Method Article

Isolatie, gedragsidentificatie en pathogeniteitsbeoordeling van entomopathogene schimmels van een boshoutboorder

DOI:

10.3791/65782

⸱

September 29th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1School of Forestry and Biotechnology, Zhejiang A&F University, 2Key Laboratory of Vector Biology and Pathogen Control of Zhejiang Province, Huzhou University, 3Department of Biology, Lund University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier presenteren we een protocol voor het verkrijgen van entomopathogene schimmels van een boshoutboorder en een vervangende manier om hun entomopathogene activiteiten te evalueren met behulp van een Coleoptera-modelinsect. Deze methode is efficiënt en handig voor het verkennen van entomopathogene schimmelbronnen van houtborende insectenplagen in natuurlijke bossen.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Boshoutboorders (FWB) veroorzaken wereldwijd ernstige schade aan bomen en economische verliezen. De introductie van entomopathogene schimmels (EPF) tijdens de FWB-opkomstperiode wordt beschouwd als een acceptabel alternatief voor chemische bestrijding. EPF-bronnen zijn echter aanzienlijk minder onderzocht voor FWB's, in tegenstelling tot plagen van landbouwinsecten. Dit artikel presenteert een protocol voor het verkennen van EPF-bronnen van FWB's met wilde Monochamus alternatus-populaties als voorbeeld. In dit protocol is de toewijzing van vallen geaasd met M. Alternatus-lokstoffen voor verschillende populaties garandeerden het verzamelen van adequate monsters met natuurlijke infectiesymptomen, tijdens de opkomstperioden van de kever. Na het fijn ontleden van de huid en het plaatsen ervan op een selectief medium, werden schimmelsoorten geïsoleerd uit elk deel van keverlichamen en geïdentificeerd op basis van zowel moleculaire als morfologische kenmerken.

Verschillende schimmelsoorten werden gecertificeerd als parasitaire EPF's via herinfectie van gezonde M. alternatus met sporensuspensies. Hun gedragsfenotypes op M. alternatus werden waargenomen met behulp van scanning-elektronenmicroscopie en verder vergeleken met die op het Coleoptera-modelinsect Tribolium castaneum. Voor EPF's die consistente parasitismefenotypes vertonen op beide keversoorten, evaluatie van hun activiteiten op T. castaneum leverde waardevolle informatie over dodelijkheid op voor toekomstig onderzoek naar M. alternatus. Dit protocol hielp bij de ontdekking van EPF die nieuw is gerapporteerd over M. alternatus-populaties in China, wat zou kunnen worden toegepast als een efficiënte benadering om meer EPF-bronnen van andere FWB's te verkennen.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De verwoesting veroorzaakt door insectenplagen heeft geleid tot grote ecologische en economische verliezen in zowel bos- als landbouwecosystemen. De meeste landbouwplagen stellen zich bloot aan natuurlijke vijanden of kunstmatige bestrijders en beschadigen waardplanten. In plaats daarvan voltooien boshoutboorders (FWB) bijna hun hele ontwikkelingscycli in gastheerboomstammen1, wat grote uitdagingen met zich meebrengt om efficiënte biologische bestrijdingsorganismen van FWB in het wilde veld te onderzoeken. Wat nog erger is, is dat FWB's een groot aantal fytopathogenen2 dragen of een intieme relatie hebben met deze pathogenen als hun potentiële vectoren 3,4, waardoor de negatieve effecten van FWB op de gezondheid van bossen dramatisch worden versterkt. Overmatig gebruik van chemische insecticiden kan de ernst van FWB verlichten, maar de opkomst van resistentie tegen insecticiden 5,6 beperkt de toepassing ervan in het milieu. In bepaalde gevallen werden sluipwespenden, roofzuchtige geleedpotigen en entomopathogene microben vrijgegeven als biologische bestrijdingsmiddelen in de verspreidingsgebieden van FWB7 en werd bewezen dat ze efficiënte en economisch aanvaardbare alternatieven zijn voor chemische bestrijding 8,9,10.

Entomopathogene schimmels (EPF) worden geacht het voordeel te hebben bij het beheersen van FWB ten opzichte van de meeste andere microbiële groepen. Hun sporen kunnen worden gedragen door insectengastheren en stabiel op lichaamsoppervlakken worden gefixeerd via penetratie in de nagelriem of het omhulsel 8,11. EPF biedt ook een uitstekend aanpassingsvermogen aan omgevingsstress en sommige soorten koloniseren goed in het weefsel van bomen als endofyten12,13, waardoor hun groei, overleving en overdracht wordt vergemakkelijkt. In vergelijking met die in de landbouwsector is de soortendiversiteit van EPF die in natuurlijke bosecosystemen wordt gebruikt, echter opmerkelijk beperkt 14,15,16. Beauveria bassiana (stam PPRI 5339) bleek de meest veelbelovende stam te zijn om een IPM-programma te promoten bij eucalyptuskevers in Zuid-Afrika17 en de combinatie van twee veelbelovende isolaten van B. Bassiana bood de mogelijkheid voor de praktische microbiële bestrijding van rode palmkever, Rhynchophorus ferrugineus, in verschillende levensfasen in palmboomvelden18. Naast Beauveria en het bekende Metarhizium vertoonden andere EPF-geslachten van de orde Hypocreales, met name soorten Lecanicillium (waarvan er vele nu zijn ingedeeld in het geslacht Akanthomyces19,20), een sterke pathogeniteit en een groot potentieel bij het beheer van bosplagen, zoals de cipresluis in Chili21.

