Toepassing van levende mitochondriënkleuring bij het sorteren van cellen om hepatocyten te zuiveren die zijn afgeleid van door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen

Samenvatting

Hepatocyten afgeleid van pluripotente stamcellen kunnen worden gezuiverd door middel van celsortering, met behulp van een combinatie van mitochondriale en geactiveerde leukocytenceladhesiemolecuul (ALCAM, ook bekend als CD166) kleuring.

Samenvatting

Menselijke embryonale stamcellen (ES) en geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) hebben potentiële toepassingen in celgebaseerde regeneratieve geneeskunde voor de behandeling van ernstig zieke organen vanwege hun onbeperkte proliferatie en pluripotente eigenschappen. Het differentiëren van menselijke ES/iPS-cellen in 100% zuivere doelceltypen is echter een uitdaging vanwege hun hoge gevoeligheid voor de omgeving. Tumorigenese na transplantatie wordt veroorzaakt door besmette, prolifererende en ongedifferentieerde cellen, waardoor hoogzuiveringstechnologie essentieel is voor de veilige realisatie van regeneratieve geneeskunde. Om het risico op tumorigenese te verminderen, is een hoogzuiveringstechnologie ontwikkeld voor humane iPS-cel-afgeleide hepatocyten. De methode maakt gebruik van FACS (fluorescentie-geactiveerde celsortering) met behulp van een combinatie van een hoog mitochondriaal gehalte en de celoppervlaktemarker ALCAM (geactiveerd leukocytenceladhesiemolecuul) zonder genetische modificatie. 97% ± 0,38% (n = 5) van de gezuiverde hepatocyten die deze methode gebruikten, vertoonden albumine-eiwitexpressie. Dit artikel is bedoeld om gedetailleerde procedures te bieden voor deze methode, zoals toegepast op de meest recente tweedimensionale differentiatiemethode voor menselijke iPS-cellen in hepatocyten.

Inleiding

Embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen (respectievelijk ES en iPS) worden beschouwd als veelbelovende celbronnen voor regeneratieve therapieën. De efficiëntie van het differentiëren van deze cellen in specifieke doelceltypen kan echter variëren, zelfs wanneer dezelfde cellijn, hetzelfde protocol en dezelfde experimentator 1,2,3,4 wordt gebruikt. Deze variabiliteit kan worden toegeschreven aan de hoge gevoeligheid van menselijke ES/iPS-cellen voor hun omgeving. Daarom is het momenteel moeilijk om consequent zuivere doelcellen te verkrijgen. Om zeer veilige regeneratieve geneeskunde te bereiken, is het van cruciaal belang om proliferatieve cellen en ongedifferentieerde stamcellen in therapeutische cellen te elimineren, en geavanceerde zuiveringstechnologie voor doelcellen is essentieel ^5,6,7.

Een celsorteerder is een apparaat dat onmiddellijk individuele cellen analyseert en levende cellen van belang sorteert op basis van de fluorescerende signaalsterktes, wat een veelbelovende oplossing biedt. Dit kan worden bereikt door antilichaamkleuring van celtype-specifieke oppervlaktemarkers of door gebruik te maken van celtype-specifieke reporter-genexpressies. Met behulp van deze techniek zijn er verschillende rapporten over methoden voor het zuiveren van pluripotente stamcel-afgeleide cardiomyocyten ^8,9,10 en hepatocyten^11,12. Hattori et al. ontwikkelden een innovatieve mitochondriale zuiveringsmethode met behulp van een celsorteerder¹³. Door gebruik te maken van het feit dat cardiomyocyten een hoge energiebehoefte hebben door mitochondriale activiteit, kan het kleuren van de cellen met de levende mitochondriën-indicatieve kleurstof TMRM (tetramethylrhodaminemethylester) worden gebruikt om cardiomyocyten te labelen en sterk te zuiveren door FACS van menselijke ES-cel-afgeleide embryoïde lichamen die verschillende celtypen bevatten. De afwezigheid van tumorigeniciteit werd bevestigd door teratoomvormingstesten met de gezuiverde cardiomyocyten. Bovendien ontdekten Yamashita et al. onverwacht een methode om hepatocyten te zuiveren uit menselijke ES-cel-afgeleide embryoïde lichamen door fracties te isoleren met hoge mitochondriale activiteit en ALCAM-positieve expressie¹⁴. De grondgedachte voor deze methode is dat hepatocyten ook een relatief hoog aantal mitochondriën hebben vanwege hun hoge consumptie van ATP voor het metabolisme van voedingsstoffen en ontgifting¹⁵, en hepatocyten brengen ALCAM tot expressie, een lid van de immunoglobuline-superfamilie, die een rol speelt bij celadhesie en migratie¹⁶.

