding van de gatdiameter, maar kan worden bereikt door in de loop van de tijd verschillende z-stapels vast te leggen. Een alternatieve methode zou zijn om een draaiende schijf confocaal te gebruiken voor snellere beeldvorming. Bovendien levert de thermoplasmonische benadering doorgaans een beperkt aantal optimale resultaten per uur op wanneer deze wordt toegepast op afzonderlijke cellen of GUV-experimenten, meestal twee tot drie, bij monstertemperaturen tussen 20 °C en 30 °C. Om de meest nauwkeurige waarneming van de dynamiek van eiwitten en membranen te verkrijgen, wordt aanbevolen om de cellen in een HEPES-bevattende buffer te houden en het monster elk uur te vervangen. Als alternatief kan het experimentele venster worden verlengd door de experimenten uit te voeren in een celincubatiekamer, d.w.z. bij een constante temperatuur van 37 °C met 5% CO2 . Bovendien zou het combineren van deze benadering met andere beeldvormingstechnieken, zoals stochastische optische reconstructiemicroscopie (STORM), een dieper begrip kunnen opleveren van de biofysische functie en interactie van belangrijke eiwitten die betrokken zijn bij membraanherstel op het niveau van één molecuul. Dit zou gedetailleerde informatie kunnen opleveren over de plaats van de verwonding, inclusief de wondgeometrie en locatie van annexine-eiwitten, en andere belangrijke spelers kunnen identificeren die betrokken zijn bij het repareren van het membraanoppervlak.

Om maximale effectiviteit en precisie te bereiken bij het induceren van membraanletsel, is het absoluut noodzakelijk om voorafgaand aan elk experiment de locatie van de laserfocus te verifiëren en ervoor te zorgen dat de axiale positie van de laserfocus samenvalt met de confocale focus. Deze uitlijning optimaliseert de intensiteit tijdens AuNP-beeldvorming, wat leidt tot een maximale lokale temperatuurstijging en daaruit voortvloeiend membraanletsel bij een lager laservermogen. Dit proces wordt handmatig uitgevoerd en is daarom gevoelig voor variabiliteit in de efficiëntie van membraanbreuken, aangezien de focus handmatig wordt vertaald naar een positie die samenvalt met de locatie van het deeltje. In microscopen die geen reflectiemodus hebben, zoals in sommige commerciële systemen, kan co-lokalisatie van de laserfocus en het deeltje een uitdaging zijn. In dergelijke gevallen kunnen alternatieve beeldvormingsmodi (bijv. helder veld) worden gebruikt en kan een langzame rasterscan worden uitgevoerd rond de verwachte deeltjespositie. Opgemerkt moet worden dat een laag laservermogen waarschijnlijk alleen membraanpermeabilisatie induceert, terwijl een hoog laservermogen temperaturen rond de NP kan genereren die het kookpunt van water overschrijden, zelfs als het glasoppervlak een koelend effect heeft. Geschat wordt dat de vorming van nanobellen rond de NP's plaatsvindt tussen 200 °C en 300 °C25,48, waarbij de explosieve hitte kan leiden tot verplaatsing van deeltjes van de laserfocus of deeltjesfragmentatie. Bovendien vormt de vorming van nano- of microbellen tijdens verhitting een uitdaging voor deze methode. Aangezien luchtinterfaces membranen ontnat maken en eiwitdestabilisatie kunnen veroorzaken, wat ongewenst is, is het absoluut noodzakelijk om de verwarming te beperken bij het onderzoeken van membraanreparatie. Met name gouden nanoschelpen verdragen geen hoge temperaturen en zullen onder deze omstandigheden degraderen, zoals aangetoond door microscopie met hoge resolutie58.