De dennenzagkever Monochamus alternatus is een beruchte dennenbosplaag in China en de buurlanden, die zich nestelt in takken en stammen van pijnbomen om het transport van voedingsstoffen en water te belemmeren 22,23,24. Bovendien heeft M. alternatus bevordert ook de invasie van het plantparasitaire dennenaaltje (Bursaphelenchus xylophilus, PWN) als zijn belangrijkste vectorkever. Een andere soortgenoot van de kever, M. galloprovincialis, heeft PWN de afgelopen jaren in verschillende landen in Europa verspreid25. Eerder onderzoek rapporteerde verschillende geslachten van natuurlijke EPF's van Monochamus spp., zoals Beauveria, Metarhizium en Lecanicillium (Verticillium, een zelfs vroegere naam van Lecanicillium), in Spanje, Japan en de provincies Anhui/Zhejiang van China 26,27,28,29. Desalniettemin lijken deze collecties van EPF's vaak beperkt te zijn tot een bepaalde locatie, vergeleken met het wijdverbreide voorkomen van Monochamus-kevers in natuurlijke velden. Aangezien de M. alternatus kever een brede geografische verspreiding heeft in China, kan hij worden beschouwd als een representatieve houtboorder om meer potentiële EPF's in verschillende populaties te onderzoeken.

In dit protocol introduceren we een specifieke procedure die EPF's uit verschillende geografische populaties van M onderzoekt. alternatus in het zuiden van China. Dit protocol gebruikt een model Coleoptera-kever als vervanging om entomopathogeniteitstesten uit te voeren, op voorwaarde dat de geteste schimmelsoort een consistent gedragsfenotype heeft op beide keversoorten. Dit protocol kan ook inzicht geven in EPF-exploratie voor andere boshoutboorders, waarbij de diversiteit van hun entomopathogene schimmelsoorten wordt onderschat of minder wordt onderzocht.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Isolatie van schimmels uit M. alternatus (figuur 1)