Eerdere sterk zuiverende methoden voor pluripotente stamcel-afgeleide hepatocyten vereisten genetische modificaties, en niet-genetische zuiveringsmethoden hadden een lage efficiëntie¹⁷. De mitochondriale niet-genetische methode heeft de verdienste om een hoge zuiverheid te bereiken. Wanneer levervoorlopercellen nodig zijn, kan worden gekozen voor CD133- en CD13- of Dlk1-gebaseerde methoden ^18,19. Hoewel de nauwkeurigheid van de technologie voor het bewerken van het genoom is gevorderd, kan het potentiële risico van onvoorziene genomische veranderingen (bijv. carcinogenese) niet volledig worden geëlimineerd. Methoden gebaseerd op mitochondriale activiteit, zonder genetische modificatie te betrekken, kunnen vrij zijn van dergelijke risico's.

Als resultaat van onderzoek van verschillende mitochondriale indicatoren in neonatale cardiomyocyten van ratten, werd waargenomen dat TMRM binnen 24 uur volledig verdween, terwijl andere kleurstoffen ten minste 5 dagen bleven¹³. Bovendien is het belangrijk op te merken dat TMRM en JC-1 geen invloed hadden op de levensvatbaarheid van cellen wanneer ze werden beoordeeld met de 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT)-test, terwijl andere kleurstoffen verschillende effecten op de levensvatbaarheid van de cellen vertoonden¹³. TMRM demonstreert een hogere veiligheid.

Tot op heden zijn er verschillende tweedimensionale (2D) differentiatiemethoden ontwikkeld als efficiëntere benaderingen voor het induceren van differentiatie in vergelijking met driedimensionale (3D) embryoïde lichaamsvorming. Dit komt omdat stapsgewijze differentiatie-inducerende verbindingen of cytokines uniform kunnen worden toegediend aan cellen op een 2D-vlak, in plaats van in een 3D-ruimte. In deze studie werd de eerder gerapporteerde methode²⁰ gewijzigd om differentiatie te induceren in humane iPS-cel-afgeleide hepatocyten. Hier worden de details beschreven van de procedures voor de up-to-date 2D-differentiatie en zuivering van hepatocyten afkomstig van menselijke iPS-cellen.

Protocol

In deze studie werd gebruik gemaakt van commercieel verkregen humane iPS-cellen (253G1-stam) (zie Materiaaltabel).

1. Onderhoud van menselijke iPS-cellen

1. Bewaar menselijke iPS-cellen in feedervrije omstandigheden in AK02-medium op kweekschalen gecoat met 0,25 μg/cm² iMatrix-511 (zie Materiaaltabel).

2. Hepatische differentiatie van humane iPS-cellen in 2D-culturen

OPMERKING: Raadpleeg Figuur 1A voor het dagelijkse schema van leverdifferentiatie. Gebruik tijdens het hele proces kweekplaten met 6 putjes en voeg 2 ml van het daarvoor bestemde was- of kweekmedium toe aan elk putje. Houd de celkweekconditie op 100% vochtigheid, 5% CO₂ en 20% O₂ bij 37 °C.