Dit artikel biedt een gedetailleerd protocol voor het gebruik van thermoplasmonics om sterk gelokaliseerde puncties in membranen uit te voeren, dat van toepassing is op zowel cellen als modelmembranen. Om de mate van verhitting verder te verminderen, kunnen kleinere nanodeeltjes die resoneren met NIR-licht worden gebruikt, waardoor intracellulaire puncties in endosomen, het endoplasmatisch reticulum en de nucleaire envelop mogelijk worden. Dergelijke nanodeeltjes, met inbegrip van staafjes en nanomatroesjka's48, kunnen worden gebruikt om het herstel van de nucleaire envelop te onderzoeken door zich te richten op endocytose gouden nanodeeltjes die gemakkelijk aan het celoppervlak worden opgenomen en naar de kern69 worden getransporteerd. Over het algemeen maakt deze techniek de identificatie en het onderzoek mogelijk van de belangrijkste moleculaire componenten die betrokken zijn bij PMR, waardoor hun biofysische functie en rol wordt opgehelderd met behoud van de levensvatbaarheid van de cellen.

Openbaarmakingen

De auteurs hebben niets te onthullen.

Dankbetuigingen

We willen Jesper Nylandsted bedanken voor het leveren van recombinante annexine-eiwitten en plasmiden die coderen voor annexines. Dit werk werd financieel ondersteund door de Deense Raad voor Onafhankelijk Onderzoek, Natuurwetenschappen (DFF-4181-00196), door het Interdisciplinair Synergyprogramma 2018 van de Novo Nordisk Foundation (NNF18OC0034936), het Wetenschappelijk Comité Danish Cancer Society (R90-A5847-14-S2), de Lundbeck Foundation (R218-2016-534) en door het Lundbeck Foundation Center of Excellence (Biomembranes in Nanomedicine).

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel
NaamBedrijfCatalogusnummerOpmerkingen
1064 nm trapping laserSpectra PhysicsN/ASpectra Physics J201-BL-106C, Nd: YVO4 NIR laser
160 nm Gold NanoshellsNanoComposixNCXGSIR150
200 nm Gold NanoparticlesBBI SolutionsEM.GC200/7
35 mm glass surface MatTex microwellMATTEKP35G-1.5-14-C
Amber-glass vialsSupelco Sigma Aldrich243438
Annexin A2 plasmidsN/AN/AOntvangen van onze medewerker bij het Deense Cancer Research Center
Annexin A4 recombinant-protein N/AN/AN-terminal GFP tagged ANXA4 ontvangen van onze medewerker bij het Deense Cancer Research Center
Annexin A5 recombinant-protein N/AN/AN-terminal GFP tagged ANXA5 ontvangen van onze medewerker bij het Deense Cancer Research Center
beta-caseinSigma Life ScienceC6905-1G
CaCl2Suprlco (sigma Aldrich)10035-04-8
Centrifuge 5702Eppendorf5702
ChloroformVWR Chemicals67-66-3
Culture dish (Nunclon Delta Surface)Thermo scientific150460
DID cell-labelling SolutionInvitrogen 7757
Distilled waterGibco15230-089
DOPCAvanti Polar Lipids850375COpgelost in chloroform 
DOPSAvanti Polar Lipids840035CDissolved in chloroform
Dulbecco's Modified Eage's MediumThermo Fisher Scientific11995065
FIJI ImageJ distributionImageJ2N/A
GCaMP6s-CAAXN/AOntvangen van onze medewerker bij het Deense Cancer Research Center
Gibco Fetal Bovine SerumFisher Scientific1157339710% van het kweekmedium
GlucosePROLABO24 374.297
Hamilton syringesHamilton CompanyN/A50 en 500 microliters
Harrick Plasma Cleaner PDG-002Harrick PlasmaN/A
HEK293T cellsN/AOntvangen van onze medewerker bij het Deense Cancer Research Center
Leica Acousto-Optical Beam Splitter (AOBS)LeicaN/A
Leica PL APO 63x water immersion objective, NA = 1.2LeicaN/A
Leica SP5 confocal scanning microscopeLeicaN/A
LipofectamineFisher Scientific15338030
MatLabThe Mathworks, Inc., Natick, Massachusetts, United StatesN/A
NaClVWR Chemicals7647-14-5
Opti-MEM Reduced-Serum MediumThermo Fisher Scientific11058021
ParafilmBemisPM-992
Penicillin-StreptomycinThermo Fisher Scientific151401221% van het kweekmedium
Phosphate Buffered Saline (PBS)Thermo Fisher Scientific10010023
Piezoelectric stage (PI 731.20) Physik Instrumente (Germany)N/A
Poly-L-LysineSigma-AldrichP8920-100ML0,01-0,1% voor coating
Polyvinyl alcoholSigma-Aldrich363065-25G
round glass slide 25 mm ØVWR631-1584
Sonicator Brandson 2800BrandsonN/A
sucroseSigma Life Science57-50-1
T25 tissue culture flaskFalcon353108Blauwe Ventielkaap
Tris-HClInvitrogen 15567-027
TrypLEThermo Fisher ScientificA1285901
Trypsin-EDTAFisher Scientific11590626
 VWR Mixer mini vortex 230V EUVWR 12620-84 ECN: 444-2790, SN: 150713022