  1. Verzamel het kevermonster
    1. Verzamel de dennen sawyer kevers M. alternatus met behulp van commerciële vallen (zie Tabel met materialen) gelokt met lokstoffen vóór de voorspelde verschijningsperioden van de keverpopulaties in natuurlijk geïnfecteerde dennenbossen.
      OPMERKING: In deze studie werden kevers verzameld uit vijf geografische regio's van Zuid-China (Huzhou/Zhejiang, Liangshan/Sichuan, Xiamen/Fujian, Shaoguan/Guangdong, Yulin/Guangxi). De instelling van de val van boven naar beneden is als volgt: een ronde bovenkant (50 cm in diameter), een kruisvormig paneel (35 cm breed en 66 cm lang), een trechter (35,5 cm in ronde diameter aan de bovenkant en 5,5 cm in ronde diameter onder), een opvangbeker (10,5 cm in diameter en 26,5 cm in lengte). De gastheer vluchtige stoffen (bijv. ethanol en α-pineen) en het aggregatieferomoon (2-undecyloxy-1-ethanol) worden gebruikt als lokaas30.
    2. Label het monster voordat u het naar het laboratorium overbrengt. Doe elke kever in individuele gesteriliseerde buisjes met verse takjes. Vervang de takjes om de 2 dagen door verse.
    3. Kweek de levende kevers bij 25 ± 1 °C in een niet-bevochtigde broedmachine (16-8 l/d-cycli) en observeer ze dagelijks.
    4. Registreer monsters die verminderde voeding en mobiliteit aantonen. Overdracht dode M. alternatus die verhard en stijf worden tot natte kamers om de groei van schimmelmycelia en conidia te observeren.
      OPMERKING: Eenmaal geïnfecteerd door entomopathogene schimmels, vertoonden de kevers in het beginstadium van de infectie een afname van voeding en mobiliteit31,32. Na de dood werden hun lichamen verhard en stijf, waarbij mycelia en conidia enkele dagen na opslag in een natte kamer verschenen33.
    5. Bewaar keverkadavers met schimmelinfecties bij 4 °C voor toekomstig gebruik. Om dit protocol te volgen, moet u de monsters onmiddellijk binnen een paar uur verwerken om besmetting met meer saprotrofe schimmels te voorkomen.
  2. Bereiding van het groeimedium
    1. Voeg 39 g aardappeldextrose-agar (PDA) poeder toe aan 1 L zuiver water en autoclaaf het gedurende 30 minuten bij 121 °C.
    2. Koel af tot een werkende temperatuur (~50 °C), voeg 0,05 g streptomycine, 0,05 g penicilline G en 0,05 g tetracycline toe en schud om het medium te verdelen.
    3. Schep het medium in petrischaaltjes onder een schone bank en gebruik het na het stollen.
      OPMERKING: Het PDA-medium met antibiotica wordt gebruikt voor isolatie van kevers, wat de groei van bacteriën voorkomt zonder de groei van schimmels tijdens isolatie te beïnvloeden. Het PDA-medium zonder antibiotica wordt echter gebruikt voor de dagelijkse teelt en conservering.
    4. Doe 35 g aardappeldextrosebouillon (PDB) poeder in 1 L ddH2O en autoclaaf het gedurende 30 minuten bij 121 °C. Koel het af voor gebruik.
  3. Dissectie van het kevermonster met symptomen van schimmelinfectie
    1. Bereid gesteriliseerde scharen, scalpels en insectenspelden voor; Werk vervolgens onder een schone bank met een alcoholbrander.
      OPMERKING: Het gebruik van dissectiehulpmiddelen kan worden aangepast aan persoonlijke voorkeuren. Insectenpennen zijn scherper dan standaard ontleednaalden en verschillende specificaties kunnen voldoen aan de noodzaak van dissectie.
    2. Ontleed de integumenten van het keverlichaam met gereedschap in steriele petrischalen voor eenmalig gebruik. Zorg ervoor dat u mogelijke schade aan de weefsels van de middendarm en de dikke darm vermijdt die interne inhoud kan uitstralen.
    3. Verdeel de keverlichamen als volgt over de hoofdposities: antennes, kop, borstkas, achterlijf, vleugels (elk paar) en poten.
  4. Zuivering van schimmels
    1. Knip de integumenten van elke positie in kleine stukjes met een schaar. Druk het buitenoppervlak voorzichtig op het oppervlak van PDA-platen met antibiotica.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat schimmelmycelium op de integumenten op de plaat is geïnoculeerd.
    2. Sluit zorgvuldig af met parafilm en kweek in een incubator bij 25 ± 1 °C totdat de weefsels volledig bedekt zijn met mycelium.
    3. Breng enkelvoudige kolonies over volgens fenotypische eigenschappen (kleur, vorm) op een nieuwe PDA met antibiotica voor kweek bij 25 ± 1 °C.
    4. Herhaal stap 1.4.3 twee of drie keer op PDA met antibiotica totdat zuivere kolonies afzonderlijk zijn geïsoleerd.
      OPMERKING: Als er meerdere schimmelstammen in de originele platen groeien, kies dan het mycelium precies uit om het sorteren van meer schimmelsoorten te vergemakkelijken.
  5. Opslag van de schimmelisolaten
    1. Breng agarblokken (~5 mm in diameter) over van kolonies naar nieuwe PDA-platen.
    2. Kweek in een incubator bij 25 ± 1 °C gedurende 1-2 weken.
    3. Plaats in een koelkast van 4 °C voor dagelijkse opslag voor verder gebruik.
    4. Inoculeer schimmelstammen in 50 ml steriele PDB in een kolf van 250 ml, schudden met 180 tpm/min bij 25 °C gedurende 5-7 dagen.
    5. Oogst 1 ml van het vers gekweekte schimmelmycelium en suspendeer het in 1 ml gesteriliseerde 20% glycerol in steriele diepvriesbuisjes van 2 ml (de uiteindelijke concentratie glycerol is 10%).
    6. Sluit de buizen af met parafilm en koel ze voor bij -20 °C en -40 °C. Houd de buizen vervolgens als voorraad op -80 °C.