1. Smeer elk putje van een plaat met 6 putjes in met 1 ml basale membraanmatrix (1/25 verdund in PBS (-)) en incubeer bij 37 °C gedurende 1 uur.
2. Transporteer menselijke iPS-cellen op de gecoate schaal met een dichtheid van 20.000-30.000 cellen/cm² met behulp van AK02N-medium aangevuld met 10 μM ROCK-remmer (Y-27632) (zie materiaaltabel). Vervang het medium zonder Y-27632 de volgende dag en kweek nog 2 dagen.
3. Was de cellen één keer met RPMI-1640 medium. Start endodermdifferentiatie door het medium te vervangen door RPMI-B27-Glu (RPMI-1640 + 2% B27 insuline + 1% dipeptide L-Alanyl-L-Glutamine) aangevuld met 3-6 μM CHIR-99021 en 100 ng/ml Activine A gedurende 24 uur (zie Materiaaltabel).
4. Vervang het medium door RPMI-B27-Glu aangevuld met 50 ng/ml Activin A gedurende 24 uur.
5. Om differentiatie van levervoorlopercellen te induceren, vervangt u het medium door RPMI-B27-Glu aangevuld met 1% dimethylsulfoxide (DMSO) gedurende 5 dagen.
6. Om de rijping van hepatocyten te bevorderen, schakelt u over op het rijpingsmedium van hepatocyten: Leibovitz's L-15-medium met 10 μM hydrocortison 21-hemisuccinaat, 8,3% tryptosefosfaatbouillon, 100 nM dexamethason (DEX), 50 μg/ml natrium-L-ascorbaat, 0,58% insuline-transferrine-selenium (ITS), 8,3% foetaal runderserum (FBS), 2 mM Dipeptide L-Alanyl-L-Glutamine en 100 nM N-Hexanoic-Try-Ile-(6)-amino Hexaanic amide (Dihexa) (zie Materiaaltabel).
7. Vervang het medium elke 2 dagen gedurende 20 dagen. Sorteer de cellen ongeveer 27 dagen na het starten van de differentiatie.

3. Celpreparaat voor zuivering van humane iPS-cellen-afgeleide hepatocyten

1. Was hepatische gedifferentieerde cellen met 2 ml PBS (-) per putje.
2. Voeg 1 ml enzymoplossing per putje toe, waaronder 0,1% collagenase, 0,083% trypsine, 10 μM ROCK-remmer (Y-27632), 20 nM ciclosporine A en 50 μg/ml natrium-L-ascorbaat in de adsbuffer (116 mM NaCl, 12,5 mM NaH₂PO₄, 20 mM HEPES, 5,4 mM KCl, 5,6 mM glucose en 0,8 mM MgSO4; pH 7,35) (zie Materiaaltabel). Maak de cellen los van de platen door ze ongeveer 2 uur horizontaal te draaien bij 37 °C.
3. Nadat u hebt bevestigd dat de cellen onder een microscoop zijn losgemaakt en afgerond, verspreidt u ze in afzonderlijke cellen door voorzichtig te pipetteren en verzamelt u ze in een buis van 50 ml.
4. Centrifugeer de cellen bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 18 °C om ze te pelleteren. Verwijder het supernatans met behulp van een aspirator.
5. Kleuring van de mitochondriën van de cellen door ze te dispergeren in 5 ml hepatocytrijpingsmedium dat 100 nM TMRM (tetramethylrhodamine, methl-ester) bevat (zie Materiaaltabel). Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C en bescherm ze tegen licht door ze in aluminiumfolie te wikkelen.
6. Centrifugeer de cellen bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 18 °C om ze te pelleteren. Verwijder het supernatant.
7. Resuspendeer de cellen met 1-5 ml koude Ads-buffer met 2% FBS.
8. Tel het celgetal met behulp van een 0,4% Trypan blauwe oplossing en een plaatje met celtelling.
9. Centrifugeer de cellen bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C om ze te pelleteren. Verwijder het supernatant.
10. Verdun een anti-ALCAM-antilichaam (primair antilichaam, zie materiaaltabel) in een verhouding van 1:50 in de Ads-buffer en voeg 100 μL van het verdunde antilichaam toe per 10⁶ cellen. Kleur de cellen gedurende 50 minuten op ijs. Bereid cellen voor die niet zijn gekleurd met het primaire antilichaam als negatieve controle.
11. Was de cellen twee keer met een koude adsbuffer die 2% FBS bevat.
12. Verdun een Alexa Fluor 488 ezel anti-geit IgG (secundair antilichaam, zie Materiaaltabel) in een verhouding van 1:100 in de Ads-buffer en voeg 100 μL van het verdunde antilichaam toe per 10⁶ cellen. Vlek de cellen gedurende 30 minuten op ijs. Kleurcellen die niet zijn gekleurd met het primaire antilichaam met behulp van het secundaire antilichaam.
13. Was de cellen twee keer met een koude adsbuffer die 2% FBS bevat.
14. Resuspendeer de cellen in de advertentiebuffer en filtreer ze door een celzeef met klikdop (35 μm mesh) net voordat ze worden gesorteerd op FACS om grote celklonten en vuil te verwijderen.