Referenties

  1. Bendix, P. M., et al. Interdisciplinary synergy to reveal mechanisms of annexin-mediated plasma membrane shaping and repair. Cells. 9 (4), 1029(2020).
  2. Gajic, O., Lee, J., Doerr, C. H., Berrios, J. C., Myers, J. L., Hubmayr, R. D. Ventilator-induced Cell Wounding and Repair in the Intact Lung. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 167, 1057-1063 (2003).
  3. McNeil, P. L., Khakee, R. Disruptions of muscle fiber plasma membranes. Role in exercise-induced damage. The American Journal of Pathology. 140 (5), 1097-1109 (1992).
  4. Yu, Q. C., McNeil, P. L. Transient disruptions of aortic endothelial cell plasma membranes. The American Journal of Pathology. 141 (6), 1349-1360 (1992).
  5. Boye, T. L., et al. Annexin A4 and A6 induce membrane curvature and constriction during cell membrane repair. Nature Communications. 8, 1623(2017).
  6. Bischofberger, M., Gonzalez, M. R., van der Goot, F. G. Membrane injury by pore-forming proteins. Current Opinion in Cell Biology. 21, 589-595 (2009).
  7. Tang, S. K. Y., Marshall, W. F. Self-repairing cells. Science (New York, N.Y.). 356, 1022-1025 (2017).
  8. Abreu-Blanco, M. T., Verboon, J. M., Parkhurst, S. M. Single cell wound repair: Dealing with life's little traumas. Bioarchitecture. 1, 114-121 (2011).
  9. Sønder, S. L., et al. Annexin A7 is required for ESCRT III-mediated plasma membrane repair. Scientific Reports. 9, 6726(2019).
  10. Andrews, N. W., Almeida, P. E., Corrotte, M. Damage control: cellular mechanisms of plasma membrane repair. Trends in Cell Biology. 24 (12), 734-742 (2014).
  11. Idone, V., Tam, C., Goss, J. W., Toomre, D., Pypaert, M., Andrews, N. W. Repair of injured plasma membrane by rapid Ca2+-dependent endocytosis. The Journal of Cell Biology. 180 (5), 905-914 (2008).
  12. Lauritzen, S. P., Boye, T. L., Nylandsted, J. Annexins are instrumental for efficient plasma membrane repair in cancer cells. Seminars in Cell & Developmental Biology. 45, 32-38 (2015).
  13. Häger, S. C., Nylandsted, J. Annexins: players of single cell wound healing and regeneration. Communicative & Integrative Biology. 12 (1), 162-165 (2019).
  14. Jaiswal, J. K., et al. S100A11 is required for efficient plasma membrane repair and survival of invasive cancer cells. Nature Communications. 5, 3795(2014).
  15. Draeger, A., Monastyrskaya, K., Babiychuk, E. B. Plasma membrane repair and cellular damage control: The annexin survival kit. Biochemical Pharmacology. 81 (6), 703-712 (2011).
  16. Moreno-Pescador, G. S., et al. Thermoplasmonic nano-rupture of cells reveals annexin V function in plasma membrane repair. Nanoscale. 14 (21), 7778-7787 (2022).
  17. Zhivotovsky, B., Orrenius, S. Calcium and cell death mechanisms: A perspective from the cell death community. Cell Calcium. 50 (3), 211-221 (2011).
  18. Gerke, V., Moss, S. E. Annexins: From structure to function. Physiological Reviews. 82 (2), 331-371 (2002).
  19. Idone, V., Tam, C., Andrews, N. W. Two-way traffic on the road to plasma membrane repair. Trends in Cell Biology. 18 (11), 552-559 (2008).
  20. Boye, T. L., et al. Annexins induce curvature on free-edge membranes displaying distinct morphologies. Scientific Reports. 8, 10309(2018).