2. Moleculaire en morfologische identificatie van schimmelisolaten

  1. Extractie van schimmel genoom-DNA
    1. Kweek schimmels in PDB zoals beschreven in stap 1.5.4.
    2. Oogst het mycelium en filter het om het te scheiden van de PDB. Homogeniseer in vloeibare stikstof met behulp van een voorgekoelde vijzel en stamper.
    3. Extraheer het genomische DNA met behulp van de Fungi Genomic DNA Isolation Kit volgens de instructies van de fabrikant (zie Materiaaltabel).
  2. PCR-amplificatie en DNA-sequencing
    1. Bereid het PCR-reactiemengsel als volgt: 25 μL Taq DNA-polymerase, 1 μL sjabloon, 2 μL voorwaartse en achterwaartse primers en ddH2O tot een totaal volume van 50 μL.
    2. Amplificeer het rDNA-ITS-gebied van het DNA-monster met behulp van primerparen ITS1 en ITS434 (zie tabel 1) met de volgende procedure: eerste denaturering bij 95 °C gedurende 4 min, gevolgd door 35 denatureringscycli bij 94 °C gedurende 60 s, gloeien bij 58 °C gedurende 60 s, rek bij 72 °C gedurende 2 min; en een uiteindelijke rek bij 72 °C gedurende 10 min.
    3. Elektroforese van versterkte producten met behulp van 1,5% agarosegel bij 100 V, 100 mA.
    4. Sequentie van de PCR.
    5. Lijn de volgorde uit met Clustal X2.0 en MEGA 6.0.
      OPMERKING: Tijdens de uitlijning van de sequentie worden locaties met een dubbelzinnige uitlijning uitgesloten en worden hiaten behandeld als ontbrekende gegevens.
    6. Vergelijk de verkregen sequentie met die in de ITS-sequentiedatabase in GenBank met behulp van BLAST op de website van het National Center for Biotechnology Information (NCBI). Identificeer voorlopig de informatie over de schimmelstamsoort.
  3. Morfologische identificatie
    1. Gebruik een camera om de morfologie van de rijpe schimmelzuivere kolonie op zowel de voor- als achterkant van de PDA-platen vast te leggen.
    2. Pluk conidia uit de zuivere cultuur schimmelkolonies met een inoculatienaald en leg ze op een glasplaatje met een druppel steriel water.
    3. Houd het dekglaasje vast en leg het langzaam neer in een hoek van ~45°, zodat het dekglaasje het preparaat zonder luchtbellen kan bedekken.
    4. Snijd met een scalpel een 5 mm2 agarblok uit kolonies aan de rand van de schimmelkolonie en leg het op een schoon glasplaatje met een druppel steriel water. Plaag schimmels voorzichtig uit elkaar met een fijne naald om specifieke structuren te zien.
    5. Herhaal stap 2.3.3.
    6. Bekijk de ongeslachtelijke vorm van de schimmels onder een optische microscoop (OM), inclusief de vorm, transparantie en houding van de hyfen, conidioforen, phialiden en conidiën. Noteer en meet de vorm en grootte van de aseksuele kenmerken om de verschillende schimmelisolaten van elkaar te onderscheiden.
      OPMERKING: Om het vermogen om schimmelstructuren te observeren te maximaliseren, gebruikt u vlekken en montagemedium35.

3. Inductie van de symptomen van schimmelinfectie op M. alternatus om hun gedragsfenotypes te observeren

  1. Bereiding van conidiale suspensie
    1. Bereid 0,01% Tween-80 met zuiver water en autoclaaf het gedurende 25 minuten op 121 °C. Gebruik na afkoeling.
    2. Voeg een geschikte hoeveelheid steriele kleine glasparels en 0,01% Tween-80-oplossing toe aan een centrifugebuisje van 2 ml.
    3. Schraap schimmelkolonies in de buis en schud deze voldoende met een vortexshaker totdat de kolonie is opgebroken. Filtreer door twee lagen gaas om het mycelium te verwijderen.
      OPMERKING: Schudden wordt gedaan om de suspensie van conidiospore in 0,01% Tween-80-oplossing te garanderen.
    4. Tel het aantal sporen onder de OM met een hemocytometer, stel het in op 1 × 108 conidiaal/ml met steriel 0,01% Tween-80 en houd het bij 4 °C voor gebruik.
  2. Bereiding van kevers
    1. Autoclaaf de dennentakjes (ongeveer even groot) en droog ze in de oven (~ 60 °C).
    2. Houd in het veld verzamelde M. alternatus volwassenen met dennentakjes in een broedmachine bij 25 ± 1 °C.
    3. Verhonger kevers gedurende 24 uur en steriliseer het oppervlak van de kevers met bleekmiddel, ethanol en gedestilleerd water [10:10:80 (v:v)] voor gebruik.
  3. Inductie van de schimmelinfectie
    1. Werk onder een schone bank, dompel de dennentakjes 10 s onder in conidiale suspensie en droog ze aan de lucht.
    2. Dompel kevers gedurende 10 s in conidische suspensie en breng ze vervolgens over naar steriele buisjes van 50 ml (één kever en één takje per buis). Vervang de takjes elke 2 dagen door nieuwe.
    3. Voor negatieve controle verandert u de conidiale suspensie in alleen steriele 0,01% Tween-80-oplossing. Maak vijf replicaten voor elke schimmelstam en controlegroep.
    4. Beoordeel de activiteit van kevers op basis van de hoeveelheid frass die op dennentakjes wordt geproduceerd. Als het voeden stopt, beschouw ze dan als dood.
    5. Doe de dode kevers in nieuwe steriele buisjes van 50 ml en plaats er een stuk steriel vochtig katoen op. Incubeer bij 25 ± 1 °C.
      OPMERKING: Het natte katoen wordt gebruikt om de luchtvochtigheid op peil te houden, omdat de groei van schimmels voldoende vocht vereist, maar niet te veel.
    6. Observeer en fotografeer de verandering van het keveroppervlak elke dag op hetzelfde tijdstip.
  4. Herisolatie en bevestigen van schimmelsoorten
    1. Totdat er duidelijke fenotypes van schimmelinfecties op het oppervlak van kevers verschijnen, plukt u mycelium uit verschillende weefsels afzonderlijk in nieuwe PDA-platen.
    2. Kweek bij 25 ± 1 °C en observeer om er zeker van te zijn dat de morfologie consistent is met die van de geënte schimmels.
  5. Behandeling van modelkever
    1. Herhaal stap 3.2.1-3.3.6 op de modelkever Tribolium castaneum, gebruik tarwezemelen als voedsel en steriliseer tarwezemelen met UV-licht.
    2. Raak kevers lichtjes aan met een steriel pincet. Ga ervan uit dat ze dood zijn als er geen reactie komt.