4. FACS-analyses en sortering van van humane iPS-cellen afgeleide hepatocyten

1. Stel de FACS-machine in voor het sorteren van cellen volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel).
   OPMERKING: Gebruik een mondstuk van 85 μm of 100 μm en een ND-filter van 2.0 voor hepatocyten. Gebruik het FITC-kanaal voor het detecteren van Alexa Flour 488 voor ALCAM en het PE-kanaal voor het detecteren van TMRM-fluorescentie voor mitochondriën.
2. Pas de FSC (forward scatter) en SSC (side scatter) spanningen aan om de celpopulatie goed te visualiseren.
3. Pas de voltages van de FITC- en PE-fluorescentiekanalen aan. Begin met niet-gelabelde cellen en centreer de celpopulatie onderaan elke kanaalplot. Zorg ervoor dat de gelabelde cellen op de juiste manier in de plot zijn geplaatst.
4. Gebruik een veelgebruikte poortstrategie om doubletten te elimineren: Gate de belangrijkste FSC-A vs. SSC-A-populatie (Figuur 2A), gevolgd door FSC-H vs. -W, en dan SSC-H vs. -W (Figuur 2B,C).
5. Gate de TMRM^hi- en ALCAM^+-populatie (P2 in figuur 2E) om hepatocyten te sorteren. Gate de TMRM^hi en ALCAM-populatie (P1 in figuur 2E) om niet-hepatocyten te sorteren. Verzamel gesorteerde hepatocyten en niet-hepatocyten in verzamelbuisjes van 15 ml met hepatocytrijpingsmedium.
6. Centrifugeer de verzamelbuis met de gesorteerde cellen bij 200 x g gedurende 5 minuten bij 18 °C.
7. Verwijder het supernatans en resuspendeer de cellen in het hepatocytrijpingsmedium.
8. Zaai de cellen op met mitomycine C behandelde muizenembryonale fibroblasten (MEF's) of gelachtige basale membraanmatrix met hepatocytrijpingsmedium aangevuld met 10 μM Y-27632 en 20 nM ciclosporine A. Kweek de cellen gedurende 5 dagen in een CO₂ -incubator van 37 °C.

5. Immunocytochemie voor detectie van humane iPS-cellen-afgeleide hepatocyten

1. Was de gekweekte cellen gedurende 5 dagen na het sorteren met PBS (-).
2. Fixeer de cellen met 4% paraformaldehyde gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
3. Was de cellen met TBS-T-buffer (1x TBS met 1% Tween 20) twee keer om de paraformaldehyde te verwijderen.
4. Incubeer de cellen met 0,1% Triton X-100 verdunde TBS-T-buffer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
5. Was de cellen twee keer met TBS-T-buffer om Triton X-100 te verwijderen.
6. Voeg in de handel verkrijgbare blokkeringsoplossing (zie Materiaaltabel) toe aan de cellen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
7. Voeg primaire antilichamen toe tegen albumine (hepatocytmarker) en humaan nucleair antigeen (hNA, zie materiaaltabel), verdund 1:50 in blokkeringsoplossing.
8. Incubeer de cellen een nacht bij 4 °C. Was de cellen twee keer met TBS-T buffer.
9. Voeg secundaire antilichamen toe: Alexa Fluor 488 ezel anti-konijn IgG en Alexa Fluor 546 ezel anti-muis IgG, verdund 1:100 in blokkeringsoplossing (zie Materiaaltabel).
10. Incubeer de cellen bij kamertemperatuur gedurende 30 min. Was de cellen twee keer met TBS-T buffer.
11. Evalueer de zuiverheid van de hepatocyten door albumine-positieve en hNA-positieve cellen te tellen onder een fluorescentiemicroscoop. Bereken het percentage albumine-positieve cellen per hNA-positieve cel voor zowel de P1- als de P2-populatie.