  21. Bouter, A., et al. Annexin-A5 assembled into two-dimensional arrays promotes cell membrane repair. Nature Communications. 2, 270(2011).
  22. Boye, T. L., Nylandsted, J. Annexins in plasma membrane repair. Biological Chemistry. 397 (10), 961-969 (2016).
  23. Weinberger, A., et al. Gel-assisted formation of giant unilamellar vesicles. Biophysical Journal. 105 (1), 154-164 (2013).
  24. Numata, T., Tatsuta, H., Morita, Y., Otani, Y., Umeda, N. Localized thermal processing with a laser-trapped and heated metal nanoparticle. IEEJ Transactions on Electrical and Electronic Engineering. 2, 398-401 (2007).
  25. Bendix, P. M., Reihani, S. N. S., Oddershede, L. B. Direct measurements of heating by electromagnetically trapped gold nanoparticles on supported lipid bilayers. ACS Nano. 4 (4), 2256-2262 (2010).
  26. Kyrsting, A., Bendix, P. M., Stamou, D. G., Oddershede, L. B. Heat profiling of three-dimensionally optically trapped gold nanoparticles using vesicle cargo release. Nano Letters. 11 (2), 888-892 (2011).
  27. Andersen, T., Kyrsting, A., Bendix, P. M. Local and transient permeation events are associated with local melting of giant liposomes. Soft Matter. 10 (24), 4268-4274 (2014).
  28. Bahadori, A., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. Hot-nanoparticle-mediated fusion of selected cells. Nano Research. 10, 2034-2045 (2017).
  29. Rørvig-Lund, A., Bahadori, A., Semsey, S., Bendix, P. M., Oddershede, L. B. Vesicle fusion triggered by optically heated gold nanoparticles. Nano Letters. 15 (6), 4183-4188 (2015).
  30. Moreno-Pescador, G., Arastoo, M. R., Ruhoff, V. T., Chiantia, S., Daniels, R., Bendix, P. M. Thermoplasmonic vesicle fusion reveals membrane phase segregation of influenza spike proteins. Nano Letters. 23 (8), 3377-3384 (2023).
  31. Bahadori, A., Lund, A. R., Semsey, S., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. Controlled cellular fusion using optically trapped plasmonic nano-heaters. SPIE Proceedings. SPIE 9922, Optical Trapping and Optical Micromanipulation XIII. 992211, (2016).
  32. Bahadori, A., Moreno-Pescador, G., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. Remotely controlled fusion of selected vesicles and living cells: a key issue review. Reports on Progress in Physics. 81 (3), 32602(2018).
  33. Moreno-Pescador, G., Arastoo, M. R., Chiantia, S., Daniels, R., Bendix, P. M. Thermoplasmonic induced vesicle fusion for investigating membrane protein phase affinity. bioRxiv. , (2022).
  34. Pescador, G. S. M., et al. Investigating plasma-membrane repair employing thermoplasmonics. Biophysical Journal. 120 (3), 45A(2021).
  35. Moreno-Pescador, G. S., Qoqaj, I., Thusgaard Ruhoff, V., Iversen, J., Nylandsted, J., Bendix, P. M. Effect of local thermoplasmonic heating on biological membranes. SPIE 11083, Optical Trapping and Optical Micromanipulation XVI. 110830M, (2019).
  36. Bement, W. M., Mandato, C. A., Kirsch, M. N. Wound-induced assembly and closure of an actomyosin purse string in Xenopus oocytes. Current Biology. 9 (11), 579-587 (1999).
  37. Weisleder, N., et al. Recombinant MG53 protein modulates therapeutic cell membrane repair in treatment of muscular dystrophy. Science Translational Medicine. 4 (139), 139ra85(2012).