4. Bevestig de infectie fenotypes van schimmels op M. alternatus en modelkever

  1. Monstervoorbereiding voor observatie
    1. Ontleed de geïnfecteerde M. Alternatus kadavers zorgvuldig zoals in stap 1.3.
    2. Kies T. Castanium-lichamen met duidelijke symptomen van een schimmelinfectie.
    3. Snijd 5 mm schijfproppen van vier volwassen schimmelkolonies die op PDA groeien.
  2. Monster voorbehandeling
    1. Doe pluggen, geïnfecteerde keverweefsels en lichamen gedurende 2 dagen in voorgekoeld 2,5% glutaaraldehyde bij 4 °C.
    2. Was de monsters driemaal in 0,1% fosfaatbuffer (pH 7,2-7,4) gedurende 5 minuten en dehydrateer in 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95%, 100% ethanol gedurende 10 minuten.
    3. Droog de monsters in een vacuümvriesdroger.
      OPMERKING: Het hele voorbehandelingsproces moet voorzichtig zijn, inclusief snijden, weken, uitdrogen, wassen en drogen, om schade aan het monster te voorkomen.
  3. Waarneming van scanning-elektronenmicroscopie (SEM)
    1. Smeer de voorbehandelde monsters in met platina met behulp van een sputtercoater en observeer onder een scanning-elektronenmicroscoop36.
    2. Noteer de morfologische kenmerken van hyfen en conidia die groeien op PDA, M. alternatusweefsels en modelkeverlichamen.
    3. Vergelijk of de resultaten consistent zijn met die onder OM in stap 2.3.

5. Evaluatie van de entomopathogene activiteit

  1. Bereiding van conidiale suspensie
    1. De bereiding van de conidiale suspensie is dezelfde als in de stappen 3.1.1-3.1.4.
  2. Voorbehandeling van modelkever
    1. Kweek, voed, steriliseer en honger T. Castanium zoals in stap 3.5.1.
    2. Steriliseer tarwezemelen door UV en plaats evenveel gewicht op steriele petrischalen.
  3. Test op entomopathogene activiteit
    1. Behandel tarwezemelen met de conidiale suspensie en droog ze aan de lucht onder een schone bank bij kamertemperatuur.
    2. Dompel T onder. Castaneumkevers in de conidiale suspensie gedurende 10 s en breng ze over naar een petrischaal (n = 20 in elke petrischaal). Vervang elke 4 dagen nieuwe tarwezemelen door dezelfde conidiale behandeling.
    3. Breng voor negatieve controle alleen steriele 0,01% Tween-80-oplossing aan.
      OPMERKING: Zet ten minste drie replicaten opzij voor elke behandelingsgroep en de controlegroep.
    4. Tel de dode kevers dagelijks.
      NOTITIE: Raak kevers lichtjes aan met een steriel pincet. Ga ervan uit dat ze dood zijn als er geen reactie is.
  4. Fylogenetische analyse van meerdere genen
    1. Extraheer entomopathogene schimmel genoom-DNA zoals beschreven in stap 2.1.
      OPMERKING: Identificatie van meerdere genen wordt uitgevoerd voor de parasitaire EPF's die significante infectiefenotypes en sterke entomopathogene activiteiten vertonen tegen de modelkever.
    2. Amplificeer de volgende genen, waaronder een gebied dat zich uitstrekt over het nucleaire ribosomale SSU34-gen, een segment van het rRNA-gen met grote subeenheid (LSU37,38), een deel van het verlengingsfactor 1-alfa (tef-1α39) -gen, de op een na grootste subeenheidsequenties van RNA-polymerase ІІ (rpb240) en een deel van de β-tubuline41 gen, met behulp van respectievelijk de primerparen NS1/NS4, LR7/LROR, EF-983F/EF-2218R, RPB2-5'F/RPB2-5'R en TUB1/TUB22 (zie tabel 1).
      1. Bereid het PCR-reactiemengsel voor zoals in stap 2.2.1.
      2. Voer de amplificatie als volgt uit: initiële denaturering bij 95 °C gedurende 4 min, gevolgd door 35 cycli (tef-1α, rpb2, SSU), 38 cycli (LSU) of 39 cycli (β-tubuline) denaturering bij 94 °C gedurende 60 s, gloeien bij 47 °C gedurende 60 s (LSU), 55 °C gedurende 60 s (tef-1α), 54 °C gedurende 40 s (β-tubuline) en 50 °C gedurende 30 s (rpb2, SSU), rek bij 72 °C gedurende 1 minuut en een uiteindelijke rek bij 72 °C gedurende 10 min.
    3. Volg de volgorde en lijn uit volgens dezelfde stappen als in de stappen 2.2.4-2.2.5.
    4. Voer de fylogenetische analyse uit door MEGA 6.0 op basis van de Maximum Likelihood (ML) methode42.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Isolatie en identificatie van schimmelisolaten van M. Alternatus
Met behulp van lokstoffen kan een groot aantal (in totaal ongeveer 500 kevers ) M. Alternatus werden verzameld uit vijf geografische regio's. Keverkadavers met typische symptomen van infectie door entomopathogene schimmels werden geplukt; Vervolgens werden de lichaamsintegumenten van elke kever ontleed in verschillende posities, zoals beschreven in protocolstap 1.3. A...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Verschillende geografische populaties van FWB kunnen gevarieerde interacties ontwikkelen met de natuurlijke entomopathogene schimmels, als gevolg van langdurige aanpassing van EPF-soorten aan het milieu aan lokale klimaatfactoren en de specifieke genotypische populatie van het gastheerinsect44,45. Uitbreiding van de bemonsteringslocaties naar meerdere gebieden waar insecten voorkomen, vergroot de mogelijkheid om diverse stammen o...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