Resultaten

De tijdlijn van de processen die menselijke iPS-cellen induceren om te differentiëren tot hepatocyten door middel van 2D-cultuur (Figuur 1A) en representatieve celkenmerken (Figuur 1B) worden getoond. Ongeveer op differentiatiedag 12 begonnen cellen veelhoekige celvormen en ronde kernen te vertonen, kenmerkend voor hepatocyten. Sommige hepatocyten vertoonden ook multinucleatie.

FACS-analyse werd uitgevoerd met behulp van de cellen op ...

Discussie

Vanwege hun functies in het metabolisme van voedingsstoffen en ontgifting bezitten hepatocyten een relatief groot aantal mitochondriën in vergelijking met andere celtypen¹⁵. ALCAM is een lid van de immunoglobuline-superfamilie en speelt een rol bij celadhesie en migratie. Het komt tot expressie in verschillende celtypen, waaronder lever-, epitheel-, lymfocytische, myeloïde, fibroblast- en neuronale cellen¹⁶. Door gebruik te maken van een combinatie van de op mitochondriën g...

Materialen

Lijst van materialen gebruikt in dit artikel

Naam	Bedrijf	Catalogusnummer	Opmerkingen
253G1 human iPS cell line	RIKEN BioResource Research Center	HPS0002
4% paraformaldehyde	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	163-20145
Activin A Solution, Human, Recombinant	NACALAI TESQUE, INC.	18585
Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1	Chemicon	MAB1281	Antilichaam tegen humaan nucleair antigeen
B-27 Supplement (50x), serum free	Thermo Fisher Scientific	17504044
BD FACSAria III	BD Biosciences		Celsorteer
CHIR-99021	MedChemExpress	HY-10182
Ciclosporin A	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	035-18961
Collagenase	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	034-22363
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix	Corning	354230	Gelachtige basement membrane matrix
CultureSure Y-27632	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	036-24023	ROCK-remmer
Dexamethasone	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	047-18863
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	047-29353
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11055
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546	Thermo Fisher Scientific	A10036
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-21206
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap	Corning	352235
Fetal Bovine Serum	Biowest	51820-500
GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061	Dipeptide L-Alanyl-L-Glutamine
Human/Mouse/Rat/Canine ALCAM/CD166 Antibody	R&D Systems	AF1172
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt	Sigma-Aldrich	H2270
iMatrix-511 silk	Nippi	892021
ImmunoBlock	KAC	CTKN001	Blokkingsoplossing
ITS-G Supplement(×100)	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	090-06741
Leibovitz's L-15 Medium	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	128-06075
N-Hexanoic-Try-Ile-(6)-amino Hexanoic amide (Dihexa)	Toronto Research Chemicals	H293745
Polyclonal Rabbit Anti-Human Albumin	Dako	A0001
Polyoxyethylene Sorbitan Monolaurate (Tween 20)	NACALAI TESQUE, INC.	28353-85
RPMI-1640	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	189-02025
Sodium L-Ascorbate	NACALAI TESQUE, INC.	03422-32
StemFit AK02N	REPROCELL	RCAK02N
TBS (10x)	NACALAI TESQUE, INC.	12748-31
Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM)	Thermo Fisher Scientific	T668
Triton X-100	NACALAI TESQUE, INC.	28229-25
Trypan Blue Solution	NACALAI TESQUE, INC.	20577-34
TRYPSIN 250	Difco	215240
Tryptose phosphate broth solution	Sigma-Aldrich	T8159