  38. Sudji, I. R., Subburaj, Y., Frenkel, N., García-Sáez, A. J., Wink, M. Membrane disintegration caused by the steroid saponin digitonin is related to the presence of cholesterol. Molecules. 20 (11), 20146-20160 (2015).
  39. Babiychuk, E. B., Monastyrskaya, K., Potez, S., Draeger, A. Intracellular Ca2+ operates a switch between repair and lysis of streptolysin O-perforated cells. Cell Death & Differentiation. 16, 1126-1134 (2009).
  40. Nygård Skalman, L., Holst, M. R., Larsson, E., Lundmark, R. Plasma membrane damage caused by listeriolysin O is not repaired through endocytosis of the membrane pore. Biology Open. 7 (10), bio035287(2018).
  41. Swaggart, K. A., et al. Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 6004-6009 (2014).
  42. Yeheskely-Hayon, D., Minai, L., Golan, L., Dann, E. J., Yelin, D. Optically induced cell fusion using bispecific nanoparticles. Small. 9 (22), 3771-3777 (2013).
  43. Minai, L., Yeheskely-Hayon, D., Golan, L., Bisker, G., Dann, E. J., Yelin, D. Optical nanomanipulations of malignant cells: Controlled cell damage and fusion. Small. 8 (11), 1732-1739 (2012).
  44. Lukianova-Hleb, E., et al. Plasmonic nanobubbles as transient vapor nanobubbles generated around plasmonic nanoparticles. ACS Nano. 4 (4), 2109-2123 (2010).
  45. Vogel, A., Noack, J., Hüttman, G., Paltauf, G. Mechanisms of femtosecond laser nanosurgery of cells and tissues. Applied Physics B. 81, 1015-1047 (2005).
  46. Baffou, G., Polleux, J., Rigneault, H., Monneret, S. Super-heating and micro-bubble generation around plasmonic nanoparticles under cw illumination. Journal of Physical Chemistry C. 118 (9), 4890-4898 (2014).
  47. Sasikumar, K., Liang, Z., Cahill, D. G., Keblinski, P. Curvature induced phase stability of an intensely heated liquid. Journal of Chemical Physics. 140 (23), 234506(2014).
  48. Jauffred, L., Samadi, A., Klingberg, H., Bendix, P. M., Oddershede, L. B. Plasmonic heating of nanostructures. Chemical Reviews. 119 (13), 8087-8130 (2019).
  49. Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nature Methods. 5 (6), 491-505 (2008).
  50. Bendix, P. M., Jauffred, L., Norregaard, K., Oddershede, L. B. Optical trapping of nanoparticles and quantum dots. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 20, 15-26 (2014).
  51. Samadi, A., Bendix, P. M., Oddershede, L. B. Optical manipulation of individual strongly absorbing platinum nanoparticles. Nanoscale. 46, 18449-18455 (2017).
  52. Jørgensen, J. T., Norregaard, K., Tian, P., Bendix, P. M., Kjaer, A., Oddershede, L. B. Single particle and PET-based platform for identifying optimal plasmonic nano-heaters for photothermal cancer therapy. Scientific Reports. 6, 30076(2016).
  53. Goldenberg, H., Tranter, C. J. Heat flow in an infinite medium heated by a sphere. British Journal of Applied Physics. 3 (9), 296-298 (1952).
  54. Eustis, S., El-Sayed, M. A. Why gold nanoparticles are more precious than pretty gold: Noble metal surface plasmon resonance and its enhancement of the radiative and nonradiative properties of nanocrystals of different shapes. Chemical Society Reviews. 35, 209-217 (2006).