De auteurs verklaren geen belangenconflicten.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dit onderzoek werd ondersteund door het National Key Research and Development Program of China (2021YFC2600100) en de Natural Science Foundation van de provincie Zhejiang (LY21C040001).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL, 2 mL centrifuge tubesBiosharpBS-15-M
10 µL pipet tipsSangon BiotechF601216
10 µL, 20 µL, 100 µL, 200 µL, 1,000 µL pipettesRainin
1,000 µL pipet tipsSangon BiotechF630102
2 mL cryogenic vialsCorning430659
20x PBS bufferSangon BiotechB548117-0500
200 µL pipet tipsSangon BiotechF601227
2,000 bp makerTaKaRarSD0531
50 mL tubesNest602052
50% glutaraldehyde solutionSangon BiotechG916054
50x TAE bufferSangon BiotechB548101
6x loading bufferTaKaRarSD0503
AgaroseSangon BiotechA610013
Anhydrous ethanolJkchemicalLB10V37
Biochemistry Cultivation CabinetShanghaiyihengLRH-250F
ChloroformJuhua61553
Commercial beetle trapsFEIMENGDIBF-8www.yinyouji.com
Gel imagerBio-RadGelDoc XR+
GlycerolSangon BiotechA600232
High speed refrigerated centrifugeSigmaD-37520
High-Pressure Steam Sterilization PotMettler ToledoJA5003
Isopropyl alcoholGeneral-reagentG75885B
Nucleic acid dyeSangon BiotechA616696
Optical Microscope, OMLeicaDM2000
ParafilmParafilmPM996
PCR meterHeal ForceTrident960
Penicillin GMarklinGB15743
Potato dextrose agar, PDAOxoidCM0139
Potato dextrose broth, PDBSolarbioP9240
PrimersSangon Biotech/
Primers TaqTaKaRarRR902A
Rapid Fungi Genomic DNA Isolation KitSangon BiotechB518229
Scanning Electron Microscope, SEMHitachiS-3400N
StreptomycinMarklinS6153
TetracyclineMarklinT829835
Tween-80MarklinT6336
Vacuum freeze dryerYamatoDC801
Vortex ShakerHLDWH-861
β-MercaptoethanolMarklinM6230

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hajek, A. E., Bauer, L. S. Microbial control of wood-boring insects attacking forest and shade trees. Field Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. 10, 505-525 (2007).
  2. Linnakoski, R., Forbes, K. M. Pathogens-the hidden face of forest invasions by wood-boring insect pests. Frontiers in Plant Science. 10, 90(2019).
  3. Hulcr, J., Dunn, R. R. The sudden emergence of pathogenicity in insect-fungus symbioses threatens naive forest ecosystems. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 278 (1720), 2866-2873 (2011).
  4. Humble, L. M., Allen, E. A. Forest biosecurity: alien invasive species and vectored organisms. Canadian Journal of Plant Pathology. 10, 90(2006).
  5. Ahmed, R., Freed, S. Biochemical resistance mechanisms against chlorpyrifos, imidacloprid and lambda-cyhalothrin in Rhynchophorus ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Curculionidae). Crop Protection. 143, 105568(2021).
  6. Al-Ayedh, H., Hussain, A., Rizwan-Ul-Haq, M., Al-Jabr, A. M. Status of insecticide resistance in field-collected populations of Rhynchophorus ferrugineus (Olivier) (Coleoptera: Curculionidae). International Journal of Agriculture and Biology. 18 (01), 103-110 (2015).
  7. Garcia, F. R. M., Ovruski, S. M., Suarez, L., Cancino, J., Liburd, O. E. Biological control of Tephritid fruit flies in the Americas and Hawaii: a review of the use of parasitoids and predators. Insects. 11 (10), 662(2020).
  8. Lacey, L. A., Shapiro-Ilan, D. I. Microbial control of insect pests in temperate orchard systems: potential for incorporation into IPM. Annual Review of Entomology. 53, 121-144 (2008).
  9. Wang, Z. Z., Liu, Y. Q., Shi, M., Huang, J. H., Chen, X. X. Parasitoid wasps as effective biological control agents. Journal of Integrative Agriculture. 18 (4), 705-715 (2019).
  10. Islam, W., et al. Insect-fungal-interactions: a detailed review on entomopathogenic fungi pathogenicity to combat insect pests. Microbial Pathogenesis. 159, 105122(2021).
  11. Ali, S., Huang, Z., Ren, S. Production of cuticle degrading enzymes by Isaria fumosorosea and their evaluation as a biocontrol agent against diamondback moth. Journal of Pest Science. 83 (4), 361-370 (2010).
  12. Vidal, S., Jaber, L. R. Entomopathogenic fungi as endophytes: plant-endophyte-herbivore interactions and prospects for use in biological control. Current Science. 109 (1), 46-54 (2015).
  13. Rasool, S., et al. Seed inoculations with entomopathogenic fungi affect aphid populations coinciding with modulation of plant secondary metabolite profiles across plant families. New Phytololgist. 229 (3), 1715-1727 (2021).
  14. Dara, S. K., Montalva, C., Barta, M. Microbial control of invasive forest pests with entomopathogenic fungi: a review of the current situation. Insects. 10 (10), 341(2019).
  15. Rajula, J., Rahman, A., Krutmuang, P. Entomopathogenic fungi in Southeast Asia and Africa and their possible adoption in biological control. Biological Control. 151, 104399(2020).
  16. Sharma, L., et al. Advances in entomopathogen isolation: a case of bacteria and fungi. Microorganisms. 9 (1), 16(2020).
  17. Echeverri-Molina, D., Santolamazza-Carbone, S. Toxicity of synthetic and biological insecticides against adults of the Eucalyptus snout-beetle Gonipterus scutellatus Gyllenhal (Coleoptera: Curculionidae). Journal of Pest Science. 83 (3), 297-305 (2010).
  18. Yang, T. H., et al. Entomopathogenic fungi-mediated biological control of the red palm weevil Rhynchophorus ferrugineus. Journal of Asia-Pacific Entomology. 26 (1), 102037(2023).
  19. Kepler, R. M., et al. A phylogenetically-based nomenclature for Cordycipitaceae (Hypocreales). IMA Fungus. 8 (2), 335-353 (2017).
  20. Zhou, Y. M., Zhi, J. R., Qu, J. J., Zou, X. Estimated divergence times of Lecanicillium in the family Cordycipitaceae provide insights into the attribution of Lecanicillium. Frontiers in Microbiology. 13, 859886(2022).
  21. Montalva, C., et al. Lecanicillium attenuatum isolates affecting the invasive cypress aphid (Cinara cupressi) in Chile. BioControl. 62 (5), 625-637 (2017).
  22. Futai, K. Pine wood nematode, Bursaphelenchus xylophilus. Annual Review of Phytopathology. 51 (1), 61-83 (2013).
  23. Kobayashi, F., Yamane, A., Ikeda, T. The Japanese pine sawyer beetle as the vector of pine wilt disease. Annual Review of Entomology. 29 (1), 115-135 (1984).
  24. Zhao, L., Sun, J. Pinewood nematode Bursaphelenchus xylophilus. (Steiner and Buhrer) Nickle. Biological invasions and its management in China. 13, 3-21 (2017).
  25. Akbulut, S., Stamps, W. T. Insect vectors of the pinewood nematode: a review of the biology and ecology of Monochamus species. Forest Pathology. 42 (2), 89-99 (2012).
  26. Shimazu, M. Effects of temperature on growth of Beauveria bassiana F-263, a strain highly virulent to the Japanese pine sawyer, Monochamus alternatus, especially tolerance to high temperatures. Applied Entomology and Zoology. 39 (3), 469-475 (2004).
  27. Han, B., Piao, C. G., Wang, L. F., Li, Y., Zheng, R. Z. Survey, identification and virulence test of pathogens of the pine sawyer beetle, Monochamus alternatus, at forest farm of maanshan, anhui province. Forest Research. 20 (20), 204-208 (2007).
  28. Ma, L., Zhang, L., Lin, H., Mao, S. Investigation of pathogens of Monochamus alternatus in east China and virulence. Chinese Journal of Biological Control. 25 (3), 220-224 (2009).