  55. Landau, L. D., Lifshitz, E. M. Fluid Mechanics: Landau and Lifshitz: Course of Theoretical Physics. 6, Elsevier. (2013).
  56. Niederauer, C., Seynen, M., Zomerdijk, J., Kamp, M., Ganzinger, K. A. The K2: Open-source simultaneous triple-color TIRF microscope for live-cell and single-molecule imaging. HardwareX. 13, e00404(2023).
  57. Richardson, A. C., Reihani, N., Oddershede, L. B. Combining confocal microscopy with precise force-scope optical tweezers. SPIE Proceedings:SPIE 6326, Optical Trapping and Optical Micromanipulation III. 632628, (2006).
  58. Samadi, A., Klingberg, H., Jauffred, L., Kjær, A., Bendix, P. M., Oddershede, L. B. Platinum nanoparticles: a non-toxic, effective and thermally stable alternative plasmonic material for cancer therapy and bioengineering. Nanoscale. 10 (19), 9097-9107 (2018).
  59. ThermoFisher Scientific Attofluor Cell Chamber for microscopy. , https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A7816 (2023).
  60. Kreibig, U., Vollmer, M. Theoretical considerations. In: Optical Properties of Metal Clusters. 25, Springer, Berlin, Heidelberg. (1995).
  61. Mie, G. Beiträge zur Optik trüber Medien, speziell kolloidaler Metallösungen. Annalen der Physik. 330 (3), 377-445 (1908).
  62. Rueden, C. T., et al. ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data. BMC Bioinformatics. 18 (1), 529(2017).
  63. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  64. Klenow, M. B., Heitmann, A. S. B., Nylandsted, J., Simonsen, A. C. Timescale of hole closure during plasma membrane repair estimated by calcium imaging and numerical modeling. Scientific Reports. 11, 4226(2021).
  65. Li, T., Wu, X., Liu, F., Li, N. Analytical methods based on the light-scattering of plasmonic nanoparticles at the single particle level with dark-field microscopy imaging. Analyst. 142 (2), 248-256 (2017).
  66. Gibbs-Flournoy, E. A., Bromberg, P. A., Hofer, T. P. J., Samet, J. M., Zucker, R. M. Darkfield-Confocal Microscopy detection of nanoscale particle internalization by human lung cells. Particle and Fibre Toxicology. 8 (1), 2(2011).
  67. Taylor, R. W., Sandoghdar, V. Interferometric scattering microscopy: Seeing single nanoparticles and molecules via Rayleigh scattering. Nano Letters. 19 (8), 4827-4835 (2019).
  68. Wu, Y., Ali, M. R. K., Chen, K., Fang, N., El-Sayed, M. A. Gold nanoparticles in biological optical imaging. Nano Today. 24, 120-140 (2019).
  69. Klingberg, H., Oddershede, L. B., Loeschner, K., Larsen, E. H., Loft, S., Møller, P. Uptake of gold nanoparticles in primary human endothelial cells. Toxicology Research. 4 (3), 566-666 (2015).

Herprints en machtigingen

Meer artikelen verkennen

Thermoplasmonische punctieconfocale microscopiegoudnanodeeltjesannexine-eiwittengigantische unilamellaire vesiclesoptische pincettenmembraanruptuurcalciuminstroommodelmembraansystemen
Een thermoplasmonische benadering voor het onderzoeken van plasmamembraanherstel in levende cellen en modelmembranen
Neem contact met ons op
Aanbevelen aan de bibliotheek

Privacy

Gebruiksvoorwaarden

Beleidsoverzicht

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle rechten voorbehouden.