  29. Alvarez-Baz, G., Fernandez-Bravo, M., Pajares, J., Quesada-Moraga, E. Potential of native Beauveria pseudobassiana strain for biological control of pine wood nematode vector Monochamus galloprovincialis. Journal of Invertebrate Pathology. 132, 48-56 (2015).
  30. Dong, Y., Xie, P., Zheng, K., Gu, Y., Fan, J. Teflon coating and anti-escape ring improve trapping efficiency of the longhorn beetle, Monochamus alternatus. Applied Sciences. 13 (3), 1664(2023).
  31. Gul, H. T., Saeed, S., Khan, F. Z. A. Entomopathogenic fungi as effective insect pest management tactic: a review. Applied Sciences and Business Economics. 1 (1), 10-18 (2014).
  32. Takuji Noma Strickler, K. Effects of Beauveria bassiana on Lygus hesperus (Hemiptera: Miridae) feeding and oviposition. Environmental Entomology. 29 (2), 394-402 (2000).
  33. Thakur, R., Sandhu, S. S. Distribution, occurrence and natural invertebrate hosts of indigenous entomopathogenic fungi of Central India. Indian Journal of Microbiology. 50 (1), 89-96 (2010).
  34. White, T. J., Bruns, T., Lee, S., Taylor, J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. PCR Protocols. 18 (1), 315-322 (1990).
  35. Zaman, G., Chayen, J. An aqueous mounting medium. Journal of Clinical Pathology. 34 (5), 567-568 (1981).
  36. Koon, M. A., et al. Preparation of prokaryotic and eukaryotic organisms using chemical drying for morphological analysis in scanning electron microscopy (SEM). Journal of Visualized Experiments. (143), e58761(2019).
  37. Vilgalys, R., Hester, M. Rapid genetic identification and mapping of enzymatically amplified ribosomal DNA from several Cryptococcus species. Journal of Bacteriology. 172 (8), 4238-4246 (1990).
  38. Rehner, S. A., Samuels, G. J. Taxonomy and phylogeny of Gliocladium analysed from nuclear large subunit ribosomal DNA sequences. Mycological Reasearch. 98 (6), 625-634 (1994).
  39. Aphidech, S., Kusavadee, S. Isolation, identification, culture and production of adenosine and cordycepin from cicada larva infected with entomopathogenic fungi in Thailand. African Journal of Microbiology Research. 7 (2), 137-146 (2013).
  40. Wang, Y., et al. Polycephalomyces yunnanensis (Hypocreales), a new species of Polycephalomyces parasitizing Ophiocordyceps nutans and stink bugs (hemipteran adults). Phytotaxa. 208 (1), (2015).
  41. Qi, M., Xie, C. X., Chen, Q. W., Yu, Z. D. Pestalotiopsis trachicarpicola, a novel pathogen causes twig blight of Pinus bungeana (Pinaceae) in China. Antonie Van Leeuwenhoek. 114 (1), 1-9 (2021).
  42. Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., Kumar, S. MEGA6: molecular evolutionary genetics analysis version 6.0. Molecular Biology and Evolution. 30 (12), 2725-2729 (2013).
  43. Wu, S., et al. Discovery of entomopathogenic fungi across geographical regions in southern China on pine sawyer beetle Monochamus alternatus and implication for multi-pathogen vectoring potential of this beetle. Frontiers in Plant Science. 13, 1061520(2022).
  44. Brodeur, J. Host specificity in biological control: insights from opportunistic pathogens. Evolutionary Applications. 5 (5), 470-480 (2012).
  45. Croll, D., Mcdonald, B. A. The genetic basis of local adaptation for pathogenic fungi in agricultural ecosystems. Molecular Ecology Resources. 26 (7), 2027-2040 (2017).
  46. Perez-Gonzalez, V. H., et al. Specific diversity of the entomopathogenic fungi Beauveria and Metarhizium in Mexican agricultural soils. Journal of Invertebrate Pathology. 119, 54-61 (2014).
  47. Debono, M., Gordee, R. S. Antibiotics that inhibit fungal cell wall development. Reviews of Microbiol. 48, 471-497 (1994).
  48. Li, S., et al. Exploring the accuracy of amplicon-based internal transcribed spacer markers for a fungal community. Molecular Ecology Resources. 20 (1), 170-184 (2019).
  49. Wan, J., Dai, Z., Zhang, K., Li, G., Zhao, P. Pathogenicity and metabolites of endoparasitic nematophagous fungus Drechmeria coniospora YMF 1.01759 against nematodes. Microorganisms. 9 (8), 1735(2021).
  50. Ammon, V., Wyllie, T. D., Brown, M. F. Investigation of the infection process of macrophomina phaseolina on the surface of soybean roots using scanning electron microscopy. Mycopathologia. 55 (2), 77-81 (1975).
  51. Throne, J. E., Hallman, G. J., Johnson, J. A., Follett, P. A. Post-harvest entomology research in the United States department of agriculture-agricultural research service. Pest Management Science. 59 (6-7), 619-628 (2003).
  52. Silver, K., et al. The Tribolium castaneum cell line TcA: a new tool kit for cell biology. Scientific Reports. 4 (1), 6840(2014).
  53. Fatehi, S., et al. Characterization of iflavirus in the red flour beetle, Tribolium castaneum (Coleoptera; Tenebrionidae). Insects. 14 (3), 220(2023).
  54. Li, C., et al. Identification and characterization of development-related microRNAs in the red flour beetle, Tribolium castaneum. International Journal of Molecular Sciences. 24 (7), 6685(2023).
  55. Li, J., et al. The TGF-β receptor gene saxophone influences larval-pupal-adult development in Tribolium castaneum. Molecules. 27 (18), 6017(2022).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Entomopathogenic FungiForest Wood BorersMonochamus AlternatusFungal IsolationPathogenicity AssessmentScanning Electron MicroscopyMolecular IdentificationParasitic FungiPhylogenetic AnalysisInsect Pathogenicity

Related Articles